يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة بحثية

تنظيم مسار AKT/Wnt/β-كاتينين وتحفيز الكوكروبتوزيس بواسطة الكركمين في الورم الأرومي الدبقي

653 مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/69663

⸱

يناير 27, 2026

 , 
1Department of Neurosurgery, The First Affiliated Hospital of Yangtze University

في هذه المقالة

ملخص

يثبط الكركمين (CUM) تقدم الورم الأرومي الدبقي (GBM) عن طريق تحفيز النفخ النحمي من خلال تثبيط محور AKT/Wnt/β-كاتينين. يبحث هذا البروتوكول في الآلية الجزيئية التي من خلالها يعيق CUM تطور السرطان الخبيث في GBM ويصف طرقا لتقييم كيفية تحفيز CUM للكبروبتوس من خلال تعديل هذا المسار.

الملخص

يمكن للكركمين (CUM) تنظيم السلوك الخبيث للورم الأرومي الدبقي (GBM). تبحث هذه الدراسة فيما إذا كان CUM يثبط تقدم الكتلة الجيبية العظمية من خلال تحفيز التكسير المغناطيسي عبر مسار الإشارات AKT/Wnt/β-كاتينين. تم تحديد تركيزات الكركمين المثلى باستخدام اختبار MTT. تمت معالجة خلايا A172 وU251 ب CUM، ومثبط AKT MK-2206، ومثبط Wnt LGK974، وإلسم-Cu (Elesclomol + CuCl2). تم تقييم تكاثر الخلايا، الهجرة، الغزو، والموت المبرمج باستخدام تلوين كربوكسي فلوريسين سوكسنيميديل أميني إستر، واختبارات خدش، وفحوصات ترانسويل، وقياس خلوي التدفق، على التوالي. تم استخدام فلورة الميتوكوندريا التأكسدية، وتحليل الأيض لفرس البحر، وتألق المناعي، وكشف Cu2+ ، وإزالة الطلاء الغربي لتقييم الإجهاد التأكسدي للميتوكوندريا والكابروبتوسيس. تم تحليل محور AKT/Wnt/β-كاتينين باستخدام مجموعة مراسل TCF/LEF1 وتغطية غربية. تم إنشاء نموذج زينوغرافت GBM، وتم إعطاء CUM بواسطة الغافاج لمدة خمسة أسابيع. تم تقييم تأثيرات CUM على نمو الورم، والكوبروبتوزيس، وتعبير بروتين مسار AKT/Wnt/β-كاتينين. تمت معالجة الخلايا بجرعات 10 ميكرومولار و20 ميكرومولار في المختبر. أدى علاج الرحم المحبط إلى تقليل التكاثر والهجرة والغزو، مع تعزيز الإجهاد التأكسدي والنقابة. كما قمع CUM نشاط إشارات Wnt/β-Catenin. أدى تثبيط المسار إلى زيادة مستويات أنواع الأكسجين التفاعلية (3.7 مرة) ومستويات الكوز2+ (3.1 ضعف)، وتقليل تعبير إنزيم أستيل ترانسفيرازات ثنائي هيدروليبوأميد، مما أدى إلى كبح السلوك الخبيث. في الفئران العارية، قلل CUM بشكل كبير من نمو الأورام، وعزز الكوب البروبتسي، وثبط تنشيط محور AKT/Wnt/β-كاتينين. تشير نتائجنا إلى أن CUM يثبط إشارات AKT/Wnt/β-كاتينين، ويعزز الكبروب توزيس، ويتداخل مع تقدم GBM.

المقدمة

الورم الدبقي هو الورم الخبيث الأولي داخل الجمجمة شيوعا في الجهاز العصبي المركزي (CNS). عادة ما يشير الورم الدبقي من الدرجة الرابعة إلى الورم الأرومي الدبقي (GBM)، مع توقعات ضعيفة2. GBM هو ورم دماغي شديد التوغل، يشكل ما يقارب 50٪ من الأورام الخبيثة في الجهاز العصبي المركزي، مع متوسط بقاء أقل من سنةو3 سنوات. يشتهر بارتفاع أورام خبيثه ومعدل تكراره العالي 4,5. حاليا، تعتمد استراتيجيات علاج GBM بشكل أساسي على الجراحة، مدعومة بالعلاج الإشعاعي والعلاج الكيميائي وطرق العلاج الشاملة الأخرى6. على الرغم من أن الاستراتيجيات العلاجية الناشئة مثل العلاج المناعي، والعلاج الحيوي، والطب النانوي حققت نتائج ملحوظة في الدراسات ما قبل السريرية، إلا أن معدل البقاء الإجمالي خلال خمس سنوات لا يزال فقط 4.3٪9. أكثر نظام العلاج الكيميائي استخداما هو نظام ستوب؛ ومع ذلك، بالنسبة لمرضى GBM المصابين ب MGMT غير المثيل، فإن معدل البقاء الإجمالي ليس طويلا بشكل ملحوظ10. لذلك، فإن استكشاف استراتيجيات علاجية جديدة له أهمية رئيسية في إطالة فترة بقاء المرضى. تفترض هذه الدراسة أن آلية مكافحة السرطان للكوركمين (CUM) على GBM تتعلق بمرض الكبروب النباتي.

