يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

عزل وتنقية الحويصلات خارج الخلايا النباتية من أوراق الأرابيدوبسيس باستخدام طريقة جمع غسيل أبوبلاستيك محسنة

1.1K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/69715

⸱

مارس 24, 2026

 ,  ,  , 
1Department of Plant Pathology and Microbiology, Texas A&M University

في هذه المقالة

ملخص

يصف هذا البروتوكول طريقة محسنة لعزل الحويصلات خارج الخلية (EVs) من أوراق الأرابيدوبسيس ثاليانا لدعم التحليلات الجزيئية والوظيفية في مراحل لاحقة.

الملخص

الحويصلات خارج الخلية (EVs) هي جسيمات نانوية مرتبطة بالغشاء تفرزها كائنات وأنواع خلايا متنوعة، وتعرف بشكل متزايد كوسيط مهم للتواصل بين الخلايا وبين الممالك. بينما علم بيولوجيا المركبات الكهربائية الكهربائي راسخ جيدا في أنظمة الثدييات، فإن أبحاث المركبات الكهربائية النباتية حديثة نسبيا وتتوسع بسرعة، مدفوعة جزئيا بالأدلة التي تشير إلى أن المركبات الكهربائية النباتية يمكنها توصيل RNA صغيرة، mRNAs، بروتينات، وشحنات أخرى تشارك في المناعة والتفاعلات بين النبات والميكروبات. ومع ذلك، يظل عزل المركبات الكهربائية النباتية عالية النقاء تحديا تقنيا بسبب جدران الخلايا الصلبة، وكثرة المستقلبات الثانوية، وخطر التلوث السيتوصولي أثناء جمع السوائل المقاومة. يحدد هذا البروتوكول سير عمل مبسط لعزل وتنقية المركبات الكهربائية النباتية من نسيج أوراق الأرابيدوبسيس ثاليانا . تستخدم خطوة تسلل لطيفة تعتمد على الحقنة لتقليل تلف الخلايا وتسرب السيتوسول، بينما يساعد استخدام شفرات أوراق فردية (بدون أعواد أو نسيج وعائي) في تقليل التلوث من المحتويات الوعائية وداخل الخلايا. يتم إثراء الكروماتوغرافيا الكهربائية في البداية بواسطة الطرد المركزي التفاضلي ويمكن تنقيطها أكثر باستخدام التجزئة التدرجية بكثافة السكروز أو الكروماتوغرافيا بتحديد الحجم (SEC). ينتج هذا البروتوكول مركبات كهربائية ذات سلامة هيكلية محفوظة وتقليل التلوث الخلوي من خلال تقليل تلف الخلايا وتسرب السيتوبلازم أثناء جمع السوائل الارتجاعية، كما يتم تقييمه بواسطة تحليل تتبع الجسيمات النانوية والمجهر الإلكتروني الناقل. هذه العينات الكهربائية مناسبة للتطبيقات اللاحقة، بما في ذلك تحليل الحمض النووي الريبي، والبروتيوميات، والاختبارات الوظيفية لدراسات تفاعل النبات والميكروبات. بشكل عام، توفر هذه الطريقة نهجا قابلا للتكرار وقابلا للتكيف للحصول على سيارات كهربائية عالية الجودة للنباتات.

المقدمة

الحويصلات خارج الخلية (EVs) هي جزيئات غشائية مرتبطة بطبقتين دهنية تفرزها مجموعة واسعة من الكائنات الحية، من البكتيريا إلى البشر 1,2. في الأنظمة الحيوانية، تصنف EVs عادة إلى الإكسوسومات، والحويصلات الدقيقة، والأجسام المبوية بناء على مسارات تكوينها البيولوجي وحجمها3. تنشأ الإكسوسومات (~30-150 نانومتر قطرها) من اندماج الأجسام متعددة الحويصلات (MVBs) مع غشاء البلازما، مما يؤدي إلى إطلاق الحويصلات داخل اللمعة4، بينما تنمو الحويصلات الدقيقة (~100-1000 نانومتر قطرها) مباشرة من غشاء البلازما5. بالإضافة إلى الإكسوسومات والحويصلات الدقيقة، تنتج الخلايا الثديية أيضا أجساما استماتة تطلق أثناء موت الخلايا المبرمج6. تم ربط هذه الحويصلات بتعديل المناعة، وتطور الورم، وتوصيل العلاج، مما جعلها موضوعا لأبحاث طبية حيوية مكثفة 7,8. في النباتات، تصنيف EV أقل تحديدا من الحيوانات. وقد حددت الدراسات في الأرابيدوبسيس ثاليانا عدة أنواع فرعية من النباتات الكهربائية المدفوعة بناء على اختلافات في مؤشرات البروتين، والحجم، ومسارات التكوين الحيوي المفترضة. تشمل هذه الحويصلات الإيجابية للتتراسبانين (TET)، والتي تعتبر حويصلات شبيهة بالإكسوسومات مشتقة من أجسام متعددة الحويصلات 9,10، والإيبوتيكات الإيجابية لبروتين السينتاكسين 1(PEN1)، وEVs المشتقة من العضيات الإيجابية للأكياس الخارجية (EXPO)12,13، بالإضافة إلى مجموعات أخرى من العضيات الخارجية مثل EVs المرتبطة بالالتهام الذاتي14 وحبوب اللقاح15.

