مقالة منهجية

اختبار اللويحات المضادة للتكاثر لفحص الجزيئات النشطة حيويا في المختبرات ضد توكسوبلازما غوندي التاكيزويتات

DOI:

10.3791/69725

⸱

يناير 23, 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratório de Quimioterapia de Protozoários Egler Chiari, Departamento de Parasitologia - ICB, Universidade Federal de Minas Gerais

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يهدف هذا العمل إلى وصف طريقة بسيطة لاختبار البلاك للمساعدة في فحص الجزيئات النشطة بيولوجيا جديدة ضد مرحلة التاكيزويت في البروتوزوان توكسوبلازما غوندي.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التوكسوبلازما هو عدوى طفيلية ترتبط عادة بآفات العين والتشوهات الوليدية. منذ أوائل خمسينيات القرن الماضي، اعتمد العلاج الأول لهذا المرض على مزيج من السلفاديازين، البيريميثامين، وحمض الفولينيك. على مدار تلك السنوات، تم إدخال عدد قليل فقط من الأنظمة البديلة. وهذا يبرز الحاجة لاكتشاف جزيئات نشطة حيويا جديدة ضد توكسوبلازما غوندي. نظرا لأن هذا الممرض طفيلي داخل الخلية إلزاميا، فإن الفحص التقليدي للأدوية في المختبر عادة ما يتطلب مواد ومعدات باهظة الثمن، مثل الاختبارات باستخدام بروتينات فلورية أو طفيليات تعبر عن β-جالاكتوسيداز. بالإضافة إلى ذلك، قد تستغرق طرق مثل قياس المجهر البصري وقتا طويلا. اختبار اللويحات هو طريقة تقيم شدة تكاثر مسببات الأمراض داخل الخلية من خلال قياس عدد المناطق ومناطق التدمير في طبقة خلية أحادية الطبقة المتضررة من دورة التحليح للطفيلي. يصف هذا العمل بروتوكول اختبار البلاك المحسنا مصمما لفحص الجزيئات النشطة ضد التاكيزويتات داخل الخلايا ل T. gondii في المختبر. يستخدم هذا البروتوكول مواد رخيصة وإعداد مختبري بسيط، مما ينتج نتائج سريعة وقابلة للتكرار تسهل تحديد جزيئات نشطة جديدة ضد هذا الطفيلي من قبل مجموعات بحثية مختلفة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

داء التوكسوبلازما هو مرض حيواني منتشر غير متجانس حول العالم، ويؤثر على حوالي ثلث سكان العالم 1,2. ترتبط أعراض هذا المرض بدرجة مناعة المضيف وتكاثر الطفيلي 3,4. المرحلة الحادة من المرض، التي تتميز بتكرار مرحلة التاكيزويت، تكون عادة بدون أعراض لدى الأفراد ذوي المناعة العالية 5,6. على النقيض من ذلك، يظهر الأشخاص الذين يعانون من ضعف المناعة بأعراض أكثر تكرارا، بما في ذلك أعراض غير محددة مثل التعب العام، والحمى، بالإضافة إلى التهاب الدماغ والتهاب الشبكية 6,7,8. على الرغم من أهميته السريرية، فإن العلاج الحالي غير فعال ضد مرحلة توكسوبلازما غوندي براديزويت (في المرحلة المزمنة) ولا يؤدي إلى علاج طفيلي. كما أن الأحداث السلبية للأدوية الحالية تقلل من الالتزام بالعلاج 9,10,11. لذلك من الضروري إيجاد علاجات جديدة وأكثر أمانا وفعالية لعلاج التوكسوبلازما.