يمكن أن يؤدي الأيض غير الطبيعي للنحاس أو تلف الخلايا الناتج عن النحاس إلى سلسلة من الأمراض11. في ظروف الأكسدة التقليدية، يمكن أكسدة Cu+ المختزل إلىCu+ 2+. وجد تسفيتكوف وآخرون آلية غير مكتشفة سابقا لموت الخلايا الناتج عن النحاس، تسمى الكوب بربتوسيس. ترتبط أيونات Cu2+ بالمركبات الأسيلية، ثم يتم تقليل تنظيم تعبير بروتينات تجمع Fe-S، مما يسبب موت الخلايا12,13. أكدت أبحاث موسعة أن النحجار مرتبط ارتباطا وثيقا بالعملية الفيزيولوجية المرضية للأورام 14,15. تمثل ال lncRNA والجينات المرتبطة بالكوبروبتوزيس مؤشرات حيوية محتملة لتشخيص وعلاج GBM16. يمكن ل BCMD أن يطلق Cu2+، ويحفز الكوب بروب توزيس، ويؤدي إلى موت الخلايا المناعية لعلاج GBM17. لذلك، نعتقد أن النفخ يمكن استخدامه كهدف جديد لعلاج GBM. ومع ذلك، تعتمد معظم الأنظمة الحالية على حاملات صناعية مثل إليسكومول-Cu أو الحث المباشر لأيونات النحاس عالية التركيز. على الرغم من أن هذا التدخل الخارجي الجذري يمكن أن يثبت مفهوم الكوب روبتوزيس، إلا أن فرص التحول السريري محدودة بسبب نقص الارتباط الفسيولوجي والاستهداف. لذلك، أصبح البحث عن مركبات طبيعية أو جزيئية صغيرة يمكنها تنظيم تكوين الكتلة المغناطيسي الكام بشكل داخلي ودقيق وتوضيح آلية الإشارة الصاعدة الخاصة به جسرا رئيسيا بين هذه الآلية الجديدة والعلاج السريري.

يعتبر الطب الصيني على نطاق واسع مصدرا قيما لأبحاث أدوية مكافحة الأورام. CUM هو مادة متعددة الفينولات مستخرجة من الكركم التقليدي في الطب الصيني. أكدت الصيدلة الحديثة أنه يمتلك وظائف مضادة للأكسدة ومضادة للالتهابات ومضادة للأورام. لدى وحدة الرحم الصناعي العديد من الأنشطة المضادة للأورام. يمكن أن يقلل من نشاط خلايا GBM من خلال تعزيز الاستماتة المبرمجة، واضطراب المسارات المتعددة الجزيئات، وآليات أخرى18. أظهرت التجارب في المختبر أن الجرعة المنخفضة من CUM مع الإشعاع يمكن أن يعزز بشكل تآزري من تكاثر مضادات GBM19. علاوة على ذلك، يمكن ل CUM تنظيم المسارات الأساسية المتعلقة ب GBM، بما في ذلك MAPK20. مقارنة بالعلاج الكيميائي التقليدي بالتيموزولوميد (TMZ)، يظهر CUM مزايا علاجية فريدة. غالبا ما تكون فعالية التيموزولوميد محدودة بآليات إصلاح الحمض النووي القوية في GBM، مما يؤدي إلى مقاومة الأدوية؛ الآلية التي يحفز بها CUM النفخ المكعب من خلال استهداف الأيض الميتوكوندري21,22 مستقلة عن TMZ. لا يمكن ل CUM فقط تنظيم العمليات الأيضية المرتبطة بالتجمع المكسي ويمكنه أيضا التدخل في نفس الوقت مع عدة مسارات إشارات رئيسية مرتبطة بتقدم مرض الكتلة المزمنة، مما يوفر طرقا محتملة لتجاوز قيود العلاجات الفردية وتطوير استراتيجيات علاجية مشتركة. نطاق تركيز CUM المستخدم في هذه الدراسة (10-20 ميكرومول) يتوافق مع التركيزات الفعالة التي تم الإبلاغ عنها في دراسات العلاج قبل السريري23. على الرغم من أن انخفاض التوافر البيولوجي الفموي للوحدة الدماغية الكرومغناطيسية وكفاءة توصيله عبر حاجز الدم والدماغ هما تحديات رئيسية في التطبيقات العملية، إلا أن أنظمة التوصيل النانوي الناشئة واستراتيجيات التعديل المستهدفة قدمت حلولا واعدة لتجاوز هذا الاختناق24.

على الرغم من أن العديد من الدراسات أبلغت عن تأثيرات المبردات المائية، والمضادة للتكاثر، ومثبطات الهجرة لمرض السلوك المبدئي في المرض الخلقي المبكر(25,26)، إلا أن معظم الأبحاث الحالية ركزت على تأثيراته على المسارات التقليدية للموت المبرمج أو الالتهام الذاتي. تهدف هذه الدراسة إلى توضيح ما إذا كانت CUM تثبط التطور الخبيث ل GBM من خلال تنظيم التهاب الغابة السرطانية. بحثنا فيما إذا كان CUM قد يسبب الكونبروبتوس جزئيا عن طريق تثبيط محور AKT/Wnt/β-كاتينين، وبالتالي قمع GBM. استنادا إلى ذلك، توفر هذه الدراسة أسس تجريبية ل CUM لتحسين علاج GBM ولتطوير أهداف جديدة في علاج GBM.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تم تنفيذ جميع إجراءات وفقا للمعايير المؤسسية المعتمدة للرعاية الإنسانية واستخدام المختبرية، وتمت الموافقة عليها رسميا من قبل لجنة أخلاقيات المؤسسية. تم اتخاذ تدابير لتقليل الانزعاج والضيق لدى كلما أمكن.

اتبعت الأعمال المتعلقة بالمركبات الكيميائية والأصباغ والعينات البيولوجية ممارسات السلامة البيولوجية المعتمدة للحد من المخاطر المحتملة. تم التعامل مع المواد الخطرة المحتملة - بما في ذلك البارافورمالديهايد، والكواشف القائمة على النحاس، وDHE - باستخدام معدات الحماية الشخصية المناسبة، بما في ذلك القفازات، وأقنعة الوجه، ونظارات السلامة. تم فصل جميع المواد النفايات، مثل المواد المستهلكة والمواد الملوثة القابلة للتخلص مرة واحدة، في حاويات مخصصة للخطر البيولوجي وتمت معالجتها لاحقا من قبل خدمات إدارة النفايات الخطرة المعتمدة وفقا للوائح السلامة المؤسسية والبيئية. التصميم التجريبي العام موضح في الشكل 1.