تشير الأدلة المتزايدة إلى أن النباتات تفرز المركبات الكهربائية كجزء من استراتيجيتها الدفاعية ضد مسببات الأمراض. توفر المركبات الكهربائية النباتية شحنات جزيئية متنوعة، بما في ذلك RNA صغيرة، mRNAs، وجزيئات تنظيمية أخرى، تقمع ضراوة مسببات الأمراض الفطرية والبويضية 10,16,17,18,19. تسلط هذه النتائج الضوء على المركبات الكهربائية كأدوات ل "حرب RNA"، مما يمكن النباتات من قمع تعبير جينات الممرض بشكل مباشر، وهو آلية لها آثار عميقةعلى حماية المحاصيل. بعيدا عن المناعة، قد تساهم المركبات الكهربائية النباتية أيضا في إعادة تشكيل جدار الخلية، والاستجابة للإجهاد، والإشارات التطورية21. على عكس أبحاث المركبات الكهربائية الحيوانية، حيث توجد بروتوكولات العزل والتوصيف الموحدة على نطاق واسع22، لا يزال مجال الطاقة الكهربائية النباتية في مراحله التكوينية. هذا يحد من قابلية التكرار والمقارنة عبر الدراسات، مما يخلق حاجة ملحة لمنهجيات موحدة وقوية لعزل ودراسة هذه الحويصلات.

عزل المركبات الكهربائية النباتية يطرح تحديات تقنية فريدة لم تواجهها الأنظمة الحيوانية. تحتوي الأنسجة النباتية التالفة على نواتج ثانوية وفيرة، وحطام جدار الخلية، وشظايا عضوية يمكن أن تتنقى مع EVs، مما يعقد التوصيف في المراحل التالية23. علاوة على ذلك، فإن سائل الغسيل المقاوم (AWF)، الذي يستخدم عادة كمادة بداية لعزل وتنقية المركبات الكهربائية للنباتات، غالبا ما ينتج مزيجا غير متجانس من الحويصلات والملوثات24. بينما يظل الطرد المركزي التفاضلي نهجا أساسيا مستخدما على نطاق واسع، إلا أنه لا يمكنه حل مجموعات الطرد المركزي التفاضلية المميزة بالكامل أو فصل الجرثومات الكهربائية عن المجمعات الجزيئية الكبيرة المعزولةالمشتركة 25,26. قدمت المراجعات الحديثة والدراسات المنهجية إرشادات مهمة واعتبارات أفضل الممارسات لعزل وتوصيف المركبات الكهربائيةللنباتات 27،28،29،30،31. ومع ذلك، لا يزال تنفيذ ودمج هذه الأساليب عمليا تحديا، وغالبا ما تكون هناك حاجة إلى خطوات تنقية إضافية مثل الطرد المركزي بتدرج الكثافة والكروماتوغرافيا بالإقصاء بالحجم لتحسين نقاء المركبات الكهربائية وقابليتها للتكرار عبر الدراسات.

هنا، نقدم بروتوكولا مبسطا لعزل السيارات الكهربائية عن سائل الغسيل الأبوبلاستيك أرابيدوبسيس باستخدام استراتيجية تنقية متعددة الخطوات. على عكس طرق عزل المركبات الكهربائية الشائعة في النباتات التي تعتمد على تسرب النبات بالكامل بواسطة مضخات التفريغ11، يتجنب هذا البروتوكول إدراج الأعناق والأنسجة الوعائية، مما قد يزيد من التلوث من البنى الوعائية. بدلا من ذلك، تستخدم شفرات أوراق معزولة وطريقة تسلل لطيفة تعتمد على الحقنة لتحسين جمع الأبوبلاست مع تقليل اضطراب الأنسجة. تؤدي المعالجة الدقيقة للأوراق وتوجيهها وظروف الطرد المركزي إلى تقليل التلوث من المكونات داخل الخلية، مما يوفر مادة بداية أنظف لعزل المركبات الكهربائية. بعد الطرد المركزي التفاضلي، يمكن تنقية الكهرومغناطيسيات الكهربائية بشكل أكبر باستخدام التجزئة التدرجية بكثافة السكروز أو الكروماتوغرافيا بتقنية الاستبعاد بالحجم لتحقيق نقاء ودقة أعلى للحويصلات. تعد التحضيرات الناتجة للطاقة الكهربائية مناسبة جيدا للتطبيقات اللاحقة، بما في ذلك تسلسل الحمض النووي الريبي، والتحليل البروتيومي، والاختبارات الوظيفية مثل تفاعل الممرضات ودراسات امتصاص المركبات الكهربائية، مما يعزز قابلية التكرار وقابلية التفسير في أبحاث المركبات الكهربائية النباتية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

ملاحظة: إجراء خطوات الطرد المركزي في جهاز طرد مركزي مبرد عند 4 درجات مئوية للحفاظ على سلامة السيارة الكهربائية. يجب استخدام أنابيب معقمة. يجب تنفيذ جميع خطوات التعامل مع العينات بسرعة وكفاءة، ويفضل أن يعمل عدة أشخاص بالتوازي، لتقليل تلف الأنسجة ومنع التلوث الذي قد يضر بجودة المركبات الكهربائية.