يتطلب تطوير الأدوية الجديدة فترة زمنية طويلة، واستثمارات بمليارات الدولارات، ومراحل بحث متعددة. نظرا لارتفاع تكلفة تطوير الأدوية، تحتاج صناعة الأدوية إلى اختيار أفضل مرشح دواء مسبقا 12,13,14,15. بالنسبة لفحص الأدوية، يمكن استخدام عدة طرق، بما في ذلك طرق السيليكو، واستخدام الذكاء الاصطناعي، والنهج الأكثر شيوعا، الطرق البيولوجية 16,17,18,19. يتضمن الفحص البيولوجي في المختبرات استخدام مكتبات من الجزيئات (مكتبات كيميائية) لجعل الجزيئات متاحة لتحديد النشاط البيولوجي 20,21,22. نظرا لأن هذه المكتبات الكيميائية تحتوي على تنوع في الجزيئات، فمن الضروري تحسين الموارد والوقت. لذلك، يمكن أن يكون اختبار البلاك طريقة للمساعدة في فحص الجزيئات الحيوية الجديدة بسرعة ضد مسببات الأمراض المختلفة مثل T. gondii.

اختبار البلاك هو طريقة في المختبر تستخدم الدورة التحلفية للممرضات داخل الخلية لقياس تركيز مسببات الأمراض في طبقة خلوية واحدة، مما يؤدي إلى تكوين اللويحات النخريةعلى مدى الزمن. تعود أول دراسة باستخدام تقنية اختبار البلاك إلى بداية النصف الثاني من القرن العشرين، عندما استخدم فريق ريناتو دولبيكو طبقات أحادية من الأرومات الليفية للدجاج المصابة بفيروس التهاب الدماغ والنخاع الغربي للخيول لإثبات التناسب بين عدد اللويحات النخرية المكونة وتركيز الفيروس16. كما تم وصف استخدام هذه التقنية في T. gondii بشكل جيد، كما أوضح سابقا أوفرمان وزملاؤه23.

واحدة من أولى الدراسات التي استخدمت اختبار البلاك لمراقبة استجابة في تثبيط T. gondii ضد تركيزات مختلفة من الجزيئات أجريت بواسطة روبرتس وآخرين في عام 1976:17. على الرغم من أن اختبار البلاك يستخدم على نطاق واسع لتعقيم الفيروس16,24، إلا أن هذه الطريقة استخدمتها مجموعات بحثية قليلة فقط لتقييم نشاط مضاد T. gondii للجزيئات 21,22,25,26,27. بحثا عن اختبار يسمح باختبار مكتبات المركبات ذات إنتاجية عالية ومواد رخيصة وإعداد مختبري بسيط، تم استكشاف اختبار البلاك كبديل لفحص الأدوية الروتيني في المختبر. أدى ذلك إلى إنشاء بروتوكول محسن يتيح التقييم المتزامن لنشاط الجزيئات المختلفة باستخدام مواد بسيطة ونظام التقاط صور، مما يعطي نتائج سريعة وقابلة للتكرار. لذا، نصف هنا البروتوكول المفصل، الذي تم التحقق منه في مختبرنا، لمساعدة مجموعات أخرى في فحص الجزيئات النشطة الحيوية الجديدة ضد التاكيزويتات في T. gondii.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تنفيذ التلاعب بزراعة الطفيليات والخلايا، بالإضافة إلى التخلص من النفايات ووجهتها، وفقا للتشريعات البرازيلية، كما هو مطلوب من قبل الوكالة الوطنية للرقابة الصحية (ANVISA) رقم 222/2018. كانت جميع الإجراءات تحت إشراف لجنة السلامة البيولوجية الداخلية (CIBio) التابعة ل ICB-UFMG. هذه الدراسة لا تشمل استخدام أو البشر أو الكائنات المعدلة وراثيا. دعمت منح من CNPq وCAPES وFAPEMIG هذا العمل. ESMD (CNPq 308082/2023-0) وRWAV (CNPq 305574/2021-3) هما زملاء إنتاجية CNPq. المواد المستخدمة والمواد المستخدمة مدرجة في جدول المواد.

1. تحضير وسيط RPMI-1640 المكملة

ملاحظة: تم تطوير وسط RPMI-1640 في الأصل لزراعة خلايا اللوكيميا البشرية في كل من التعليق والطبقة الأحادية. ومع ذلك، أظهرت الدراسات اللاحقة ملاءمته لمجموعة متنوعة من زراعة الخلايا الثديية.

