مقالة منهجية

اختبار اللويحات المضادة للتكاثر لفحص الجزيئات النشطة حيويا في المختبرات ضد توكسوبلازما غوندي التاكيزويتات

DOI:

10.3791/69725

⸱

يناير 23, 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratório de Quimioterapia de Protozoários Egler Chiari, Departamento de Parasitologia - ICB, Universidade Federal de Minas Gerais

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يهدف هذا العمل إلى وصف طريقة بسيطة لاختبار البلاك للمساعدة في فحص الجزيئات النشطة بيولوجيا جديدة ضد مرحلة التاكيزويت في البروتوزوان توكسوبلازما غوندي.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التوكسوبلازما هو عدوى طفيلية ترتبط عادة بآفات العين والتشوهات الوليدية. منذ أوائل خمسينيات القرن الماضي، اعتمد العلاج الأول لهذا المرض على مزيج من السلفاديازين، البيريميثامين، وحمض الفولينيك. على مدار تلك السنوات، تم إدخال عدد قليل فقط من الأنظمة البديلة. وهذا يبرز الحاجة لاكتشاف جزيئات نشطة حيويا جديدة ضد توكسوبلازما غوندي. نظرا لأن هذا الممرض طفيلي داخل الخلية إلزاميا، فإن الفحص التقليدي للأدوية في المختبر عادة ما يتطلب مواد ومعدات باهظة الثمن، مثل الاختبارات باستخدام بروتينات فلورية أو طفيليات تعبر عن β-جالاكتوسيداز. بالإضافة إلى ذلك، قد تستغرق طرق مثل قياس المجهر البصري وقتا طويلا. اختبار اللويحات هو طريقة تقيم شدة تكاثر مسببات الأمراض داخل الخلية من خلال قياس عدد المناطق ومناطق التدمير في طبقة خلية أحادية الطبقة المتضررة من دورة التحليح للطفيلي. يصف هذا العمل بروتوكول اختبار البلاك المحسنا مصمما لفحص الجزيئات النشطة ضد التاكيزويتات داخل الخلايا ل T. gondii في المختبر. يستخدم هذا البروتوكول مواد رخيصة وإعداد مختبري بسيط، مما ينتج نتائج سريعة وقابلة للتكرار تسهل تحديد جزيئات نشطة جديدة ضد هذا الطفيلي من قبل مجموعات بحثية مختلفة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

داء التوكسوبلازما هو مرض حيواني منتشر غير متجانس حول العالم، ويؤثر على حوالي ثلث سكان العالم 1,2. ترتبط أعراض هذا المرض بدرجة مناعة المضيف وتكاثر الطفيلي 3,4. المرحلة الحادة من المرض، التي تتميز بتكرار مرحلة التاكيزويت، تكون عادة بدون أعراض لدى الأفراد ذوي المناعة العالية 5,6. على النقيض من ذلك، يظهر الأشخاص الذين يعانون من ضعف المناعة بأعراض أكثر تكرارا، بما في ذلك أعراض غير محددة مثل التعب العام، والحمى، بالإضافة إلى التهاب الدماغ والتهاب الشبكية

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تنفيذ التلاعب بزراعة الطفيليات والخلايا، بالإضافة إلى التخلص من النفايات ووجهتها، وفقا للتشريعات البرازيلية، كما هو مطلوب من قبل الوكالة الوطنية للرقابة الصحية (ANVISA) رقم 222/2018. كانت جميع الإجراءات تحت إشراف لجنة السلامة البيولوجية الداخلية (CIBio) التابعة ل ICB-UFMG. هذه الدراسة لا تشمل استخدام أو البشر أو الكائنات المعدلة وراثيا. دعمت منح من CNPq وCAPES وFAPEMIG هذا العمل. ESMD (CNPq 308082/2023-0) وRWAV (CNPq 305574/2021-3) هما زملاء إنتاجية CNPq. المواد المستخدمة والمواد المستخدمة مدرجة في جدول المواد.

1. تحضير وسيط RPMI-1640 المكملة

ملاحظة: تم تطوير وسط RPMI-1640 في ال....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لتقييم اختبار البلاك بعد العلاج، فإن العوامل الإيجابية (الخلايا المصابة بالتاكيزويتات وغير المعالجة) والسلبية (الخلايا غير المصابة التي تحتوي على 0.1٪ DMSO) هي الأهمية. في نهاية التجربة، يجب أن يظهر بئر التحكم الإيجابي فراغات فارغة محددة جيدا مع بقايا من الخلايا الملتصقة (الشكل 2). على النقيض من ذلك، يجب أن يعرض بئر التحكم السالب طبقة أحادية سليمة بدون فراغات. يعد التحكم السلبي أمرا حاسما لتأكيد سلامة الطبقة الأحادية وقابلية بقاء الخلايا طوال فترة التجربة. يعمل الضابط الإيجابي كمرجع لحساب نس.......

