Research Article

تصور التحريض الكهربائي المعتمد على العمر للخلايا الجذعية المشتقة من الدهون البشرية تحت الحقول الكهربائية التيار المستمر

DOI:

10.3791/69666

⸱

December 19th, 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Plastic Surgery, The First Affiliated Hospital of China Medical University, 2Department of Dermatology, Institute for Regenerative Cures, University of California, Davis, 3Department of Ophthalmology and Vision Science, Institute for Regenerative Cures, University of California, Davis

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في مجموعة صغيرة من المتبرعات، قلل التقدم في العمر من الهجرة الكهربائية التكتيكية لمتلازمات hADSC. غير DCEF التعبير الجيني (747 للأعلى، 624 للأسفل)، مما أثرى مصطلحات نقل الصوديوم/قنوات GO ومسارات PI3K-Akt KEGG، مما يشير إلى تورط في التحريض الكهربائي المرتبط بالعمر، دون إثبات السببية.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تعد الخلايا الجذعية المشتقة من الدهون البشرية (hADSCs) محورية لتجديد الأنسجة وشفاء الجروح، ويعد هجرتها الموجهة شرطا أساسيا لتحقيق هذه التأثيرات العلاجية. الحقول الكهربائية (EFs) معروفة جيدا كمؤشرات رئيسية توجه هجرة الخلايا أثناء إصلاح الجرح، ومع ذلك فإن السلوك الكهربائي التكتيكي لوحدات hADSC - خاصة كيف تنظم خصائص المتبرع (مثل العمر) هذا السلوك وآلياته الجزيئية الأساسية - لا يزال غير مفهوم جيدا. تحد هذه الفجوة المعرفية من التطبيق الأمثل لأنظمة hADSCs في الطب التجديدي. في هذه الدراسة، قمنا أولا بالتحقق من وجود الكهروتاكسيس في hADSCs وأكدنا اعتماده على الجهد: تحت الحقول الكهربائية للتيار المستمر (DCEFs) التي تتراوح بين 100-200 mV/mm، هاجرت hADSCs اتجاهيا نحو الأنود، مع شدة EF أقوى تعزز اتجاه الهجرة والسرعة (مقارنة بالتحكم عند 0 mV/mm). ثم قارنا hADSCs من متبرعات شابات (27.00 ± 4.58 سنة) والمتبرعات الإناث المسنات (62.33 ± 4.04 سنة) باستخدام تسلسل الحمض النووي الريبي (RNA-seq) بعد تحفيز DCEF بمقدار 200 mV/mm. حدد تحليل النسخ 747 جينا مرتفعا و624 جينا منخفضا في hADSCs المسنين، مع جينات معبر عنها بشكل تفاضلي (DEGs) غنية بعمليات ومسارات حيوية للتحريض الكهربائي - بما في ذلك نقل أغشاء أيونات الصوديوم، ونشاط قناة الصوديوم المجهدة (مصطلحات GO)، ومسار إشارات PI3K-Akt (مسار KEGG). وظيفيا، أظهر hADSCs المسنين انخفاضا كبيرا في هجرة الأنودالز (انخفاض المسافة المتراكمة، والمسافة الإقليدية، والمباشرة) مقارنة ب hADSCs الشباب تحت تحفيز DCEF. تقدم هذه الدراسة أول دليل على الإكساب الكهربائية المعتمدة على العمر في hADSCs، مما يثبت أن عمر المتبرع يرتبط بضعف القدرة الكهربائية. كما يكشف أن نشاط قنوات الصوديوم غير المنظم وإشارات PI3K-Akt قد يكونان وراء هذا الانخفاض المرتبط بالعمر. تشير هذه النتائج إلى الآليات التنظيمية المحتملة لتحريك hADSC الكهربائي وتقدم رؤى جديدة لتخصيص العلاجات القائمة على hADSC (مثل اختيار المتبرعين المثليين أو استهداف مسارات الصوديوم/PI3K-Akt) لتحسين تجديد الأنسجة ونتائج شفاء الجروح.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمتلك الخلايا الجذعية المشتقة من الدهون (ADSC) قدرة قوية على التجدد الذاتي وإمكانات تجددية كبيرة. في ظروف الحث المناسبة، يمكن أن تتمايز إلى أسطوانيات عظمية، خلايا غضروفية، وخلايا دهنية، من بينأمور أخرى: 1. من خلال الإشارات الباراكرينية، يمكن ل ADSC أيضا دعم تكوين الأوعية الدموية والأوعية اللمفاوية2،3، ومنع تكوين الندبات4، وإظهار تأثيرات مناعية تنظيمية5. لذلك، يعتبر ADSC خلية بذور مثالية للعلاجات القائمة على الخلايا في الطب التجديدي.

تتأثر وظيفة ADSC بخصائص مختلفة للمتبرع، والتي قد تؤثر على فعاليتها المحتملة في العلاجات الخلوية، بما في ذلك عمر المتبرع، ومؤشر كتلة الجسم، والجنس،وغيرها. يظهر ADSC المستخرج من متبرعين أكبر سنا خصائص تقدم عمر أكثر وضوحا، مع انخفاض في قدرة التمايز الديني الخلقي، وإمكانات التمايز العظامي، والقدرة على الهجرة 7,8,9. علاوة على ذلك، فإن القدرة على تعزيز تكاثر خلايا الكيراتينويين وتحفيز آليات الإصلاح الذاتي في الجسم تقل.

الهجرة الموجهة بالخلايا هي آلية فسيولوجية رئيسية في شفاء الجروح وتجدد الأنسجة، حيث تلعب الحقول الكهربائية (EFs) دورا مهما في توجيه هجرة الخلايا وتعزيز إصلاح الجرح11. على سبيل المثال، عندما يتضرر الحاجز الظلائي، تتولد حقول كهربائية داخلية فورا وتستمر حتى يلتئم الجرحوتستعاد وظيفة الحاجز الطلائي. باعتبارها واحدة من الإشارات التي توجه هجرة الخلايا الموجهة، فقد ثبت أن الإشارات الكهربائية لها أولوية أعلى من الإشارات الأخرى المتواجدة، مثل تثبيط التلامس، والقوى الميكانيكية، والعوامل الكيميائية15,16. تم تطوير عدة طرق لتعزيز شفاء الجروح وتجديد الأنسجة، مثل الأدوية وأجهزة التحفيز الكهربائي الخارجية التي تعزز أو تحاكي الحقول الكهربائية الداخلية في جسم الإنسان17,18. قدرة الخلايا على الهجرة وفقا لتدرج المجال الكهربائي تعرف باسم الإلكتروكسيس. أظهرت الدراسات المختبرية أن العديد من أنواع الخلايا المختلفة قادرة على الهجرة الموجهة في الحقول الكهربائية. تهاجر بعض الخلايا نحو الأنود، مثل خلايا القمة العصبية القحفية في الثدييات، والخلايا النجمية البشرية، وخلايا سرطان الثدي البشرية 19,20,21. تنتقل خلايا أخرى نحو الكاثود، مثل خلايا الظهارة الأنبوبية الكلوية البشرية، والأرومات الليفية الجلدية البشرية، والعدلات البشرية22، 23، 24. يمكن توجيه ADSC للهجرة نحو الأنود في الحقول الكهربائية للتيار المستمر (DC)، وتحت ظروف الزراعة المطولة، أظهر التيار الكهربائي النبضي الخارجي فعالا أنه يعزز الهجرة الاتجاهية ل ADSC نحو الأنود مع الحفاظ على حيوية الخلية25. حتى الآن، لا تزال الدراسات حول خصائص التوك الكهربائي للخلايا الجذعية المشتقة من الدهون البشرية نادرة، ولا تزال الآليات الأساسية التي تنظم سلوكها الكهربائي غير مفهومة بالكامل.