  1. أضف إلى الزجاجة التي تحتوي على 250 مل من RPMI-1640، 2.5 مل من 200 ملليمتر لجلوتامين (100x).
  2. أضف 2.5 مل من المضاد الحيوي-مضاد الفطريات (100x) إلى الوسط.
  3. بعد ذلك، أضف 5.0 مل أو 25 مل من مصل البقر الجنيني (FBS) إلى الزجاجة مع RPMI-1640 (2٪ أو 10٪ FBS).
  4. خزنها في ثلاجة (2-8 درجة مئوية).

2. تحضير PBS (مرة واحدة)

ملاحظة: لتحضير 1 لتر من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) عند درجة حموضة 7.2 و25 درجة مئوية، اتبع الخطوات التالية.

  1. قس الكميات التالية من الأملاح بشكل منفصل: 1.4 جرام من Na2HPO4، 0.24 جرام من KH2PO4، و8.5 جرام من NaCl.
  2. أضف الأملاح المثقلة بشكل منفصل إلى كأس بسعة 1 لتر يحتوي على 800 مل من الماء منزوع الأيون. حرك المحلول حتى تذوب جميع الأملاح تماما.
  3. قس درجة الحموضة للمحلول باستخدام مقياس الرقم الهيدروجيني. يجب أن يكون 7.2. إذا لزم الأمر، استخدم 6 مولار حمض هيدروكلوريك أو 3 مولار هيدروكسيد الصوديوم لرفع درجة الحموضة إلى 7.2.
  4. باستخدام قضيب زجاجي، انقل المحلول أعلاه كميا إلى قارورة حجمية بسعة 1 لتر.
  5. أضف ماء منزوع الأيونات إلى القارورة الحجمية حتى يصل الحجم الكلي إلى 1 لتر، مما يضمن أن الغضروف الهلالي عند العلامة الصحيحة.
  6. اخلط المحلول في قارورة الحجم، مع قلبه بلطف.
  7. قسم محلول PBS النهائي إلى زجاجات زجاجية أصغر (100-250 مل).
  8. قم بتعقيم الزجاجات عند 121 درجة مئوية، 1.1 كجم/سم2 لمدة 15 دقيقة.
  9. تخزين محلول PBS في الثلاجة (2-8 درجات مئوية).
    ملاحظة 1: استخدم PBS عند 37 درجة مئوية لجميع التجارب.

3. تحضير محلول الفورمالديهايد بنسبة 4٪

  1. اخلط 35.68 مل من 1x PBS و4.32 مل من الفورمالديهايد 37٪ في الحمض الداخلي.
  2. تخزين المحلول في قارورة بلاستيكية عند درجة حرارة الغرفة (25 درجة مئوية).

4. تحضير محلول المخزون للجزيئات النشطة

ملاحظة: تحقق من ذوبانية الجزيئات في DMSO أو DMF أو الإيثانول أو الماء، واختر المذيب الأنسب. لتقليل التأثيرات المحتملة للسمية المخففة على الطفيليات، يجب أن يكون محلول المخزون أكثر تركيزا بمقدار 1000 مرة على الأقل من أعلى تركيز للمركب المراد اختباره. على سبيل المثال، إذا كان أعلى تركيز يجب اختباره هو 1 ميكرومولار، يجب أن يكون محلول المخزن على الأقل 1 ملليمولار. لتحضير محلول مخزن بسعة 10 مللي مول، اتبع الخطوات التالية:

