التحول الفعال القائم على التجدد القائم على الزراعة الجرو بكتيريا لنوع من البراصفة البرمائية اللاجنسية، Rorippa aquatica

Page E. Gonzalez; Calvin M. Coffin; Keiko  U. Torii

doi:10.3791/69672

مقالة منهجية

التحول الفعال القائم على التجدد القائم على الزراعة الجرو بكتيريا لنوع من البراصفة البرمائية اللاجنسية، Rorippa aquatica

DOI:

10.3791/69672

⸱

يناير 16, 2026

Page E. Gonzalez¹ , Calvin M. Coffin¹ , Keiko U. Torii¹

¹Howard Hughes Medical Institute and Department of Molecular Biosciences, The University of Texas at Austin

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نقدم بروتوكولا فعالا ومحسن للتحول الجرويباكتيريوم لنوع من البراسيكاسي اللاجنسي من نوع البراسيكاسيا، Rorippa aquatica، دون الحاجة إلى إجراءات زراعة أنسجة معقمة تتطلب موارد كبيرة. باستخدام علامة التحول البصري وخط أنابيب تجديد البراعم نجح في توليد محولات شبه مستنسخة، مما دفع الدراسات المستقبلية لتكيف النبات مع البيئة تحت الماء.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

كان التحول الجيني المستقر للنباتات الذي توسطه Agrobacterium tumefaciens أداة قوية للأبحاث الأساسية في علم الأحياء النباتي وكذلك لتقنيات النبات الحيوية التي تؤثر بشكل مباشر على تحسين المحاصيل. خطوط التحويل البسيطة والفعالة، مثل طريقة الغمر الزهري في الأرابيدوبسيس، قدمت تحليلات واسعة النطاق لوظيفة الجينات بشكل كبير. ومع ذلك، لا يمكن تطبيق مثل هذا المسار على أنواع النباتات التي لا تخضع للتكاثر الجنسي. روريبا أكواتيكا هو نوع ناشئ من نماذج البرمائية من عائلة براسيكاسيا، يظهر تغيرات غير متجانسة وكبيرة في شكل الأوراق والنباتات في البيئات البرية أو تحت الماء. R. aquatica يتكاثر حصريا بشكل نباتي. يوفر خط الأنابيب المحسن المعروض هنا تحويلا فعالا وموثوقا من R. aquatica بوساطة الزراعة بكتيريا ولا يتطلب زراعة أنسجة معقمة. تغمر قصاصات الأوراق لفترة وجيزة في البكتيريوم المعلق في مخزن التحول الذي يحتوي على ناقل ثنائي يعبر عن علامة بصرية، RUBY، تحت المحفز المكون. بعد ذلك، تزرع الملقحات على ورق ترشيح مبلل بالماء في غرفة نمو. ثم تفصل النباتات المتجددة ذات صبغات RUBY الحمراء وتزرع في التربة. تلك المتجددات الأولية من النوع الأول (R1-T1) تعبر عن قطاعات حمراء. من خلال قطع القطاع الأحمر وتكرار خطوات التجدد، يتم إنتاج عدد كبير من الأشقاء المعدلين وراثيا في الجيل التالي من R2-T1، وبعضها يكاد يكون أحمر بشكل متساو؛ يدل على تعبير RUBY. يمكن اعتماد هذا المسار البسيط للتحويل البشري الريفي أكواتيكا وربما أنواع النباتات الأخرى التي تكاثر نباتيا لإدخال جينات مهمة لدراسة وظائفها في التكيف مع اليابسة مقابل بيئات مائية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التحول الجيني المستقر، أي إدخال وتعبير الجينات ذات الاهتمام بنوع نباتي معين، هو أمر أساسي في علوم النبات الأساسية والتكنولوجيا الحيوية للنباتات. التحول الذي يعبر عنه Agrobacterium tumefaciens هو الوسيلة الأكثر استخداما في الهندسة الوراثية النباتية لإنتاجه الموثوق للمحولات^{المستقرة 1}. أدى تطوير نظام ناقل ثنائي، حيث يتم فصل ناقل استنساخ T-DNA وبلازميد مساعد فير غير مسلح إلى كيانين، ثورة في التحول البوساطة بأجروبكتيريوم ^1,2. بالنسبة للنبات النموذجي أرابيدوبسيس ثاليانا، أتاح إجراء تحويل بسيط وفعال من حيث التكلفة إلى غمس الأزهار من توليد محولات مستنسخة (نصف الرمزية) عالية الإنتاجية لعلم الوراثة والجينوم الوظيفي ^3,4. ومع ذلك، فإن مثل هذا النهج غير ممكن للأنواع النباتية التي تتكاثر بشكل رئيسي أو حصري بشكل نباتي.

تظهر النباتات البرمائية قدرة فريدة على الازدهار في البيئات البرية والمائية (تحت الماء)⁵. روريبا أكواتيكا هو نوع من البراسيكاسي البرمائي يظهر تنوعا غير متجانس. في البيئة البرية، يطور R. aquatica أوراقا مستديرة ذات بشرة تتكون من خلايا الرصف والثغر. على النقيض من ذلك، تظهر أوراقها المائية أشكال متكيفة جيدا مع البيئة تحت الماء: أوراق إبرية شديدة التشريح مع بشرة خالية من خلايا الرصف أو الثغور الجلدية ^6,7. من الناحية التطورية، ترتبط R. aquatica ارتباطا وثيقا ب Arabidopsis thaliana; كلاهما ينتمي إلى نفس العائلة، وهي البراسيكاسي⁶. مع توفر بيانات تسلسل الجينوم الكامل والحفاظ العالي على تسلسل الجينات المشفرة بين R. aquatica و A. thaliana، يعد R. aquatica نموذجا برمائيا ناشئا لدراسة الأساس الجزيئي للتكيف مع اليابسة^{والماء 8}. في الواقع، تشير الدراسات الفسيولوجية والحديثة للتعبير الجيني إلى أن إعادة توصيل مسارات الضوء وإشارات الهرمونات أمر حاسم لتنوع R. aquatica ^7,8.