نحن أول من يحقق بشكل منهجي في الفروق الكهربائية التكتيكية المعتمدة على العمر بين المتبرعات الشابات والإناث المسنات تحت الحقول الكهربائية ذات التيار المستمر التدرج (DCEF)، وللكشف بشكل أكبر عن الآليات الأساسية (المتعلقة بنشاط قناة الصوديوم وإشارات PI3K-Akt) باستخدام التحليل الترانسكريبتوميك. في هذه الدراسة، درسنا تأثيرات DCEF على hADSCs. باستخدام تسلسل الحمض النووي الريبي وتحليل الإثراء الجيني التفريقي، قارنا ملفات التعبير الجيني بين مجموعتين من hADSC مشتقة من متبرعات شابات ومسنات بعد تحفيز DCEF لتحديد الفروق النسخية المرتبطة بالعمر. افترضنا أن شيخوخة المتبرعين تؤثر على الاستجابة الكهربائية لمتلازمات hADSC، وأن هذا الانخفاض المرتبط بالعمر مرتبط بتغير نشاط قناة الصوديوم وإشارات PI3K-Akt.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم الحصول على موافقة مستنيرة من جميع المشاركين قبل جمع الأنسجة. تمت الموافقة على هذه الدراسة من قبل لجنة الأخلاقيات في أول مستشفى تابع لجامعة الصين الطبية (رقم الموافقة: [2018]2018-110-2). تم الحصول على موافقة مكتوبة ومستنيرة من جميع المشاركين قبل جمع الأنسجة

عزل وثقافة hADSC
جمع الأنسجة: تم الحصول على عينات من أنسجة دهون البطن البشرية خلال إجراءات شفط دهون اختيارية روتينية أجريت في قسم جراحة التجميل في المستشفى الأول التابع لجامعة الصين الطبية. جميع المتبرعات كن من النساء السليمات المتطوعات الخضعن لعملية شفط الدهون البطني التجميلي، ولم تجر أي تدخلات جراحية إضافية لأغراض البحث. تم جمع عينات الأنسجة من قبل الجراح الجراحي تحت ظروف معقمة مباشرة بعد الشفط ونقلها إلى المختبر في حاويات معقمة على الثلج خلال 30 دقيقة.

حجم العينة: تم تضمين 6 متبرعين في هذه الدراسة، يتألفون من 3 متبرعين أصغر سنا (العمر: 27.00 ± 4.58 سنة) و3 متبرعين أكبر سنا (العمر: 62.33 ± 4.04 سنوات).

معالجة الأنسجة: انقل شظايا الأنسجة الدهنية إلى أنبوب مخروطي بحجم 50 مل، والطرد المركزي عند 1800 × جرام لمدة 3 دقائق عند 4 درجات مئوية، واسحب الطور العلوي للزيت بعناية (لإزالة الدهون الزائدة). أضف 0.2٪ كولاجناز النوع الرابع (الحجم النهائي: 5-10 مل لكل 1 جرام من نسيج دهني) إلى حبيبة الأنسجة، ثم ضع الأنبوب في حمام ماء أو حاضنة بدرجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة. حرك الأنبوب بلطف كل 10-15 دقيقة أثناء الهضم لضمان تلامس موحد بين الكولاجناز والأنسجة. بعد الهضم، أنهي التفاعل بإضافة DMEM منخفض الجلوكوز مع 10٪ FBS و1٪ بنسلين/ستريبتوميسين (نسبة حجم وسط المعادلة إلى محلول الكولاجيناز = 1:1).

تحذير: عند التعامل مع الكولاجناز، ارتد قفازات ذات استخدام مرة واحدة، ومعطف مختبر، ونظارات أمان لتجنب التواصل مع الجلد والعين، حضر واستخدم المادة في خزانة أمان بيولوجية (BSC) لمنع تلوث الهباء الجوي، وفي حالة التسرب، قم بمسح المواد فورا بنسبة 75٪ إيثانول والتخلص من المواد الملوثة كنفايات بيولوجية.

عزل الخلايا: قم بعمل الطرد المركزي لخليط الهضم المعادل بحرارة 1200 × جرام لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية لتسخين الخلايا. تخلص من السوبرناتينت، ثم أعد تعليق الحبيبة في مخزن تحلل كريات الدم الحمراء (155 ملليموتر NH₄Cl، 10 ململ KHCO₃، 0.1 ملليمولار EDTA؛ الرقم الهيدروجيني 7.4؛ الحجم: 2-3 مل لكل حبيبة) وحضن في درجة حرارة الغرفة (22-25 درجة مئوية) لمدة 5 دقائق لتحليل الخلايا الحمراء المتبقية. قم بترشيح تعليق الخلية بشكل متسلسل عبر مصفاة بحجم 200 ميكرومتر لإزالة بقايا الأنسجة غير المهضومة والحصول على تعليق خلوي واحد.

عد الخلايا: قبل التلقيح، تم قياس أعداد الخلايا باستخدام جهاز قياس الدم الخلوي. لفترة وجيزة، تم فصل hADSCs مع 0.25٪ تريبسين-إيدتا، وأعيد تعليقها في وسط النمو، وخلطت بنسبة 1:1 مع محلول أزرق تربان بنسبة 0.4٪. تم عد الخلايا الحية (غير المصبوغة) يدويا باستخدام مقياس الدم النويباور تحت المجهر الضوئي، وتم حساب إجمالي أعداد الخلايا الصالحة للحياة كالتالي: عدد الخلايا لكل مل = (متوسط الخلايا العد × عامل التخفيف × 104).

زراعة الخلايا: قم بزرع الخلايا المصفاة بكثافة 5 × 103 خلايا/سم2 في وسط النمو (DMEM منخفض الجلوكوز + 10٪ FBS + 1٪ بنسلين/ستربتوميسين) وحضن عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2. استبدل الوسط كل 2-3 أيام لإزالة الخلايا غير الملتصقة والحفاظ على ظروف الزراعة المثالية. جميع hADSCs المستخدمة في التجارب اللاحقة — بما في ذلك توصيف الخلايا (كشف علامات السطح، اختبارات تمايز الثلاثية)، تحفيز DCEF، تحليل الهجرة والشكل، اختبارات الشيخوخة/التكاثر، وتسلسل الحمض النووي الريبي — كانت عند المقطع 3 إلى المقطع 5.