الشكل 1
الشكل 1: سير عمل هذه الدراسة. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

زراعة الخلايا والتجميع
تم زراعة الخلايا النجمية في الدماغ البشري (NHA) وسلاسل الخلايا النجمية A172 وU251 وLN229 وSHG-44 (انظر جدول المواد) في وسط DMEM يحتوي على 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) وحفظت في الحاضنة عند درجة حرارة 3 °م مع 5٪ CO₂. كان الوسط يغير كل يومين، وتمر الخلايا عندما تصل إلى حوالي 80٪ من التقاطع. تم تحديد الجرعة المناسبة ووقت التعرض ل CUM باستخدام اختبار MTT. تمت معالجة خلايا NHA وA172 وU251 وLN229 وSHG-44 بتركيزات مختلفة (0، 2.5، 5، 10، 20، و4 ميكرومول) من CUM لمدة 24، 48، و7 ساعات على التوالي،23 ساعة. ثم أضيف 2 ميكرولتر من محلول MTT. بعد الساعة، أضيف 15 ميكرولتر من ثنائي ميثيل كبريتسيد إلى كل بئر وخلطه بلطف. تم قياس الكثافة البصرية عند 45 نانومتر باستخدام قارئ الميكرولوتين. تم استخدام الخلايا غير المعالجة (مجموعة التحكم) كعناصر تحكم سلبية في جميع التجارب.

تم زرع خلايا A172 وU251 وتقسيمها إلى مجموعات: ضابطة، CUM بجرعة منخفضة (1 ميكروM)، جرعة عالية من CUM (2 ميكروM)، مثبط AKT (MK-2206)، مثبط AKT + مثبط Wnt (MK-2206 + LGK974)، وإلسم-Cu (إليسكومول + CuCl₂)، بناء على ظروف العلاج. تمت معالجة الخلايا في مجموعات CUM بجرعة 10 أو 2 ميكرومولار CUM لمدة 4 ساعات. تلقت الخلايا في مجموعة MK-2206 1 ميكرومولار MK-2206 لمدة ساعتين. تمت معالجة الخلايا في مجموعة MK-2206 + LGK974 بميكروM LGK974 للسH بعد التعرض ل MK-2206. تمت معالجة خلايا مجموعة Elsm-Cu ب Elesclomol بقوة 100 نانومالر وμM CuCl₂ لمدة 4 ساعاتو14 ساعة.

قياس التدفق الخلوي
تم حضن الخلايا المزروعة من A172 وU251 في كل مجموعة بمحلول صبغ PBS يحتوي على محلول تلوين PI بقوة 1 ميكروغرام/مل لمدة دقيقة واحدة. ثم عولجت الخلايا بنسبة 0.25٪ من التريبسين وجمعت بالطرد المركزي (20 × جم، على الأقل، درجة حرارة الغرفة). تم اكتشاف الخلايا الإيجابية ل PI باستخدام مقياس تدفق خلوي مع قناة PE (الإثارة عند 488 نانومتر)، وتم حساب معدل موت الخلية27.

اختبار كاربوكسي فلوريساين سوكسنيميديل الإستر الأميني (CFSE)
تم حضن خلايا A172 وU251 بصبغة CFSE من نوع CellTrace بمقدار ميكرومول/لتر عند درجة حرارة 3 °م لمدة دقيقة واحدة في الظلام. ثم تم تحييد الوسط، وتم طرد الخلايا على حرارة 20 × جرام للدنى في درجة حرارة الغرفة. بعد الجمع، كانت الخلايا تزرع وتعالج وفقا لتجميعاتها. تم تحليل شدة الفلورة في CFSE باستخدام قياس تدفق الخلايا (الإثارة عند 488 نانومتر)27.

اختبار تكوين نسخ الخلايا
تم هضم الخلايا المزروعة A172 وU251، وإعادة تعليقها، وعددها. تمت إضافة ملليترين من نظام التعليق الخلوي المحضر. بعد خلط لطيف، تم حضن الخلايا لمدة تقارب 14 يوما. ثم تم تثبيت الخلايا ب4٪ بارافورمالديهايد لمدة 3 دقائق، وتم التخلص من المثبت. بعد التلوين بلون بنفسجي كريستالي بنسبة 0.1٪. تم التقاط صور المستعمرات، وتم حساب معدل تكوين المستنسخين14.

اختبار خدش الخلية
تم زراعة خلايا A172 وU251 (1 ×10 6 خلايا/بئر) حتى وصلتا إلى 90٪ من التلاقط. تم خدش طبقة الخلية الأحادية مرة واحدة باستخدام رأس معقم بسعة 2 ميكرولتر لتكوين جرح ثم عولجت بتركيزات مختلفة من ال CUM لكل H و48 ساعة. تم التقاط الصور باستخدام المجهر. تم تقييم معدل شفاء الخدوش باستخدام برنامج ImageJ. تم تحويل الصور إلى صيغة 8-بت، وتم تعيين عتبة موحدة لتمييز منطقة الخدش عن منطقة الخلية، وتم حساب مناطق الخدش عند 0 ساعة و48 ساعة باستخدام دالة تحليل الجسيمات . معدل شفاء الخدوش (٪) = (مسافة 0 ساعة − مسافة 48 ساعة) / مسافة 0 ساعة × 100٪23.