لاختبار الوظائف الجزيئية للجينات والمسارات المرشحة، فإن التحول الجيني ضروري للغاية. تتكاثر R. aquatica بشكل نباتي في الطبيعة ^8,9. لذلك، وعلى عكس A. thaliana، لا يمكن تطبيق تحويل الغمس الزهري بواسطة Agrobacterium على R. aquatica. ومن اللافت أن R. aquatica يعيد تجدد النباتات الكاملة بسهولة من الأوراق المتقطعة دون إضافة مكملات خارجية للهرمونات النباتية¹⁰. لفترة وجيزة، خلال أيام قليلة من انفصال مقطع الورقة، يصبح تكاثر الخلايا نشطا في النسيج الوعائي عند الطرف القريب من سطح القطع المجرد. خلال أسبوع، تتجدد الجذور والفروع، مما ينتج في النهاية نباتات صغيرة (نباتات وردية). يمكن فصل النباتات الفردية ونموها حتى النضج¹⁰. يمكن استخدام عملية تجديد النباتات بالكامل بشكل تلقائي بسهولة لتحويل وراثي ل R. aquatica.

يمكن خط الأنابيب المحسن المذكور هنا من التحويل الفعال والموثوق بوساطة البكتيريا الزراعية ل R. aquatica من خلال استغلال قدرته على التجدد التلقائي بعد انفصال الأوراق. لتسهيل اختيار المحولات دون الحاجة إلى عمليات زراعة معقمة مكلفة، تم اعتماد علامة اختيار بصري غير غازية تسمى RUBY، وهي ناقل صناعي يحتوي على ثلاثة جينات تؤدي إلى التخليق الحيوي للبيتالين¹¹. من خلال تحسين ظروف الزراعة البكتيرية، وخطوات التطعيم، وعمليات حضانة قصاصات الأوراق للتجدد، تم إنتاج نباتات R. aquatica المعدل وراثيا بشكل موثوق حتى النضج. تقريبا جميع المحولات الأولية في جيل R1-T1 تظهر قطاعات حمراء، مما يشير إلى أنها فسيفساء جينية غير متجانسة. من خلال قطع قطاعات الأوراق الحمراء RUBY+ وتكرار عمليات التجدد، يمكن توليد نباتات وردية حمراء بالكامل، وبالتالي تحويلات R. aquatica شبه مستنسخة، في الجيل التالي من R2-T1. يمكن تطبيق هذا المسار التحويلي بسهولة لإدخال/التعبير عن جينات أجنبية محل اهتمام في R. aquatica، مما يسرع الدراسات الجينية الجزيئية لتكيف النباتات وغير المتجانسة مع البيئات القاسية.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المواد المستخدمة والمواد المستخدمة مدرجة في جدول المواد.

1. تحضير المواد النباتية

قم بقص وقطع الأوراق الصحية الناضجة بالكامل إلى قطع بطول 1-2 سم من نباتات أم ناضجة تبلغ من العمر شهرين (الشكل 1A).
قم بتبطين صينية تكاثر النبات (20 × 30 سم صينية Perma Nest) بطبقتين من مناديل الورق المطوية المعقم بالمعقمة. تشبع مناشف الورق بماء معقم، بحيث يكون هناك طبقة رقيقة من الماء فوقها.
ضع القصاصات على الجانب المحوري مع وجود مساحة حول كل نبتة خارجية لتجنب التداخل (الشكل 1A).
رش القطع بخفة وغط الصينية بإحكام بغلاف بلاستيكي.
ضع الصواني في غرفة النمو عند 25 °C-28 °C مع 16 ساعة ضوء و8 ساعات مظلمة في ظروف رطبة وشدة ضوء 50 ميكرومول/م²/ث.
افحص وحافظ على صواني التكاثر النظيفة والرطبة 2-3 مرات في الأسبوع.
1. أضف ماء معقم للحفاظ على طبقة رقيقة من الماء فوق مناشف ورقية مشبعة.
2. استبدل الغلاف البلاستيكي الذي فقد التصاقه و/أو يظهر عليه علامات التلوث (مثل العكارة المرئية في الماء).
باستخدام المقص الصغير أو المشرط، قم بإزالة نباتات وردية فردية سليمة ومتجددة بعناية تحمل سعايا وجذرا بين 14-21 يوما بعد التأسيس (الشكل 1B).
ملاحظة: يتطلب الأمر استئصالا دقيقا للحصول على نبتة وردية واحدة مع بقاء الساق والجذر سليمين. تتكاثر نباتات وردة الروريبا بكثافة على طول تقاطع الورقة الخارجية والضلع الأوسط، مما يعقد تحديد النباتات الفردية من الوردة. تنمو براعم نبات الوردة بشكل محوري، بينما تنمو الجذور تحت سطح الورقة، مما يعقد رؤية النبات الكامل للوردة (الشكل 1B).
زرع نباتات الوردة الفردية في أوعية تحتوي على وسط تربة رطب (نسبة خليط الزراعة 2:1:1: فيرميلكوليت: بيرلايت) مع إضافة سماد بطيء الإطلاق (الشكل 1B).
اسق بماء الصنبور مع تعديل 0.25 جرام/لتر من سماد NPK المحبب وغطه بقبة رطوبة أو غلاف بلاستيكي للحفاظ على ظروف الرطوبة.
ضع الصواني في غرفة النمو في ظروف سابقة (25 °C-28 °C مع فترة إضاءة 16 ساعة و8 ساعات مظلمة في ظروف رطبة وشدة ضوء 50 ميكرومول/م²/ثانية)
ملاحظة: من الضروري الحفاظ على ظروف التربة الرطبة. حافظ على طبقة رقيقة من الماء تحت الزراعة المزروعة.

2. مزارع البكتيريا الزراعية للتحول

سلالة Streak A. tumefaciens GV3101 التي تحتوي على Ti-بلازميد pMP90 (pTiC58DT-DNA) التي تحتوي على ناقل RUBY على صفيحة LB بحجم 30 مل تحتوي على ريفامبيسين (0.03 ملغ/مل)، جنتامايسين (0.025 ملغ/مل)، وسبكتينوميسين (0.05 ملغ/مل) وتنمو عند 28° مئوية لمدة 48-72 ساعة حتى تظهر مستعمرات فردية.
اختر مستعمرة واحدة وقم بتلقيح 5 مل من مرق MG/L مع تعديل بالبيوتين والمضادات الحيوية الانتقائية السابقة (الجدول 1) وحضنه في هزاز دوار بدرجة حرارة 28 درجة مئوية بسرعة 200 دورة في الدقيقة لمدة 16 ساعة.
انقل اللقاح إلى قارورة مخروطية تحتوي على مرق 250 ملغ/لتر وحضنه في هزاز دوار بدرجة حرارة 28 درجة مئوية بسرعة 200 دورة في الدقيقة لمدة 16 ساعة.
تأكد من أن مزرعة السائل لديها حد أدنى من OD₆₀₀ و1.2 باستخدام مقياس طياف. قم بإزالة البكتيريا عن طريق الطرد المركزي بقوة 3396 x g لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة (حوالي 22 درجة مئوية). عدل مرق التلقيح ب 200 ميكرومولار أسيتوزرينجون (AS).
ملاحظة: يتم تحضير أليكوتات من AS المعقم بالفلتر في DMSO بتركيز عمل 100 مللي مولار وتخزينها عند -20 درجة مئوية. يجب أن يصنع مرق التلقيح طازجا. يضاف AS مباشرة قبل خطوة الطرد المركزي لتقليل التدهور. أوصاف الوسائط ومكوناتها مدرجة في الجدول 1.
لتجنب الاضطراب المباشر للحبيبات البكتيرية، تخلص من المادة الفائقة وأعد تعليقها في مرق التلقيح.
قم بتدوير القارورة يدويا بحيث يكون المحلول بمقدار OD₆₀₀ تقريبا 0.8.
حضن اللقاح على جهاز هزاز بسرعة 90 دورة في الدقيقة لمدة 2.5 ساعة في درجة حرارة البيئة (حوالي 22 درجة مئوية).
الظروف التاريخية ذات الصلة (الزراعة واللقاح OD₆₀₀، تركيز AS وكمية المواد السطحية، فترة التطعيم، وعدد الوحدات التجريبية المطلوبة لكفاءة التحول.
ملاحظة: تركيزات البكتيريا وزراعة التعليق المثلى ضرورية لتعظيم كفاءة التحويل مع تقليل النمو البكتيريا المفرط. قبل الطرد المركزي، تأكد من أن مزرعة البكتيريا تحتوي على حد أدنى من OD600 وهو 1.2؛ أعد تعليقها إلى اللقاح OD600 بقيمة 0.8. تم تحسين التعديلات على مرق الحث لتعزيز التحول دون المساس بفعالية التجديد. التركيزات الموصى بها هي 150-225 ميكرومولار للحمض المقاوم للسطح، و0.005٪ للمواد الفعالة السطحية.
تحذير: تخلص من جميع البكتيريا والنباتات المعدلة وراثيا في حاويات نفايات بيولوجية خطرة مخصصة.

3. تحول قصاصات أوراق R. aquatica

أثناء خضوع زراعة إعادة تعليق اللقاح للحضانة، اختر عدة نباتات تربية عمرها شهرين تظهر أوراقا صحية مع هوامش كاملة.
حضر صينية تكاثر النبات (20 صواني Perma Nest بحجم 30 سم) مع طبقتين من مناشف الورق المعقم بعقم القيمة. اطو مناشف الورق. تشبع مناشف الورق بماء معقم، بحيث يكون هناك طبقة رقيقة من الماء فوقها.
ملاحظة: أنشئ صينية تحكم سلبية تمر فيها النباتات غير الملقحة بظروف بيئية متطابقة.
تأكد من تجهيز طاولة المختبر بحاويات معقمة بسعة 100-500 مل من DDH₂O مناسبة للحجم المتوقع من اللقاح المعلق، وميكروبايبت، وأطراف.
قبل انتهاء مرحلة الحضانة، قم بإزالة عشرة أوراق بسرعة عند قاعدة السويقات من النباتات المختارة. ضع النباتات المستخرجة في طبق بتري مع ماء معقم.
ملاحظة: من الضروري استخدام الأنسجة المقطوعة حديثا لتطعيم الأوراق لتجنب جفاف الأوراق.
بعد 2.5 ساعة، قم بإخراج الماصة 50 ميكرولتر من مادة المعالجة السطحية إلى محلول إعادة تعليق بسعة 1 لتر (تركيز 0.005٪ من المواد الفعالة للسطح) وتدوير القارورة بلطف لخلط (الشكل 2A). تأكد من سهولة وجود صينية تكاثر لوضع النباتات الخارجية بعد التطعيم (الشكل 2B).
ضع الجانب السفلي للورقة للأعلى واقطع عموديا على طول الضلع الأوسط إلى قطع بطول 1 سم باستخدام مشرط (الشكل 2C).
ضع الأوراق المقطوعة حديثا فورا في أنبوب بسعة 50 مل، مناسب لخلاط الأنابيب الدوار، ليعمل كبحوث تطعيم.
صب اللقاح في أنبوب الزراعة بحجم كبير لتشبع جميع المواد ثم حرك في خلاط دوار لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة للتطعيم (الشكل 2D,E).
أزل جميع الأوراق الملقحة من المحلول باستخدام الملقط وضعها مباشرة في صينية التكاثر المحضرة.
افصل وافرد النباتات المنقوعة بحيث تغمر جزئيا ولكن ليس بالكامل في طبقة الماء الرقيقة فوق المناشف الورقية المشبعة (الشكل 2F).
تحذير: حافظ على ظروف معقمة وتجنب أي ملامسة للأسطح أو الأدوات المستخدمة أثناء إجراءات الزراعة قبل تعقيمها.
أغلق كل صينية بغلاف بلاستيكي واحتضن في الظلام عند درجة حرارة محيطة (22° مئوية) لمدة ثلاثة أيام.
عند انتهاء فترة الظلام، تأكد من إغلاق الصواني بغلاف بلاستيكي شفاف وتعديل الصواني ب ddH₂O للحفاظ على مستوى الرطوبة.
انقل صواني التطعيم إلى غرفة نمو تحت ظروف التكاثر النباتي.
تحذير: قم بتجميع نفايات اللقاح في حاوية نفايات، وعالجها بمحلول مبيض بنسبة 10٪، ثم التخلص منها وفقا لإرشادات السلامة البيولوجية.