توصيف hADSC
تعبير علامات سطح الخلية: زراعة الخلايا حتى تصل إلى 70٪ من التقاطع، ثم فصل الخلايا الملتصقة بنسبة 0.25٪ تريبسين-إيدتا (حضانة عند 37 درجة مئوية لمدة 3 دقائق). قم بطرد مركزي لتعليق الخلية عند 300 × g لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية، ثم تخلص من السوبرناتان، وأعد تعليق الحبيبات الخلوية بمقدار 1x PBS (الحجم: 1-2 مل). أليكوت 1 ×10 5 خلايا لكل عينة (معلقة في 100 ميكرولتر من 1x PBS) وإضافة أجسام مضادة متقاربة فلورية عند التخفيفات المحددة: مضاد CD44 (1:50)، مضاد CD90 (1:100)، مضاد CD29 (1:50)، مضاد CD73 (1:50)، ومضاد CD105 (1:20)1,4,7. حضن خليط الأجسام المضادة والخلايا عند 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة في الظلام لتجنب تبريد الفلوروفور. بعد الحضانة، يتم استخدام الطرد المركزي عند 1000 × g لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية وسحب المادة الفائقة بالكامل. أعد تعليق الحبيبة في 1-2 مل من 1x PBS، ثم قم بتشغيل الطرد المركزي مرة أخرى عند 1000 x g لمدة 3 دقائق عند 4 درجات مئوية، ثم تخلص من السوبرناتينت، وكرر عملية الغسل مرتين لإزالة الأجسام المضادة غير المربوطة. وأخيرا، أعد تعليق حبيبات الخلية في 200 ميكرولتر من PBS 1x طازج، وجمع بيانات الفلورة باستخدام مقياس تدفق خلوي، وإجراء تحليل كمي باستخدام برنامج FlowJo (v10). اتبع سير عمل البوابات إجراءات التنمذج الظاهري القياسية MSC: بوابة FSC-SSC لاستبعاد الحطام واختيار المجموعة الرئيسية للخلية بناء على الحجم والدقة، تليها استبعاد مزدوج باستخدام مخططات FSC-A مقابل FSC-H ومخططات SSC-A مقابل SSC-H لضمان أحداث خلية واحدة. ثم تم إجراء بوابات الخلايا الحية لاستبعاد الخلايا الميتة الموجبة للتريبان أو PI. تم إجراء بوابة فلورية للعناصر الضابطة التي تم صبغها بلون واحد، وتم استخدام عناصر التحكم غير المصبوغة لتحديد عتبات ل CD29، CD44، CD73، CD90، CD105 (علامات إيجابية)، وCD34، CD45 (علامات سلبية). تم تصدير وتحليل قطع البوابة التمثيلية لتأكيد هوية hADSCs.

جهد التفاضل
التمايز المبكر: احصد hADSCs من جيل P3 عند تلاقي 85٪ باستخدام 0.25٪ تريبسين-EDTA، ثم زرعها في صفائح بئر 24 بئر بكثافة 1 × 10⁵ خلايا لكل بئر (باستخدام وسط DMEM كامل) وحضن عند 37 درجة مئوية مع 5٪CO2 حتى تصل الخلايا إلى 85٪ من التقاء الوحدة مرة أخرى. للتحفيز، استخدم مجموعة تمايز تكوين الدهون، مع إعادة تكوين مكون المجموعة A (محفز Adipogene) والمكون B (حافظ Adipogene) كما هو موضح في الدليل، واستخدم المكون A لأول 3 أيام قبل التحول إلى المكون B لمدة يوم واحد. كرر هذه الدورة لمدة 3 أسابيع. للصبغ، استنشق وسط الحث، واغسل الخلايا بلطف بسعة 3 مل من 1x PBS (تجنب تعطيل طبقات الخلايا)، وثبت الخلايا ب 4٪ بارافورمالديهايد (PFA) في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة، ثم حضن بمحلول زيت أحمر 0.3٪ (معد في 60٪ من الإيزوبروبانول) في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. اغسل الخلايا 3 مرات مع 1x PBS لإزالة البقعة الزائدة، ثم صور قطرات الدهون باستخدام مجهر ضوئي مقلوب (20x).

التمايز العظامي: يتم زرع hADSCs في صفائح بحجم 12 بئر بكثافة 1 × 10⁵ خلية لكل بئر، وعندما تصل الخلايا إلى التقاء بنسبة 85٪، استخدم مجموعة تمايز التجمع العظمي للتحفيز -- إعادة تكوين مكون المجموعة A (محفز العظام) والمكون B (مكمل العظام) في DMEM منخفض الجلوكوز (التركيزات النهائية: 10٪ FBS، 1٪ بنسلين/ستربتومايسين، 0.1 ميكرومولار ديكساميثازون، 10 ملليمولار β-جليسروفوسفات، 0.05 ملليمولار حمض الأسكوربيك-2-فوسفات) وتجديد الوسط كل 3 أيام لمدة 3 أسابيع. للصبغ، ثبت الخلايا ب 4٪ من PFA في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة، ثم اغسله 3 مرات مع 1x PBS، ثم حضن بمحلول أليزارين ريد S بنسبة 2٪ (درجة الحموضة 4.2، معد في ماء منزوع الأيون) في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. اغسل الخلايا 3x مع 1x PBS لإزالة الصبغة غير المرتبطة، ثم صور العقيدات المترسبة بالكالسيوم تحت مجهر تباين الطور (20x) وقم بقياس التمعدن بقياس مساحة العقيدات الحمراء الموجبة S باستخدام برنامج ImageJ.

التمايز الغضروطي: قم بطرد 250,000 جهاز hADSC بقوة 500 × جرام لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية في أنبوب مخروطي بحجم 15 مل لتكوين حبيبة خلية، ثم أضف 500 ميكرولتر من وسط DMEM الكامل إلى الأنبوب، واحتضنه طوال الليل عند حرارة 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربونلتثبيت الحبيبة. في اليوم التالي، استخدم مجموعة التمايز الغضروفية للتحفيز — إعادة تكوين مكون المجموعة A (محفز غضروفي) في وسط مستقل عن CO2 (التركيزات النهائية: 1٪ بنسلين/ستربتومايسين، 10 نانوغرام/ملتر TGF-β3، 50 ميكروغرام/مل حمض الأسكوربيك-2-فوسفات، 100 ميكروغرام/مل بيروفات الصوديوم) وجدد الوسط بلطف كل 3 أيام (تجنب إزعاج الحبيبة). بعد 3 أسابيع من الحث، ثبت حبيبة الخلية ب 4٪ PFA في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة، استنشق المثبت، حضن محلول تولويدين بلو O بنسبة 0.1٪ (مع الفولت) (معد في محلول أسيتات الصوديوم 0.1 متر، درجة حموضة 4.0) في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة، استنشق الصبغة، اشطف الحبيبات ثلاث مرات بماء منزوع الأيونات لإزالة الصبغة الزائدة. ثم يصور تحت مجهر المجال الساطع (20x) ويحدد كمية تراكم البروتيوغليكان الكبريتية عن طريق قياس الكثافة البصرية المتوسطة (OD) لتلوين تولويدين بلو O باستخدام برنامج ImageJ.

تحذير: عند التعامل مع 4٪ PFA (مادة كيميائية سامة ومسببة للتآكل)، استخدم فقط غطاء بخار مع ارتداء قفازات ذات الاستخدام الواحد، ومعطف مختبر، ونظارات أمان لتجنب استنشاق البخار أو ملامسة الجلد والعينين — إذا حدث تلامس، اشطف فورا بالماء الجاري لمدة 15 دقيقة واطلب الرعاية الطبية. للتخلص من النفايات الخطرة، اجمع المواد الملوثة ب PFA وPFA المستخدمة (مثل رؤوس الماصات أو اللوحات) في حاوية نفايات كيميائية مخصصة تحمل علامة PFA Waste وتخلص منها باستخدام بروتوكولات النفايات الخطرة المؤسسية، مع التأكد من عدم اختلاط النفايات البيولوجية.

تجميع غرفة التاكسي الكهربائي: احفر ثقبين (قطرهما 0.75 سم) في طرفي خط الوسط على غطاء صحن بتري بقطر 10 سم، على بعد 1 سم من حافة الطبق (لاستيعاب جسور الأجار-الملح). ضع طبقة رقيقة من شحم التفريغ (≤ طول 2 سم، ≤ 1 سم عرضا) على أسفل طبق بتيري على طول خط المنتصف، على بعد 4 سم من كل حافة (الشكل 1A). باستخدام ملقط معقم ذو طرف دقيق، ضع غطاء زجاجي معقم بحجم 1 سم × 2 سم على كل رقعة شحم، واضغط بلطف لضمان إغلاق محكم (تجنب كسر الغطاء الانزلاقي؛ الشكل 1B-C). ضع طبقة رقيقة أخرى من شحم التفريغ فوق كل غطاء متصل، ثم ضع طبقة زجاجية معقمة ثانية بحجم 1 سم × 2 سم مباشرة على الشحم لتشكيل مكدس مزدوج الغطاء. اضغط بلطف لضمان إغلاق محكم بين الغطائين (لمنع تسرب متوسط؛ الشكل 1D). على طول الخط القطري الذي يربط الزاوية العلوية اليسرى من إحدى المدخنات الغطاء بأقرب حافة للطبق، والزاوية السفلية اليمنى من المدخنة المقابلة بأقرب حافة لها، ضع شحم التفريغ لتشكيل جدار حاجز مستمر. يجب أن يكون الجدار ملتصقا بإحكام بقاع الطبق (بدون فراغات) ويبلغ ارتفاعه حوالي 2 سم وعرضه 0.5 سم (الشكل 1E). قم بتعقيم الغرفة المجمعة تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة 20 دقيقة (للقضاء على التلوث الميكروبي)، ثم خزنها في درجة حرارة الغرفة تحت ظروف معقمة حتى الاستخدام (الشكل 1F).

تحفيز DCEF: ضع شرائح زجاجية معقمة (لزرع الخلايا) في طبق بتري بقطر 10 سم وحضن الألواح طوال الليل عند حرارة 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربونلتحضير الشرائح مسبقا (تعزيز التصاق الخلايا). تحضير محلول شتاينبرغ عن طريق تخفيف 10 مل من محلول مخزون 10 أضعاف في 90 مل من dH2O (معقم؛ التركيزات النهائية: 58 ملليمولار NaCl، 0.67 ملليمولار KCl، 0.44 ملليمولار Ca(NO3)24H2O، 0.83 ملليمولار MgSO47H2O، 10 ملليمول HEPES؛ درجة الحموضة 7.4). أضف 0.3 جرام أجار إلى 20 مل من محلول شتاينبرغ المعد، ثم اغسل الميكروويف لمدة 20 ثانية حتى يذوب الأجار بالكامل ويصبح المحلول شفافا، ثم يملأ فورا جسور الملح الزجاجية المخصصة بخليط الأغار-ستاينبرغ الساخن ودعه يتصلب في درجة حرارة الغرفة. بعد التصلب، تعقيم جسور الملح تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة 15 دقيقة، وتعقيم كأسين (كل منهما يحتوي على 30 مل من محلول شتاينبرغ) تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة 15 دقيقة. يتم حضن hADSCs من جيل P3 على الشرائح المعقمة المهيأة مسبقا بكثافة 2 × 10⁴ خلايا/سم²، وتحتضن عند 37 درجة مئوية مع 5٪CO2 لمدة 24 ساعة للسماح بالالتصاق الخلوي. ثم نقل الشرائح المزروعة بالخلايا إلى مدرج غرفة الإلكتروتاكسيس المجمعة وتثبيتها بشرائح جانبية معقمة (لمنع الحركة). قم بإغلاق المدرج بوضع غطاء زجاجي بحجم 3 سم × 2 سم فوق شحم التفريغ، والضغط بلطف لضمان إغلاق محكم، وتطبيق شحم فراغ إضافي على حواف الانزلاق العلوي لتشكيل حاجز (لمنع التبخر المتوسط). املأ خزانات الغرفة بوسط مستقل عن ثاني أكسيد الكربون2 (مع دعم 10٪ FBS و1٪ بنسلين/ستريبتومايسين؛ الحجم: 5-8 مل لكل خزان)، وأدخل جسور الأجار-ملح المعقم عبر فتحات غطاء صحن بتري (مع غمر أحد الطرفين في خزان الوسط للغرفة والطرف الآخر مغمور في كؤوس ستاينبرغ المملوءة بالمحلل)، وربط الكؤوس بمصدر طاقة عبر أقطاب Ag/AgCl (لتوفير تيار مستمر مستقر). تطبيق مجال كهربائي مستمر (DCEF) بقيمة 2 فولت/سم لمدة 4 ساعات، راقب الجهد كل 15 دقيقة باستخدام مقياس رقمي متعدد (قم بالضبط إذا لزم الأمر للحفاظ على قوة المجال الثابتة)، والتقط صورا تايم لابس لهجرة الخلايا كل 5 دقائق عند 4 حقول عشوائية باستخدام البرنامج (وضع الهدف 5x والمجال الساطع).

ملاحظة: عند استخدام المعدات الكهربائية، تأكد من جفاف مصدر الطاقة والأقطاب الكهربائية ووضعهما على سطح غير موصل لتجنب الصدمات الكهربائية. ارتد قفازات معزولة عند توصيل أو فصل الأقطاب، وأطفئ الطاقة قبل ضبط الإعداد، وفي حال حدوث تسرب وسط على المكونات الكهربائية، أغلق الكهرباء فورا وامسح بورق ماص مشبع بنسبة 75٪ إيثانول. في هذه الدراسة، من خلال تقليل سمك غرفة الرحلان الكهربائي والحفاظ عليها عند حوالي 1 مم، إلى جانب إجراء قياسات جهد متعددة النقاط في كلا طرفي الحجرة، تم التحكم في التغير في شدة المجال ضمن 10٪. في ظل هذه الظروف، يعتبر توزيع المجال الكهربائي داخل منطقة الزراعة في الأساس موحد26.

الهجرة وتحليل الشكل
التصوير الحي: بالنسبة لأجهزة hADSC التي تخضع لتحفيز DCEF، استورد تسلسلات الصور بالتايم لابس (فترات 5 دقائق) إلى برنامج ImageJ، وتتبع 100 خلية يدويا عبر 4 حقول مستقلة من البداية (t=0) حتى نهاية التحفيز (t=4 ساعات) باستخدام إضافة التتبع اليدوي، وحساب متوسط سرعة الهجرة (ميكرومتر/دقيقة) والاتجاه (نسبة D/T، حيث D = مسافة الخط المستقيم من البداية إلى النهاية، T = طول المسار الكلي) باستخدام إضافة Chemotaxis Tool (ImageJ).

التتبع: احسب معلمات الهجرة التالية لقياس السلوك الكهروتكتيكي: الاتجاهية (Σcosθi/n، حيث θi هي الزاوية بين متجه إزاحة الخلية واتجاه المجال الكهربائي (EF)، وn هو إجمالي عدد الخلايا المتتبعة، يتراوح من -1 إلى 1 مع قيم أقرب إلى 1 تشير إلى هجرة أقوى موجهة بالأنود)، المسافة المتراكمة (إجمالي طول المسار الذي تقطعه كل خلية خلال فترة التحفيز، بالميكرومتر)، سرعة المسار (المسافة المتراكمة مقسومة على وقت التحفيز، بالميكرومتر/ساعة)، والمسافة الإقليدية (إزاحة مستقيمة من البداية إلى النهاية لكل خلية، بالميكرومتر، تعكس الهجرة الصافية).

القياس الشكلي: بعد تحفيز DCEF، ثبت الخلايا بنسبة 4٪ PFA في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة، وغسل الهيكل الخلوي ب 1x PBS، وصبغ الهيكل الخلوي ب Phalloidin-TRITC (تخفيف 1:500 في 1x PBS؛ الحجم: 200 ميكرولتر لكل بئر لألواح 24 بئر) في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة (لوضع علامة على F-actin)، ووضع النوى المضادة للصبغ باستخدام DAPI (1 ميكروغرام/مل في 1x PBS؛ الحجم: 100 ميكرولتر لكل بئر) لمدة 5 دقائق. تم تصوير الخلايا باستخدام مجهر فلوري بتكبير 20x (مع صور عالية الدقة ممثلة عند 40x). تم تصوير فالودين-TRITC باستخدام طول موجة إثارة بين 540-555 نانومتر وطول موجة انبعاث 565-580 نانومتر، بينما تم تصوير DAPI باستخدام طول موجة إثارة بين 358-405 نانومتر وطول موجة انبعاث 420-480 نانومتر. ثم قس المعايير الشكلية التالية في ImageJ: المحور الطويل (أقصى قطر لفيريت، أطول مسافة بين أي نقطتين على محيط الخلية)، الطول الرأسي (عرض الخلية العمودي على المحور الطويل)، والعمودية (sinα، حيث α هي الزاوية بين المحور الطويل للخلية واتجاه EF، مع قيم أعلى تشير إلى محاذاة أكبر مع EF).

