تقييم الوظائف متعددة الوسائط لخلايا مستقبلات المستضدات الكيميرية التائية بدقة خلية واحدة من خلال تحليل البصريات السائدة

Summary

يظهر العلاج التبني لخلايا T باستخدام خلايا CAR-T واعدا في علاج سرطانات الدم، رغم أن الاستجابات الدائمة غير متسقة. الخلايا التائية متعددة الوظائف ترتبط بمتانة الهدوء، لكن الاختبارات القياسية تخفي السكان الفرعيين الرئيسيين. نقدم سير عمل خلية واحدة باستخدام منصة البصريات السائلة لتحديد وعزل خلايا CAR-T عالية الأداء لإجراء دراسات إضافية.

Abstract

العلاج التبني لخلايا T هو نموذج علاجي جديد يتم فيه تعديل الخلايا التائية الذاتية وراثيا للتعبير عن مستقبل مستضد كيمري (CAR) يستهدف الورم قبل التوسع وإعادة التسريب في المريض. على الرغم من المؤشرات الملحوظة على فعالية الأورام المضادة للأورام لدى المرضى الذين يعانون من أورام دموية متقدمة، إلا أن الاستجابات طويلة الأمد لا تظهر في جزء كبير من الحالات. على الرغم من أن عدة عوامل فريدة قد تسهم في تباين النتائج السريرية، إلا أن هناك أدلة متزايدة على أن نسبة الخلايا التائية متعددة الوظائف في منتج خلايا CAR-T قبل التسريب ترتبط ارتباطا وثيقا بمتانة هداف السرطان. للأسف، تعتمد التقييمات القياسية لمنتجات خلايا CAR-T حاليا على قياسات المجموعات السكانية الجماعية أو الاختبارات النهائية، مما يحد من القدرة على عزل ودراسة مجموعات فرعية ذات خصائص وظيفية مرتفعة. هنا، نعرض سير عمل يستخدم منصة البصريات السائدة لتقييم ملف إفراز السيتوكينات وتفعيله عبر تعبير CD137 لخلايا CAR-T الفردية، والذي يمكن دمجه اختياريا مع تقييم النشاط السام. يمكن عزل الخلايا التي تظهر أعلى درجات الوظائف متعددة الوسائط لإجراء تحليلات إضافية لتوجيه تصميم علاجات خلايا CAR-T من الجيل القادم.

Introduction

أظهرت خلايا T التي تعبر عن مستقبلات المستضدات الكيميرية (CAR) قوة مذهلة في مكافحة الأورام لدى المرضى الذين يعانون من أورام دموية خبيثة متقدمة ^1,2. ومع ذلك، فإن نسبة كبيرة من المرضى الذين تم علاجهم ينتكسون في النهاية، مما يبرز الحاجة إلى تطوير منتجات خلايا CAR-T ذات استمرارية وظيفية أكبر 3,4,5,6. على الرغم من أن العديد من العوامل الفريدة قد تساهم في التفاوت في النتائج السريرية، إلا أن هناك أدلة متزايدة على أن نسبة الخلايا التائية متعددة الوظائف في منتج خلية CAR-T قبل التسريب ترتبط ارتباطا قويا بمتانة هدوء السرطان. لذا، يمكن أن تؤدي استراتيجيات لإثراء أو هندسة خلايا CAR-T ذات وظائف متعددة أكثر إلى منتجات علاجية ذات إمكانات محسنة للتوسط في استجابات سريرية طويلة الأمد ^6,7,8. للأسف، تعتمد الطرق الحالية لتوصيف وظائف خلايا CAR-T بشكل كبير على قياسات المجموعات السكانية الجماعية أو الاختبارات النهائية. تحد هذه الخصائص من القدرة على عزل ودراسة مجموعات فرعية محددة ذات خصائص متعددة الوظائف مرتفعة. على سبيل المثال، يتم تقييم إفراز السيتوكينات عادة إما من خلال المواد الفائقة الضخمة أو عبر التلوين داخل الخلية. الأخير يتطلب تثبيت الخلية مقابل معلومات على مستوى الخلية^{الواحدة 9}. وبالمثل، يتم تقييم الجهد السام الخلوي غالبا لمجموعات خلايا CAR-T الضخمة من خلال قياس فقدان قابلية البقاء للخلايا المستهدفة بعد الزراعة المشتركة للخلايا التائية/الخلية المستهدفة¹⁰. القدرة على تقييم إفراز السيتوكينات وتفعيلها ونشاطها التحليلي لخلايا CAR-T القابلة للحياة بدقة خلية واحدة قد تحفز تطوير منتجات علاجية ذات فعالية مضادة للأورام أكثر ديمومة.

هنا، نقدم طريقة لتحليل خلايا CAR-T الفردية في نفس الوقت للوظائف متعددة الوسائط عبر منصة خلية واحدة للبصريات الفلويدية (الشكل 1). يستخدم النظام التموضع البصري الكهربائي (OEP) لتحريك خرزات التقاط السيتوكينات والخلايا الفردية إلى أقلام مفصولة مكانيا، مما يمكن من التقييمات الوظيفية لخلايا CAR-T المفردة (الشكل 2A). في هذا البروتوكول، نعرض سير عمل لتوليد خلايا CAR-T عبر نقل الجينات غير الفيروسية ونقيم إفراز وتنشيط السيتوكينات عبر CD137 لخلايا CAR-T الفردية أثناء الزراعة المشتركة مع خلايا مستضدة معبرة وسلبية للمستضد (الشكل 3 والشكل 4)¹¹. يتم توضيح القدرة على تمييز السيتوكين وملفات التنشيط بين المنتجات الخلوية المعدلة من خلال مقارنة خلايا CAR-T القياسية بخلايا c-Jun التي تعبر بشكل مفرط⁶. يمكن أيضا تقييم النشاط الخلوي السام ضد الخلايا ذات الهدف الواحد باستخدام قراءات تعتمد على الكاسباز أو الفلورة على منصة البصريات السائدة (الشكل 2B). ومع ذلك، يتطلب الأمر تحليل الوقت السريع لتحديد حركية التفاعل، والتي يمكن أن تختلف بشكل كبير لكل بناء وتجربة في CAR. وبالمثل، تتطلب اختبارات القتل المتكررة التي تحاكي التحفيز المزمن سير عمل بديل. لذلك، في هذا المقال، نصف الإجراء الأساسي لإجراء تقييم السمية الخلوية دون مناقشة تطبيقاته التفصيلية.

استنادا إلى التقييم المختار وخصائص الهدف، يمكن تفريغ خلايا CAR-T الحية التي تظهر أعلى درجة من الوظائف متعددة الوسائط من الجهاز ونقلها إلى آبار فردية في لوحة بئر 96 للمزيد من الدراسة (الشكل 2C).

Protocol

ملاحظة: تم توفير المخزن المؤقت وتحضير الوسائط في الجدول 1.

1. عزل خلايا T في CD8 من مخاريط أو مخاريط نظام اختزال الكريات البيضاء

ملاحظة: قم بجميع الخطوات باستخدام تقنية معقمة ومعقمة في خزانة السلامة البيولوجية لزراعة الأنسجة. يجب الحفاظ على جميع الأوساط المستخدمة في التخفيف والغسيل وإعادة التعليق عند 4 درجات مئوية طوال الإجراء.