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعد توحيد البروتوكولات الجديدة للاختبارات المضادة للتكاثر خطوة أساسية لدفع البحث العلمي حول تحديد الأدوية المستقبلية. يقدم البروتوكول المعروض هنا نهجا بديلا لتقييم نشاط الجزيئات النشطة حيويا في المختبر ضد التاكيزويتات في T. gondii. نظرا لأن T.gondii طفيلي إلزامي داخل الخلية يتحرك عبر حركة الانزلاق، فعندما تخرج الطفيليات من خلية متحللة، ستغزو الخلايا الواقعة بالقرب من الخلية المصابة سابقا. وبالتالي، مع تكاثر الطفيلي، يسبب مناطق تدمير محددة جيدا (

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون أنهم لا يواجهون تضارب مصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويشكر المؤلفون أيضا تمويل المجلس الوطني للأمراض والبيسكي (CNPq)، ومؤسسة أمبارو في بيسكيسا دي ميناس جيرايس (FAPEMIG)، وCAPES/PROEX. يرغب المؤلفون في شكر برو ريتوريا دي بيسكيزا من الجامعة الفيدرالية لميناس جيرايس على دعمه لهذا البحث. ESMD (CNPq 308082/2023-0) وRWAV (CNPq 305574/2021-3) هما زملاء إنتاجية CNPq.

....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
0.05٪ Trypsin-EDTAتقنيات الحياة25300-062
ماصة مصلية بسعة 10 ملأولينK17-110
جهاز الطرد المركزي بأنبوب فالكون بحجم 15 ملفانيمالموديل: 206
ماصة مصلية بحجم 5 ملأولينK17-115
صفيحة زراعة ذات 6 آبارسارستيدت833920
التوازن التحليليميتلر توليدو  الطراز: AB204 الرقم التسلسلي: 1116473813
مضاد حيوي-مضاد للفطريات (100X)تقنيات الحياة15240-062
الماصة الأوتوماتيكيةكاسفيK1-AID
الطرد المركزيإبندورفالرقم التسلسلي للطراز 5415 R: 0023591
حاضنة CO2مؤسسة PHCرقم الطراز: MCO-230AICUVL-PA الرقم التسلسلي: 210360090
زجاجة الزراعة 25 سم2سارستيدت833910
مكبر الصوت ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO)ميرك 1,02,95,21,000
إيثانول P.Aميرك1,00,98,31,000
مصل الأبقار الجنيني (FBS)تقنيات الحياة12657-029
الفورمالديهيد 37-38٪بانريك131328
GraphPad Prism برنامج جراف باد-الإصدار 8.0.1
ImageJ  البرمجيات  --الإصدار 1.52e
أنظمة توثيق التصويربيو-رادالنموذج:  نظام تصوير كيمي دوك MP رقم تسلسلي: 734BR2249
غطاء التدفق الطبقيفيكو دو برازيلالطراز: VLFS-09
إل-جلوتامين 200 مللي مولار (100X)تقنيات الحياة25030-081
أنبوب ميكرو 0.5 ملسارستيدت72,699
الأرومة الليفية الجلدية الطبيعية لحديثي الولادة (NHDF)لونزاCC-3132بسخاء من الدكتورة شيلا نارديلي، من فيوكروز باران&aaacute;؛ البرازيل
حجرة نيوباور 0.100 مم 0.0025 مم2نيو بتيكس7301-1
مقياس الدرجة المئويةميكرونالالطراز: B374 الرقم التسلسلي: 30/37
Pipette 20-200 وميكرو؛ Lكاسفي بيسك22032893
Pipette 2-20 وميكرو؛ Lلابميت برو656630226
بيبيت  0.2-2 وميكرو؛ Lلابميت برو556610114
بيبيت  1000-5,000 وميكرو؛ Lعلم واحدYM4A021482
بيبيت  100-1000 وميكرو؛ Lأبحاث إبندورف بلسQ34354C
فوسفات البوتاسيوم مونوبيسيك  (KH2PO4) P.A السينث01F2002.01.AF
RPMI-1640 متوسطسيغما-ألدريتش R0883
كلوريد الصوديوم (NaCl) P.A. كرومولين كو&ياكوت؛ ميكا فينا -
فوسفات الصوديوم ثنائي القاعدي (Na2HPO4) P.A.CRQ Produtos Quimicos EireliR2715920500
نصيحة 1.000 وميكرو؛ Lسارستيدت7,01,186
النصيحة 10 والتفاصيل الدقيقة؛ Lسارستيدت7,03,010
نصيحة 5,000 وميكرو؛ Lسارستيدت70,11,83,001
نصيحة  200 وميكرو؛ Lسارستيدت7,03,030
معصمة النقل   (3.5 مل) سارستيدت86,11,71,001
أنبوب 15 ملسارستيدت6,25,54,502
بلورة البنفسجميرك101408
خلاط الدوامةفينيكسالطراز: AP56 الرقم التسلسلي: 6633
حمام الماءهيموكيميكا دو برازيلالطراز: HM1003 الرقم التسلسلي: 700001556

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Molan, A., Nosaka, K., Hunter, M., Wang, W. Global status of Toxoplasma gondii infection: systematic review and prevalence snapshots. Trop Biomed. 36 (4), 898-925 (2019).
  2. Bigna, J. J., et al.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة