تحليل الحمض النووي الميكروبي في الحقل باستخدام مجموعة حقل الاستخراج البيولوجي ووحدة qPCR الميدانية

Summary

تعد أشكال تحليل الحمض النووي القابلة للنشر ميدانيا الموثوقة والدقيقة ضرورية للعديد من الصناعات. تقدم هذه الورقة طريقتين لتحليل الميكروبات البيئي في الميدان: 1) عزل الحمض النووي الميكروبي من العينات البيئية باستخدام مجموعة حقل استخراج بيولوجي، و2) تحليل الحمض النووي عبر وحدة qPCR الميدانية.

Abstract

مع تبني PCR الكمي (qPCR) بشكل أوسع في الصناعات، أصبحت القدرة على استخراج وتحليل الحمض النووي في بيئات نائية دون عقبات لوجستية أمرا ضروريا. مثال واضح على ذلك هو الحاجة إلى أدوات مباشرة لقياس البكتيريا المسببة لتحلل الملوثات في المواقع النائية المتأثرة بانحلاك القطارات أو انبعاث البترول، مما يتيح تقييم المخاطر والأثر البيئي في الوقت المناسب. لتحقيق ذلك بشكل موثوق، يجب أن تكون العمليات محمولة وخفيفة الوزن، وسهلة الاستخدام لغير العلماء، ومقاومة للتلوث، وقادرة على تحقيق نتائج سريعة مع الحفاظ على مراقبة جودة صارمة. على الرغم من وجود خيارات لاستخراج الأحماض النووية وتحليل qPCR خارج المختبر منذ سنوات، إلا أن التقدم التكنولوجي لم يسمح إلا مؤخرا بتطوير أنظمة قابلة للنشر ميدانيا قادرة على أداء موثوق ودقيق. في هذه الدراسة، نظهر استخدام مجموعة استخراج الحمض النووي الميداني مع أجهزة qPCR المحمولة في ظروف بيئية واقعية. أظهرت التجارب الميدانية التي أجريت في درجات حرارة خارجية محيطة تبلغ حوالي 30 درجة مئوية إنتاجية DNA وكفاءة تضخيم مماثلة لتلك التي تم الحصول عليها في البيئات المختبرية المحكمة. ومن المهم أن النتائج التي تم الحصول عليها في الميدان أظهرت حساسية وقابلية تكرار متكافئة، مما أكد أن سير العمل المحمول يمكن أن يوفر بيانات عالية الجودة دون الحاجة إلى بنية تحتية مختبرية تقليدية. تسلط هذه النتائج الضوء على الإمكانات لإجراء تحليلات جزيئية لامركزية توسع نطاق qPCR إلى بيئات بعيدة ومحدودة الموارد مع الحفاظ على الدقة والموثوقية المطلوبة لاتخاذ القرار.

Introduction

عند النظر في التحليلات البيولوجية الجزيئية، مثل qPCR، هناك عدة قيود على إدارة العينات. مثال واضح هو الطلب على أدوات بسيطة وموثوقة لقياس البكتيريا التي تتلف الملوثات في المواقع النائية المتأثرة بخروج القطارات أو انبعاث البترول، مما يدعم التقييم الفوري للمخاطر والتأثير البيئي 1,2,3,4,5. القيد الأساسي هو أنه مهما حافظت على العينة باردة، يمكن أن تتغير المجتمعات الميكروبية (وستتغير)^{مع مرور الوقت.} لضمان أن تعكس البيانات بدقة البيئة الأصلية التي جمعت منها العينات، يوصى باستخراج الحمض النووي من تلك العينات خلال 24 ساعة^و8 دقيقة. بالنسبة لمهندس يجمع عينات ميكروبية على منصة نفطية بحرية، أو عالم في أعماق غابة مطيرة، فإن هذا الجدول الزمني غير ممكن. الحصول على عينة ماء أو تربة من أحد هذه المواقع النائية إلى شركة شحن في نفس اليوم ثم إرساله إلى مختبر طوال الليل (مع الحفاظ على التبريد)، حيث يمكن استخراج الحمض النووي قبل التحليل، أمر مستحيل ببساطة.

بمجرد استخراج الحمض النووي، تتوقف الساعة، وتحفظ المعلومات الجينية الكاملة للعينة إلى أجل غير مسمى باستخدام تقنيات التخزين الصحيحة⁹. وهذا يجعل الحمض النووي المستخرج فريدا للغاية مقارنة بالغالبية العظمى من العينات الكيميائية والمعدنية والبيولوجية - التي لها عمر افتراضي محدود. يمكن استرجاع الحمض النووي المؤرشف بعد سنوات أو عقود وتحليله بحثا عن أهداف جديدة على منصات جديدة. لهذا السبب، من الضروري أن يمثل الحمض النووي المستخرج فعلا المجتمع الميكروبي الأصلي، وليس المجتمع المتغير الناتج عن الانتقال المؤجل.

بالإضافة إلى ذلك، فإن الحاجة إلى مختبر لاستخراج وتحليل العينات تحد بشكل كبير من المرونة والاتساق في برامج أخذ العينات. تكلفة اللوجستيات وحدها قد تكون باهظة لبعض المشاريع¹⁰. إن القدرة على تحليل العينات، وقياس الأهداف الجينية ذات الاهتمام بدقة خلال ساعات أو حتى دقائق من أخذ العينة، تفتح العديد من الأبواب أمام مشاريع بيئية حول العالم.

Protocol

ملاحظة: تم تنفيذ البروتوكول التالي باستخدام مجموعة Bio-Extract Kit (مجموعة حقل الاستخراج البيولوجي) وqPCR FieldQuant (qPCR القائم على الحقل).

1. أخذ عينات الكتلة الحيوية من المياه الجوفية وبروتوكول عزل الحمض النووي باستخدام مرشح مغلف ومجموعة حقل استخراج بيولوجي

1. ارتد قفازات ونظارات أمان في جميع خطوات الخطوة الأولى.
2. جهز المضخة والأنابيب البيريستالية وتطهير البئر باستخدام التطهير القياسي، وفقا لتوجيهات أخذ عينات المياه الجوفية من وكالة حماية البيئة (EPA)¹¹.
3. قم بإزالة الفلتر المغلف، والمحول، والمشابك، والأغطية من أنبوب الطرد المركزي المرفق (الشكل 1).
4. مرر الأنبوب (1/4-5/16 بوصة قطر داخلي [معرف]) عبر المشبك المرفق وشد المشبك لتثبيت الخرطوم بمحول اللوئر القفل (الشكل 2).
5. قم بتوصيل مدخل الفلتر بمحول Luer-Lock المثبت في الخطوة السابقة.
6. ضع الفلتر داخل وعاء استقبال حتى يمكن قياس كمية الماء المصفاة بدقة.
7. قم بتصفية ما يصل إلى 1 لتر من الماء باستخدام معدلات تدفق منخفضة (<0.5 لتر/دقيقة). كمية الماء المفلترة تختلف حسب عكارة الماء.
   1. إذا انسد المرشح قبل ترشيح 1 لتر، توقف واستمر إلى الخطوة التالية.
      ملاحظة: تحليل الحمض النووي حساس ويمكن إجراؤه بسعة لا تتجاوز 10 مل، حسب الكتلة الحيوية للنظام.
8. سجل يدويا حجم الصوت الذي مر عبر الفلتر بالمليلتر (mL). تخلص من الماء المصفى.
9. أغلق الفلتر من كلا الطرفين. تأكد من إغلاق الطرف الرقيق بالغطاء الأحمر والطرف السميك مغلقا بسدادة Luer-Lock البيضاء.
10. أعد الفلتر إلى الأنبوب البلاستيكي المرفق.
11. ثبت الملصق على أنبوب الطرد المركزي وسجل كمية الماء التي مرت عبر المرشح، والموقع، وتاريخ أخذ العينة، والتحليلات المطلوبة. خزنها عند 1-4 درجة مئوية حتى يتم استخراجها.
    ملاحظة: يجب استخراج المرشحات خلال 24 ساعة من أخذ العينة.
12. باستخدام مناديل تحضير الكحول المرفقة، نظف سطحا مستويا يمكن استخدامه لتجهيز عملية الاستخراج (مثل لوح خشبي، باب شاحنة خلفي، إلخ).
13. لاستخراج الحمض النووي، ضع جميع مكونات مجموعة حقل الاستخراج البيولوجي على السطح المستوي والنظيف (الشكل 3).
    1. افتح الغطاء من طرفي الفلتر وضع الأغطية جانبا لاستخدامها لاحقا. ابحث عن واحدة من الحقن بسعة 3 مل وفتحها في المجموعة. اسحب الهواء إلى حقنة 3 مل ووصلها بالفلتر عبر وصلة اللوئر المغلقة.
    2. ادفع الهواء من الحقنة لدفع أي ماء متبقي من الفلتر. افصل الحقنة واسحب المزيد من الهواء قبل تكرار العملية.
    3. كرر ذلك عدة مرات، مع التأكد من دفع أكبر قدر ممكن من الماء خارج الفلتر. أعد ملخص غطاء المقبس الأحمر.
14. اقلب حقنة المحلول A المغلقة عدة مرات لضمان خلطها جيدا. أزل غطاء حقنة اللوير المغلقة.
15. قم بتوصيل حقنة المحلول A بمدخل فلتر 0.2 ميكرومتر المغلف عبر طرف قفل اللور، وأضف ببطء كل محلول A عن طريق الضغط على المكبس. الدفع بسرعة كبيرة قد يسبب ضغطا خلفيا، لذا تأكد من خفض المكبس ببطء. إذا كان انسداد الفلتر يمنع إضافة الحل A، قم بإزالة غطاء المخرج الأحمر للفلتر وحاول مرة أخرى. أعد ملخص الفلتر.
16. اهز الفلتر المغلق بقوة لمدة 5 دقائق.
    ملاحظة: لمنع التعب، يمكن تجهيز عدة عينات لهذه الخطوة، ويمكن مذاجة جميعها يدويا في نفس الوقت. إذا كان متاحا، يمكن استخدام خلاط دوامة قابل لإعادة الشحن لأداء هذه الخطوة بدلا من الهز اليدوي.
17. اقلب حقنة المحلول B المغلقة عدة مرات لضمان خلطها جيدا. أزل غطاء قفل اللور من الحقنة.
18. قم بإزالة غطاء مدخل الفلتر المغلف. قم بتوصيل حقنة المحلول B بمدخل الفلتر المغلف عبر طرف قفل اللوئر وأضف كل محلول B ببطء عن طريق الضغط على المكبس. الدفع بسرعة كبيرة قد يسبب ضغطا خلفيا، لذا تأكد من خفض المكبس ببطء. أعد غطاء مدخل الفلتر.
19. اهز الفلتر المغلق بقوة لمدة 5 دقائق.
    ملاحظة: لمنع التعب، يمكن تجهيز عدة عينات لهذه الخطوة وكل منها مصافحة يدويا في نفس الوقت. إذا كان متاحا، يمكن استخدام خلاط دوامة قابل لإعادة الشحن لأداء هذه الخطوة بدلا من الهز اليدوي.
20. أزل غطاء المدخل.
21. مع قلب الفلتر، ادفع 1 مل من الهواء إلى داخل الفلتر باستخدام حقنة 3 مل متصلة بوحدة الفلتر المغلفة، ثم اسحب المكبس للخلف لإزالة أكبر قدر ممكن من الليزات (السائل).
    ملاحظة: إذا كان الليزات لزجا بشكل خاص، فقد يكون من الضروري دفع وسحب المكبس عدة مرات لإزالة المحلول من الفلتر.
22. أضف الليزات إلى أنبوب خرزات بسعة 5 مل. أغلق الأنبوب وأغلقه بطبقة بارافيلم فوقه.
23. اهز الأنبوب يدويا بقوة لمدة 5 دقائق. ضع الأنبوب بشكل مستقيم مع الاستمرار في الدرجات.
    ملاحظة: لمنع التعب، يمكن تجهيز عدة عينات لهذه الخطوة، ويمكن مذاجة جميعها يدويا في نفس الوقت. إذا كان متاحا، يمكن استخدام خلاط دوامة قابل لإعادة الشحن لأداء هذه الخطوة بدلا من الهز اليدوي.
24. مع تجنب تلوث سطح الرقاق، ضع خرطوشة تحضير العينة على سطح مستو.
25. أزل حقنة 1 مل من عبوتها وثبت العمود القابل للقفل بواسطة اللور على نهاية المحقنة. استخدم طرف العمود المدبب لعمل ثقبين في القسم الأول من خرطوشة تحضير العينة.
    تحذير: بعض أجزاء الخرطوشة تحتوي على أملاح فوضوية و/أو إيثانول. ارتد قفازات ونظارات أمان.
26. باستخدام ماصة بلاستيكية حجمية، انقل 1 مل من اللايزات (سائل فقط، وتجنب نقل الخرزات قدر الإمكان) من أنبوب الخرزة إلى الثقب المثقوب حديثا في قسم خرطوشة تحضير العينة الأول. للحصول على أفضل النتائج، أضف الليسات ببطء بزاوية طفيفة عند التوصيل في الفتحة في الرقاق.
27. أعد عمود الحقنة إلى القسم الأحمر من الخرطوشة. اسحب السائل بالكامل إلى الحقنة ثم ادفعه للخارج. قم بتنفيذ حركة الضخ 10 مرات.
28. ادفع كل السائل خارج الحقنة إلى الجزء الأحمر من الخرطوشة قبل الانتقال إلى الخطوة التالية. يجب ألا ينتقل أي سائل من قسم إلى آخر - وهذا ينطبق على كل خطوة متبقية من بروتوكول عزل الحمض النووي للعينة النووي.
29. ضع طرف عمود الحقنة المدبب فوق القسم الأحمر البرتقالي وثقب فتحتين عبر حاجز الرقاق. استخدم المكبس لسحب حجم الحقنة بالكامل، والسائل حتى أعلى الحقنة واضخ السائل للخارج بالكامل. كرر هذه الخطوة مرة واحدة ليصبح المجموع مضختين، مع دفع كل السوائل للخارج. لا تنقل أي سائل إلى الخطوة التالية.
30. ضع طرف عمود الحقنة المدبب فوق القسم البرتقالي وثقب ثقبين في حاجز الرقاق. استخدم المكبس لسحب كامل حجم السائل من الحقنة إلى داخل الحقنة وضخ المضخة للخارج بالكامل. لا تنقل أي سائل إلى الخطوة التالية.
31. ضع طرف عمود الحقنة المدبب فوق القسم الأصفر واثقب مرتين عبر حاجز الرقاقة. استخدم المكبس لسحب كامل حجم السائل من الحقنة إلى داخل الحقنة وضخ المضخة للخارج بالكامل. لا تنقل أي سائل إلى الخطوة التالية.
32. ضع طرف عمود الحقنة المدبب فوق القسم الأزرق الجاف بالهواء واثقب حاجز الورق مرة واحدة فقط. استخدم المكبس لسحب كامل حجم الهواء من الحقنة إلى داخل الحقنة ثم ضخ بسرعة للخارج. كرر بسرعة هذا الضخ على الأقل 20 مرة حتى يبدو العمود جافا.
33. ضع طرف عمود الحقنة المدبب فوق القسم الأخضر الأخير واثقب حاجز القصدير مرتين. استخدم المكبس لسحب كامل حجم السائل من الحقنة إلى داخل الحقنة وضخ المضخة للخارج بالكامل. كرر هذه الخطوة ليصبح المجموع 5 مضخات.
34. باستخدام الحقنة بسعة 1 مل وعمود تحضير العينة، انقل كل المحلول من القسم الأخضر إلى أنبوب ميكرو بحجم 1 مل موسوم جيدا - وهو عينة الحمض النووي المستخرجة من الميدان. يخزن عند 1-10 درجات مئوية (مثلا في مبرد باستخدام أكياس الثلج/الثلج، أو في الثلاجة، إلخ) لمدة تصل إلى أسبوع، أو حتى الاستخدام.
    ملاحظة: للتخزين طويل الأمد، يمكن تخزين عينات الحمض النووي عند -20 درجة مئوية إلى أجل غير مسمى.

2. بروتوكول تحليل qPCR القائم على الحقل باستخدام وحدة qPCR ميدانية

ملاحظة: جهاز qPCR الميداني والهاتف الذي يتحكم في الجهاز يعتمد على بطاريات قابلة لإعادة الشحن. تأكد من أن كلاهما مشحون بالكامل قبل السفر إلى الميدان.

1. ضع حتى ثلاث عينات DNA مستخرجة من الحقل في فتحات العينات النقية في الصينية. تأكد من وجود عينة واحدة في كل قسم: عينة واحدة في الفتحات 1 أو 2 أو 3، عينة واحدة في الفتحات 4 أو 5 أو 6، وعينة واحدة في الفتحات 7 أو 8 أو 9.
2. ضع شرائط الفحص لكل عينة في فتحات شرائط A أو B أو C المقابلة على الصينية. قم بمحاذاة أول بئر على الشريط مع أول فتحة في الصينية.
3. افتح الهاتف وافتح التطبيق المسمى على اسم أداة qPCR المسجلة كعلامة تجارية. الهاتف ووحدة qPCR الميدانية متصلان عبر شبكة لاسلكية قصيرة المدى مدمجة. عند فتح التطبيق، اضغط على زر بدء التشغيل .
   ملاحظة: التطبيق محمل مسبقا على الهاتف المرفق ولا يمكن تحميله في مكان آخر.
4. في الشاشة التالية، اضغط على زر توليد المعرفات .
5. هذه الشاشة التالية هي المكان الذي يتم فيه إدخال معلومات العينة لكل عينة؛ اضغط تحت معرف العينة واكتب اسم العينة.
   1. اضغط على وحدات العينة واختر وحدة الحجم المناسبة لنوع العينة المستخدمة في الاستخلاص (جرام [g]، مليلتر [mL]، أو مسحة).
   2. ثم اضغط تحت كمية العينة واكتب حجم العينة المستخدم في الاستخراج الميداني أعلاه (مثل الميليلتر من الماء المفلتر). كرر هذه العملية للعينتين المتبقيتين.
   3. عند إدخال معلومات العينة لجميع العينات، اضغط على زر المتابعة .
      ملاحظة: إذا استخدمت أقل من 3 عينات، اترك معرف العينة كالافتراضي، اختر أي وحدة، واكتب 1 في سطر كمية العينة لأي عينات غير مستخدمة للاستمرار.
6. في الشاشة التالية، اضغط على المجلد. انتقل إلى الشاشة التالية واضغط على الحفظ في المجلد الحالي.
7. في الشاشة التالية، اكتب اسم السلسلة واضغط على تأكيد.
8. شغل الآلة بالضغط والضغط مع الاستمرار على زر التشغيل ، الموجود في أعلى يسار الآلة، حتى تضيء جميع الأضواء الأمامية (~5 ثوان). ثم اضغط على تأكيد في التطبيق للمتابعة.
9. في الشاشة التالية، اضغط على الاتصال عبر اللاسلكي المدمج قصير المدى. اضغط على زر اللاسلكي قصير المدى المدمج (رمز مألوف مسجل) فوق الجهاز حتى يبدأ الضوء الأزرق في الوميض. اضغط على تأكيد وانتظر حتى يتزامن التطبيق والآلة معا. بعد مزامنتها، اضغط على اسم الآلة في التطبيق لتحديدها، ثم اضغط على زر التوصيل للمتابعة لتحميل شرائط الاختبار.
   ملاحظة: إذا لم يتزامن الجهاز والتطبيق في المرة الأولى، تأكد من أن الضوء اللاسلكي قصير المدى المدمج على الجهاز لا يزال يومض واضغط على المسح مرة أخرى.
10. قبل إزالة أغطية شرائط الفحص، تحقق من أن الحبيبات المحمولة بالليوفيليا ليست في أعلى أي من آبار شريط الفحص. إذا كانت كذلك، اضغط بلطف على قاع البئر لجعل الحبيبة تسقط إلى أسفل داخل البئر.
11. أزل الأغطية من أنابيب الشريط الكهربائي للعينة الأولى. أضف 18 ميكرولتر من الماء المعقم إلى البئر الأول من شريط الفحص وقم بعمل الماصة بلطف للأعلى والأسفل لإذابة الحبيبة. كرر ذلك للبئرين المتبقيين.
12. أضف 2 ميكرولتر من العينة إلى كل بئر وأغلق الأنابيب بإدخال مجموعة من أغطية شرائط الفحص المطاطية في الأنابيب بحيث تواجه الشقوق بين الأغطية ظهر الصينية. كرر الخطوات 2.10-2.12 للعينات المتبقية إذا لزم الأمر. بمجرد ملء جميع شرائط الفحص وإغلاقها بأغطية الشريط، اضغط على تأكيد في التطبيق.
13. أزل كل شريط اختبار واحدا تلو الآخر وتحقق من وجود فقاعات في قاع الآبار. إذا كانت هناك فقاعات في قاع أي من الآبار، اهز الشريط بلطف ذهابا وإيابا حتى تتحرك الفقاعات نحو أعلى البئر. بعد فحص جميع الآبار، اضغط على تأكيد في التطبيق وتابع تحميل الشرائط في الآلة.
14. افتح غطاء الجهاز ووضع شرائط الفحص في جهاز qPCR الميداني بنفس الترتيب والاتجاه الذي هي عليه على الصينية، بحيث تكون مفصلات البئر والشقوق بين الأغطية تواجه الجزء الخلفي من الآلة. بعد إضافة جميع الشرائط، ادفع الغطاء بلطف حتى يثبت في مكانه واضغط على تأكيد الجهاز.
15. اضغط على زر بدء التشغيل في التطبيق.
    ملاحظة: سيبدأ الجري وسيستغرق ~45 دقيقة لإكماله باستخدام ظروف جري محددة مسبقا. هذه الشروط غير قابلة للتعديل.
16. عند انتهاء التشغيل، اضغط على نتائج البريد الإلكتروني. بمجرد اتصال الهاتف بالواي فاي، سيتم إرسال النتائج للتحليل والتقارير؛ حتى ذلك الحين، يتم تخزين النتائج على الآلة.
    1. بمجرد الاتصال بالواي فاي، سيحتاج المستخدم إلى الضغط على زر الإرسال مرة أخرى لإرسال النتائج.
17. نظف الصينية بين المراحل لتجنب التلوث بين العينات.
    ملاحظة: المخرج هو ملف إكسل يحتوي على قيم عتبة الدورة (Ct) لكل بئر. ترسل هذه النتائج إلى المختبر، الذي يتحقق من جودة التضخيم ويحول قيم Ct إلى وفرة باستخدام منحنيات قياسية موثقة خاصة بكل هدف qPCR وبناء على حجم ومصفوفة العينة الأصلية. ترسل هذه النتائج إلى المستخدم كنسخة إلكترونية بالإضافة إلى ملف PDF.

Results

تم استخراج الحمض النووي من عينات بيئية ممثلة باستخدام كل من مجموعة حقل الاستخلاص البيولوجي وطريقة مختبرية موثوقة للغاية تم وصفها سابقا⁴. كما هو موضح في الشكل 4، تم تأكيد إتمام عزل الحمض النووي باستخدام مجموعة الميدان بنجاح عند مقارنة نتائج qPCR مع طريقة استخراج مختبرية موثوقة للغاية. تؤكد هذه الاتساق أن الطريقة حافظت على سلامة الحمض النووي للعينات البيئية في الميدان.

تظهر مكونات مجموعة qPCR الميدانية في الشكل 5. تم إجراء تحليل لتخفيف الزراعة القياسية لديهالوكوكويدات (DHC) باستخدام وحدة qPCR الميدانية عند درجات حرارة داخلية (21 درجة مئوية) وخارجية (30 درجة مئوية) لتوضيح متانة الجهاز في ظروف الميدان الحقيقية. تظهر النتائج في الشكل 6 الانحراف المنخفض ل 10 تكرارات مختلفة لكل منها. للتوضيح الكامل، DHC هو كائن قادر على تحلل المذيبات المكلورة وغالبا ما يتم قياسه عبر qPCR في صناعة معالجة البيئة⁴.

للتحقق من دقة الأجهزة، تم تحليل DHC بثلاث تركيزات مختلفة باستخدام عشرة أجهزة qPCR حقلية أجريت في نسخ مكررة (الشكل 7). حتى عند الوفرة المنخفضة، ظل الانحراف المعياري النسبي منخفضا (أقل من 5٪) عبر جميع المحاولات. لاحظ أنه، مقارنة بالانحراف المعياري، فإن الانحراف المعياري النسبي مهم للبيانات اللوغاريتمية لأنه يطبع النتائج من خلال المعادلة التالية:

حيث RSD هو الانحراف المعياري النسبي، σ هو الانحراف المعياري لمجموعة البيانات، و μ هو متوسط مجموعة البيانات.

معا، توفر كلتا الطريقتين في هذه الورقة نتائج قابلة للتكرار عبر عمليات استخراج ميداني مكررة واختبارات qPCR. يظهر الاتفاق بين الاستخلاصات الميدانية والمختبرية وتحليل qPCR أن البيانات الموثوقة وعالية الجودة يمكن الحصول عليها دون الاعتماد على البنية التحتية المختبرية، مما يمكن إجراء تحليلات ميكروبية في بيئات بعيدة أو محدودة الموارد.

الشكل 1: مكونات مجموعة المرشح المغلفة. يستخدم المرشح المغلف لترشيح الكتلة الحيوية خارج عينة المياه. عن طريق الاتصال بمضخة بيريستالية عبر الأنابيب، يتم دفع الماء عبر الفلتر. بعد تسجيل الحجم الكلي للماء، يتم التخلص من الماء وتكون الكتلة الحيوية المجمعة على المرشح جاهزة لاستخراج الحمض النووي. المكونات: أ. أنبوب معقم يحمل الفلتر والمكونات قبل وبعد الاستخدام، ب. غطاء المدخل، ج. مشبك الخرطوم، د. محول توصيل أنابيب اللوير المغلفة، ه. فلتر مغلف، و. غطاء مخرج مطاطي. الصورة مستخدمة بإذن من Microbial Insights, ^Inc.12. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 2: وصلة الفلتر والأنابيب. يتم دفع الأنبوب فوق محول توصيل أنبوب اللوئر اللوك ويتم تثبيته في مكانه باستخدام مشبك الخرطوم. الطرف الآخر من الأنبوب متصل بمضخة بيريستالتية (هذا الاتصال وتشغيل المضخة خارج نطاق هذا البروتوكول). الصورة مستخدمة بإذن من Microbial Insights, ^Inc.12. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 3: مكونات مجموعة ميدانية عزل الحمض النووي. جميع المكونات معقمة قبل الاستخدام. تشمل المكونات: (1) مجموعة مرشح مغلفة (انظر الشكل 1 لمزيد من التفاصيل)، (2) حقنة 3 مل، (3) حقنة بسعة 1 مل محملة مسبقا بالمحلول A، مغطاة، (4) حقنة بسعة 1 مل محملة مسبقا بالمحلول B، مغطاة، (5) حقنة 3 مل، (6) أنبوب سيليكون، (7) حقنة بسعة 1 مل مزودة بعمود عزل، (8) ماصنة نقل قابلة للاستخدام مرة واحدة بسعة 1 مل، (9) خرطوشة تحضير عينات عزل الحمض النووي، (10) أنبوب الطرد المركزي الدقيق بسعة 1.5 مل. غير موضوح: مربعات بارافيلم للإغلاق أثناء الرج، ومناديل تحضير الكحول المستخدمة لتنظيف السطح المستخدم في الاستخلاص. الصورة مستخدمة بإذن من Microbial Insights, ^Inc.12. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 4: مقارنة استخراج الحقل باستخدام عينات من العالم الحقيقي. نتائج qPCR مقارنة للحمض النووي المعزولة من عينتين ممثلتين باستخدام طريقة مختبرية (شرائط حمراء) مقابل مجموعة حقل الاستخلاص البيولوجي (الأشرطة الزرقاء). لم يتم تحليل هذه الاختبارات بشكل مكرر، كما هو متوقع في تحليل qPCR القياسي. تظهر أهداف الجينات (محور x) وفرة (محور y) ضمن رتبة حجم في كلتا الطريقتين. لا يتم تضمين معلومات عن كل هدف جيني محدد لأنها خارج نطاق هذه الورقة. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 5: جهاز ومكونات qPCR المعتمد على الحقل. المكونات تشمل: أ. جهاز qPCR المعتمد على الميدان، B. صينية تحضير العينة، شريط اختبار C. يحتوي على كواشف متحملة، D. هاتف محمل مسبقا بتطبيق يستخدم لتشغيل الآلة. الصورة مستخدمة بإذن من Microbial Insights, ^Inc.12. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 6: عرض متانة qPCR في المجال. تم تحليل معيار ديهالوكوكويدس (DHC) في عشرة نسخ تحت ظروف حرارة خارجية (30 درجة مئوية، أشرطة حمراء) وداخلية (21 درجة مئوية، أشرطة زرقاء)، مما أبرز موثوقية الجهاز في الميدان. رقم تشغيل النسخ مدرج على طول المحور x، وكمية DHC المحسوبة مدرجة على طول المحور الصادي. تم حساب متوسط الداخل (20 درجة مئوية) ليكون 4.92 × 10² خلية/مل، SD = 1.14 × 10² خلايا/مل (n = 10)، ومتوسط الخارج (30 °م) 5.89 × 10² خلايا/مل، SD = 1.80 × 10² خلية/مل (n = 10). القياسات التي تم الحصول عليها عند 20 درجة مئوية و30 درجة مئوية لم تختلف بشكل كبير (اختبار ويلش على t، p = 0.17). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 7: عرض دقة qPCR في المجال. أداء دقيق بين 10 آلات مختلفة، تعمل بشكل مكرر بثلاثة تركيزات قياسية مختلفة. القيمة الحقيقية وعدد النسخ (n = 2 ل 10 آلات عند كل تركيز قياسي) مدرجة على طول المحور x، مع أشرطة ملونة خاصة بوحدة الحقل. يظهر المحور y الوفرة المحسوبة لكل جولة. يظهر الانحراف المعياري النسبي لكل تركيز معياري في الخطوط المنقطة فوق الأشرطة. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Discussion

ميزة حاسمة لهذا البروتوكول هي أنه يتيح استخراج الحمض النووي الميكروبي وتحليل qPCR في ظروف ميدانية دون الحاجة إلى بنية تحتية مختبرية^{أو كهرباء}. تم تحسين الطريقة لتحقيق التوازن بين قابلية النقل والموثوقية، مما يوفر نتائج قابلة للتكرار تتوافق مع سير العمل المخبري حتى عند تنفيذها في الهواء الطلق^{تحت نطاق درجات} حرارة محيطة. النطاق المقترح للاستخدام يتراوح بين 4 °م إلى 95 °م (39 °F إلى 104 °F)، وتظهر المقارنة جنبا إلى جنب عند درجات الحرارة الخارجية القياسية (30 °م، 86 °فهرنهايت) لفريق ميداني اتساقا موثوقا (الشكل 6). هذا الاتساق ضروري لضمان أن تكون النتائج الميدانية قابلة للتفسير جنبا إلى جنب مع مجموعات البيانات المختبرية.

تعد هناك عدة خطوات ضرورية لنجاح البروتوكولات. خلال عملية الاستخلاص، يعد الإزالة الكاملة للسائل من المرشحات والخلط الكامل للكواشف أمرا مهما لضمان التحلل الفعال واستعادة الحمض النووي. وبالمثل، فإن النقل الدقيق للليزات إلى خرطوشة تحضير العينة مع تقليل انتقال الخرزات هو أمر أساسي لمنع الانسداد أو فشل الأعمدة. تشمل استراتيجيات استكشاف الأخطاء إبطاء انخفاض المكبس لتقليل الضغط العكسي وتكرار ضخ الحقنة إذا كانت المحللات اللزجة تعيق حركة السوائل. بالنسبة ل qPCR، تجنب الفقاعات في آبار الفحص وضمان إعادة تعليق الحبيبات بالكامل أمر بالغ الأهمية للتضخيم الدقيق.

على الرغم من مزاياها، إلا أن الطريقة لها حدود. قد تكون إنتاجية الحمض النووي أقل من تلك التي تتحقق مع مجموعات الطرد المركزي على الطرد المركزي، ويمكن أن تواجه العينات العكرة أو الغنية بالمواد العضوية أداء الأعمدة. على الرغم من أن مجموعات العزل بسيطة وسهلة الاستخدام لأي شخص - بما في ذلك المستخدمين الذين ليس لديهم خبرة سابقة في المختبر - إلا أن هناك خطرا إضافيا للخطأ عند مقارنة شخص غير متمرس في المجال. بالإضافة إلى ذلك، بينما توفر وحدة qPCR الميدانية نتائج سريعة، إلا أنها مقيدة بعدد محدود من التفاعلات المتزامنة (حاليا محدودة ب 9 أهداف جينية في كل جولة) مقارنة بدورات الدورات الحرارية التقليدية. ومع ذلك، فإن هذه القيود تعوض بسرعة التحليل والقدرة على التقاط ملفات مجتمع الميكروبات في الميدان. لا يوجد قيد جوهري على أهداف qPCR التي يمكن تحليلها سوى كتالوج المختبر الذي يقدم الوحدة.

تكمن أهمية هذه الطريقة في قدرتها على تحريك التحليلات الجزيئية، مما يتيح المراقبة الفورية لتجمعات الميكروبات في بيئات مثل حقول النفط والمواقع الزراعية أو النظم البيئية النائية. من خلال الحفاظ على سلامة الحمض النووي عند أخذ العينات وتوليد النتائج في الموقع، يقلل هذا النهج من الحواجز اللوجستية، ويعزز جودة البيانات، ويسمح باتخاذ قرارات سريعة. قد تشمل التطبيقات المستقبلية مراقبة مسببات الأمراض في الصحة العامة، ومراقبة تقدم المعالجة الحيوية، أو تقييم المخاطر الميكروبية في أنظمة المياه. مع تعديلات طفيفة، يمكن تكييف المنصة باستمرار لأهداف جزيئية إضافية واختبارات qPCR الناشئة.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
أنابيب سيليكون بحجم 5/16"	أمازون (www.amazon.com)	796753613221	قد تكون النماذج البديلة مقبولة
المبردات	ستيبلز (www.staples.com)	24299978	قد تكون النماذج البديلة مقبولة
مجموعة حقل عزل الحمض النووي	Microbial Insights, Inc.	https://microbe.com/bio-extract/	الملكية
وحدة qPCR الميدانية مع الملحقات	Microbial Insights, Inc.	https://microbe.com/fieldquant/	الملكية
القفازات	أمازون (www.amazon.com)	يعتمد على الحجم	قد تكون النماذج البديلة مقبولة
مرشحات المياه الجوفية	Microbial Insights, Inc.	https://microbe.com/wp-content/uploads/2025/08/MI-Sampling-US-01.02-bio-flo_dna_mi.pdf
آيس	متجر صغير محلي	NA
كاموير DIP1500 مضخة بيريستالتيكية 24 فولت 1500 مل/دقيقة هيغ	أمازون (www.amazon.com)	701705886813	قد تكون النماذج البديلة مقبولة
كماشة النووز الإبرية	أمازون (www.amazon.com)	762983170575	قد تكون النماذج البديلة مقبولة
مناشف ورقية	ستيبلز (www.staples.com)	2126874	قد تكون النماذج البديلة مقبولة
نظارات الأمان	أمازون (www.amazon.com)	B0BNHKWR6W	قد تكون النماذج البديلة مقبولة
قلم القلم الرفيع من شاربي	أمازون (www.amazon.com)	71641300033	قد تكون النماذج البديلة مقبولة