1. أضف 15 مل من وسط فصل الخلية (كثافة 1.077 جم/مل) إلى كل من أنبوبين مخروطيين بحجم 50 مل (أنبوب فصل).
2. أمسك مخروط نظام تقليل الكريات البيضاء (LRS) (الجانب المخروطي للأسفل) فوق أنبوب مخروطي غير مغلق بحجم 50 مل. باستخدام مقص معقم، قم بقص الأنبوب البلاستيكي الممتد أسفل مخروط LRS. ضع مخروط LRS فوق أنبوب مخروطي مفتوح بحجم 50 مل واقطع الأنبوب البلاستيكي فوقه. اجمع حوالي 8-10 مل من الدم في أنبوب مخروطي بحجم 50 مل.
3. املأ أنبوب المخروط بحجم 50 مل حتى 50 مل ب PBS + EDTA (المحضر كما هو موضح في قائمة الوسائط والمخازن) وماصة لخلط الدم المخفف. قسم الدم المخفف بالتساوي بين أنبوبي الفصل.
4. قم بطرد المركزي في أنابيب الفصل بدم مخفف بقوة 750 × جرام لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT)، مع 9 دقائق كتسارع و2 كتباطئ.
5. باستخدام ماصة مصلية بسعة 10 مل، اجمع بعناية وانقل طبقة البوفي من كل أنبوب فصل إلى أنبوب مخروطي جديد بسعة 50 مل.
6. املأ كل أنبوب مخروطي بسعة 50 مل إلى 40 مل ب PBS + EDTA وأعد تعليقه للحصول على تعليقات خلية واحدة. قم بالطرد المركزي بنظام التعليق أحادي الخلية عند 300 × g لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. استنشق السوبرناتان.
7. أعد تعليق ودمج حبيبات الخلايا في 40 مل من PBS + EDTA. قم بجهاز الطرد المركزي بنظام التعليق أحادي الخلية عند 300 × g لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. استنشق السوبرناتان.
8. أعد تعليق الحبيبات الخلوية في PBS + EDTA وحدد الكثافة الحية لتعليق خلية الدم أحادية النواة (PBMC) المحيطية عبر صبغة Trypan Blue.
   ملاحظة: تريبان بلو هو صبغة غير منفذة في الخلايا الحية تصبغ الحمض النووي. وبالتالي، ستبقى كل من الخلايا الخلفية الخلفية الحية والخلايا غير المجمعة نوويا (أي خلايا الدم الحمراء) غير مصبوغة. من المهم استبعاد الخلايا الصغيرة (مثل خلايا الدم الحمراء) عند تحديد كثافة PBMC القابلة للحياة.
9. نقل العدد المطلوب من خلايا PBMCs إلى أنبوب مخروطي جديد بسعة 50 مل للتراثيب المغناطيسي لخلايا CD8⁺ T. تقدير عدد خلايا ^CD8+ T المطلوبة بمقدار 10 أضعاف كعدد ابتدائي لخلايا PBMCs المطلوبة للإثراء المغناطيسي. حافظ على برودة المواد أثناء الإجراء.
10. قم بالطرد المركزي بنظام تعليق خلية PBMC عند 300 × g لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. استنشق السوبرناتان. أعد تعليق حبيبة الخلية في 40 ميكرولتر من مخزن MACS (المعد كما هو موضح في قائمة الوسائط والمخازن) لكل 1 ×^{10 7} خلايا.
11. أضف 10 ميكرولتر من كوكتيل بيوتين-أب لخلايا CD8⁺ لكل خلية 1 ×^{10 7} . اخلط بالمزج بالماصة واحتضن لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
12. أضف 30 ميكرولتر من مخزن MACS لكل خلية 1 × 10⁷ . أضف 20 ميكرولتر من حبات الخلايا التائية CD8⁺ لكل 1 ×¹⁰ خلايا 7. اخلط عن طريق التقطيع واحتضن لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
13. ضع عمود LS مبرد مسبقا على مغناطيس. ضع أنبوبا مخروطيا بسعة 15 مل تحته لجمع تدفق السائل. توازن كل عمود LS مع 3 مل من مخزن MACS.
14. باستخدام نفس أنبوب المخروط بسعة 15 مل مثل أنبوب التجميع، يتم تطبيق تعليق الخلية على عمود LS المتساوي. اغسل العمود ثلاث مرات باستخدام 1 مل من مخزن MACS. اترك كل غسلة بحجم 1 مل تمر بالكامل عبر عمود LS قبل تطبيق الغسلة التالية.
15. أعد تعليق الخلايا المجمعة بعناية وحدد الكثافة الفعالة للخلايا التائية المغنية CD8⁺ عبر صبغة Trypan Blue.

2. تنشيط الخلايا التائية CD8⁺ باستخدام الخرز

1. احسب عدد خرزات CD3/CD28 البشرية المطلوبة لنسبة 1:1 بين الخلايا التائية إلى الخرز. تحتوي خرزات التنشيط على 1 × 10 أو⁶ خرزات لكل 25 ميكرولتر.
2. قم بتدوير خرز التنشيط بلطف لمدة لا تقل عن 30 ثانية قبل نقل حجم تعليق الخرزات المحسوبة إلى أنبوب مخروطي بحجم 15 مل. أضف كمية مماثلة من الوسط لغسل الخرزات والدوامة لمدة لا تقل عن 5 ثوان.
3. ضع أنبوب المخروطي بحجم 15 مل داخل المغناطيس المناسب لمدة دقيقة واحدة لجمع الخرزات على جانبي الأنبوب. استنشق وتخلص من السوبرناتانت.
4. احسب حجم الوسط المطلوب لتركيز نهائي لخلايا T بمقدار 1 × 10⁶ خلايا ت. قم بإزالة أنبوب المخروط بحجم 15 مل من المغناطيس وأعد تعليقه في الحجم المحسوب لوسط الزرعة. أضف IL-2 البشري المؤتلف إلى تركيز نهائي 50 يورو/مل.
5. انقل الوسط المكمل بالكامل إلى الأنبوب الذي يحتوي على خلايا T وأعد تعليقه. يتم زرع تعليق الخلية في شكل زراعة خلوي مناسب (مثلا، 1 مل في صفائح 48 بئر، 2 مل في صفائح 24 بئر) واحتضن لمدة 40 ساعة.

3. توليد خلايا CAR-T عن طريق نقل الجينات غير الفيروسية عبر النيوليفكشن

ملاحظة: التسخين المسبق للوسط (37 درجة مئوية)، والكواشف (RT)، والطرد المركزي (RT) ضروري لتوفير كفاءة عالية في نقل الجينات.