4. تجديد نباتات الوردة وإنشاء جيل R1-T1

افحص صواني التطعيم 2-3 مرات في الأسبوع لضمان نظافة ورطبة.
1. أضف DDH_2Oباستخدام زجاجة ضغط. إذا كان ذلك متاحا، قم برش الغبار باستخدام زجاجة رش قبل إعادة إغلاق الصواني.
2. حافظ على رطوبة عالية عن طريق استبدال الغلاف البلاستيكي الذي فقد التصاقه أو يظهر عليه علامات التلوث (مثل عكارة الماء المرئية).
افحص بصريا نباتات الوردية المعاد توليدها لخصائص ملاءمة الزرعة. البراعم المتجددة المثالية تظهر ساقا سليما بأوراق وجذور متعددة لا يقل طولها عن 2-3 مم (الشكل 2G).
ملاحظة: عادة ما تتجدد نباتات الوردة المعدلة وراثيا بشكل أبطأ، وتصل عادة إلى ملاءمة الزراعة بعد 21-28 يوما من وضعها في غرفة النمو.
إزالة وزرع نباتات وردية معدلة وراثيا سليمة تحت نفس ظروف تجديد الوردة الوراثية.
(اختياري) سجل عدد المحولات المعاد تجديدها وربطها بظروف التحول لتقييم الكفاءة.
ملاحظة: توخي الحذر الإضافي أثناء الاختيار. غالبا ما تكون المنشأات المتجددة وراثيا صغيرة وسهلة التغاضي. افحص بعناية أسطح الأوراق الخلفية والخلفية باستخدام الملقط لتعظيم العائد وتقليل الضرر.
قم بإزالة نبات الوردة، مع تجنب لمس أي أوراق معدلة وراثيا. قم بتقليم أي أوراق زائدة حول الورقة المعدلة وراثيا. ازرع نبتة واحدة في كل أصيص.
قم بالتسميد والسقي والرش بسرعة لكل نبات وضعه تحت قبة بلاستيكية للحفاظ على الرطوبة (الشكل 2G,H).
قم بتسجيل وتصنيف كل شتلة معدلة وراثيا.
أعد النباتات الخارجية التي تحتوي على محولات تفتقر إلى البراعم أو الجذور أو التي تبدو صغيرة جدا بحيث لا يمكن نقلها إلى صينية التكاثر لمواصلة الفحص. زرع محولات إضافية عندما يكون النمو كافيا.
زرع الرذاذ والماء يوميا خلال الأسبوع الأول. تأكد من وجود ماء دائما في الصينية.
إزالة وتخلص من أي زرعات قد أصبحت قديمة أو لم تعد تظهر تعبيرا عن صبغة RUBY.
تحذير: التخلص من جميع المواد المعدلة وراثيا وفقا للوائح السلامة البيولوجية المؤسسية.

5. التجديد اللاحق وإنشاء جيل R2-T1 شبه المستنسخ

بمجرد أن تتطور نباتات الوردة إلى نباتات كبيرة وصحية (شهران)، توسع الأوراق المعبرة عن الياقوت من شتلة واحدة (الشكل 2H).
ملاحظة: بينما قد تبدو الأوراق التي تعبر عن الياقوت حمراء بشكل موحد، إلا أنها غالبا ما تكون كيميرية. كلا النوعين الظاهريين مناسبان للانتشار. تابع طرق التكاثر النباتي القياسية في الخطوات التالية.
قسم قطع الأوراق المحولة وضعها في صينية تكاثر. ضع علامة واضحة على كل صينية تكاثر بمعرف المانح المناسب لكل صينية الشتلة.
تحذير: لا تخلط أوراق عدة شتلات في نفس الصينية. كل شتلة تمثل حدثا معدلا وراثيا فريدا ويجب تتبعه كجيل منفصل.
تم إعادة زراعة نباتات R2-T1 (بعد 14-28 يوما من التكاثر). خصص لكل نبات معرف جديد يعكس حالته الثانية. استمر في الرعاية القياسية بعد الزراعة كما هو موضح سابقا (الشكل 2I,J).

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تحسين معايير تحويل A. tumefaciens لإنتاج نباتات معدلة وراثيا معبرة عن الياقوت بنجاح، متجاوزة القيود القائمة على العقم مع الاستفادة من معدل تجديدها اللاجنسي السريع (الشكل 1 والشكل 2). بعد تطعيم قطع الأوراق وتعرضها لعلاج مظلم لمدة 72 ساعة، بدأت النباتات المتجددة تنمو خلال أسبوعين تحت الظروف الموصوفة. تم العثور على نباتات متجددة تظهر قطاعات RUBY كيميرية كبيرة بما يكفي للنقل بين 3-5 أسابيع بعد التطعيم (الشكل 3) وكانت أصغر قليلا من تلك النباتات غير المعبرة من الوردة. لم يتم العثور على نباتات متجددة من RUBY على صواني النوع البري الضابط، مما يؤكد أن هذه الظاهرة تختلف عن فسيولوجيا R. aquatica. نوع مرق الزراعة البكتيرية، نوع مرق التلقيح المعاد تعليقه، طريقة التسرب، وفترة التطعيم لم تختلف بشكل كبير في قدرتها أو معدل توليد المحولات (الجدول 2 والجدول 3). شملت عوامل العلاج التي أثرت إيجابيا على كفاءة التحول زيادة تركيز AS ومعالجة التعرض للأكسسين قبل تلقيح الأوراق. أثرت زيادة تركيز المواد الفعالة على التوتر السطحي سلبا على العائد ووجد أنها غير مناسبة.

تم استخدام النسخة R 4.4.2 12,13,14,15 لإجراء تحليل نموذج بواسون الخطي المختلط العام (Poisson GLMM) لبيانات عدد نباتات الوردية. ومع ذلك، في التجربة D (الجدول 2D)، حيث تم فحص المتجددات المعبر عنها بواسطة RUBY لتلقيح لمدة 15 دقيقة مع تعديل ب 150 ميكرومولار AS أو 225 ميكرومولار AS، خالف النموذج الافتراضات الناتجة عن التشتت الناقص، وتم تطبيق GLMM ثنائي السالب بدلا منه.

تم فحص تأثيرات مرق البكتيريا المختلفة وظروف الزراعة على كفاءة التحول بعناية. من بين النسخ التجريبية الخمسة، أدى استخدام مرق ميلر LB أو مرق MG/L الخاص بالتحول إلى تحويل محولات تعبر عن RUBY تحت معايير شبه متطابقة ولم تختلف بشكل كبير في تأثيراتها (الجدول 2A). تراوحت وسائل الروبي المعبر عن نباتات الوردة المعاد تجديدها من قطع أوراق فردية، والتي تتكون من 15-60 نبات مبعثر لكل معالجة، من 1.61 ± 0.71 من الوردة المتجددة التي تم إنتاجها من تجارب استخدمت مرق إعادة تعليق الزراعة غير المعتمدة على ال LB وغير التصلب المغناطيسي (مرق الحث الضابط، الجدول 1) و3.23 ± 1.13 من التجارب التي تضمنت MG/L ومرق الحث المحسن. على الرغم من عدم وجود فرق كبير، وبسبب الملاحظات الذاتية، تم اختيار زراعة MG/L ومرق الحث المحسن (الجدول 1) لتجارب تحسين مستقبلية.

بعد ذلك، اختبرنا العوامل التي تؤثر على حمل البكتيريا والقدرة على الوصول إلى أنسجة النبات المريستيمية. من بين ثمانية نسخ (الجدول 2B)، أظهرت النباتات المحصنة التي تحتوي على تركيز خافضات سطحية مرتفعة بنسبة 0.01٪ إجهادا شديدا بعد شهر واحد، مما أدى إلى تجددات صغيرة وغير قابلة للحياة إلى حد كبير. لم يكن هناك محولات متجددة بين تلك النسخ المكررة، رغم أن النمط الظاهري المتجدد المجهد للنباتات السابقة كان تصبغات خمرية وبنية وصفراء، لذا قد تكون هناك محولات محتملة. على أي حال، فإن عدم قابلية التعافي للمواد التجديدية أكدت الحفاظ على تركيز 0.005٪ من المواد الفعالة للتوتر السطحي.

تمت مقارنة تقنيتين ميكانيكيتين، هما التحريك أو تسرب الفراغ، في تأثيرهما لإدخال الحمض النووي المطلوب إلى النبات المضيف. كانت طريقة التسلل المراقبة، حيث تغمر القطع المكشوفة في 50 مل من اللقاح المعلق وتدويرها في خلاط أنبوبي، ناجحة في إنتاج متجددات معبرة عن RUBY عبر المعالجات المدرجة. كما أنتج التسرب التطبيقي في الفراغ مواد متجددة معبرة عن RUBY، لكنها لم تختلف في كفاءة التحويل مقارنة بطريقة التحكم (p = 0.478، الجدول 2D). تمت ملاحظة حوالي 2-5 متجددات معبرة عن RUBY في كل صينية انتشار، سواء تم تلقيحها عبر تسرب الفراغ أو التحريك الفيزيائي.

كان تركيز الحقن البكتيري المعدل لأسيتوسيرينجون (AS) يختلف بوضوح في تأثيره على كفاءة التحول. زيادة تركيز AS من 150 ميكرومولار إلى 225 ميكرومولار حسن بشكل كبير إنتاج الروبي التي تعبر عن النباتات المعدلة وراثيا (p = 0.000309، 0.000458؛ الجدول 3C,D). من بين التجارب الأربع، كانت كل معالجة تتألف من صينية تحتوي على 40 نباتا ملقحا معالجا بنفس الطريقة. أما الذين تلقوا بتركيز أعلى فقد حققوا في المتوسط ما يقارب 5 متغيرات معبرة عن RUBY مقابل 1 محول لكل صينية AS ضابطة (الجدول 3C). علاوة على ذلك، بدا أن تأثير AS منفصل عن فترات مدة التطعيم.

من بين التجارب الثلاث التي شهدت مدة تلقيح 15 دقيقة، والتي تضمنت نباتات سابقة معدلة ب 225 ميكرومولار AS، تم العثور على متوسط 7.28 ± 4.13 من المعالجات المعبر عنها بواسطة RUBY، وهو ما كان أكبر بوضوح من معالجات 150 ميكرومولار، حيث كان معدل تجدد 2.03 ± 1.32 (الجدول 3D). لم يظهر تأثير واضح على الفترة الزمنية بين علاجات الضابط ب 150 ميكرومولار من AS (p = 0.676) حيث كان متوسط معدل التطعيم لمدة 10 دقائق 1.48 ± 0.954 مقارنة ب 1.84 ± 1.230 متجدد بين 15 دقيقة من التطعيم (الجدول 3B). وبالمثل، أعادت 10 دقائق و225 ميكرومولار المعالجة تجدد حوالي 5 نباتات وردية معبرة عن RUBY في كل معالجة، وهو ما لم يكن مختلفا بوضوح عن علاجات التلقيح لمدة 15 دقيقة، حيث تم الإشارة إلى 6-7 مقومات متجددة لصينية المعالجة (الجدول 3A).

علاوة على ذلك، تم اختبار هرمون الأكسين النباتي، الذي يساعد على تجديد النبات بشكل عام. تعرض قطع الأوراق المستخرجة حديثا لعلاج بالأوكسين النبضي قبل التلقيح كان له تأثير إيجابي واضح على زيادة تجدد الياقوت مقارنة بتلك الموجودة في ddH₂O (p = 0.00969، الجدول 2C). عند وضعها في ddH_2.0مع تعديل 285 ميكرومولار بحمض الإندول-3-أسيتيك (IAA)، أظهرت القطع السابقة معدل تحويل متوسط 6.67 ± 1.490 لكل معالجة مقارنة بالمعالجة الخالية من الأوكسين، التي بلغت معدل تجدد 2.00 ± 0.816.

تم تصنيف الخط المعدل وراثيا الذي تم تجديده فورا كجيل R1-T1 (الشكل 2)، مع خطوط متجددة فردية. جميع نباتات الوردية R1-T1 الأولية أظهرت تعبيرا من الياقوت على شكل أوراق كيميرية، مع أنماط كيميرية متنوعة. غالبا ما كانت أوراق 1-3 نباتات تعبر عن كيميرا مميزة حيث تتباعد الأنسجة المعبر عنها بواسطة الياقوت والأنسجة غير المعبر عنها عند الضلع الأوسط. حافظت غالبية شتلات R1-T1 التي تبلغ من العمر شهر واحد على تعبير كيميري (الشكل 3A)، لكن تم العثور على عدد قليل من الشتلات التي تعبر بالكامل عن الياقوت.