تجربة ترانسويل
تم تعريض خلايا A172 وU251 للمعالجات المحددة، ثم تم فصلهما إنزيميا وطردهما المركزي عند 200 × جرام لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. تم تعليق الخلايا في وسط خال من المصل. تم تخفيف المادة بنسبة 1:8 في وسط خال من المصل، وخلطها جيدا، وتم تطبيق 5 ميكرولتر على الغرفة العلوية لإدخال ترانسويل، تلاها حضانة لمدة 4 ساعات. تمت إضافة ما مجموعه 5 ×10 4 خلايا لكل بئر إلى الحجرة العليا، بينما تم وضع 60 ميكرولتر من الوسط مع 20٪ FBS في الحجرة السفلية. بعد 48 ساعة من الحضانة، تم تثبيت الخلايا باستخدام بارافورمالديهايد وصبغها باللون البنفسجي البلور. تم اختيار خمسة مجالات بصرية من مركز ومحيط كل بئر. تمت ملاحظة الخلايا وتصويرها تحت المجهر. تم حساب الخلايا الغازية باستخدام ImageJ. تم تحويل الصور إلى صيغة 8-بت، وطبقت عتبات لتمييز الخلايا الملونة عن الخلفية، وقامت وظيفة تحليل الجسيمات بعدد الخلايا التي هاجرت عبر الغشاء23.

كشف جهد الغشاء الميتوكوندري (MMP)
تم حضان الخلايا المزروعة من A172 وU251 في كل مجموعة بمحلول JC-1 العامل لمدة 30 دقيقة في الظلام. تم غسل الخلايا بلطف باستخدام مخزن JC-1 المبرد مسبقا، ومراقبتها، وتصويرها باستخدام مجهر فلوري. باستخدام إثارة 488 نانومتر، تم جمع إشارات البوليمر والمونومر JC-1 باستخدام مرشحات انبعاث 590 نانومتر و530 نانومتر على التوالي. تم تحليل نسبة الفلورة الحمراء/الخضراء (تجمعات JC-1 إلى المونومر) باستخدام برنامج ImageJ لتقييم تغييرات MMP28. تم استخراج صور القنوات الحمراء والخضراء بشكل منفصل، وتم قياس متوسط شدة الفلورة في نفس المنطقة.

كشف معدل استهلاك الأكسجين (OCR)
تم زرع خلايا A172 وU251 المزروعة. تم وضع اللوح في محلل مسخن مسبقا عند 3 درجات مئوية للتكيف. وبعد التكييف، أضيف وسيط العزم. بعد المعايرة التلقائية، تم تعديل اللوحة لمدة 15-2 دقيقة عند 3 درجات مئوية دون ثاني أكسيد الكربون. تم قياس السجل الضوئي الواضح في الأساس (OCR) الأساسي، وتم ضبط برنامج التحليل لتسجيل السجل الضوئي الضوئي الميتوكوندري على فترات محددة. تم تصدير البيانات للتحليل اللاحق28.

كشف الأكسجين التفاعلي بواسطة MitoSOX الفلوري (ROS)
تم تعديل خلايا A172 وU251 إلى كثافة 1 × 104 خلايا/مل، وتم زرع 1 مل لكل بئر في طبق الكونفوكالي، ثم تم إجراء التدخل الدوائي. تم التخلص من المادة الفائقة للخلية، وأضيف 1 مل من مسبار MitoSOX المخفف (1:1,000). تم حضن الخلايا في الظلام عند درجة حرارة 3 درجات مئوية لمدة دقيقة واحدة. تم التقاط إشارة الفلورة باستخدام مجهر الفلورة (الإثارة/الانبعاث: 510/580 نانومتر) لتقييم مستويات ROS الميتوكوندرية29.

التألق المناعي
تم غسل أغطية الغطاء مرة واحدة باستخدام وسط زراعة DMEM. ثم وضعت في صفائح بستة آبار لزراعة الخلايا والتدخل الدوائي. بعد 24 ساعة، تم تثبيت الخلايا في 4٪ بارافورمالديهايد، ثم تم حجبها بألبومين مصل البقري بنسبة 5٪ (BSA) لمدة 30 دقيقة. تمت إزالة محلول الحظر، وتم تطبيق الأجسام المضادة الأولية المخففة التي تستهدف إنزيم أستيل ترانسفيراز ديهيدروليبواميد (DLAT) و β-كاتينين، تلاها الحضانة الليلية عنددرجة مئوية 30. ثم تم إدخال الأجسام المضادة الثانوية الموسومة بالفلورية وحضانتها عند 3 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة. تم تلوين نوى الخلايا باستخدام DAPI، وتم تركيب شرائح باستخدام مادة مضادة للتلاشي. تم التقاط صور الفلورة باستخدام مجهر الفلورة، وتم قياس شدة الإشارة باستخدام برنامج ImageJ. تم تحويل الصور إلى صيغة 8-بت، وتم تطبيق عتبة ثابتة لتمييز إشارات الهدف عن الضوضاء الخلفية. تم استخدام أداة المستطيل لاختيار المناطق الخلوية المرغوبة، وتم قياس متوسط شدة الفلورة27. لرؤية الميتوكوندريا، تم علاج الخلايا ب 20 نانومالتر MitoTracker Red CMXRos لمدة 30 دقيقة ثم ثبتت ببارافورمالديهايد30.

مجموعة تقرير TCF/LEF1 من لوسيفيراز
تم تقييم تنشيط Wnt/β-كاتينين داخل خلايا A172 وU251 باستخدام مجموعة تقرير لوسيفيراز TCF/LEF1. يحتوي ناقل الإبلاغ TCF/LEF على صندوق TATA وعناصر استجابة عامل الخلايا التائية/عامل تعزيز لمفاوي (TCF/LEF)، مما يتيح الكشف غير المباشر عن نشاط النسخ β-كاتينين عبر التعبير عن البروتين الفلوري الأخضر (GFP). تم نقل الخلايا المزروعة من A172 وU251 بشكل عكسي باستخدام ناقل TCF/LEF بقوة 5 نانوغرام. بعد ستة عشر ساعة من النقل، تم تسجيل شدة الفلورة باستخدام قارئ ميكرولوح مع إعدادات إثارة وانبعاث 488 و51 نانومتر على التوالي،31.

الفئران الحاملة للأورم
تم الحفاظ على عشرة ذكور من فئران BALB/c عارية (عمرها 7 أسابيع، 2 ± 2 جم) في ظروف خالية من الممرضات المحددة (2 درجة مئوية، 65٪ رطوبة) مع وصول غير مقيد إلى الطعام والماء القياسيين. تمت الموافقة على جميع الإجراءات من قبل لجنة مراجعة الأخلاقيات في المستشفى الأول التابع لجامعة اليانغتسي (رقم 2023092؛ تاريخ الموافقة: 18.10.2023).