1. جهز ووضع علامة على صفيحة ب 48 بئر تحتوي على 1 مل من وسط زراعة الخلايا لكل حالة من حالات التكوين النووي. حضن الصفيحة لمدة لا تقل عن 30 دقيقة لتوفير وسط دافئ ومعدل ثاني أكسيد الكربون مع درجة حموضة فسيولوجية.
2. قم بتشغيل النيوكليوفيكتور واختر المواقع التي سيتم تركيبها داخل شريط ال 16 بئرا. اختر البرنامج المناسب (مثل FI-115 الذي يفضل الكفاءة العالية أو EO-115 لزيادة الجدوى).
3. أخرج لوحة زراعة الخلايا التي تحتوي على خلايا T من الحاضنة واستخدم المجهر لفحص المظهر البصري للخلايا، للحصول على انطباع أول عما إذا كان التنشيط ناجحا. يجب أن تظهر الخلايا التائية التي تم تفعيلها بنجاح تجمعا متساويا وشكل خلوي مكبر. يشير لون متوسط يختلف عن وسط جديد إلى لون برتقالي خفيف إلى أن التنشيط أدى إلى حالة أيضية أكثر نشاطا ويعتبر علامة جيدة. في هذه المرحلة، يمكن لتحليل تدفق الخلايا لعلامات التنشيط المبكرة CD25 وCD69 التحقق من التفعيل.
4. أعد تعليق الخلايا التائية المفعلة، وحصدها، وعدها. احسب عدد خلايا T المطلوبة بأخذ 1.2 إلى 2 ×^{10 6} خلايا T لكل شرط. انقل الحجم المحسوب إلى أنبوب مخروطي جديد بحجم 15 مل وجهاز طرد مركزي بقوة 200 × جرام لمدة 10 دقائق عند RT.
5. استنشق وتخلص من الفائق الفائق واغسل خلايا T ب 10 مل من PBS الدافئ. الطرد المركزي عند 200 × جرام لمدة 10 دقائق عند RT. استخدم وقت الطرد المركزي لإذابة البلازميدات المشفرة ل CAR، والتي عادة ما تحتوي على تركيز 1 ميكروغرام/ميكرولتر DNA. تجميع البلازميد المشفر بالترانسبوزاز (SB100x) (1.0 ميكروغرام) أو الدائرة الصغيرة (0.5 ميكروغرام) مع البلازميد المشفر ب CAR (1.0 ميكروغرام) أو الدائرة الصغيرة (0.6 ميكروغرام) في أنبوب طرد مركزي دقيق خال من إنزيمات DNAse بسعة 1.5 مل لكل حالة نوى للوث.
6. حضر كمية كافية من محلول P3 Nucleofector مع إضافة مكمل (حسب الحالة: 16.4 ميكرولتر من محلول النيوكليوفيكتور + 3.6 ميكرولتر من المكملة).
7. خذ أنبوب مخروطي بحجم 15 مل يحتوي على خلايا T من جهاز الطرد المركزي، وجهاز الشفاط الفائق، والطرد المركزي لمدة دقيقة واحدة عند 200 × g لجمع السائل المتبقي في القاع. استخدم ماصة بسعة 200 ميكرولتر لإزالة أكبر قدر ممكن من المخزن بحذر دون لمس حبيبة الخلية.
8. استمر فورا في إعادة تعليق حبيبات الخلية T في 20 ميكرولتر من مخزن P3 (كما هو موضح في قائمة المواد) حسب الحالة. انقل 20 ميكرولتر من تعليق الخلية في مخزن P3 إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق بسعة 1.5 مل يحتوي على الهياكل المعنية، وامزج بلطف دون إدخال الهواء، ثم نقل تعليق الخلية إلى شريط النوى ذو 16 بئرا الآن. انقر بلطف لإزالة أي هواء من قاع البئر.
9. ضع شريط ال 16 بئرا في نظام النيوليفكتور رباعي الأبعاد وابدأ إجراء النيوليفكتور. بعد نجاح النوية، يجب أن يكون هناك تقاطع أخضر ظاهر على الشاشة لكل بئر مختار.
10. أضف فورا 100 ميكرولتر من الوسط المسخن مسبقا من الطبق المحضر ب 48 بئر قبل حضنة شريط 16 بئر لمدة 10 دقائق في الحاضنة.
11. أعد تعليق الخلية بحذر من 2 إلى 3x، وانقل تعليق الخلية إلى الصفيحة المعدة ب 48 بئرا، ثم أعده إلى الحاضنة.
12. بعد 4-5 ساعات، قم بإزالة 500 ميكرولتر بعناية من كل بئر وأضف بعناية 500 ميكرولتر من وسط الزراعة الطازج والمسخن مسبقا مع 50 وحدة وحدة إل-2 المعاد تركيبها في البشر.
13. قم بإجراء تغييرات منتظمة في الوسائط كل يومين لتوسيع الخلايا، مع الحفاظ على كثافة خلوية بين 0.5 و2 × 10⁶ خلايا ترا لكل مل.
14. في اليوم السادس، أزل خرزات تفعيل CD3/CD28. احصد خلايا T عن طريق إعادة تعليق الخلايا بلطف 10 مرات ونقل تعليق الخلية إلى أنبوب مخروطي بحجم 15 مل. ضع أنبوب المخروطي بحجم 15 مل في المغناطيس المعني لمدة دقيقة واحدة.
15. استنشاق تعليق الخلية، ونقلها إلى صفيحة زراعة جديدة، وتغذية الخلايا بوسط زراعة خلايا طازج مكمل ب IL-2 بتركيز نهائي 50 U/mL. يجب أن تبقى الخرزات مرئية في الجدران الجانبية لأنبوب مخروطي بحجم 15 مل المتبقي في المغناطيس.
16. تحليل كفاءة نقل الجينات في اليوم السابع عبر تحليل تدفق الخلايا الخلوية لتعبير CAR أو علامات البديلة قبل الانتقال إلى الفرز المغناطيسي لخلايا CAR T الموجبة للجينات المنقولة في اليوم الثامن (استراتيجية البوابة في الشكل التكميلي 1).

4. الإثراء المغناطيسي لخلايا T الموجبة للجينات المنتقلة

ملاحظة: قم بجميع الخطوات باستخدام تقنية معقمة ومعقمة في خزانة السلامة البيولوجية لزراعة الأنسجة. يجب الحفاظ على جميع الأوساط المستخدمة في التخفيف والغسيل وإعادة التعليق عند 4 درجات مئوية طوال الإجراء.

1. احصد خلايا T عن طريق إعادة تعليقها بلطف ونقلها إلى أنابيب مخروطية بحجم 15 مل. عد الخلايا التائية، خذ عدد الخلايا التي سيتم إثراؤها مغناطيسيا وقم بالطرد المركزي لمدة 10 دقائق عند 300 × جرام.
2. استنشق وتخلص من الفائق الفائق واغسل عن طريق إعادة تعليق 10 مل من مخزن MACS. جهاز طرد مركزي لمدة 10 دقائق عند 300 × جرام. استنشق وتخلص من السوبرناتانت.
3. احسب كمية الأجسام المضادة البيوتينيلية الموجهة ضد العلامة البديلة (مثل tEGFR) المطلوبة. عادة، يجب تعديل الجسم المضاد إلى 1 ميكرولتر لكل 1 ×^{10 خلايا و6} .
4. أعد تعليق خلايا T بكثافة 1 ×^{10 7} خلايا لكل مل وأضف الكمية المحسوبة من الجسم المضاد البيوتينيل. احتضن لمدة 20 دقيقة عند درجة حرارة 4 درجات مئوية.
5. اغسل بإضافة 10 مل من مخزن MACS وجهاز طرد مركزي لمدة 10 دقائق عند 300 × جرام. استنشق وتخلص من السوبرناتانت.
6. أعد تعليق الخلايا التائية عند 1 × 10⁷ خلايا لكل 80 ميكرولتر من مخزن MACS. أضف حبيبات المضادات الحيوية الدقيقة بحجم 20 ميكرولتر لكل 1 ×^{10 خلايا 7} . اخلط جيدا وحضن لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
7. اغسل بإضافة 10 مل من مخزن MACS وجهاز طرد مركزي لمدة 10 دقائق عند 300 × جرام. استنشق وتخلص من السوبرناتانت. أعد تعليق الخلايا في 500 ميكرولتر من مخزن MACS.
8. ضع عمود LS مبرد مسبقا على مغناطيس. ضع أنبوبا مخروطيا بسعة 15 مل تحته لجمع تدفق السائل.
9. توازن كل عمود LS مع 3 مل من مخزن MACS. باستخدام نفس أنبوب المخروط بسعة 15 مل مثل أنبوب التجميع، يتم تطبيق تعليق الخلية على عمود LS المتساوي.
10. اغسل العمود ثلاث مرات باستخدام 1 مل من مخزن MACS. اترك كل غسلة بحجم 1 مل تمر بالكامل عبر عمود LS قبل تطبيق الغسلة التالية.
11. لجمع الخلايا الموجبة للجينات، خذ عمود LS من المغناطيس وضعه في أنبوب مخروطي جديد بحجم 15 مل. أضف 5 مل من مخزن MACS وادفع السائل بلطف خارج العمود.
12. عد الخلايا المعزولة وجهاز الطرد المركزي لمدة 10 دقائق عند 300 × جرام. أعد تعليق الخلايا الموجبة للجينات المترجمة في حجم مناسب من وسط مكمل ب IL-2 وحضن الخلايا حتى إجراء التقييمات الوظيفية و/أو الظاهرية. قم بفحص النقاء قبل بدء سير العمل عن طريق التلوين لعلامة CAR أو علامة النقل البديل (الشكل التكميلي 2).