1. تحضير الأوراق وتسربها

  1. جهز 1 لتر لعازل الحويصلات (VIB) يتكون من 20 ملليمولار هيدرات MES، 2 ملليمولار CaCl2، 0.1 مللي ناكليزر، pH 6.
  2. احصد مناطق الشفرات البعيدة من الأوراق عن طريق قطع قاعدة الشفرة لإزالة الريقات.
    ملاحظة: يوصى بوجود ما لا يقل عن 100 نبتة عمرها أربعة أسابيع لكل معالجة أو نمط جيني لضمان إنتاج كاف من EV. كانت نباتات الأرابيدوبسيس تزرع في دورات ضوئية و16 ساعة ظلام. لا تستخدم أوراقا تظهر عليها علامات إجهاد واضحة، مثل تبييض الأوراق وتجعدها.
  3. اغسل الأوراق بماء التناضح العكسي (RO) ثلاث مرات. ضعها على مناشف ورقية وجففها بلطف.
  4. قم بتحميل حوالي 50 مل من الأوراق في حقنة بسعة 120 مل. اضغط برفق على الحقنة لتثبيت الأوراق.
  5. أضف حوالي 60 مل من VIB إلى الحقنة حتى تغمس الأوراق بالكامل. طرد الهواء المحبوس بالضغط اللطيف على المكبس. اضغط قطعة من البارافيلم مطوية أربع مرات على طرف الحقنة لمنع التسرب.
    ملاحظة: عند إجراء التسريب الفراغي المعتمد على الحقنة، تأكد من أن الحقنة والمكبس مجمعان بإحكام قبل تطبيق الفراغ. اطبق القوة تدريجيا وحافظ على قبضة قوية على الحقنة لمنع حركة المكبس المفاجئة أو فقدان السيطرة.
  6. يتسلل الأوراق عن طريق سحب المكبس ببطء إلى الخارج لخلق فراغ. أمسك المكبس في وضعية التوسيع لمدة 5 ثوان، ثم حرره ببطء. كرر دورة التسلل هذه 2-3 مرات حتى تظهر الأوراق أغمق وشفافة، مما يدل على نجاح التسلل.
  7. ملاحظة: سحب المكبس يتطلب قوة معتدلة بسبب مقاومة الفراغ. يجب تثبيت الحقنة بإحكام أثناء سحب المكبس ببطء للحفاظ على التسلل المضبوط.
  8. بمجرد أن يتم تسلل الأوراق، أخرج المكبس. اسكب الفائض في الحوض.
  9. كرر الخطوات 1.4-1.7 حتى يتم تسلل جميع الأوراق المقطوعة (الشكل 1A).

2. جمع سائل الغسيل المقاوم للعرق (AWF)

  1. اقطع شريط لاصق بطول ~12 بوصة وضعه على الجانب اللاصق للأعلى. ثبت أحد طرفي الشريط بلفه حول حقنة فارغة بسعة 1 مل أسفل الطرف الأعرض مباشرة. رتب بعناية حوالي 50-70 ورقة متسربة في طبقات متداخلة على السطح اللاصق، بحيث يكون قاعدة كل شفرة تواجه الحقنة السفلية وتشير الأطراف للأعلى للجمع (الشكل 1B).
    ملاحظة: وضع عدة أوراق على شريط لاصق واحد يساعد في منع التلف. محاذاة جميع الأوراق بحيث تكون الشفرة متجهة نحو أحد الطرفين وموجها نحو أسفل أنبوب الجمع للسماح باستعادة سائل العزل الجسدي بكفاءة أثناء الطرد المركزي.
  2. لف الأوراق المثبتة بالشريط اللاصق بإحكام حول الحقنة، ثم ثبت الجزء العلوي من الحزمة بشريطين من شريط الويسكي. أدخل الحقنة الملفوفة في أنبوب بسعة 50 مل بحيث يكون طرف الأوراق المقطوع وقاعدة الحقنة موجهة نحو أسفل الأنبوب. تأكد من أن الأوراق مغطاة بشريط لاصق بإحكام، لأن التغليف الفضفاض قد يسبب تلف الأوراق ويطلق خلايا مكسورة تلوث سائل غسل الأبوبلاست (الشكل 1B).
  3. قم بالطرد المركزي على الحقنة الملفوفة التي تحتوي على أوراق متسربة على حرارة 900 × جرام لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية باستخدام جهاز طرد مركزي مبرد مزود بدوار بزاوية ثابتة. اجمع سائل الغسيل المقاوم في أنبوب مخروطي جديد بسعة 15 مل واحتفظ بالعينة على الثلج. كرر الخطوات 2.1-2.3 حتى يتم استخدام جميع الأوراق لجمع AWF.
    ملاحظة: يجب أن يكون AWF شفافا، وليس أخضر أو حتى أخضر فاتح. يشير الحمض الأخضر إلى وجود البلاستيدات الخضراء/الكلوروفيل، وقد يشير أيضا إلى تلوث الخلايا. لتقليل تلف الأوراق، استخدم دوارا بزاوية ثابتة.