لتأسيس نموذج زينوغرافت GBM، تم تعليق خلايا A172 (4 × 106 خلايا/مل) في وسط خال من المصل، وتم حقن 0.1 مل تحت الجلد في الجانب الأيمن لكل فأر. تم توزيع الحيوانات عشوائيا إما إلى مجموعة ضابطة أو مجموعة علاج CUM (عدد = 5 لكل مجموعة). تلقت مجموعة CUM 60 ملغ/كجم كوركمين يوميا عبر التمهيد الفموي، بينما تلقت مجموعة الضابطة كمية مماثلة من المحلول الملحي. تم تسجيل أقطار الأورام كل 7 أيام باستخدام جهاز فيرنييه، وتم حساب حجم الورم باستخدام الصيغة 1/2 طول × × عرض2 (مم3). بعد 5 أسابيع، تم القتل الرحيم للفئران بسبب خلع عنق الرقب، وتم جمع الأورام تحت ظروف معقمة لقياس الوزن32.

اختبار تونيل
تم تثبيت أنسجة الورم في بارافورمالديهيد بنسبة 4٪ لمدة 24 ساعة، وجففت بالإيثانول، وغرست في البارافين، وقطعت بسماكة ميكرومتر. تم إزالة الشمع من الأقسام وإعادة ترطيبها، وشطفها ب PBS، وعالجت ببروتيناز K لمدة 50 دقيقة لاسترجاع المستضد، وحضنتها ببيروكسيد الهيدروجين بنسبة 3٪. تم تطبيق خليط تفاعل TUNEL لمدة ساعة واحدة، تلاها تركيب كاشف مضاد للتلاشي. تم التقاط صور الفلورة بواسطة المجهر، وتم قياس خلايا TUNEL الموجبة في كل حقل باستخدام برنامج ImageJ.

الكيمياء المناعية النسية
تم خبز أقسام الأورام المدمجة بالبارافين عند 6 درجات مئوية، وإزالة الشمع من الزيلين، وإعادة ترطيبها عبر سلسلة إيثانول متدرجة. تم استرجاع المستضدات باستخدام مخزن EDTA الساخن، تلاه تقييد نشاط البيروكسيداز الداخلي. تم حضن الشرائح بجسم مضاد أولي مضاد Ki-67 خلال الليل عند درجة مئوية. بعد الحضانة مع جسم مضاد ثانوي لمدة 20 دقيقة، تم صبغ الأقسام بديامينوبينزيدين (DAB) لمدة 5 دقائق ثم صبغت بالهيماتوكسيلين معاكس. بعد الجفاف وتركيبه على الراتنج المحايد، تم تصوير الشرائح تحت المجهر. تم تحديد التلوين الإيجابي بواسطة ترسيب بني مائل إلى الأصفر، وتم قياس خلايا Ki-67 الموجبة باستخدام ImageJ27.

صبغة الفلورة بديهيدروإيثيديوم (DHE)
تم تقييم مستويات ROS باستخدام صبغة فلورية DHE. تم شطف أقسام الأنسجة الورمية المجمدة باستخدام PBS. تم إخماد فلورة الخلفية، وأضيف ميكرومولار DHE لكل قسم لمدة 3 دقائق. بعد غسل PBS، تم إغلاق الأجزاء في الظلام. تمت ملاحظة الفلورة باستخدام المجهر (الإثارة/الانبعاث: 518/605 نانومتر)، وتم جمع خمس صور عشوائية لكل مجموعة. تم استخدام ImageJ لقياس مستويات ROS.

اكتشاف المحتوى Cu2+
تم تقييم تركيز Cu2+ في خلايا GBM وأنسجة الأورام باستخدام مجموعة كشف لونية. تم جمع خلايا A172 وU251 بعد المعالجة وطرد مركزها على حرارة 1,500 × جرام لمدة 10 دقائق عند درجة مئوية. تم إعادة تعليق حبيبات الخلايا في 0. مل من الماء المقطر، تم تحويله على الثلج، ثم تم تركيبه بالطرد المركزي مرة أخرى. تم تجانس أنسجة الورم في ماء مقطر وتم طرد مركزها بالمثل عند 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق. تم نقل المواد الفائقة (1 ميكرولتر) إلى صفيحة تحتوي على 96 بئرا، وخلطت مع 23 ميكرولتر من المادة الكروموجينية، وأغلقت، وحضنتها لمدة 5 دقائق. تم قياس الكثافة البصرية (OD) عند 58 نانومتر باستخدام قارئ ميكرولوبلايت، وتم حساب مستويات Cu2+ بمقدار 14.

ويسترن بلوت (WB)
تم عزل البروتينات من الخلايا المزروعة وأنسجة الورم. تم الحصول على المواد الفائقة عن طريق الطرد المركزي عند 12,000 × جرام لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية، وتم قياس تركيزات البروتين باستخدام اختبار BCA. بعد إزالة الطعم، تم فصل العينات بواسطة SDS-PAGE، ونقلها إلى أغشية PVDF، وحجبها بحليب خالي الدسم بنسبة 5٪ لمدة ساعة واحدة. تم غسل الأغشية في TBST وحضانتها طوال الليل عند درجة مئوية مع الأجسام المضادة الأولية ضد FDX1، LIAS، DLAT، DLD، AKT، p-AKT، Wnt3a، GSK-3β، p-GSK-3β، β-كاتينين، p-β-كاتينين، و β-أكتين (انظر جدول المواد)14،33. بعد غسلات إضافية من TBST، تم حضن الأغشية بأجسام مضادة ثانوية متقاربة ب HRP لمدة ساعة واحدة، تم تطويرها باستخدام كاشف ECL، وتم رؤيتها بواسطة التلوين الكيميائي. تم استخدام برنامج ImageJ لقياس شدة الإشارة باستخدام أداة اختيار المستطيل ودالة تحليل الجل . تم حساب التعبير البروتيني النسبي كنسبة قيمة الرمادي للشريط المستهدف إلى الضابط الداخلي (GAPDH). تم تحضير المستخلصات النووية من خلايا A172 وU251 باستخدام مجموعة استخراج البروتين النووي. تم تقييم تعبير β-كاتينين ولامين B1، حيث خدم لامين B1 كوحدة تحكم في التحميل النووي34.