5. تحضير النظام

1. شغل الجهاز وافتح برنامج تحليل الخلايا (CAS). تأكد من أن حاوية جمع النفايات فارغة. تحقق من وجود ماء في عمود جهاز الترطيب.
2. انتقل إلى لوحة سير العمل. افتح سير عمل Full Clean (محمل مسبقا أثناء تثبيت النظام).
   ملاحظة: يوصى بتشغيل سير عمل Full Clean خلال 72 ساعة من بدء تجربة على الآلة.
3. قم بجميع الفحوصات وتابع بالنقر على ابدأ. عند الطلب، استبدل الأنابيب المخروطية وزجاجات الكواشف في كل فتحة من فتحات الكواشف بحاويات جديدة مع محلول تنظيف BLI. انقر على أيقونة الركض للمتابعة.
4. عند الطلب، استبدل الأنابيب المخروطية وزجاجات الكواشف في كل فتحة من فتحات الكواشف بحاويات جديدة تحتوي على ماء معقم. انقر على أيقونة الركض للمتابعة.
5. افتح سير عمل الفحص المسبقي (محمل مسبقا أثناء تثبيت النظام). قم بجميع الفحوصات وتابع بالنقر على ابدأ.
6. جهز أنبوبا مخروطيا بسعة 50 مل مع محلول ترطيب بسعة 2 مل. جهز أنبوبا مخروطيا منفصلا بسعة 50 مل مع 39.6 مل من 1x DPBS و400 ميكرولتر من مادة الترطيب الإضافية.
7. عند الطلب، استبدل شريحة التدفق بشريحة بصرية فلوئية. انقر على أيقونة الركض للمتابعة. نظف بعناية سطح شريحة البصريات السائدة وطبقة العش بإيثانول بنسبة 70٪ قبل إغلاق الأعشاش.
8. عند الطلب، استبدل الأنابيب المخروطية وزجاجات الكواشف في كل فتحة من فتحات حجرة الكواشف بحاويات جديدة تحتوي على المحاليل المناسبة.

6. إنشاء سير عمل الفحص

1. انتقل إلى لوحة سير العمل. اختر إنشاء سير عمل جديد (+)، ثم اختر تحليل الخلايا البصرية T، ثم اختر تحليل MCA واختبار السمية الخلوية من القائمة المنسدلة.
2. انقر مرتين على تحميل خرزات السيتوكين متعدد الإرسال لتوسيع قائمة تحميل الخرز. إذا كنت تختبر أقل من 3 أهداف سايتوكين، انقر على زر X لحذف خرزات السيتوكين من قائمة تحميل الخرز.
3. حدث كل حقل بنوع الخرزة المناسب، وهدف السيتوكين، وموقع الاستيراد.
   ملاحظة: يقوم برنامج CAS بتحميل كل خرزة التقاط سايتوكين تلقائيا حسب انخفاض سطوع Cy5، بغض النظر عن كيفية ترتيب مدخلات تحميل الخرز.
4. انقر مرتين على أولوية حمل APC مع التحكم لتوسيع قائمة تحميل الخلايا المستهدفة. إذا تم اختبار أكثر من خلية هدف ضابطة واحدة وخط عينة واحد من خلايا الهدف، أضف خطوات تحميل خلية إضافية.
5. قم بتحديث كل حقل باسم خط الخلية المستهدفة المطلوب، وحقل الرؤية المطلوب (FOVs) للقلم، ومعايير اختيار APC (عن طريق تحديد ملف قالب اختيار القلم المستهدف (TPS).
6. اختر تكوين حمل الخلايا T واختر عدة خطوط خلية. انقر مرتين على أولوية حمل الخلايا T لتوسيع قائمة تحميل الخلايا T.
7. قم بتحديث كل حقل باسم خط الخلية T المطلوب، ومجال الرؤية المرغوب في الكتابة، ومعايير اختيار الخلايا T (عن طريق تحديد ملف قالب TPS).
8. انقر مرتين على اختبار السمية الخلوية لتوسيع إعدادات اختبار السمية الخلوية. قم بتحديث حقول إعدادات التصوير الخاصة بسير العمل مع مدة الفحص المطلوبة (h).
9. انقر مرتين على اختبار النمط الظاهري واختبار السيتوكينات لتوسيع بروتوكول التلوين لاختبار إفراز السيتوكينات.
10. قم بتحديث حقل On Chip Staining مع الموقع المناسب للاستيراد للصبغات الأساسية والثانوية.
11. انقر مرتين على تفريغ الخلايا T لتوسيع قائمة التفريغ. قم بتحديث حقل # الصادرات لكل شريحة (بما في ذلك الفراغات) إلى العدد المطلوب من الصادرات. احفظ وافتح سير العمل الذي تم إنشاؤه حديثا.

7. حمولة خرزة التقاط السيتوكينات

1. قم بعمل سونيكيت و/أو دوامة لكل قارورة خرز لإعادة تعليق خرزات الالتقاط بالكامل. حدد تركيز الخرزة عبر عداد الخلايا.
2. اضبط كثافات الخرزات إلى 4.5 × 10⁶ خرزات/مل (خرزات النوع A) أو 4 ×^{10 6} خرزات/مل (خرزات النوع B) في 30 ميكرولتر من مخزن تخفيف الخرز.
3. قم بتخزين تعليق الخرزات عند 4 درجات مئوية حتى يتم طلب التحميل في حجرة تحميل العينات. قم بجميع الفحوصات وتابع بالنقر على ابدأ.
4. عند الطلب، اخلط تعليق خرز السيتوكين مع ماصة بسعة 20 ميكرولتر وحمل تعليق الخرزة في الموقع المناسب للاستيراد. انقر على أيقونة الركض للمتابعة.
5. عند الطلب، افحص بصريا عدة مجال رؤية للتحقق من أن حبيبات الالتقاط قد تم تحميلها بتوزيع متساو عبر القنوات السائلة بكثافة مناسبة. إذا كان توزيع التحميل و/أو الكثافة غير مثاليين، اختر التدفق والاستيراد لإعادة تحميل الخرز. إذا كان توزيع التحميل والكثافة كافيين، اختر Continue لبدء رسم الخرز.
6. كرر الخطوة 7.3 لكل خرزة التقاط للسيتوكين.

8. حمل خلايا الهدف

1. تحديد كثافة الخلايا الحية لكل خط من الخلايا المستهدفة عبر تلوين تريبان بلو.
   ملاحظة: يفترض هذا سير العمل أن الخلايا المستهدفة مصدرها من الثقافات النشطة. إذا كان من المقرر استخدام الخلايا المحجوزة بالتجميد بدلا من ذلك، تأكد من أن الخلايا قد تم زراعتها لمرحلة واحدة على الأقل بعد الذوبان وأنها صالحة للحياة بنسبة لا تقل عن 90٪.
2. اجمع 1 ×^{10 خلايا هدف 6} في أنبوب ميكروفوج بسعة 1.7 مل. الطرد المركزي عند 300 x g لمدة 5 دقائق عند RT. استنشق السوبرناتان.
3. أعد تعليق كل حبيبة من خلايا الهدف في محلول تلوين Annexin V بسعة 100 ميكرولتر. حضن لمدة 30 دقيقة في RT، محميا من الضوء.
4. أضف 400 ميكرولتر من مخزن الربط 1x Annexin V وأعد تعليقها عن طريق التوصيل بالماصة. الطرد المركزي عند 300 x g لمدة 5 دقائق عند RT. استنشق السوبرناتان.
5. أعد تعليق كل حبيبة من خلايا الهدف في 250 ميكرولتر من وسائط التحميل + CaCl₂. تخزين تعليق خلايا الهدف عند 4 درجات مئوية حتى يتم طلب التحميل في حجرة تحميل العينات.
6. عند الطلب، أعد تعليق الخلايا المستهدفة باستخدام ماصة بسعة 200 ميكرولتر وحمل تعليق الخلية المستهدفة إلى موقع الاستيراد المناسب. انقر على أيقونة الركض للمتابعة.
7. عند الطلب، افحص بصريا عدة مجال رؤية للتحقق من أن الخلايا المستهدفة قد تم تحميلها بتوزيع متساو عبر القنوات السائلة بكثافة مناسبة. إذا كان توزيع التحميل و/أو الكثافة غير مثاليين، اختر التدفق والاستيراد لإعادة محاولة تحميل خلايا الهدف. إذا كان توزيع التحميل والكثافة كافيين، اختر متابعة لبدء البوابة عبر TPS.
8. عند الطلب، انتقل إلى العمليات اليدوية، ثم انقر على TPS، وحمل قالب TPS المطلوب.
9. حدد المرشح البصري ومجالات الرؤية التي سيتم تصويرها لتحديد بوابات TPS، ثم انقر على التقاط فقط لبدء التقاط الصورة.
10. افتح محرر تكوين البوابة، اضغط على مربع اختيار Annexin، واختر القناة المناسبة لتلوين Annexin V لمعامل X. من القائمة المنسدلة، اختر سجل (دلتا وسطو السطوع). اختر OEP لمعامل Y. من القائمة المنسدلة، اختر أقرب جار.
11. اسحب زوايا البوابة الناتجة لاستبعاد خلايا^{Annexin V hi} وNearest Neighbor^low ، ثم احفظ قالب TPS دون تغيير اسم الملف.
12. انتقل إلى سير العمل واضغط على متابعة للمتابعة في الكتابة. كرر الخطوات 8.7-8.11 لكل خط من خلية الهدف.

9. حمل خلية T

1. حدد كثافة الخلايا الحية لكل خط من خلايا T باستخدام تلوين تريبان بلو.
   ملاحظة: يفترض هذا السير أن الخلايا التائية مصدرها من الثقافات النشطة. إذا كان من المقرر استخدام الخلايا المحجوزة بالتجميد بدلا من ذلك، تأكد من أن الخلايا قد تم استزراعها طوال الليل بعد الذوبان وأنها قابلة للحياة بنسبة لا تقل عن 90٪.
2. اجمع 1 × 10 خلايا^{T و6} في أنبوب ميكروفوج بسعة 1.7 مل. الطرد المركزي عند 300 x g لمدة 5 دقائق عند RT. استنشق السوبرناتان.
3. أعد تعليق كل حبيبة من خلايا الهدف في محلول تلوين Annexin V بسعة 100 ميكرولتر. حضن لمدة 30 دقيقة في RT، محميا من الضوء.
4. أضف 400 ميكرولتر من مخزن الربط 1x Annexin V وأعد تعليقها عن طريق التوصيل بالماصة. الطرد المركزي عند 300 x g لمدة 5 دقائق عند RT. استنشق السوبرناتان.
5. أعد تعليق كل حبيبة من خلايا T في 250 ميكرولتر من وسائط التحميل + CaCl₂. تخزين معلقات خلايا T عند 4 درجات مئوية حتى يتم طلب التحميل في حجرة تحميل العينات.
6. عند الطلب، أعد تعليق الخلايا المستهدفة بماصة بسعة 200 ميكرولتر وحمل تعليق الخلية T في موقع الاستيراد المناسب. انقر على أيقونة الركض للمتابعة.
7. عند الطلب، فحص عدة مجال رؤية بصريا للتحقق من أن الخلايا التائية قد تم تحميلها بتوزيع متساو عبر القنوات السائلة بكثافة مناسبة. إذا كان توزيع التحميل و/أو الكثافة غير مثاليين، اختر التنظيف والاستيراد لإعادة محاولة تحميل خلايا T. إذا كان توزيع التحميل والكثافة كافيين، اختر متابعة لبدء البوابة عبر TPS.
8. عند الطلب، انتقل إلى العمليات اليدوية، ثم انقر على TPS، وحمل قالب TPS المطلوب.
9. حدد المرشح البصري ومجالات الرؤية التي سيتم تصويرها لتحديد بوابات TPS، ثم انقر على التقاط فقط لبدء التقاط الصورة.
10. افتح محرر تكوين البوابة، اضغط على مربع اختيار Annexin، واختر القناة المناسبة لتلوين Annexin V لمعامل X. من القائمة المنسدلة، اختر سجل (دلتا وسطو السطوع). اختر OEP لمعامل Y. من القائمة المنسدلة، اختر أقرب جار.
11. اسحب زوايا البوابة الناتجة لاستبعاد خلايا^{Annexin V hi} وNearest Neighbor^low ، ثم احفظ قالب TPS دون تغيير اسم الملف.
12. انتقل إلى سير العمل واضغط على متابعة للمتابعة في الكتابة. كرر الخطوات 9.7-9.11 لكل خط من خلية T.

10. اختبار السمية الخلوية

1. تحضير وسط التروية في أنبوب مخروطي بسعة 50 مل بإضافة 100 ميكرولتر من مادة NucView 530 Caspase-3 المذابة مسبقا إلى 20 مل من وسائط الخلايا التائية (تركيز المخزون 1 ملليمول، التركيز النهائي 5 ميكرومتر).
2. عند الطلب، استبدل الأنبوب المخروطي المناسب في فتحات حجرة الكواشف مع الأنبوب المخروطي المحضر الذي يحتوي على وسط التروية. انقر على أيقونة الركض للمتابعة.
   ملاحظة: 20 مل من ميديا التفريغ كافية لتركيب شريحة أوبتوفلويديكس واحدة لمدة 24 ساعة. جهز وسائط تروية إضافية إذا كان اختبار السمية الخلوية سيستمر لأكثر من 24 ساعة.
3. إذا رغب، أنهي أي خطوات متبقية لاختبار السمية الخلوية في أي نقطة بعد مرور 14 ساعة عن طريق الضغط على تخطي بقية تصوير TPS ومتابعة سير العمل.