  1. وزن المركب ليتم اختباره باستخدام ميزان تحليلي بدقة 0.0001 جم.
  2. تحديد حجم المخفف المطلوب للحصول على محلول 10 مللي مولار باستخدام الصيغة التالية:
    V (mL) = (Y MM) × 100
    حيث:
    Y: كتلة المركب بالملليغرام (mg)
    MM: الكتلة المولية للمركب
    V (ملليتر): حجم المذيب
  3. أضف المخفف إلى المستلم الذي يحتوي على المركب الموزون.
  4. قم بالتجانس باستخدام خلاط الدوامة.
  5. قسم المحلول إلى أليكوات صغيرة واحتزنها في فريزر عند -20 درجة مئوية.
  6. قبل الاستخدام، دع محلول aliquot يذوب تماما ثم يتجانس مرة أخرى باستخدام خلاط الدوامة.
    ملاحظة: لتحضير محاليل فرعية مع تركيزات أخرى، استخدم الصيغة التالية
    V (μL) = x mM × y μL/10 mM
    V (μL) ∶ حجم المحلول المطلوب لتحضير المحلول الجديد
    x mM: التركيز المرغوب للمحلول الجديد.
    y (μL): الحجم المرغوب للمحلول الجديد.

5. زراعة الخلايا

  1. استخدم خلايا NHDF عن طريق تدوير القارورة بلطف في حمام ماء بدرجة حرارة 37 درجة مئوية.
    ملاحظة: يمكن استبدال خلايا NHDF بأروميات ليفية بشرية من القلفة (HFF) أو خطوط خلايا أخرى تشكل طبقة واحدة مستقرة. اختبار البلاك يعمل فقط مع خطوط الخلايا التي تشكل طبقة أحادية مستقرة، أي الخلايا التي يتوقف نموها عند التلامس. لا يمكن استخدام سلاسل الخلايا التي لا تظهر تثبيط التكاثر، مثل خطوط الأورام، لأن الخلايا تتنافس مع الطفيليات على العناصر الغذائية في وسط الزراعة وتعيد تعويض منطقة البلاك التي تتكون من الطفيليات.
  2. انقل الخلايا المذابة فورا إلى أنبوب مخروطي بحجم 15 مل يحتوي على وسط RPMI-1640 مكمل بسعة 10 مل (الدرجة 1).
  3. قم بطرد المركزي للخلايا بحرارة 200 × جرام لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. عندما تكتمل دورة الدوران، يجب أن تكون حبيبة الخلية مرئية في أسفل الأنبوب.
  4. تخلص من المادة الفائقة بعناية للحفاظ على حبيبات الخلية.
  5. أعد تعليق الحبيبات الخلوية بوسط RPMI-1640 مكمل بسعة 12 مل يحتوي على 10٪ FBS وزرع ثلاث قوارير بحجم 25 سم2 أو قارورة واحدة بقطر 75 سم2 . بعد يومين إلى ثلاثة، افحص قارورة الزراعة باستخدام مجهر تباين الطور المقلوب لتحديد استعادة تكاثر الخلايا (يجب أن تظهر الخلايا تلاقيا لا يقل عن 40٪-50٪).
  6. عندما تصل الخلايا إلى طبقة أحادية كاملة (100٪ التقاء واحد)، أزل الوسط من القارورة باستخدام ماصة باستور. تخلص من الوسط والماصة.
  7. أضف 1-2 مل من PBS مرة واحدة إلى القارورة، وانتظر دقيقة واحدة، ثم أزل PBS.
  8. أضف 1 مل من محلول التربسين-فيرسين بنسبة 0.05٪ إلى القارورة وضعها في الحاضنة مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون، والرطوبة، ودرجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة دقيقتين.
  9. بعد دقيقتين، راقب الخلايا باستخدام المجهر المقلوب للتأكد من انفصال الخلايا.
  10. أعد تعليق الخلايا المنفصلة بوسط RPMI-1640 بسعة 24 مل مع 10٪ FBS باستخدام ماصة مصلية بسعة 10 مل وموزع ماصة أوتوماتيكي.
    ملاحظة: كل قارورة زراعة بمساحة 25 أو 75 سم مربع تحتوي على طبقة أحادية متصلة قادرة على التكرار في 5 أو 15 زجاجة زراعة أخرى بمساحة 25 سم مربع على التوالي.
  11. بعد إضافة الحجم اللازم من الوسط (24 مل)، قم بتجانس تعليق الخلية مع الماصة المصلية.
  12. انقل 4 مل من تعليق الخلية في الوسط إلى كل قارورة بحجم 25 سم2 أو 12 مل إلى 75 سم2 . تذكر ترك 4 مل من تعليق الخلية في القارورة الأولى.
  13. ضع القوارير في حاضنة تحتوي على 5٪ ثاني أكسيد الكربون، والرطوبة، ودرجة حرارة 37 درجة مئوية.
  14. انتظر حتى يتم الحصول على طبقة واحدة كاملة من الخلايا (100٪ من التقاء الجميع).
    ملاحظة: حدد كل قارورة بالتاريخ ورقم الممر.