القطاعات الكيميرية المصبوغة بالياقوت اللاجنسية من قطع أوراق شتلة R1-T1 (الشكل 3B) أعادت تجدد نباتات الوردة الروبي الكاملة أو الكيميرية R1-T1 خلال 2-4 أسابيع بعد الاستئصال (الشكل 3C). بعد شهر واحد، أظهرت معظم شتلات R2-T1 أوراق RUBY بشكل رئيسي، مع بعض الشتلات التي أظهرت مناطق كيميرية صغيرة غير معبرة عنها (الشكل 3D,E).

figure-results-1
الشكل 1: بروتوكول التكاثر النباتي والجدول الزمني. توضح الصور التمثيلية خط الإنتاج المستخدم لإعادة توليد نباتات الوردة اللاجنسية. (أ) إزالة الأوراق الناضجة والصحية والفصوصية الكاملة من النباتات الأم الراسخة وتقطيعها إلى 2-3 قطع. (ب) وضع النباتات الخارجة في صينية التكاثر وصيانتها تحت ظروف محددة. بعد 3 أسابيع، تم استئصال نباتات الوردة من النباتات المستقيمة ونقلها إلى وسط التربة. فيما يلي صورة فعلية للورود المعاد تجديدها لا تزال ملتصقة (سهام وردية) بقصاصة الورقة الأم. هذه النباتات الصغيرة في المرحلة المثلى للنقل. شريط المقياس: 10 مم. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-2
الشكل 2: تحويل قصاصات أوراق R. aquatica وتجديد المحولات التي تعبر عن نسخ RUBY . نظرة رسومية على عملية التحويل وإنتاج المتجددات المتحولة. (أ) الحصول على اللقاح البكتيري. (ب) تحضير صينية تكاثر بورق ترشيح معقم وماء. (ج) استئصال الأوراق إلى قطع من الزرعة. (د) غمر النباتات الخارجية في اللقاح. (ه) تحريك في خلاط دوار لمدة 20 صن/دقيقة واحدة لمدة 10 دقائق. (و) نشر النباتات المشبعة في الصينية، وتغطيها بقبة بلاستيكية، وحضانها في ظروف مظلمة لمدة 72 ساعة. (ج، ه) بعد شهر واحد، إزالة النباتات المتجددة المتجددة سليمة من النباتات المعرضة للبكتيريا الزراعية ونقلها لتأسيس نباتات ناضجة. (I,J) تكرار خطوة الانتشار (G,H) لإنتاج توليد شبه مستنسخ من R2-T1. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-3
الشكل 3: أجيال لا جنسية من خط معدلة وراثيا من RUBY . (أ) شتلة ناضجة من R1-T1 تظهر أوراقا كيميرية تحمل تعبير ياقوت . شريط الميزة: 1 سم. (B) اثنان من عشرين نبتة مستخرجة تم وضعهما حديثا في صينية تكاثر من الشتلة التي عمرها 3 أشهر كما هو موضح في (A). تظهر النباتات الخارجية نمطا كيميريا من RUBY مفصول عند منتصف الضلع. شريط الميزة: 1 سم. (C) نباتات روزيت R2-T1 معاد تجديدها بدرجات متفاوتة من تعبير RUBY الكيميري، بعد شهر من الاستئصال، قبل الزراعة. جذور روبي الإيجابية المعاد توليدها (سهم مارون). شريط الميزة: 2 سم (D) شتلة R2-T1 ظهرت بعد شهر من الزراعة، تظهر تعبيرا عن الياقوت . شريط الميزة: 2 سم (E) شتلة R2-T1 ناضجة بعد 3 أشهر من الزراعة تظهر قطاعات صغيرة (سهام خضراء). شريط الميزان: 2 سم. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا التشكيل.

figure-results-4
الشكل 4: مخطط انسيابي لخط الأنابيب المحسن. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الجدول 1: صيغ الوسائط يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.

الجدول 2: تأثير أربعة معلمات تحسين على كفاءة التحويل في R. aquatica. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.

الجدول 3: تأثير تركيز الأسيتوزرينجون في اللقاح على كفاءة التحول فيR. aquatica. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذه الدراسة، أنشأنا تحولا بسيطا ومباشرا يعتمد على التجدد القائم على الزراعة البكتيريا لنمو R. aquatica، وهو نبات برمائي من عائلة الكرسي يتكاثر فقط لاجنسيا ^10,16. لم يتم إنشاء خط تحول شامل للنباتات البرمائية التي تكاثر نباتيا، ولم يتم استخدام قابلية التحول العملية ل R. aquatica مع علامة بصرية. ومن الجدير بالذكر أن هذا الخط لا يتطلب عملية زراعة أنسجة نباتية معقمة ومرهقة أو حاضنات نمو نباتية متخصصة. وبالتالي، يمكن اعتماد هذا البروتوكول على نطاق واسع في بيئات تجريبية متنوعة من مختبرات البحث العلمي إلى الفصول الدراسية.

من بين ظروف التلقيح والحضانة المختلفة التي تم اختبارها، أحدثت بعض العوامل تحسنا كبيرا في كفاءة التحول. ومن الجدير بالذكر أن تركيزا أعلى قليلا للأسيتوسيرينغون (AS) بالإضافة إلى تركيز حمض الإندول-3-أسيتيك (IAA) أثرا إيجابيا على كفاءة التحول (الجدول 1 والجدول 2). AS هو مركب فينولي يجذب البكتيريا الزراعية، وقد ثبت أنه يحسن كفاءة تحول النبات في أرابيدوبسيس¹⁷. يعد أوكسين النباتي مركزيا لإعادة برمجة خلايا النبات. لوحظ زيادة سريعة في التعبير الجيني المرتبط بالأكسجين خلال عملية التجديد الناتجة عن الجرح¹⁰. لهذا السبب، يمكن الافتراض أن إضافة أكسين خارجيا (IAA) أثناء التطعيم خارج الزرع تزيد من كفاءة التجدد. ومع ذلك، لم تلاحظ فروقات في عدد النباتات المعاد تجديدها من ثلاث تجارب (57 7.55 مقابل 59.67 5.51 للمجموعة مقابل العلاج). لذلك، قد يساعد علاج الأوكسين على الأرجح في عملية التحول بدلا من التجدد نفسه.