اختبارات الشيخونة والانتشار
صبغة SA-β-Gal: استخدم مجموعة كشف الشيخوخة لتحديد الخلايا المشوخة (الخلايا المصبوغة باللون الأزرق) تحت مجهر ذو المجال الساطع (هدف 20x). زرع بذور hADSCs من جيل P3 في ألواح بسعة 6 آبار بكثافة 2 × 10خلايا 5 لكل بئر، ثم الزراعة حتى تلاقي بنسبة 80٪، ثم استنشاق الوسط، وغسل الخلايا بلطف 3 مرات مع 1x PBS، وإضافة 1 مل من محلول التثبيت (المرفق في المجموعة) لكل بئر وحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة، وغسل الخلايا 3 مرات مع 1x PBS لإزالة المثبت المتبقي بعد التثبيت. أضف 0.5 مل من محلول التلوين SA-β جالون (يتم تحضيره بخلط 50 ميكرولتر من ركيزة SA-β جالون مع 450 ميكرولتر من محلول التلوين حسب دليل الطقم) لكل بئر، ثم أغلق اللوحة بفيلم شفاف (لمنع التبخر)، واحتضن اللوحة طوال الليل (16-18 ساعة) عند 37 درجة مئوية (تجنب التعرض لثاني أكسيد الكربون2 ، لأنه يغير درجة الحموضة ويثبط نشاط الإنزيم)، التقط صورا ساطعة ل ≥10 حقول عشوائية لكل بئر (10 أضعاف الهدف) في اليوم التالي، وعد عدد الخلايا المصبوغة بالزرق (SA-β-gal+) وإجمالي الخلايا، وحساب نسبة الخلايا المتقدمة في السن ك (عدد خلايا SA-β-gal+ / إجمالي عدد الخلايا) × 100.

صبغة المناعة Ki67
بعد صبغ SA-β-جالون، استنشق محلول التلوين، اغسل الخلايا مرتين مع 1x PBS، نفخ أغشية الخلايا بنسبة 0.1٪ ترايتون X-100 (معد ب 1x PBS؛ 1 مل لكل بئر) في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق، وقم بحجب ارتباط الأجسام المضادة غير النوعية ب 5٪ BSA (في 1x PBS؛ 1 مل لكل بئر) في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة. ثم تم حضن الخلايا بالجسم المضاد الأولي Anti-Ki67 (تخفيف 1:200 في 1٪ BSA/PBS؛ 500 ميكرولتر لكل بئر) عند 4 درجات مئوية طوال الليل. في اليوم التالي، تم غسل الخلايا 3 مرات مع إزالة الجسم المضاد الأولي غير المرتبط ب 1x PBS (5 دقائق لكل منها) وحضنتها بأجسام مضادة ثانوية متقاربة من أليكسا فلور 488 (تخفيف 1:500 في 1٪ BSA/PBS؛ 500 ميكرولتر لكل بئر) في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة في الظلام. تم غسل الخلايا مرة أخرى 3 مرات مع 1x PBS وصبغها بعكاس DAPI (1 ميكروغرام/مل في 1x PBS؛ 200 ميكرولتر لكل بئر) لمدة 5 دقائق. تم التقاط صور الفلورة باستخدام مجهر فلوري بتكبير 20x (مع صور عالية الدقة التمثيلية عند 40x). تم تصور خلايا أليكسا فلور الموسومة ب Ki67+ باستخدام طول موجة إثارة بين 485-495 نانومتر وطول موجة انبعاث بين 515-545 نانومتر، بينما تم تصوير النوى الملونة ب DAPI باستخدام طول موجة إثارة بين 358-405 نانومتر وطول موجة انبعاث بين 420-480 نانومتر. تم حساب نسبة الخلايا التكاثرية كالتالي: (عدد خلايا Ki67+ / عدد نوى DAPI+ ) × 100.

ملاحظة: عند التعامل مع الأجسام المضادة الأولية والثانوية، اعمل في مركز البكالوريوس لمنع التلوث، وتقسيم الأجسام المضادة إلى أحجام للاستخدام الواحد لتجنب تكرار دورات التجمد والذوبان، وجمع المواد الملوثة بالأجسام المضادة (مثل رؤوس الماصات، اللوحات) في كيس مخصص للنفايات البيولوجية القابلة للعمل بالأوكلفا للتعقيم عن طريق التعقيم قبل التخلص منه.

تحليل الإلكتروتاكسي المعتمد على العمر لأجهزة hADSC: استخدم مصدر طاقة نبضي تيار مستمر لتوليد DCEF بثلاث شدات: 0 mV/mm (تحكم)، 100 mV/mm، و200 mV/mm، واستخدم محطة عمل خلايا حية لمراقبة وتسجيل هجرة الخلايا في الوقت الحقيقي، ولكل شدة EF، قارن كمية قدرة الهجرة الأنودية لhADSCs من المتبرعات الشابات والمسنات من خلال قياس المسافة المتراكمة. المسافة الإقليدية، سرعة المسار، والتوجيه، مع ثلاث نسخ بيولوجية مستقلة لكل مجموعة لضمان موثوقية النتيجة. تم قياس معلمات الهجرة الكهربائية باستخدام إضافات أدوات التتبع اليدوي والكيموتاكسي في ImageJ (NIH). تم تتبع الخلايا الفردية يدويا طوال فترة التحفيز التي مدتها 4 ساعات، وتم حساب المعلمات التالية وفقا للطرق القياسية: المسافة المتراكمة: الطول الكلي للمسار الذي تقطعه كل خلية خلال فترة التسجيل. المسافة الإقليدية: المسافة المستقيمة بين موقعي بداية ونهاية الخلية. سرعة المسار: المسافة المتراكمة مقسومة على إجمالي زمن التتبع (ميكرومتر/ساعة). الاتجاه: يحسب كمتوسط جيب تمام الزاوية (θ) بين كل متجه إزاحة ومتجه المجال الكهربائي (تتراوح القيم من -1 إلى 1؛ القيم الأقرب إلى 1 تشير إلى هجرة أنودالي قوية).

تسلسل الحمض النووي الريبي
استخراج وتحضير الحمض النووي الريبي: قم بتعقيم وعاء مملوء بالثلج تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة 15 دقيقة (للحفاظ على استقرار الحمض النووي الريبي) وقم بجميع الخطوات التالية على الجليد. انقل شرائح زجاجية ببذور hADSC (1 سم × 2 سم) من غرفة الإلكتروتاكسيس إلى طبق بتري معقم، اغسل الخلايا 3 مرات مع 3 مل من PBS بارد جدا (أضف PBS بلطف، حرك قليلا، ثم استنشق بالكامل لإزالة الوسط المتبقي)، ثم أضف 1 مل من كاشف ترايزول إلى كل شريحة وحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة لتحليل الخلايا بالكامل (تأكد من أن الليزات يغطي طبقة الخلية بالكامل). انقل المادة الليزات إلى أنبوب طرد مركزي خال من RNase بسعة 1.5 مل، أضف 0.2 مل من الكلوروفورم، ثم الدوامة بقوة لمدة 15 ثانية لتحفيز فصل الطور، ثم حضن الأنبوب على الثلج لمدة 15 دقيقة، ثم الطرد المركزي عند 12,000 x g لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية. يفصل هذا الطور الليزات إلى ثلاث طبقات: الطور المائي العلوي الذي يحتوي على RNA، طبقة البروتين الوسطى، والطور العضوي السفلي. انقل الطور المائي العلوي (≈ 0.5 مل) بعناية إلى أنبوب جديد خال من RNase (تجنب لمس الطبقة الوسطى)، أضف 0.5 مل من الإيزوبروبانول، ثم استخدم دوامة برفق لترسيب الحمض النووي الريبي، ثم حضن على الجليد لمدة 10 دقائق، ثم الطرد المركزي عند 12,000 x g لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية؛ يشكل الحمض النووي الريبي حبيبة بيضاء في أسفل الأنبوب. تخلص من الفائق، وكرر ترسيب الإيزوبروبانول مرة واحدة لتحسين نقاء الحمض الريبي، ثم استنشق المادة الفائقة بالكامل، وجفف الحبيبات في الهواء في طبقة الحمض النووي المغناطيسي على درجة حرارة الغرفة لمدة 5-10 دقائق (لا تجف أكثر من اللازم، لأن ذلك يقلل من الذوبانية)، وأعد تعليق حبيبة الحمض النووي الريبي في 30 ميكرولتر من الماء المعالج ب DEPC، ثم حضن على حرارة 55 درجة مئوية لمدة 10 دقائق للمساعدة في الذوبان. قياس نقاء الحمض النووي الريبي عن طريق قياس نسبة A260/A280 (الهدف: 1.8-2.0) باستخدام مقياس طيفي، وتقييم سلامة الحمض النووي الريبي باستخدام شريحة نانو RNA؛ الهدف: رقم سلامة الحمض النووي الريبي [RIN] > 8.0، وتخزين عينات RNA مؤهلة عند -80 درجة مئوية حتى يتم التسلسل.

تحذير: التريزول والكلوروفورم سامان ومتطايرتان ومسرطنان، لذا تعامل معهما فقط في غطاء بخار مع ارتداء قفازات نيتريل ومعطف مختبر ونظارات أمان — تجنب استنشاق الأبخرة، وامسح بمنشفة ورقية واشطفها بالصابون والماء لمدة 10 دقائق إذا انسكبت على الجلد، ولا تخلطها مع المبيض أو عوامل مؤكسدة أخرى (لأن ذلك قد ينتج عنه غازات سامة). للتخلص من النفايات الخطرة المتعلقة باستخراج الحمض النووي الريبي، اجمع الخلطات والفائقات الإيزوبروبانول والأنابيب الملوثة في حاوية محكمة الإغلاق ومقاومة كيميائيا تحمل علامة نفايات RNA (لا تخلط مع النفايات المائية أو النفايات البيولوجية) والتخلص من بروتوكولات النفايات الخطرة المؤسسية التالية، مع التأكد من عدم صب المصارف.

معالجة البيانات المسبقة ومراقبة الجودة: تحضير مكتبات التسلسل باستخدام مجموعة تحضير مكتبة mRNA-seq الخاصة ب VAHTS وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة -- إثراء mRNA باستخدام حرز مغناطيسي أوليغو(dT)، تقسيم mRNA إلى شظايا بطول 200-300 قطعة وحدة حركية باستخدام الكاتيونات التكافئية، تخليق cDNA للسلسلة الأولى باستخدام سداسي العينات العشوائية تليها cDNA من السلسلة الثانية، إجراء إصلاح نهائي، إضافة ذيول A، ربط محولات التسلسل، تضخيم المكتبات بواسطة PCR، وتنقية باستخدام الخرز. تسلسل المكتبات على منصة التسلسل (قراءات مزدوجة بقوة 150 بت في النهاية)، ويولد حوالي 50 مليون قراءة خام لكل عينة، ثم استخدم برنامجا لتقليم القراءات منخفضة الجودة (إزالة القراءات التي تحتوي على >50٪ من القواعد التي تحمل درجة جودة Phred <20) وتسلسلات المحولات، مع الاحتفاظ بحوالي 48 مليون قراءة نظيفة لكل عينة (Q30 > 90٪) للتحليل بعد التقليم.

تحليل المعلوماتية الحيوية: محاذاة القراءات النظيفة مع الجينوم المرجعي البشري (GRCh38/hg38) باستخدام برنامج Hisat2 v2.2.1 وحفظ نتائج المحاذاة كملفات BAM، واستخدام برنامج htseq-count v0.13.5 لعد عدد القراءات الموجهة لكل جين (استنادا إلى تعليقات جينات Ensembl)، وتطبيع بيانات عدد الجينات باستخدام دالة estimateSizeFactors من حزمة DESeq (2012) R لإزالة تأثيرات الدفعات والاختلافات في عمق التسلسل. وإجراء تحليل التعبير التفاضلي باستخدام دالة nbinomTest (حزمة DESeq)، واختيار الجينات المعبر عنها تفاضلا (DEGs) باستخدام عتبات تغير الطي (FC) > 2 وقيمة p المعدلة (PADj) < 0.05. إجراء تحليل إثراء أنطولوجيا الجينات (GO) (العملية البيولوجية، الوظيفة الجزيئية، المكون الخلوي) وتحليل مسار إثراء موسوعة كيوتو للجينات والجينوم (KEGG) على DEGs باستخدام حزمة clusterProfiler v4.0 R، مع التركيز على الإثراء المرتبط بهجرة الخلايا (مثل التصاق الخلية، هجرة الخلايا)، نقل الأيونات (مثل نقل أغشية أيون الصوديوم)، ومسارات الإشارة (مثل مسار إشارة PI3K-Akt). قم بإجراء تجميع هرمي غير خاضع للإشراف على مستويات DEG باستخدام حزمة Pheatmap v1.0.12 R وتصور أنماط تعبير الجينات عبر العينات باستخدام خريطة حرارية (درجات z مدرجة حسب الصف).