11. اختبار النمط الظاهري والسيتوكين

1. تحضير محلول التلوين الأولي في أنبوب ميكروفوج بسعة 1.7 مل عن طريق خلط 76 ميكرولتر من الأجسام المضادة لكشف لوحة CD8/NK البشرية متعددة الأبعاد و4 ميكرولتر من مضادات CD137_BV421.
2. اخلط عن طريق استخدام الماصات وخزنها عند 4 درجات مئوية حتى يطلب منها التحميل. عند طلب ذلك، اخلط محلول التلوين الأساسي مع ماصة بسعة 20 ميكرولتر وحمل في مكان الاستيراد المناسب. انقر على أيقونة الركض للمتابعة.
3. جهز محلول التلوين الثانوي في أنبوب ميكروفوج منفصل بسعة 1.7 مل عن طريق خلط 72 ميكرولتر من 1x DPBS مع 8 ميكرولتر من مجموعة التعددية SA-PE.
   ملاحظة: يجب تحضير محلول التلوين الثانوي مسبقا، بحيث يكون جاهزا للتحميل بمجرد اكتمال التلوين الأولي.
4. اخلط عن طريق استخدام الماصات وخزنها عند 4 درجات مئوية حتى يطلب منها التحميل. عند الطلب، اخلط محلول التلوين الثانوي مع ماصة بسعة 20 ميكرولتر وحمل في مكان الاستيراد المناسب. انقر على أيقونة الركض للمتابعة.

12. تحليل الاختبار

1. انتقل إلى سطح المكتب وافتح برنامج Assay Analyzer . اختر محلل الاختبار، ثم اختر سير العمل، ثم اختر نوع سير العمل الذي سيتم تحليله.
2. استخدم أي معيار مرغوب فيه لتحديد أقلام ذات أهمية للتفريغ. قم بإنشاء قائمة التفريغ وفقا للمعايير المطلوبة، ثم عد إلى برنامج CAS واختر استمرار سير العمل المحدد.
3. تحقق من هذا المربع الخاص بقائمة إنشاء التصدير باستخدام Assay Analyzer ل: [معرف شريحة البصريات] محدد.

13. تفريغ الذخيرة

1. جهز صفيحة قاع دائري بسعة 96 بئر مع 50 ميكرولتر من وسائط خلية T لكل بئر. انقر على الاستمرار للمضي قدما في تفريغ الجهاز.
2. عند الطلب، افتح حجرة تحميل الشريحة، وافتح غطاء العش، وأخرج شريحة البصريات السائدة. ضع الشريحة في طبق بتري معقم، مع رفع الحافة العلوية لشريحة البصريات السائدة بدرجة >1 لمنع الخلايا من الخروج من الأقلام. خزنها في حاضنة زراعة أنسجة معقمة خلال خطوة الغسل التالية.
3. ضع شريحة فلاش معقمة في العش الفارغ، أغلق غطاء العش، ثم أغلق حجرة الشقائق. انقر على تم ثم متابعة.
4. عند الطلب، افتح حجرة تحميل الشريحة، وافتح غطاء العش، وأزل شريحة التدفق. أعد شريحة البصريات السائدة إلى العش الفارغ، ثم أغلق غطاء العش، ثم أغلق حجرة الشريحة. انقر على أيقونة الجري للمتابعة.
5. عند الطلب، اختر فتح لعرض قائمة لوح البئر (load/unload plate ). انقر على إلغاء التحميل لإزالة اللوحة السابقة. قم بتحديث معرف لوحة البئر ونوع لوحة البئر، اختر Load، ثم اختر Done.
6. انقر على الاستمرار للمضي قدما في تفريغ الجهاز. بعد تفريغ جميع الأقلام المطلوبة، انتقل إلى العمليات اليدوية وافتح حجرة الشرائح لاسترجاع اللوحة التي تحتوي على الخلايا المعنية.

Results

باستخدام البروتوكول المذكور، تحدينا خلايا T المختلطة ذات النواة الوهمية، وخلايا CAR، وخلايا CAR المعبر بشكل مفرط عن c-Jun مع خلايا ورم سلبية للمستضد أو إيجابية للمستضدات في الشكل 3 K562، أو تركناها غير محفزة (فقط خلايا T فقط). تم تقييم الخلايا المستهدفة من حيث تعبيرها المتجانس للمستضد كشرط مسبق للنتائج القابلة للتكرار (الشكل التكميلي 3). نظرا لعزلها في أقلام نانوية مفردة، تمكنا من توصيف ملفات تعبير السيتوكينات لهذه الخلايا على أنها منتجة مفردة أو مزدوجة أو ثلاثية، اعتمادا على الحالة التي تم اختبارها (الشكل 3). تم التحقق من هذه النتائج باستخدام ELISA كطريقة معتمدة للكشف عن السيتوكينات (الشكل التكميلي 4).

كما هو متوقع، بقيت غالبية الخلايا التائية المزيفة سلبية لجميع السيتوكينات الثلاثة المقاسة (TNF-α، IFN-γ، وIL-2). بين خلايا CAR T القياسية، تم اكتشاف منتجي السيتوكينات IFN-γ الإيجابية المزدوجة والثلاثية والمفرزة الواحدة، بالإضافة إلى أجزاء صغيرة من الخلايا التي تفرز TNF-α وIL-2، عند تحدي المستضد، بينما لم يتسبب التعرض لخلايا الورم السلبية للمستضد إلى إفراز السيتوكينات متعددة الخلايا. ومن المثير للاهتمام أن التعبير الزائد ل c-Jun زاد من نسبة منتجي السيتوكينات المزدوجة والثلاثية، بالإضافة إلى الخلايا التي تفرز السيتوكين الواحد، عند اللقاء، مما قلل من النسبة الكلية للخلايا السلبية للسيتوكينات مقارنة بخلايا CAR T القياسية. تتوافق هذه النتائج مع تقارير سابقة تصف التعديل الظاهري لخلايا CAR T من خلال التعبير القسري عن عامل النسخ⁶. ومن الجدير بالذكر أننا لاحظنا نسبة أكبر من الخلايا الموجبة IFN-γ في مجموعة الخلايا التائية فقط مقارنة بمجموعة الخلايا الورمية السلبية للمستضد، وقد يكون ذلك بسبب قلة عدد الخلايا التي تم تحليلها في تلك الحالة.

لدراسة تنشيط الخلايا التائية بشكل أعمق، قمنا بتقييم تعبير CD137 في خلايا CAR T الفردية المزيفة التي تم تعريضها للنواة، وخلايا CAR، والخلايا التي تعبر بشكل مفرط عن c-Jun وعولجت كما هو موضح أعلاه (الشكل 4 والجدول التكميلي 1). أدى تحدي خلايا CAR T مع الخلايا المستهدفة K562 المعبرة عن المستضدات إلى زيادة في تعبير CD137 مقارنة بالخلايا المزيفة بالنواة. علاوة على ذلك، لاحظنا اتجاها نحو نسبة أعلى قليلا من خلايا CD137 الموجبة بين خلايا CAR T المفردة في التعبير عن c-Jun مقارنة بمنتج CAR القياسي.