3. عزل الأرابيدوبسيس EV من AWF عبر الطرد المركزي التفريقي

  1. يتم الطرد المركزي لسائل الغسيل المجمع بقوة 2000 جرام لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية باستخدام جهاز طرد مركزي مبرد مزود بدوار دلو متأرجح، مع إعدادات تسارع وتباطؤ قياسية. بعد الطرد المركزي، استخدم فلتر خلية نايلون بحجم 0.45 ميكرومتر لإزالة الحطام الخلوي الكبير من الفائق. تخلص من الحبيبة. انقل المادة الفائقة المفلترة إلى أنابيب طرد مركزي جديدة (الشكل 2).
  2. قم بالطرد المركزي للسائل الفائق المفلتر بحرارة 10,000 × جرام لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية باستخدام جهاز طرد مركزي مبرد مزود بدوار بزاوية ثابتة، مع إعدادات تسارع وتباطؤ قياسية. تخلص من الحبيبات واحتفظ بالسوبرناتينت للعمل فوق الطرد المركزي. تقوم هذه الخطوة أيضا بإزالة الحطام الخلوي الكبير والحويصلات الكبيرة (الشكل 2).
  3. نقل المادة الفائقة إلى أنابيب الطرد المركزي الفائق بسعة 17 مل والطرد المركزي فوق الفائق عند 100,000 × جرام لمدة ساعة واحدة عند 4 درجات مئوية باستخدام جهاز طرد مركزي فائق مزود بدوار دلو متأرجح، مع إعدادات قياسية للتسارع والتباطؤ. بعد الطرد المركزي، تخلص من المادة الفائقة وأعد تعليق الحبيبة في حوالي 16 مل من عازل VIB للغسيل. كرر جولة الطرد المركزي الفائق لجمع المركبات الكهربائية (الشكل 2).
    ملاحظة: يتم إجراء الطرد المركزي عند 100,000 x جرام لترسيب الحويصلات الصغيرة مثل الإكسوسومات. تساعد خطوات الغسل اللاحقة في القضاء على البروتينات غير الكهربائية عن طريق إعادة تعليق الحبيبات في الحافظة الاحتياطية. يجب أن تكون أنابيب الطرد المركزي الفائق متوازنة بعناية حسب الكتلة وفقا لمواصفات الشركة المصنعة قبل الطرد المركزي. افحص الأنابيب والدوارات بحثا عن العيوب قبل الاستخدام وتأكد من تثبيت الدوار بشكل صحيح قبل بدء التشغيل.
  4. تخلص من الفائق وأعد تعليق الرصاصة في VIB. استخدم رأس الماصة لكشط أسفل الأنبوب بلطف لتسهيل استعادة الرصاصة الكهربائية بالكامل (الشكل 2).
    ملاحظة: غالبا ما تكون رصاصة EV شفافة وقد لا تكون قابلة للكشف بصريا عند إعادة تعليقها. الكشط الخفيف لأسفل الأنبوب يسهل عملية إعادة تعليق السيارة الكهربائية. قم بضبط حجم إعادة التعليق لتحقيق التركيز المطلوب للسيارة الكهربائية، حيث أن أحجام إعادة التعليق الصغيرة تؤدي عادة إلى تحضيرات أكثر تركيزا للسيارات الكهربائية. عادة، إعادة تعليق EVs في 50 ميكرولتر تعطي تركيزات بروتينية تقارب 1-1.5 ميكروغرام/ميكرولتر وتركيزات جسيمات تقترب من 10 9-1010 جسيمات/مل.
  5. تخزين المركبات الكهربائية المعلقة عند 4 درجات مئوية للاستخدام الفوري أو عند -80 درجة مئوية للتخزين طويل الأمد دون تجميد مفاجئ في النيتروجين السائل.
    ملاحظة: قد يقلل التخزين طويل الأمد من سلامة المركبات الكهربائية. استخدم السيارات الكهربائية المحضرة حديثا كلما أمكن.

4. استخدام تجزئة تدرج كثافة السكروز لتنقية EV

ملاحظة: الطرد المركزي فوق الفائق وحده يجمع عدة أنواع من الحويصلات. لتحقيق دقة أكبر، يمكن استخدام تجزئة تدرج الكثافة، حيث يتم فصل الحويصلات حسب كثافتها الطفوية وخصائص الطفو. في هذا النهج، تستخدم تدرجات السكروز لإثراء مجموعات فرعية محددة من التوك الكهربائي. بدلا من ذلك، يمكن استخدام تدرجات يوديكسانول.