مادة خافضة للتوتر السطحي غير أيوني، تريسلان ألكوكسيليات (المعروفة باسم سيلويت L-77)، تزيد بشكل كبير من كفاءة التحول في الأرابيدوبسيس عبر طريقة الغمس الزهري³، ولهذا السبب تستخدم على نطاق واسع بين مجتمع علم الأحياء النباتي. لوحظ إجهاد نباتي طفيف بين النباتات السابقة المعدلة بسيلويت L-77 عند 0.005٪ (وهو التركيز الموصى به للغسيل الزهري). عندما تم مضاعفة هذه الجرعة (0.01٪)، تعرضت قصاصات أوراق R. aquatica لأضرار جسيمة، مما أدى إلى استعادة شبه معدومة من المحولات (الجدول 2B). خلال الغمس الزهري للأرابيدوبسيس، يقلل استخدام المواد الفعالة من التوتر السطحي للمواد الملقحة ويعزز الوصول إلى براعم الأزهار. على النقيض من ذلك، كنوع نباتي برمائي، تطور R. aquatica أوراقا ناعمة خالية من الترايشومات أو الجلد السميك⁵. تسبب زيادة المواد الفعالة في تلف أنسجة الأوراق، مما يشير إلى أن عوامل غير المواد الفعالة يجب أن تعطى الأولوية لكفاءة التحول في أنسجة الأوراق غير المتورمة. المادة السطحية أكثر صلة بالنمط الظاهري للمراهقين، حيث تسهل اختراق الأنسجة. بعد دمج جميع المعلمات المختبرة، يتم توفير خط أنابيب بأفضل الظروف كمخطط تدفق (الشكل 4).

يعد استخدام علامة بصرية، RUBY، عنصرا أساسيا في هذا المسار المحول. روبي هو تقرير صناعي يشفر ثلاثة جينات ترميز (CYP76AD1، DODA، وجلوكوزيل ترانسفيراز) تقوم بتصنيع صبغة حمراء زاهية، بيتالين¹¹. عندما لوحظ تعبير RUBY في متجددات R1-T1، أظهر تعبيرا على شكل قطاعات حمراء، مما يشير إلى أنها على الأرجح كيميرية (الشكل 2 والشكل 3). كشفت دراسة سابقة أن تجديد R. aquatica ينشأ من كامبيوم وعائي لورقة مقطوعة في القسم¹⁰. ومن اللافت أن متجددات R1-T1 تظهر أحيانا حدودا كيميرية على طول الوريد الأوسط، حيث يكون نصف شفرة الورقة أحمر والنصف الآخر أخضر (الشكل 3A,B). أدت إعادة التجدد من قطاعات RUBY أحيانا إلى إنتاج نباتات حمراء بالكامل ذات جذور حمراء (الشكل 3C، السهم المارون)، والتي نمت لاحقا إلى نباتات R2-T1 حمراء موحدة (الشكل 3D). لم تلاحظ أي آثار جانبية لفرط تعبير RUBY على نمو وتطور R. aquatica (الشكل 3). في الدعم، لم تلاحظ فروق ملحوظة في حجم وشكل أوراق وردة R1-T1 مع قطاعات RUBY (مثل الشكل 3B). من الممكن أن أي جين متحول قوي مدفوع بالمحفز التكويني قد يتداخل مع نمو النبات الطبيعي والاستجابة الفسيولوجية.

في بعض المناسبات، طورت هذه النباتات الياقوتية 'شبه المستنسخة' قطاعات خضراء (الشكل 3E، الأسهم الخضراء)، مما يشير إلى ارتكاس أو إسكات الجينات المتنقلة. وهذا يشير إلى أن وجود علامة مرئية مثل RUBY أمر لا غنى عنه للتعبير خارج الرحم أو إسكات (مثل RNAi) لجين ذي اهتمام في الدراسات الجزيئية والميكانيكية المستقبلية. يمكن إدخال جين متحول محل اهتمام إلى شريط روبي وملاحظة الأنماط الظاهرية في قطاعات الياقوتة الحمراء. في الختام، وباستخدام إعادة البرمجة المباشرة الناتجة عن قص الأوراق وعلامة مرئية غير جراحية، تم تحسين خط تحويل بسيط وفعال ل R. aquatica، وهي من فصائلة الكرسي التي تكاثر نباتيا. ورغم أن ذلك خارج نطاق هذا البروتوكول، إلا أن الفهم المستقبلي للأصل الدقيق لتجديد R. aquatica المحولة قد يوفر فهما لإعادة برمجة الخلايا في النباتات.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نعلن أنه لا توجد لدينا تضارب مصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر البروفيسور يونده تشاو على نصيحته بشأن تصميم المتجه لتعديل بلازميدات روبي الحالية؛ الدكتور شوكا إيكيماتسو والبروفيسور سيسوكي كيمورا للنصائح حول التعامل مع R. aquatica ؛ الدكتور إيسي تاكاهاشي للمساعدة في الرسومات. يدعم هذا العمل الأموال الناشئة ووقف كرسي جونسون آند جونسون المئوية لعلم بيولوجيا خلايا النبات من جامعة تكساس في أوستن، ومعهد هوارد هيوز الطبي إلى K.U.T. تم إنشاء الشكلين 1 والشكل 2 في BioRender بواسطة P.E.G. وتم تعديلهما في Adobe Illustrator بواسطة K.U.T.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسم	الشركة	رقم فهرسي
1000 وميكرو؛ رؤوس مطارق LTS منخفضة الاحتجاز مع مصفاة	راينين	30389213
الأسيتوسرينجون	سيغما-ألدرتش	D134406-1G
مستخلص خميرة البكتو، تقني	فيشر ساينتيفك	DF0886-17-0
بي دي باكتو آجار	فيشر ساينتيفك	214030
بي دي ديفكو LB بروث، ميلر	ميدلاند ساينتيفك	DIFCO 244610
التريبتون المجفف ببكتو BD	فيشر ساينتيفك	DF0123-17-3
مسحوق البيوتين المحمول	سيغما-ألدرتش	B4501-100MG
القباب النظيفة لصواني PermaNest	حل المزارع	GD221
غلاف بلاستيكي شفاف	توماس ساينتفيك	22-305654
فيرميكوليت خشن	البكتين
فوسفات الهيدروجين ثنائي البوتاسيوم اللامائي	سيغما-ألدرتش	105109
أطباق بتري ذات الاستخدام الواحد 100 × 15 مم	VWR الدولية	25384-342
دي-مانيتول	سيغما-ألدرتش	M9546-250G
إيثانول، 200 درجة	فيشر ساينتيفك	04-355-720
أنابيب الطرد المركزي المخروطية بسعة فالكون 50 مل	فيشر ساينتيفك	14-432-22
مناشف ورقية مطوية بحجم 9.3" × 10.5"	كيمبرلي-كلارك	2920
مقياس الطيف المرئي GENESYS 30	ثيرمو ساينتفيك	840-277000
محلول الجنتاميسين	سيغما-ألدرتش	G1272-100ML
حمض L-جلوتاميك أحادي الصوديوم الملحي المائي	سيغما-ألدرتش	G1626-100G
كلوريد المغنيسيوم	سيغما-ألدرتش	M8266-100G
كبريتات المغنيسيوم، الهيبتاهيدرات	سيغما-ألدرتش	M9546-250G
هزاز الحاضنة MaxQ 6000	ثيرمو ساينتفيك	SHKE6000
ماء MES	سيغما-ألدرتش	M8250-100G
خليط الملح القاعدي موراشيغي وسكوغ (MS)، مسحوق	سيغما-ألدرتش	M5524-50L
MX-RL-pro: دوار الأنابيب الدوارة	سكايلوجكس	824222019999
ميو-إينوزيتول	سيغما-ألدرتش	I7508-100G
غرفة بيرسيفال للنمو	بيرسيفال	AR36L3
إضافة التربة لزراعة البيرلايت	صناعات PVP	PVP105408
صواني النباتات الدائمة 8''x12''	VWR الدولية	470150-476
مقياس الرقم الهيدروجيني سبعة كومباكت 5220	ميتلر توليدو	30019028
المشرط المحمي	فيشر ساينتيفك	02-688-79
ريفامبيسين	سيغما-ألدرتش	R3501-5G
سماد الإصدار الذكي لطعام النبات	أوسموكوت	B0071CZTBA
كلوريد الصوديوم	فيشر ساينتيفك	S271-3
سبكتينومايسين ثنائي هيدروكلوريد بنتاهيدرات	سيغما-ألدرتش	S4014-5G
زجاجات الرش مع جهاز تبخير المضخة	توماس ساينتفيك	1141V43
أواني قياس مربعة بحجم 3.5 بوصة	شركة جروررز نورسيري سبلاي إنك.	03GA-0350S
سكروز	سيغما-ألدرتش	S0389-5KG
تربة الزراعة الاحترافية صن شاين #4	صن جورو للبستنة	1341CFL0028P S
السطح السطحي- سيلويت L-77	فيشر ساينتيفك	NC1791615
مزيل الفراغ	مستودع المختبر	55207
طعام نباتي متعدد الأغراض قابل للذوبان في الماء	معجزة-غرو	160101