في الختام، مكن البروتوكول الموصوف من تقييم إفراز وتنشيط خلايا CAR T على مستوى الخلية الواحدة، مما أتاح تحديد منتجي السيتوكينات أحادية ومتعددة الخلايا وإعادة ملخص الاتجاهات الظاهرية التي وصفت سابقا على المستوى^{الإجمالي 6}.

الشكل 1: سير العمل التخطيطي للتحليل متعدد الوسائط عبر منصة البصريات السائلة. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 2: صور تمثيلية لميزات منصة البصريات السائدة المختلفة. (أ) استيراد تسلسل الجسيمات المفردة إلى أقلام فردية عبر OEP. الأقلام في الجزء الأيسر من الصور تم تحميلها في التسلسل السابق. (ب) أحداث القتل في ثلاث أقلام فردية على مر الزمن، تظهر خلايا أومية تعبر عن GFP وتعبر عن المستضدات. (ج) تصدير خلية فردية من قلم واحد عبر OEP. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 3: تحليل تمثيلي لملفات إفراز السيتوكينات على مستوى الخلية الواحدة. تم زراعة خلايا T المزيفة أو خلايا CAR-T الفردية المجهولة للنواة في وجود أو غياب خلايا ورم سلبية للمستضد أو إيجابية للمستضد K562 داخل أقلام نانوية تحتوي على حبات التقاط السيتوكينات ل TNF-α وIL-2 وIFN-γ. تظهر الرسوم البيانية الدائرية نسب خلايا CAR-T المحللة بشكل فردي مع ملف إفراز السيتوكينات المشار إليه بعد 24 ساعة من الزراعة المشتركة (تحليل نقطة النهاية). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 4: تحليل تمثيلي لتعبير CD137 على مستوى الخلية الواحدة. تم صبغ خلايا T المزيفة أو خلايا CAR-T الفردية المزيفة للتعبير عن سطح CD137 على شريحة البصريات السائدة، بعد 24 ساعة من الزراعة في وجود أو غياب خلايا ورم K562 سالبة للمستضد أو إيجابية للمستضد. تظهر مخططات الكمان شدة الفلورة لتعبير CD137 على خلايا T المزيفة النواة وخلايا CAR-T بعد 24 ساعة من الزراعة. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

مكونات وسط خلية T (مصفى معقم باستخدام وحدات مرشح تفريغ 0.22 ميكرومولايت)	الحجم (التركيز النهائي)
RPMI-1640 (1x GlutaMAX، 25mM HEPES)	500 مل
البنسلين/ستريبتوميسين (10,000 وحدة وحدة لكل مل)	5 مل (90 وحدة وحدة لكل مل)
β-ميركابتوإيثانول (50 ملممتر)	0.5 مل (45 ميكرومتر)
المصل البشري (معطل الحرارة)	50 مل (9٪)
مكمل جلوتاماكس (100x)	5 مل (0.9x)
مكونات وسط خلايا الورم	الحجم (التركيز النهائي)
RPMI-1640 (1x GlutaMAX، 25mM HEPES)	500 مل
البنسلين/ستريبتوميسين (10,000 وحدة وحدة لكل مل)	5 مل (90 وحدة وحدة لكل مل)
مصل العجل الجنيني (معطل الحرارة)	50 مل (9٪)
مكونات مخزن MACS	الحجم (التركيز النهائي)
DPBS (خالي من Mg2+، خالي من Ca2+)	500 مل
مصل العجل الجنيني (معطل الحرارة)	2.5 مل (0.5٪)
EDTA (0.5 م)	2 مل (2 ملميول)
مكونات مخزن PBS/EDTA	الحجم (التركيز النهائي)
DPBS	500 مل
EDTA (0.5 م)	2 مل (2 ملميول)
مكونات وسائط التحميل	الحجم (التركيز النهائي)
وسط الخلايا التائية	18 مل
كاشف التحميل	2 مل
تحميل مكونات الوسائط + CaCl2	الحجم (التركيز النهائي)
وسائط تحميل	499 ميكرولتر
CaCl2	1.25 ميكرولتر
وسط التروية + ركيزة الكاسباز	الحجم (التركيز النهائي)
وسط الخلايا التائية	20 مل
ركيزة NucView 530 Caspase-3 (1 mM في DMSO)	100 ميكرولتر
مكونات مخزن تخفيف الخرز	الحجم (التركيز النهائي)
DPBS	800 ميكرولتر
BSA (2٪ بدون ضد)	100 ميكرولتر (0.2٪ w/v)
Tween-20 (10٪ ضد الضربة)	10 ميكرولتر (0.1٪ w/v)

الجدول 1: تحضير الوسائط والمخازن.

الشكل 1 الإضافي. استراتيجية تحديد نموذجية لتقييم كفاءة نقل الجينات قبل الإثراء المغناطيسي. تظهر مخططات الكونتور والمخطط التكراري النموذجي استراتيجية البوابات لتحديد خلايا CAR T المعبر عن CAR (tEGFR الإيجابية) بعد إجراء نقل الجينات. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الشكل الإضافي 2. التحكم في النقاء بعد الفرز. تظهر مخططات الكونتور النموذجية نسبة من خلايا CAR T المعبر عن CAR (tEGFR-إيجابي) بعد إجراء الفرز المغناطيسي. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الشكل الإضافي 3. تعبير المستضدات على الخلايا الورمية المستهدفة. تظهر مخططات التكرار التمثيلي خلايا الورم WT K562 أو المعدلة للتعبير عن ROR1 المصبوغ بجسم مضاد متشابك أو ROR1 عبر قياس تدفق الخلية. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الشكل الإضافي 4. كشف السيتوكينات باستخدام ELISA القياسي. تركيزات IL-2 و IFN-γ في الفائق الطبيعي بعد 24 ساعة من الزراعة المشتركة مع خلايا الورم^{K562 ROR1} عند E:T بنسبة 4:1 كما تم قياسها بواسطة ELISA لخلايا CAR مقابل CAR+cJ التائية. الدلالة الإحصائية كما تم تحديدها بواسطة اختبار t غير المقترن مع *P≤ 0.05، **P≤ 0.01، ***P≤ 0.001، ****P≤ 0.0001. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الجدول التكميلي 1: الخلايا التي تم تحليلها. يشير الجدول إلى عدد الخلايا الفردية التي تم تحليلها لكل حالة. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

Discussion

يتيح سير العمل المثبت تقييم إفراز السيتوكينات وملف تفعيل خلايا CAR-T الفردية أثناء الزراعة المشتركة مع الخلايا المستهدفة الإيجابية والسلبية للمستضدات والتي يمكن دمجها اختياريا مع تقييم النشاط التحليلي الخلوي. بينما توفر القدرة على التقاط بيانات وظيفية متعددة الوسائط بدقة خلية واحدة طريقة لتحليل أداء خلايا CAR T بدقة غير مسبوقة، فإن قابلية قياس القياسات تعتمد بشكل كبير على دقة تقنية OEP في تحميل نفس عدد خرزات التقاط السيتوكين، وخلايا الهدف، وخلايا CAR-T في كل قلم. لذا، من الضروري التأكد من تحسين كثافة التحميل ومعايير TPS لكل كاشف أو عينة خلية لتمكين تحميل القطرة الواحدة و/أو الخلية الفردية في كل قلم. بينما يمكن تكييف تركيز التعليق أو الخلوي في قنوات السوائل تمكين تحميل القلم بشكل كاف، فإن خيارات التدفق والاستيراد في المنصة تمثل استراتيجية إضافية لإعادة محاولة عملية التحميل.

ميزة واحدة في تصميم شريحة البصريات هي تقسيم ترتيب القلم إلى 22 مجال رؤية مميز. من خلال تحميل خلايا T مصممة بهياكل CAR مختلفة إلى مجال رؤية مختلفة داخل شريحة البصريات السائلة، تمكنا أيضا من تقييم ما إذا كان بناء بديل يفرض فرط التعبير في c-Jun يمكن أن يعزز توليد خلايا CAR-T ذات الوظائف متعددة الوسائط، مقارنة ببنية CAR القياسية (الشكل 3 والشكل 4). وبهذه الطريقة، توفر منصة البصريات البصرية وسائل لتحديد هياكل CAR المرشحة بسرعة والتي قد تمتلك القدرة على تعزيز متانة الشفاء الناتج عن خلايا CAR-T. ومن الجدير بالذكر أن تحليل التفاعل بين الخلايا المستهدفة والخلايا المؤثرة على مستوى الخلية المفردة يتطلب تحكما حاسما في المعايير الرئيسية، مثل تباين تعبير المستضد المستهدف على خلايا الورم ونقاء مجموعة خلايا CAR-T (الشكل التكميلي 2 والشكل التكميلي 3).

على الرغم من تركيزنا على تقييم إفراز IL-2 وTNF-α وIFN-γ، فإن النطاق الواسع من المحللات القابلة للذوبان التي يمكن اكتشافها عبر لوحات التقاط السيتوكين متعددة القنوات المتوفرة تجاريا يسمح بتخصيص كبير لسير العمل. تبرز التطورات الأخيرة أن المجال يتقدم أيضا في اتجاه القياس الخلوي عالي البعد، مما يفتح آفاقا جديدة للتآزر مع التوصيف الوظيفي لأنواع خلايا المناعة المختلفة^12,13. على سبيل المثال، قد تشمل التطبيقات المستقبلية حملات فحص لتحديد الخلايا التائية التنظيمية متعددة الوظائف التي تعبر عن CAR. تفرز هذه السيتوكينات المضادة للالتهابات متعددة مثل TGF-β وIL-10¹⁴. لذا، يمكن أن تمهد قدرة نظام البصريات السائل على التكيف الطريق لرؤى حاسمة مع توسع العلاجات المناعية الخلوية إلى آفاق جديدة في علاج الأمراض غير الخبيثة.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
نوكليوفيكتور 4-D	لونزا
حبات مضادة للبيوتين	ميلتيني بيوتيك	130-090-485
CD3/CD28 داينابيدز	ثيرمو فيشر	11131D
مجموعة عزل الخلايا التائية CD8+	ميلتيني بيوتيك	130-096-495
أنابيب مخروطية بحجم 15 مل من CELLSTAR (PP)	غرينر بيو-ون	188271-N
أنابيب مخروطية بحجم 50 مل من CELLSTAR (PP)	غرينر بيو-ون	227261
كورنينج 75 سم وأعلى من الطبقة 2; قارورة زراعة خلايا الرقبة المائلة على شكل حرف U مع غطاء ختم القابس	كورنينغ	430720U
كوستار 24-بئر شفاف معالج ب TC متعدد الصفائح، ملفوفة بشكل فردي، معقمة	كورنينغ	3526
كوستار 48-بئر شفافة معالجة ب TC متعددة الآبار، ملفوفة بشكل فردي، معقمة	كورنينغ	3548
متلازمة DPBS، لا كالسيوم، لا مغنيسيوم	ثيرمو فيشر	14190169
مغناطيس دايناماج-15	ثيرمو فيشر	12301D
EGFR (إربيتوكس، سيتوكسيماب)	إيلي ليلي	NDC 66733-948-23	للتصريف الداخلي (البيوتين)
الأجسام المضادة EGFR (C225 (سيتوكسيماب)) [أليكسا فلور 647]	نوفوس بيولوجيالز	NBP2-75903AF647
مصل البقر الجنيني، القيمة	ثيرمو فيشر	A5256801
مكمل جلوتاماكس (100x)	ثيرمو فيشر	35050038
IL-2 ISبشري، درجة ممتازة	ميلتيني بيوتيك	130-097-748
مصل الإنسان	الصليب الأحمر الألماني (DVR) / الصليب الأحمر الألماني (GRC)	لا يوجد
عمود فصل الخلايا في MACS، LS	ميلتيني بيوتيك	130-042-401
MACS MultiStand	ميلتيني بيوتيك	130-042-303
مجموعة P3 للخلية الأولية 4D-Nucleofector X	لونزا	V4XP-3032
بانكول إنسان، الكثافة: 1.077 جم/مل	بان بيوتيك	P04-60500
مجموعة كشف الاستماتة من PE Annexin V I	بكالوريوس العلوم الحيوية	559763
البنسلين-ستريبتوميسين (10.000 U/ml)	ثيرمو فيشر	15140122
مجموعة البيوتينيل والعزل من سطح خلايا بيرس	ثيرمو فيشر	A44390
مجموعة البداية من QuadroMACS (LS)	ميلتيني بيوتيك	130-091-051
RPMI 1640 متوسط، مكمل جلوتامكس، HEPES	ثيرمو فيشر	72400054
الماصات المصلية 2، 5، 10، 25 و50 مل	غرينر بيو-ون	710180, 606180, 607180, 760180, 768180
صبغة تريبان بلو (0.4٪)	ثيرمو فيشر	15250-061
ألترا بيور 0,5  M EDTA، الرقم الهيدروجيني 8,0	ثيرمو فيشر	15575020
β-ميركابتوإيثانول (50 ملميول)	ثيرمو فيشر	31350010
كواشف المنارات
صفيحة دائرية ذات 96 بئر	كورنينغ	3799
شريحة بيكون البلاستيكية للتدفق		500-00030
محلول تنظيف BLI، هيبوغلويت الصوديوم، 0.825٪	بروكر	520-08000
مصل البقر الألبومين (BSA)	سيغما-ألدرتش	A4161
الجسم المضاد المضاد للبشر من Brilliant Violet 421 CD137 (4-1BB)	الأسطورة الحيوية	309820
كلوريد الكالسيوم (CaCl2)	سيغما-ألدرتش	C5670
LEGENDplex Human IFN-& GAMMA؛ خرز التقاط B3، 13X	الأسطورة الحيوية	740545
LEGENDplex Human IL-2 Capture Bead A5، 13X	الأسطورة الحيوية	740934
أجسام مضادة لكشف لوحة الثانوية البشرية في LEGENDplex V02	الأسطورة الحيوية	741041
ليجندبليكس إنسان TNF-α خرزة التقاط B7، 13X	الأسطورة الحيوية	740711
ليجند بليكس SA-PE	الأسطورة الحيوية	740452
ركيزة NucView 530 Caspase-3، 1 ملليمولار في DMSO	Hö إزيل	B-10406
شريحة OptoSelect 3500	بروكر	500-12001
أزيد الصوديوم	سيغما-ألدرتش	S2002
20 سنة	سيغما-ألدرتش	P1379
مخزن تصدير نباتي	بروكر	520-00040
زجاجات VWR Media Bottles، مربع، PETG، 125 مل	VWR	216-2265
زجاجات وسائط VWR، مربعة، PETG، 500 مل	VWR	216-2267
مادة الترطيب	بروكر	520-08016
محلول البلل	بروكر	520-00009