  1. فصل تدرج السكروز من التحميل العلوي للمركبات الكهربائية
    1. جهز مخزونات تدرج السكروز بنسبة 10-90٪ تتكون من التركيزات التالية: 10٪، 16٪، 22٪، 28٪، 34٪، 40٪، 46٪. 52٪، 58٪، 64٪، 70٪، و90٪ يستخدمون VIB. استخدم حمام ماء بدرجة حرارة 60 درجة مئوية للمساعدة في إذابة مخزون 70٪ و90٪.
    2. جهز تدرج متقطع عن طريق وضع 1 مل من كل محلول سكروز في أنبوب طرد مركزي فائق بسعة 17 مل، بدءا من المحلول الأكثر تركيزا في الأسفل ومتابعة تدريجيا إلى الأقل تركيزا. استبعد طبقة السكروز بنسبة 10٪ عند تجميع التدرج.
      ملاحظة: قم بتوزيع كل طبقة كثافة بعناية على طول الجدار الداخلي للأنبوب لتقليل الخلط بين الطبقات المجاورة. يوصى باستخدام ماصة أوتوماتيكية مضبوطة على سرعة توزيع بطيئة لتوفير تدفق مستمر ومنظم وتحسين استقرار التدرج. إذا تم استخدام ماصة يدوية عادية، يجب إجراء الصرف ببطء وثبات، مع وضع رأس الماصة فوق واجهة الطبقة السابقة مباشرة، مع الحرص على تجنب تكون فقاعات الهواء.
    3. اخلط الحبيبة المعاد تعليق EV (~100 ميكروغرام من بروتين EV) مع محلول السكروز 10٪ بحجم 1 مل. ثم، ضع هذا الخليط كطبقة نهائية من الطبقة المتقطعة. الحجم الكلي سيكون ~12.1 مل.
    4. الطرد المركزي عند 100,000 جرام لمدة 16 ساعة عند 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: لتشغيل الطرد المركزي فوق العالي الممتد، تأكد من أن الأنابيب والمكثفات والدوارات مصنفة للعمل المطول والسرعة العالية واتباع إجراءات التوازن الموصى بها من قبل الشركة المصنعة.
    5. اجمع ستة كسور بحجم 2 مل لكل عينة عن طريق استخدام الماصات من الأعلى. انقل كل جزء إلى أنبوب طرد مركزي فائق جديد بسعة 17 مل.
    6. أعد تعليق الكسور المجمعة في مخزن VIB ~16 مل وجهاز طرد مركزي بقوة 100,000 جرام لمدة ساعة واحدة عند 4 درجات مئوية.
    7. تخلص من السوبرناتانت، ثم أعد تعليق كل حبيبة في 50 ميكرولتر من VIB.
      ملاحظة: رصاصة EV غير مرئية. اكشط أسفل الأنبوب بلطف باستخدام رأس الماصة لإعادة تعليقه من جديد. قم بضبط حجم المخزن حسب الحاجة (مثلا 10 ميكرولتر لتركيز أعلى).
  2. فصل تدرج السكروز من الأسفل للسيارات الكهربائية
    1. جهز مخزونات تدرج السكروز بنسبة 10-90٪ تتكون من تركيزات كالتالي: 10٪، 16٪، 22٪، 28٪، 34٪، 40٪، 46٪، 52٪، 58٪، 64٪، 70٪، و90٪ باستخدام مخزن VIB. استخدم حمام ماء بدرجة حرارة 60 درجة مئوية للمساعدة في إذابة مخزون 70٪ و90٪.
    2. اخلط الحبيبة المعاد تعليق EV (~100 ميكروغرام من بروتين EV) مع محلول السكروز بحجم 1 مل بنسبة 90٪. ثم، قم بوضع هذا الخليط كطبقة أولى من طبقة متقطعة.
    3. جهز تدرج السكروز المتقطع المتبقي عن طريق وضع طبقة متتابعة من 1 مل من كل محلول سكروز فوق خليط السكروز EV-90٪، بدءا من 70٪ سكروز وتدريجيا إلى تركيزات أقل (64٪، 58٪، 52٪، 46٪، 40٪، 34٪، 28٪، 22٪، 16٪، و10٪). قم بتوزيع كل طبقة بعناية على طول جدار الأنبوب باستخدام ماصة لتقليل الخلط بين الطبقات المجاورة. الحجم الكلي سيكون ~12.1 مل.
    4. الطرد المركزي عند 100,000 جرام لمدة 72 ساعة عند 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: لتشغيل الطرد المركزي فوق العالي الممتد، تأكد من أن الأنابيب والمكثفات والدوارات مصنفة للعمل المطول والسرعة العالية واتباع إجراءات التوازن الموصى بها من قبل الشركة المصنعة.
    5. اجمع ستة كسور بحجم 2 مل لكل عينة عن طريق استخدام الماصات من الأعلى. انقل كل جزء إلى أنبوب طرد مركزي فائق جديد بسعة 17 مل.
    6. أعد تعليق الكسور المجمعة في ~16 مل من المخزن الكهفي والطرد المركزي عند 100,000 جرام لمدة ساعة واحدة عند 4 درجات مئوية.
    7. تخلص من السوبرناتانت، ثم أعد تعليق كل حبيبة في 50 ميكرولتر من مخزن VIB.
      ملاحظة: رصاصة EV غير مرئية. اكشط أسفل الأنبوب بلطف باستخدام رأس الماصة لإعادة تعليقه من جديد. قم بضبط حجم المخزن حسب الحاجة (مثلا 10 ميكرولتر لتركيز أعلى).

5. استخدام كروماتوغرافيا استبعاد الحجم (عمود 35 نانومتر) لتنقية المركبات الكهربائية

  1. تحضير المخزن وتوازن الأعمدة
    1. جهز VIB وجميع الدوافع الإضافية طازجة. قم بترشيح جميع المخازن عبر غشاء بحجم 0.22 ميكرومتر وإزالة الغاز تحت الفراغ قبل الاستخدام لمنع تكون فقاعات الهواء وانسداد المسام.
      ملاحظة: إزالة الغازات غير الكاملة أو استخدام المخازن غير المفلترة يمكن أن تدخل فقاعات الهواء أو الجسيمات إلى طبقة الراتنج، مما يؤدي إلى تعطيل التدفق وانخفاض كفاءة فصل المركبات الكهربائية الكهربائية. إذا لوحظت فقاعات في العمود، يجب إيقاف الجريان وإعادة توازن العمود.
    2. اترك العمود والمخازن لتتوازن مع درجة حرارة الغرفة (18-24 درجة مئوية) قبل إزالة أغطية الأعمدة.
      ملاحظة: يجب أن تكون العمود والمخازن موازنة تماما مع درجة حرارة الغرفة قبل إزالة الغطاء. تطبيق حاجز بدرجة حرارة الغرفة على عمود بارد يمكن أن يسبب تكون فقاعات داخل الراتنج، مما يؤدي إلى تشوه ملفات الغسل وتقليل قابلية التكرار.
    3. ضع العمود في وضع مستقيم وأزل الغطاء العلوي للعمود بحذر.
    4. أزل الغطاء السفلي ودع المخزن المؤقت يفرغ تماما من العمود.
      ملاحظة: تأكد من أن مخزن التخزين قد تفريغ بالكامل من العمود قبل التوازن.
    5. توازن العمود عن طريق الغسل بثلاثة أحجام أعمدة (25.5 مل) من مخزن VIB غير الغازي بحجم 0.22 ميكرومتر.
  2. تحميل المركبات الكهربائية وجمع العينات
    1. استخدم 100 ميكروغرام من بروتين EV الكلي لكل تنقية SEC. قبل التحميل على عمود SEC، قم بضبط عينات EV إلى حجم نهائي 500 ميكرولتر باستخدام VIB.
    2. قم بتطبيق نظام تعليق EV بسعة 500 ميكرولتر مباشرة على الفريت التحميل في أعلى العمود.
    3. اترك العينة تدخل طبقة الراتنج بالكامل قبل إضافة مخزن VIB. حافظ على تدفق مستمر للعمود طوال فترة الفصل لضمان التسرب الدقيق حسب الحجم.
      ملاحظة: يجب أن يبقى تدفق العمود مستمرا طوال فترة الفصل. السماح للعمود بالجفاف أو إيقاف التدفق لفترات طويلة يعطل الفصل القائم على الحجم وقد يؤدي إلى تداخل الكسور وتقليل إثراء الطاقة الكهربائية.
    4. بعد دخول عينة EV (500 ميكرولتر) بالكامل إلى طبقة الراتنج، أضف 2 مل من VIB ودعها تتدفق بالكامل. هذا التوزيع يتوافق مع حجم العمود الميت ويجب التخلص منه. ثم تم جمع كسور EV بإضافة 400 ميكرولتر من VIB وجمع القطرات، مع تكرار هذه العملية للحصول على الكسور من 1 إلى 6 في أنابيب الطرد المركزي الدقيق بسعة 1.5 مل.
      ملاحظة: يجب ألا يحتوي حجم الصوت الميت على المركبات الكهربائية. استنادا إلى التحقق باستخدام عمود 35 نانومتر، عادة ما يتم استرداد التوكولات الكهربائية في أجزاء من 1 إلى 3. إذا لزم الأمر، يمكن تقييم الحجم الميت من خلال تحليل تتبع الجسيمات النانوية (NTA) أو الحقن المناعي لتحديد علامات EV لتأكيد غياب المركبات الكهربائية.
  3. تنظيف وتخزين الأعمدة
    1. مباشرة بعد جمع الكسور، غسل العمود بحجم عمود واحد (8.5 مل) بحجم 0.5 مليون نيتول إتش لتعقيم الراتنج. ثم اشطف العمود ب 17 مل من VIB لاستعادة الرقم الهيدروجيني المحايد. ثم يكون العمود جاهزا لتحميل العينة التالية.
      ملاحظة: غسل العمود باستخدام المحلول المؤقت وحده غير كاف لإزالة البروتينات أو الحويصيلات المتبقية. تعد خطوة تنظيف NaOH ضرورية لمنع انتقال الحمض النووي بين العينات، خاصة في تحليلات الأحماض النووية أو RNA في المراحل النهائية.
    2. للتخزين طويل الأمد، غسل العمود بكمية من الماء منزوع الأيونات بعد التنظيف، يليه عمودين من حجم 20٪ إيثانول للتخزين. قم بملخص العمود وخزنها بشكل عمودي.
      ملاحظة: شطف العمود بماء منزوع الأيونات قبل تخزين الإيثانول يمنع تبلور الملح داخل طبقة الراتنج، مما يحافظ على أداء العمود.

6. التحقق من صحة EV، وقياسه، وتقييم الحجم/الشكل

  1. تحليل تتبع الجسيمات النانوية (NTA)
    1. قس توزيع حجم EV وتركيز الجسيمات بواسطة NTA.
    2. تخفيف عينات EV عند 1:100 في VIB معقمة بفلتر 0.2 ميكرومتر لتحقيق تركيز جسيمات ضمن نطاق الكشف الأمثل (حوالي 10⁷-10⁹ جسيمات/مل).
    3. اخلط العينات المخففة بلطف لتجنب تكون الفقاعات وحملها في الجهاز المزود بليزر 532 نانومتر وكاميرا sCMOS عالية الحساسية.
    4. إجراء جمع وتحليل البيانات باستخدام برنامج NS Xplorer بعتبة كشف 10 نانومتر (حتى 1000 نانومتر)، مع تطبيق خوارزمية تركيز ديناميكية قائمة على حجم الملاحظة.
  2. تحليل البقعة الغربية لعلامات المركبات الكهربائية
    1. لتحليل البقعة الغربية، غسل وتعليق كسور EV التي تم الحصول عليها بعد فصل تدرج السكروز بمقدار 50 ميكرولتر من VIB. امزج كمية 10 ميكرولتر من كل جزء مع مخزن تحميل SDS، وتم تفكيكها، وحل على جل تريس-جليسين بنسبة 12٪ قبل الحقن المناعي مع الأجسام المضادة TET8 من علامة EV.
    2. بالنسبة لكسور EV المشتقة من SEC، تركز أولا 400 ميكرولتر من كل جزء إلى 50 ميكرولتر باستخدام مرشح طرد مركزي بوزن جزيئي بوزن 100 كيلو دالتون. ثم استخدم 10 ميكرولتر من العينة المركزة لتحليل البقعة الغربية كما هو موضح أعلاه.
  3. المجهر الإلكتروني الناقل (TEM)
    1. إيداع 5 ميكرولتر من المركبات الكهربائية المعلقة في VIB على شبكات شبكة 300 شبكة كربون-فورمفار بتفريغ توهج. ثم قم بسحب العينة الزائدة باستخدام ورق التصفية.
    2. ثم صبغ الشبكة سلبا ب 3 ميكرولتر من المجهر الإلكتروني، ثم اسحب الشبكة بورق الفلتر، واتركها تجف في الهواء قبل التصوير بتقنية TEM بجهد 300 كيلوفولت.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

لتقييم ما إذا كان بروتوكول جمع AWF المحسن يقلل من تلف الأنسجة والتلوث السيتوبلازمي، تم مقارنة AWF التي تم الحصول عليها باستخدام طريقتنا (الطريقة 1) مباشرة مع طريقة بديلة (الطريقة 2) تعتمد على تسرب مضخة الفراغ للنبات بالكامل11. تم تقييم تلف الخلايا بعد التسرب بواسطة صبغة تريبان بلو، التي أظهرت انخفاضا ملحوظا في التلوين في الأوراق المعالجة باستخدام الطريقة 1، مما يشير إلى مستويات أقل من تمزق الخلايا (الشكل 3A). لتقييم التلوث السيتوبلازم...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

برزت المركبات الكهربائية النباتية كلاعبين محوريين في مناعة النبات، لا سيما في التوسط في التواصل عبر المملكة مع مسببات الأمراض الفطرية32. تظهر الأدلة المتزايدة أن النباتات تفرز EVs في الأبوبلاست، حيث تعمل على توصيل RNA صغيرة (sRNAs)، وmRNAs، وبروتينات يمكنها كبح الضراوة في مسببات الأمراض الغازية، مثل Botrytis cinerea، Rhizoctonia solani، وممرض الأوموسيت Phytophthora capsici 10,18,33

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

المؤلفون لا يكشفون عن أي تضارب مصالح.

شكر وتقدير

يحظى بكالوريوس اللاهوت بدعم من برنامج مسارات زمالة الدكتوراه من جامعة تكساس إيه آند إم. تدعم B.H. صناديق بدء من جامعة تكساس A&M ووزارة الزراعة الأمريكية HATCH 7009138 رقم المشروع: TEX08074.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
0.45 وميكرو؛ مرشحات نايلون MVWR76479-032
1 مل حقنة غير ضروريةبكالوريوس العلوم الحيوية309659
فلتر طرد مركزي فائق بقوة 100 كيلو دالتونأميكونUFC 910008
حقنة 100 مل غير ضروريةبكالوريوس العلوم الحيوية551721050
أنابيب مخروطية بحجم 15 ملVWR89039-664
أنابيب مخروطية بحجم 50 ملVWR89039-656
<إم>أرابيدوبسيس ثاليانا (كول-0)خطوط تديرها المختبرغير قابل للتطبيق
شبكات الشبكة 300 من نوع الكربون-فورمفارتيد بيلا01753-F
شريط شفافشريط السحر الاسكتلنديS-9783
بارافيلمفيشر ساينتيفك13-374-12
مخزن PBSصنع داخلياغير قابل للتطبيق
عمود qEV الأصلي الجيل الثاني 35 نانومترعلوم IZONICO-35
الطرد المركزي المبردإبندورف5810R
دوار الطرد المركزي المبرد بزاوية ثابتةإبندورفF-34-6-38
دوار دلو متأرجح للطرد المركزي المبردإبندورفA-4-62
سكروزVWR470302-810
الطرد المركزي فوق الفائقبيكمان كولترXPN-100
أنابيب الطرد المركزي فوق الفائقبيكمان كولتر337986
صبغة أورانيليسعلوم المجهر الإلكتروني250218-01

المراجع

  1. Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends. J Cell Biol. 200 (4), 373-383 (2013).
  2. Zhou, X., et al. Small extracellular vesicles: The origins, current status, future prospects, and applications. Stem Cell Res Ther. 16 (1), 184(2025).
  3. Colombo, M., Raposo, G., Théry, C. Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles. Annu Rev Cell Dev Biol. 30, 255-289 (2014).
  4. Akers, J. C., Gonda, D., Kim, R., Carter, B. S., Chen, C. C. Biogenesis of extracellular vesicles (EV): Exosomes, microvesicles, retrovirus-like vesicles, and apoptotic bodies. J Neurooncol. 113 (1), 1-11 (2013).
  5. Ratajczak, M. Z., Ratajczak, J. Extracellular microvesicles/exosomes: Discovery, disbelief, acceptance, and the future. Leukemia. 34 (12), 3126-3135 (2020).
  6. Hristov, M., Erl, W., Linder, S., Weber, P. C. Apoptotic bodies from endothelial cells enhance the number and initiate the differentiation of human endothelial progenitor cells in vitro. Blood. 104 (9), 2761-2766 (2004).
  7. Marar, C., Starich, B., Wirtz, D. Extracellular vesicles in immunomodulation and tumor progression. Nat Immunol. 22 (5), 560-570 (2021).
  8. Ruan, S., et al. Extracellular vesicles as an advanced delivery biomaterial for precision cancer immunotherapy. Adv Healthc Mater. 11 (5), e2100650(2022).
  9. Cai, Q., et al. Message in a bubble: Shuttling small RNAs and proteins between cells and interacting organisms using extracellular vesicles. Annu Rev Plant Biol. 72, 497-524 (2021).
  10. Cai, Q., et al. Plants send small RNAs in extracellular vesicles to fungal pathogen to silence virulence genes. Science. 360 (6393), 1126-1129 (2018).
  11. Rutter, B. D., Innes, R. W. Extracellular vesicles isolated from the leaf apoplast carry stress-response proteins. Plant Physiol. 173 (1), 728-741 (2017).
  12. Ding, Y., et al. Exo70e2 is essential for exocyst subunit recruitment and expo formation in both plants and animals. Mol Biol Cell. 25 (3), 412-426 (2014).
  13. Wang, J., et al. Expo, an exocyst-positive organelle distinct from multivesicular endosomes and autophagosomes, mediates cytosol to cell wall exocytosis in Arabidopsis and tobacco cells. Plant Cell. 22 (12), 4009-4030 (2010).
  14. Jeon, H. S., et al. Pathogen-induced autophagy regulates monolignol transport and lignin formation in plant immunity. Autophagy. 19 (2), 597-615 (2023).
  15. Prado, N., et al. Nanovesicles are secreted during pollen germination and pollen tube growth: A possible role in fertilization. Mol Plant. 7 (3), 573-577 (2014).
  16. Samuel, M., Bleackley, M., Anderson, M., Mathivanan, S. Extracellular vesicles including exosomes in cross kingdom regulation: A viewpoint from plant-fungal interactions. Front Plant Sci. 6, 766(2015).
  17. Pinedo, M., De La Canal, L., De Marcos Lousa, C. A call for rigor and standardization in plant extracellular vesicle research. J Extracell Vesicles. 10 (6), e12048(2021).
  18. Huang, Y., et al. Rice extracellular vesicles send defense proteins into fungus rhizoctonia solani to reduce disease. Dev Cell. 60 (8), 1168-1181.e6 (2025).
  19. Wang, S., et al. Plant mrnas move into a fungal pathogen via extracellular vesicles to reduce infection. Cell Host Microbe. 32 (1), 93-105.e6 (2024).
  20. He, B., et al. Publisher correction: Rna-binding proteins contribute to small rna loading in plant extracellular vesicles. Nat Plants. 7 (4), 539(2021).
  21. Rutter, B. D., Innes, R. W. Extracellular vesicles as key mediators of plant-microbe interactions. Curr Opin Plant Biol. 44, 16-22 (2018).
  22. Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (misev2018): A position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. J Extracell Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).
  23. Regente, M., et al. Plant extracellular vesicles are incorporated by a fungal pathogen and inhibit its growth. J Exp Bot. 68 (20), 5485-5495 (2017).
  24. Mu, J., et al. Interspecies communication between plant and mouse gut host cells through edible plant derived exosome-like nanoparticles. Mol Nutr Food Res. 58 (7), 1561-1573 (2014).
  25. Baldrich, P., et al. Plant extracellular vesicles contain diverse small RNA species and are enriched in 10- to 17-nucleotide "tiny" RNAs. Plant Cell. 31 (2), 315-324 (2019).
  26. Regente, M., et al. Vesicular fractions of sunflower apoplastic fluids are associated with potential exosome marker proteins. FEBS Lett. 583 (20), 3363-3366 (2009).
  27. Rutter, B. D., Innes, R. W. Growing pains: Addressing the pitfalls of plant extracellular vesicle research. New Phytol. 228 (5), 1505-1510 (2020).
  28. Thieron, H., et al. Practical advice for extracellular vesicle isolation in plant-microbe interactions: Concerns, considerations, and conclusions. J Extracell Vesicles. 13 (12), e70022(2024).
  29. Borniego, M. L., et al. Diverse plant Rnas coat Arabidopsis leaves and are distinct from apoplastic RNAs. Proc Natl Acad Sci U S A. 122 (1), e2409090121(2025).
  30. Chen, A., He, B., Jin, H. Isolation of extracellular vesicles from Arabidopsis. Curr Protoc. 2 (1), e352(2022).
  31. Koch, B. L., Rutter, B. D., Innes, R. W. Arabidopsis produces distinct subpopulations of extracellular vesicles that respond differentially to biotic stress. bioRxiv. , (2024).
  32. Hamby, R., Cai, Q., Jin, H. RNA communication between organisms inspires innovative eco-friendly strategies for disease control. Nat Rev Mol Cell Biol. 26 (2), 81-82 (2025).
  33. Hou, Y., et al. A phytophthora effector suppresses trans-kingdom RNAi to promote disease susceptibility. Cell Host Microbe. 25 (1), 153-165.e5 (2019).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

عزل وتنقية الحويصلات خارج الخلايا النباتية من أوراق الأرابيدوبسيس باستخدام طريقة جمع غسيل أبوبلاستيك محسنة
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.