التحليل الإحصائي: تعرض جميع البيانات التجريبية كمتوسط ± خطأ معياري للمتوسط (متوسط ± SEM)، مع وجود ما لا يقل عن 3 نسخ بيولوجية مستقلة لكل مجموعة (n ≥ 3). استخدم اختبار Student t لمقارنة الفروقات بين مجموعتين (مثل المتبرعين الشباب مقابل كبار السن) وتحليل التباين أحادي الاتجاه (ANOVA) يليه اختبار Tukey بعد الاختبار لمقارنة الفروقات بين ثلاث مجموعات أو أكثر (مثل شدات EF المختلفة)، وإجراء تحليلات إحصائية باستخدام برنامج SPSS 23.0 وتعريف الدلالة الإحصائية كما يلي: *p < 0.05، **p < 0.01، ص < 0.001.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوجه تطبيق الحقول الكهربائية الهجرة الاتجاهية لوحدات hADSC ويعزز قدرتها على الهجرة
أظهرت hADSCs المستخرجة علامات سطحية نموذجية لخلايا جذعية الميزنشيمية (مثل CD29، CD44، CD90، CD73، CD105) وكانت تمتلك إمكانات تمايز ثلاثي الخطوط (أديبوجين، هاستوجني، غضروفية؛ الشكل 2A)، مع تلبية المعايير القياسية لتحديد hADSC. طبقنا حقول كهربائية مستمرة (DCEFs) عند شدات 0 ميلي فولت/مم، 100 مللي فولت/مم، و200 مللي فولت/مم للتحقيق في الاستجابة الكهربائية التكتيكية لهواتف hADSC. في مجموعة التحك...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في بداية عملية إصلاح وتجديد إصابات الأنسجة، تظهر الحقول الكهربائية كواحدة من أقدم الإشارات الفيزيائية التي تم تأسيسها في البيئة الدقيقة. خصائصها الاتجاهية مرتبطة مكانيا وزمانيا بتجنيد الخلايا إلى موقع الإصابة27. تنشأ الحقول الكهربائية الداخلية من الجهد عبر الظهارة الناتج عن نقل الأيونات المستقطبة في الأنسجة الظهارية. عندما يتعطل الحاجز الظهاري أو يمر بالتقدم في العمر، يتغير الجهد ثانويا، بينما تحافظ المناطق غير المتضررة أو غير المتسللة على نقل الأيونات، مما يؤدي إ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لا يوجد لدى المؤلفين تضارب مصالح للكشف عنها.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر بصدق قسم جراحة التجميل في المستشفى الأول التابع لجامعة الصين الطبية (شنيانغ، الصين) ومعهد الشفاء التجديدي في جامعة كاليفورنيا، ديفيس (كاليفورنيا، الولايات المتحدة الأمريكية) على توفير البنية التحتية التجريبية الحيوية والموارد البحثية المشتركة التي مكنت هذه الدراسة. كما نعبر عن امتناننا لشركة Shanghai OE Biotech Co., Ltd. على دعمهم الفني في تسلسل الحمض النووي الريبي والتحليل المعلوماتي الحيوي.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
4° C/-20° C/-80° ثلاجة Cهاير، الصينHYC-390/DW-25L262/DW-86L728J
أغارهوشي، الصين10000561
المحلل الحيوي Agilent 2100شركة أجيلينت تكنولوجيز، الولايات المتحدةG2939BA
أليزارين ريد S سيغما-ألدريتش، الولايات المتحدةA5533
خزانة السلامة البيولوجية ثيرمو فيشر ساينتفيك، الولايات المتحدة1300 A2 1.5 م
CaNO3· 4H2Oهوشي، الصين10013960
الطرد المركزيثيرمو فيشر ساينتفيك، الولايات المتحدةX4R Pro 
حاضنة CO2ثيرمو فيشر ساينتفيك، الولايات المتحدةفورما ستيري-سايكل 3307 
الكولاجيناز من النوع الرابعبايوشراب، الصين  BS076
المجهر الكونفوكليزيس، ألمانياLSM 900
مصدر طاقة نبضات التيار المستمر  دايدو باورترونيكس، كورياDDP-500
ديكساميثازونسيغما-ألدريتش، الولايات المتحدةD4902
المقياس الرقمي متعددفلوك، الولايات المتحدةفلوك-175
DMSOسيغما-ألدريتش، الولايات المتحدةD2650
التوازن الإلكتروني  سارتوريوس، ألمانيا  BSA224S-CW
FBS جيبكو، الولايات المتحدة10270-106
مقياس التدفق الخلويثيرمو فيشر ساينتفيك، الولايات المتحدةA24858
IBMX (1-ميثيل-3-إيزوبيوتيلكسانثين)سيغما-ألدريتش، الولايات المتحدةI7018
إندوميثاسين    سيغما-ألدريتش، الولايات المتحدةI7378
الأنسولينسيغما-ألدريتش، الولايات المتحدةI5500   
المجهر المقلوبزيس، ألمانياأكسيو أوبزرفر 7 / ACR
ITS-Gسيغما-ألدريتش، الولايات المتحدةI3146
KClهوشي، الصين10019318
KH2PO4هوشي، الصين10019320
حمض اللينوليك  سيغما-ألدريتش، الولايات المتحدةL1376
محطة لايف سيللايف سيل إنسترومنت، كورياتشاملايد TC 
DMEM منخفض الجلوكوزجيبكو، الولايات المتحدة11885084
MgSO4· 7H2O هوشي، الصين10019322
Na2HPO4· 12H2Oهوشي، الصين10019324
NaClهوشي، الصين10019318
مطياف نانوسدروب 2000ثيرمو فيشر ساينتفيك، الولايات المتحدةND-2000
أويل ريد أوسيغما-ألدريتش، الولايات المتحدةO0625
البنسلين/الستربتوميسينجيبكو، الولايات المتحدة15140122
البيبيتسإبندورف، ألمانيا 4920000061
SYBR بريميكس EX Taqتاكارا، الصين  RR420A
تولويدين بلو O         سيغما-ألدريتش، الولايات المتحدةT3260
تريسهوشي، الصين10019326
تريزولبيوتايم، الصينR0016
تريبسين-إيدتاجيبكو، الولايات المتحدة25200056
المجهر القائمزيس، ألمانيا415200-0000-000 
شحم الفراغداو كورنينغ، الولايات المتحدة1597418
فيتامين C     سيغما-ألدريتش، الولايات المتحدةA4544
نظام تنقية المياهثيرمو فيشر ساينتفيك، الولايات المتحدة  GenPure xCAD Plus UF-TOC
&بيتا;-جليسروفوسفات سيغما-ألدريتش، الولايات المتحدةG9422