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gelvin, S. B. Agrobacterium-mediated plant transformation: the biology behind the "gene-jockeying" tool. Microbiol Mol Biol Rev. 67 (1), 16-37 (2003).
Hellens, R., Mullineaux, P., Klee, H. Technical Focus: A guide to Agrobacterium binary Ti vectors. Trends Plant Sci. 5 (10), 446-451 (2000).
Clough, S. J., Bent, A. F. Floral dip: A simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana. Plant J. 16 (6), 735-743 (1998).
Zhang, X., Henriques, R., Lin, S. S., Niu, Q. W., Chua, N. H. Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana using the floral dip method. Nat Protoc. 1 (2), 641-646 (2006).
Koga, H., Ikematsu, S., Kimura, S. Diving into the water: Amphibious plants as a model for investigating plant adaptations to aquatic environments. Annu Rev Plant Biol. 75 (1), 579-604 (2024).
Nakayama, H., et al. Regulation of the KNOX-GA gene module induces heterophyllic alteration in North American lake cress. Plant Cell. 26 (12), 4733-4748 (2014).
Ikematsu, S., et al. Rewiring of hormones and light response pathways underlies the inhibition of stomatal development in an amphibious plant Rorippa aquatica underwater. Curr Biol. 33 (3), 543-556.e4 (2023).
Sakamoto, T., et al. A chromosome-level genome assembly for the amphibious plant Rorippa aquatica reveals its allotetraploid origin and mechanisms of heterophylly upon submergence. Commun Biol. 7 (1), 431(2024).
Flora of North America: Volume 7: Magnoliophyta: Dilleniidae, Part 2. , Oxford University Press Inc. 493-506 (2010).
Amano, R., et al. Molecular basis for natural vegetative propagation via regeneration in North American Lake Cress, Rorippa aquatica (Brassicaceae). Plant Cell Physiol. 61 (2), 353-369 (2020).
He, Y., Zhang, T., Sun, H., Zhan, H., Zhao, Y. A reporter for noninvasively monitoring gene expression and plant transformation. Hortic Res. 7 (1), 152(2020).
Hartig, F. DHARMa: Residual Diagnostics for Hierarchical (Multi-Level / Mixed) Regression Models. R package version 0.4.7. , (2024).
Lenth, R. emmeans: Estimated Marginal Means, aka Least-Squares. R package version 1.10.7. , (2025).
McGillycuddy, M., Bolker, B. M., Popovic, G., Warton, D. I. Parsimoniously fitting large multivariate random effects in glmmTMB. J Stat Software. 112 (1), 1-19 (2025).
Bates, D., Mächler, M., Bolker, B. M., Walker, S. C. Fitting linear mixed-effects models using lme4. J Stat Software. 67 (1), 1-48 (2015).
Nakayama, H., Sinha, N. R., Kimura, S. How do plants and phytohormones accomplish heterophylly, leaf phenotypic plasticity, in response to environmental cues. Front Plant Sci. 8, 1717(2017).
Sheikholeslam, S. N., Weeks, D. P. Acetosyringone promotes high efficiency transformation of Arabidopsis thaliana explants by Agrobacterium tumefaciens. Plant Mol Biol. 8 (4), 291-298 (1987).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Agrobacterium RUBY

التحول الفعال القائم على التجدد القائم على الزراعة الجرو بكتيريا لنوع من البراصفة البرمائية اللاجنسية، Rorippa aquatica

في هذه المقالة

ملخص

الملخص

المقدمة

البروتوكول

النتائج

المناقشة

الإفصاحات

شكر وتقدير

المواد

المراجع

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

مقالات ذات صلة