التحليل الإحصائي
تعكس النتائج الكمية متوسط ثلاثة نسخ مستقلة. تم تقييم جميع البيانات من حيث التوزيع الطبيعي وتجانس التباين. تم استخدام اختبار ANOVA أحادي الاتجاه تلاه اختبار توكي بعد الاختبار للمقارنات عبر عدة مجموعات. تعرض البيانات كمتوسط ± انحراف معياري (SD). تم اعتبار قيمة P أقل من 0.05 ذات دلالة إحصائية. تم استخدام هذه الإجراءات لضمان متانة البيانات ودعم موثوقية الاستنتاجات.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

تثبيط قدرة خلايا GBM على البقاء وموت الخلايا المستحث
أولا، لم يكن هناك تغيير كبير في فعالية خلايا NHA بعد 2 ساعة و48 ساعة و72 ساعة من تدخل CUM (الشكل 2A)، مما يشير إلى أن تركيزات CUM المستخدمة لم يكن لها تأثير سام على الخلايا الطبيعية. على النقيض من ذلك، انخفضت بقاء خطوط خلايا GBM (A172، U251، LN229، وSHG-44) بشكل ملحوظ عند تركيزات CUM ≥ 1 ميكرومولار (P < 0.05-0.001) (الشكل 2B-E). استنادا إلى هذه النتائج، ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يرتبط معدل تكرار GBM بخصائصه البيولوجية الخبيثة36. يمارس CUM تأثيرات مضادة ل GBM من خلال تنظيم الإجهاد التأكسدي، والموت المبرمج، والالتهام الذاتي، والنقائل، والغزو، والأهداف الجزيئية الرئيسية37. في هذه الدراسة، أظهرت التجارب على المستوى الخلوي أن CUM زاد بشكل كبير من وفيات خلايا GBM وأعيق التكاثر، وتكوين المستعمرات، والهجرة، والغزو — نتائج تتوافق مع التقاريرالسابقة 20.

يرتبط النحاس بتقدم أ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يعلن المؤلفون أنهم لا يملكون تضارب مصالح.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
محلول صبغة بنفسجي بلوري بنسبة 0.1٪سيرفيسبيوG1014خلايا الوسم
4٪ بارافورمالديهيدبيوتايمP0099تثبيت الخلايا أو الأنسجة
مثبط AKT (MK-2206)Selleck.cn، شنغهاي، الصينS1078مثبط AKT محدد
الأجسام المضادة (الأجسام المضادة الأولية والثانوية)ABclonal Technology، ووهان، الصين / abcam، كامبريدج، المملكة المتحدة / سيرفيسبيو، ووهان، الصين / بيوتايم، شنغهاي، الصين / الإشارات الخلية، دانفرز، ماساتشوستس، الولايات المتحدة الأمريكيةA8814، ab32572، GB25303، ab15580، ab108257، ab246917، A8814، AF6708، AA326، 4060، ab219412، 280376، 9322، ab97051، ab229025اكتشاف مستويات تعبير البروتين
مجموعة كشف الخلايا المبرمجةسيرفيسبيو، ووهان، الصينG1021اكتشاف الموت المبرمج
صبغة CFSE لأثر الخلاياإنفيتروجين، كارلسباد، كاليفورنيا، الولايات المتحدة الأمريكيةC34570كشف تكاثر الخلايا
نظام تصوير الإضاءة الكيميائيةبيو-راد، هيركوليس، كاليفورنيا، الولايات المتحدة الأمريكيةChemi Doc XRS+الكشف عن البروتين بحساسية فائقة الحساسية
مجموعة اختبار الألوان Cu2+إلابساينس، ووهان، الصينE-BC-K300-Mاكتشاف محتوى Cu2+ في أنسجة الورم وخلايا GBM
CuCl2سيغما-ألدريتش، دارمشتات، ألمانيا751944محفز الكوكبروبتوس
الكركمين (CUM)ورقة مصدر شنغهاي، شنغهاي، الصينS19245المركب متعدد الفينول
مجموعة كشف DHEبيوتايم، شنغهاي، الصينS0063اكتشاف مستويات ROS
كبريتات ثنائي ميثيل (DMSO)سيرفيسبيوG4101-2مذيب لاختبار MTT
مطور ECLسيرفيسبيوG2161يستخدم في البقعة الغربية
إليسكومولSelleck.cnS1052محفز الكوكبروبتوس
قياس التدفق الخلويبي دي للعلوم الحيوية، نيوجيرسي، الولايات المتحدة الأمريكيةبي دي فاكسالريا IIIيستخدم في اختبارات موت الخلايا وCFSE
مجهر الفلورةأوليمبوس، طوكيو، اليابانIX73يستخدم في اختبارات التألق المناعي، وROS، وTUNEL، وDHE، وMMP
خطوط الخلايا الورم الأرومي الدبقي A172 (RRID: CVCL_0131)، U251 (RRID: CVCL_0021)، LN229 (RRID: CVCL_0393) و SHG-44 (RRID: CVCL_6902)شركة بونوساي للتكنولوجيا الحيوية المحدودة، ووهان، الصينCL-0012، CL-0237، CL-0578، CL-0207خطوط الخلايا الورم الأرومي الدبقي البشري
برنامج GraphPad Prism 9.0جراف باد سوفتوير ذ.م.مالإصدار 9.0التحليل الإحصائي
برنامج ImageJ 1.53kالمعهد الوطني للصحة النفسيةالإصدار 1.53kالحساب الإحصائي
حل JC-1 العاملسولاربيو، بكين، الصينM8650اكتشاف MMP
ذكر فئران BALB/c عاريةشركة سلاك كينغدا لابراتير للحيوانات، هونان، الصينتجربة الفأر
قارئ الميكروبليتبايو-تيك، فيرمونت، الولايات المتحدة الأمريكيةELX-800لقياس قيمة OD450 نانومتر
المجهرأوليمبوسBX53يستخدم في اختبار خدش الخلية، وتجربة ترانسويل، واختبارات الكيمياء المناعية
مسبار ميتوسوكسثيرمو فيشر ساينتفيك، والثام، ماساتشوستس، الولايات المتحدة الأمريكيةM36008يستخدم لاكتشاف ROS
مايتوتراكر ريد CMXRosثيرمو فيشر العلميM7512الوسم المحدد للميتوكوندريا في الخلايا الحية
مجموعة كشف MTTسيرفيسبيوG4101-1اكتشاف قابلية الخلية للبقاء
الخلايا الطبيعية للدماغ النجمية (RRID:CVCL_B0DK)شركة هواتو للتكنولوجيا الحيوية المحدودة، شنتشن، الصينHTX2408خط الخلية لتجارب التحكم
مجموعة استخراج البروتين النوويبيوتايمP0027استخراج البروتين النووي
محلل استقلاب طاقة خلايا فرس البحرأجيلينت،   بكين، الصينسي هورس XFيستخدم لاكتشاف التعرف على الحروف الواضحة
مجموعة تقرير TCF/LEF1 من لوسيفيرازشركة Biolab Technology Co., Ltd، بكين، الصيناكتشاف نشاط مسار إشارة Wnt/β-catenin
مجموعة كشف TUNELبيوتايمC1088اكتشاف الاستماتة المبرمجة في أنسجة الأورام
مثبط Wnt (LGK974)Selleck.cnS7143مثبط Wnt المحدد

المراجع

  1. Weller, M., et al. Glioma. Nat Rev Dis Primers. 10 (1), 33(2024).
  2. Liang, R., Xiang, Y., Hu, C., Tang, X. Expression and clinical significance of RBBP4 gene in lower-grade glioma: an integrative analysis. Biochem Biophys Rep. 35, 101533(2023).
  3. Sahoo, O. S., Mitra, R., Nagaiah, N. K. H. The hidden architects of glioblastoma multiforme: glioma stem cells. 3 (1), 66(2024).
  4. Schaff, L. R., Mellinghoff, I. K. Glioblastoma and other primary brain malignancies in adults: a review. JAMA. 329 (7), 574-587 (2023).
  5. Singh, D. Nanocage-tethered polymeric hybridome for pDNA delivery: a revolutionary approach for treatment of glioblastoma. J Can Biomol Therap. 2 (1), 133-144 (2025).
  6. van den Bent, M. J., et al. Primary brain tumours in adults. Lancet. 402 (10412), 1564-1579 (2023).
  7. Zhou, Y., Shi, F., Zhu, J., Yuan, Y. An update on the clinical trial research of immunotherapy for glioblastoma. Front Immunol. 16, 1582296(2025).
  8. Ravuluri, J. A. V., et al. Brain-targeted nano-architectures for efficient drug delivery and sensitization in glioblastoma. Curr Pharm Des. 29 (22), 1775-1790 (2023).
  9. LeBlanc, V. G., et al. Single-cell landscapes of primary glioblastomas and matched explants and cell lines show variable retention of inter- and intratumor heterogeneity. Cancer Cell. 40 (4), 379-392.e9 (2022).
  10. Zhang, Y., et al. Single-cell RNA sequencing identifies critical transcription factors of tumor cell invasion induced by hypoxia microenvironment in glioblastoma. Theranostics. 13 (11), 3744-3760 (2023).
  11. Jiang, Y., Huo, Z., Qi, X., Zuo, T., Wu, Z. Copper-induced tumor cell death mechanisms and antitumor theragnostic applications of copper complexes. Nanomedicine (Lond). 17 (5), 303-324 (2022).
  12. Tsvetkov, P., et al. Copper induces cell death by targeting lipoylated TCA cycle proteins. Science. 375 (6586), 1254-1261 (2022).
  13. Meena, R., Sahoo, S. S., Sunil, A., Manna, D. Cuproptosis: a copper-mediated programmed cell death. Chem Asian J. 20 (4), e202400934(2025).
  14. Jin, Y., et al. Baicalein enhances cisplatin sensitivity in cervical cancer cells by promoting cuproptosis through the Akt pathway. Biomed Pharmacother. 179, 117415(2024).
  15. Ning, S., et al. Type-I AIE photosensitizer loaded biomimetic system boosting cuproptosis to inhibit breast cancer metastasis and rechallenge. ACS Nano. 17 (11), 10206-10217 (2023).
  16. Chen, Y., Zhang, J., Zheng, W., Xu, H. Cuproptosis-related lncRNAs and genes: potential markers for glioblastoma prognosis and treatment. PLoS One. 20 (2), e0315927(2025).
  17. Huang, Q. -X., et al. Metal-organic framework nanoagent induces cuproptosis for effective immunotherapy of malignant glioblastoma. Nano Today. 51, 10911(2023).
  18. Mohamadian, M., Ahmadi, S. S., Bahrami, A., Ferns, G. A. Review on the therapeutic potential of curcumin and its derivatives on glioma biology. Neurochem Res. 47 (10), 2936-2953 (2022).
  19. Zoi, V., et al. Curcumin and radiotherapy exert synergistic anti-glioma effect in vitro. Biomedicines. 9 (11), 1562(2021).
  20. Wong, S. C., Kamarudin, M. N. A., Naidu, R. Anticancer mechanism of curcumin on human glioblastoma. Nutrients. 13 (3), 950(2021).
  21. Sun, X., et al. Protective effect of curcumin on hepatolenticular degeneration through copper excretion and inhibition of ferroptosis. Phytomedicine. 113, 154539(2023).
  22. Xiang, B., et al. Curcumin ameliorates copper-induced neurotoxicity through inhibiting oxidative stress and mitochondrial apoptosis in SH-SY5Y cells. Neurochem Res. 46 (2), 367-378 (2021).
  23. Wang, Z., et al. Curcumin suppresses glioblastoma cell proliferation by p-AKT/mTOR pathway and increases the PTEN expression. Arch Biochem Biophys. 689, 108412(2020).
  24. Jia, F., et al. Matrix metallopeptidase 2-responsive curcumin-loaded nanoparticles-induced signal transducer and activator of transcription 3 inhibition suppresses glioblastoma multiforme growth via enhancing nuclear factor erythroid 2-related factor 2 activity. Int J Biol Macromol. 307 (Pt 2), 141998(2025).
  25. Su, X., Chen, S., Lu, H., Li, H., Qin, C. Study on the inhibitory effect of curcumin on GBM and its potential mechanism. Drug Des Devel Ther. 15, 2769-2781 (2021).
  26. Bhagat, N., et al. Self-assembled systems for nose-to-brain delivery of temozolomide in brain tumor therapy. Int J Pharm. 675, 125540(2025).
  27. Mohajerani, F., et al. CLEC19A overexpression inhibits tumor cell proliferation and migration and promotes apoptosis concomitant suppression of PI3K/AKT/NF-κB signaling pathway in glioblastoma multiforme. BMC Cancer. 24 (1), 19(2024).
  28. Li, Z., et al. MELK promotes HCC carcinogenesis through modulating cuproptosis-related gene DLAT-mediated mitochondrial function. Cell Death Dis. 14 (11), 733(2023).
  29. Lin, S., Wu, B., Hu, X., Lu, H. Sirtuin 4 downregulation contributes to chondrocyte senescence and osteoarthritis via mediating mitochondrial dysfunction. Int J Biol Sci. 20 (4), 1256-1278 (2024).
  30. Wang, W., et al. Ferroptosis inducers enhanced cuproptosis induced by copper ionophores in primary liver cancer. J Exp Clin Cancer Res. 42 (1), 142(2023).
  31. Wagstaff, M., et al. β-Catenin interacts with canonical RBPs including MSI2 to associate with a Wnt signalling mRNA network in myeloid leukaemia cells. Oncogene. 44 (29), 2490-2503 (2025).
  32. Liao, C. L., et al. Tetrandrine suppresses human brain glioblastoma GBM 8401/luc2 cell-xenografted subcutaneous tumors in nude mice in vivo. Molecules. 26 (23), 7105(2021).
  33. Huo, S., et al. ATF3/SPI1/SLC31A1 signaling promotes cuproptosis induced by advanced glycosylation end products in diabetic myocardial injury. Int J Mol Sci. 24 (2), 1667(2023).
  34. Zhang, Z., et al. Maresin1 suppresses high-glucose-induced ferroptosis in osteoblasts via NRF2 activation in type 2 diabetic osteoporosis. Cells. 11 (16), 2560(2022).
  35. Wang, H., et al. Targeting Wnt/β-catenin signaling exacerbates ferroptosis and increases the efficacy of melanoma immunotherapy via the regulation of MITF. Cells. 11 (22), 3580(2022).
  36. Liu, Y., et al. DNA aptamer S11e recognizes fibrosarcoma and acts as a tumor suppressor. Bioact Mater. 12, 278-291 (2022).
  37. Walker, B. C., Mittal, S. Antitumor activity of curcumin in glioblastoma. Int J Mol Sci. 21 (24), 9435(2020).
  38. Zhang, B., Xie, L., Liu, J., Liu, A., He, M. Construction and validation of a cuproptosis-related prognostic model for glioblastoma. Front Immunol. 14, 1082974(2023).
  39. Liu, Z., Ma, H., Lai, Z. The role of ferroptosis and cuproptosis in curcumin against hepatocellular carcinoma. Molecules. 28 (4), 1623(2023).
  40. Tian, Z., Jiang, S., Zhou, J., Zhang, W. Copper homeostasis and cuproptosis in mitochondria. Life Sci. 334, 122223(2023).
  41. Prasad Panda, S., Kesharwani, A. Micronutrients/miRs/ATP networking in mitochondria: clinical intervention with ferroptosis, cuproptosis, and calcium burden. Mitochondrion. 71, 1-16 (2023).
  42. Peng, Y., Wang, Y., Zhou, C., Mei, W., Zeng, C. PI3K/Akt/mTOR pathway and its role in cancer therapeutics: are we making headway. Front Oncol. 12, 819128(2022).
  43. Precilla, D. S., et al. Wnt/β-catenin antagonists: exploring new avenues to trigger old drugs in alleviating glioblastoma multiforme. Curr Mol Pharmacol. 15 (2), 338-360 (2022).
  44. Li, C., Yang, J., Wang, W., Li, R. LHPP exerts a tumor-inhibiting role in glioblastoma via the downregulation of Akt and Wnt/β-catenin signaling. J Bioenerg Biomembr. 53 (1), 61-71 (2021).
  45. Liu, Y. T., et al. Dysregulated Wnt/β-catenin signaling confers resistance to cuproptosis in cancer cells. Cell Death Differ. 31 (11), 1452-1466 (2024).
  46. Yu, W., et al. Investigation of cuproptosis regulator-mediated modification patterns and SLC30A7 function in GBM. Aging (Albany NY). 16 (4), 3554-3582 (2024).
  47. Afshari, A. R., et al. Anti-tumor effects of curcuminoids in glioblastoma multiforme: an updated literature review. Curr Med Chem. 28 (39), 8116-8138 (2021).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

AKT Wnt

تم نشر هذه المقالة

الفيديو قريباً

تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.