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Qin, Y., et al. An update on adipose-derived stem cells for regenerative medicine: Where challenge meets opportunity. Adv Sci. 10 (20), e2207334(2023).
  2. Biniazan, F., Stoian, A., Haykal, S. Adipose-derived stem cells: Angiogenetic potential and utility in tissue engineering. Int J Mol Sci. 25 (4), 2356(2024).
  3. Ahmadzadeh, N., et al. Human adipose-derived stem cells support lymphangiogenesis in vitro by secretion of lymphangiogenic factors. Exp Cell Res. 388 (2), 111816(2020).
  4. Xiu, X. W., Yan, M., Zhen, G., Jun, Y. Human adipose-derived stem cells inhibit bioactivity of keloid fibroblasts. Stem Cell Res Ther. 9 (1), 40(2018).
  5. Alexandre, T. J. M., et al. Human adipose mesenchymal stem cells as potent anti-fibrosis therapy for systemic sclerosis. J Autoimmun. 70, 31-39 (2016).
  6. Xie, Y., et al. Transcriptome differences in adipose stromal cells derived from pre- and postmenopausal women. Stem Cell Res Ther. 11 (1), 92(2020).
  7. Liu, M., et al. Adipose-derived mesenchymal stem cells from the elderly exhibit decreased migration and differentiation abilities with senescent properties. Cell Transplant. 26 (9), 1505-1519 (2017).
  8. Foti, R., et al. Senescence in adipose-derived stem cells: Biological mechanisms and therapeutic challenges. Int J Mol Sci. 25 (15), 8390(2024).
  9. Jajini, V., Michelle, G., Afshin, M., Peter, B. Systematic review of patient factors affecting adipose stem cell viability and function: Implications for regenerative therapy. Stem Cell Res Ther. 8 (1), 45(2017).
  10. Ning, M., et al. Adipose-derived stem cells from younger donors, but not aging donors, inspire the host self-healing capability through their secretome. Exp Biol Med. 242 (1), 68-79 (2017).
  11. Wang, E. T., Zhao, M. Regulation of tissue repair and regeneration by electric fields. Chin J Traumatol. 13 (1), 55-61 (2010).
  12. Chiang, M. C., Cragoe, E. J., Vanable, J. W. Intrinsic electric fields promote epithelization of wounds in the newt Notophthalmus viridescens. Dev Biol. 146 (2), 377-385 (1991).
  13. Reid, B., Song, B., McCaig, C. D., Zhao, M. Wound healing in rat cornea: The role of electric currents. FASEB J. 19 (3), 379-386 (2005).
  14. Li, L., et al. Electric fields guide migration of epidermal stem cells and promote skin wound healing. Wound Repair Regen. 20 (6), 840-851 (2012).
  15. Zhao, M., et al. Electrical signals control wound healing through phosphatidylinositol-3-OH kinase-γ and PTEN. Nature. 442 (7101), 457-460 (2006).
  16. Zhao, M. Electrical fields in wound healing: An overriding signal that directs cell migration. Semin Cell Dev Biol. 20 (6), 674-682 (2009).
  17. Pretteam, S., et al. Electrical stimulation: A novel therapeutic strategy to heal biological wounds. RSC Adv. 14 (44), 32142-32173 (2024).
  18. Reid, B., Ochoa-Gonzalez, E., McCaig, C. D., Zhao, M. Modulating endogenous electric currents in human corneal wounds: A novel approach of bioelectric stimulation without electrodes. Cornea. 30 (3), 338-343 (2011).
  19. Mehta, A. S., et al. Physiological electric fields induce directional migration of mammalian cranial neural crest cells. Dev Biol. 471, 97-105 (2021).
  20. Yang, C., et al. Steered migration and changed morphology of human astrocytes by an applied electric field. Exp Cell Res. 374 (2), 282-289 (2019).
  21. Zhu, K., et al. Electric fields at breast cancer and cancer cell collective galvanotaxis. Sci Rep. 10 (1), 8712(2020).
  22. Guo, L., et al. Migration of human renal tubular epithelial cells in response to physiological electric signals. Front Cell Dev Biol. 9, 724012(2021).
  23. Kim, M. S., et al. Golgi polarization plays a role in the directional migration of neonatal dermal fibroblasts induced by direct current electric fields. Biochem Biophys Res Commun. 460 (2), 255-260 (2015).
  24. Moarefian, M., et al. Electrotaxis-on-chip to quantify neutrophil migration towards electrochemical gradients. Front Immunol. 12, 674727(2021).
  25. Lee, M. H., et al. Pulsed electrical stimulation enhances consistency of directional migration of adipose-derived stem cells. Cells. 10 (11), 2846(2021).
  26. Song, B., et al. Application of direct current electric fields to cells and tissues in vitro and modulation of wound electric field in vivo. Nat Protoc. 2 (6), 1479-1489 (2007).
  27. McCaig, C. D., Rajnicek, A. M., Song, B., Zhao, M. Controlling cell behavior electrically: Current views and future potential. Physiol Rev. 85 (3), 943-978 (2005).
  28. McCaig, C. D., Song, B., Rajnicek, A. M. Electrical dimensions in cell science. J Cell Sci. 122 (23), 4267-4276 (2009).
  29. Merrick, D., et al. Identification of a mesenchymal progenitor cell hierarchy in adipose tissue. Science. 364 (6438), eaav2501(2019).
  30. Huayllani, M. T., et al. Adipose-derived stem cells in wound healing of full-thickness skin defects: A review of the literature. J Plast Surg Hand Surg. 54 (5), 263-279 (2020).
  31. Hong, S. H., et al. Stem cell passage affects directional migration of stem cells in electrotaxis. Stem Cell Res. 38, 101475(2019).
  32. Jia, Q., Zhao, H., Wang, Y., Cen, Y., Zhang, Z. Mechanisms and applications of adipose-derived stem cell extracellular vesicles in the inflammation of wound healing. Front Immunol. 14, 1214757(2023).
  33. Hammerick, K. E., Longaker, M. T., Prinz, F. B. In vitro effects of direct current electric fields on adipose-derived stromal cells. Biochem Biophys Res Commun. 397 (1), 12-17 (2010).
  34. Banks, T. A., Luckman, P. S., Frith, J. E., Cooper-White, J. J. Effects of electric fields on human mesenchymal stem cell behaviour and morphology using a novel multichannel device. Integr Biol. 7 (6), 693-712 (2015).
  35. Zhao, M., et al. Electrical stimulation directly induces pre-angiogenic responses in vascular endothelial cells by signaling through VEGF receptors. J Cell Sci. 117 (3), 397-405 (2004).
  36. Tandon, N., et al. Electrical stimulation systems for cardiac tissue engineering. Nat Protoc. 4 (2), 155-173 (2009).
  37. Kashimoto, R., et al. Lattice-patterned collagen fibers and their dynamics in axolotl skin regeneration. iScience. 25 (7), 104524(2022).
  38. Sarkar, A., Kobylkevich, B. M., Graham, D. M., Messerli, M. A. Electromigration of cell surface macromolecules in DC electric fields during cell polarization and galvanotaxis. J Theor Biol. 478, 58-73 (2019).
  39. Fang, K. S., et al. Epidermal growth factor receptor relocalization and kinase activity are necessary for directional migration of keratinocytes in DC electric fields. J Cell Sci. 112 (12), 1967-1978 (1999).
  40. Zhao, M., Pu, J., Forrester, J. V., McCaig, C. D. Membrane lipids, EGF receptors, and intracellular signals colocalize and are polarized in epithelial cells moving directionally in a physiological electric field. FASEB J. 16 (8), 857-859 (2002).
  41. Gorzkowska, J., et al. The dynamics of chemoattractant receptor redistribution in the electrotaxis of 3T3 fibroblasts. Cell Commun Signal. 23 (1), 173(2025).
  42. Pu, J., et al. EGF receptor signaling is essential for electric-field-directed migration of breast cancer cells. J Cell Sci. 120 (19), 3395-3403 (2007).
  43. Tsai, H. F., et al. Evaluation of EGFR and RTK signaling in the electrotaxis of lung adenocarcinoma cells under direct-current electric field stimulation. PLoS One. 8 (8), e73418(2013).
  44. Zhu, K., et al. Expression of integrins to control migration direction of electrotaxis. FASEB J. 33 (8), 9131-9141 (2019).
  45. Zhao, M., et al. Orientation and directed migration of cultured corneal epithelial cells in small electric fields are serum dependent. J Cell Sci. 109 (6), 1405-1414 (1996).
  46. Wan, P., et al. Guidance receptor promotes the asymmetric distribution of exocyst and recycling endosome during collective cell migration. Development. 140 (23), 4797-4806 (2013).
  47. Djamgoz, M. B. A., et al. Directional movement of rat prostate cancer cells in direct-current electric fields: Involvement of voltage-gated Na+ channel activity. J Cell Sci. 114 (14), 2697-2705 (2001).
  48. Tai, G., Tai, M., Zhao, M. Electrically stimulated cell migration and its contribution to wound healing. Burns Trauma. 6, 20(2018).
  49. Alt, E. U., et al. Aging alters tissue-resident mesenchymal stem cell properties. Stem Cell Res. 8 (2), 215-225 (2012).
  50. Antelo-Iglesias, L., et al. The role of cellular senescence in tissue repair and regeneration. Mech Ageing Dev. 198, 111528(2021).
  51. Aurelie, C., Cheng, C., Han, L. The crosstalk between cellular reprogramming and senescence in aging and regeneration. Mech Ageing Dev. 138, 111005(2020).
  52. Kammeyer, A., Luiten, R. M. Oxidation events and skin aging. Ageing Res Rev. 21, 16-29 (2015).
  53. Sun, J., et al. Tideglusib promotes wound healing in aged skin by activating the PI3K/Akt pathway. Stem Cell Res Ther. 13 (1), 269(2022).
  54. Liu, S., et al. The PI3K-Akt pathway inhibits senescence and promotes self-renewal of human skin-derived precursors in vitro. Aging Cell. 10 (4), 661-674 (2011).
  55. Luo, R., Dai, J., Zhang, J., Li, Z. Accelerated skin wound healing by electrical stimulation. Adv Healthc Mater. 10 (16), e2100557(2021).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Adipose Derived Stem CellsElectrotaxisElectric Field StimulationAge Dependent MigrationStem Cell MigrationRNA SequencingSodium Channel ActivityPI3K Akt SignalingTissue RegenerationWound Healing

Related Articles