6. تحضير طبق الزراعة

  1. افحص سلامة طبقة الخلية الأحادية (100٪ التقاء الداخل) في قارورة الزراعة باستخدام مجهر مقلوب.
  2. اتبع إجراء التريبسين كما هو موضح أعلاه (الخطوات 5.7-5.9).
  3. باستخدام ماصة مصلية بسعة 5 مل، أعد تعليق الخلايا المنفصلة بوسط 4 مل RPMI وانقلها إلى أنبوب مخروطي بسعة 15 مل.
  4. الطرد المركزي بحرارة 200 × جرام لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
  5. تخلص من السوبرناتانت بعناية.
  6. أعد تعليق حبيبة الخلية ب 1 مل من وسط RPMI-1640 الطازج.
  7. قم بالتجانس باستخدام خلاط الدوامة.
  8. نقل 10 ميكرولتر إلى أنبوب بسعة 1.5 مل يحتوي على 490 ميكرولتر من محلول فورمالديهايد بنسبة 4٪ (تخفيف بنسبة 1:50) باستخدام ميكروبايبت ذات طرف معقم.
    ملاحظة: عامل التخفيف = (الحجم الكلي (μL)) / (حجم العينة (μL))
  9. أنشأ غرفة نيوباور.
  10. توحيد المحلول الثابت مع الطفيليات (المعد في البند 6.8) باستخدام خلاط الدوامات.
  11. أضف 10 ميكرولتر من المحلول مع الطفيليات الثابتة إلى غرفة نيوباور.
  12. عد أربعة أرباع من غرفة نويباور، كل منها يتكون من 16 مربعا.
  13. حدد عدد الخلايا لكل مل:
    عدد الخلايا (لكل ملتر) = [(n° خلايا لكل مربع)/4] × Fd × 104
    حيث:
    عامل التخفيف (Fd) = 50
  14. تم زرع كل بئر من صفيحة زراعة مكونة من 12 أو 6 بئر، مع 5 × 104 أو 10× 5 خلايا على التوالي، معاد تعليقها في 1 أو 2 مل من وسط RPMI-1640 المدعم ب 10٪ FBS.
  15. ضع الصفائح في حاضنة تحتوي على 5٪ ثاني أكسيد الكربون، وجو رطب، ودرجة حرارة 37 درجة مئوية.
  16. انتظر حتى تصل طبقة الخلية الأحادية إلى 100٪ من التقاء البعض.

7. الزراعة في المختبر باستخدام التاكيزويت

ملاحظة: بالنسبة لاختبار اللويحة، نوصي بسلالة الرطوبة النسبية من T. gondii.

  1. تخلص من الوسط القديم من قارورة2 سم، تحتوي على طبقة أحادية كاملة (التقاء 100٪) من خلايا NHDF باستخدام ماصة باستور. بعد ذلك، أضف 4 مل من المتوسط الكامل RPMI-1640 الطازج إلى القارورة.
  2. انقل 5 ميكرولتر من مادة فائقة تحتوي على تاكيزويتات خارجة طازجة من قارورة سابقة مع ثقافة ملوثة متحللة. الحجم البالغ 5 ميكرولتر يسمح بدورة تحليل تتراوح بين 6-7 أيام لكل قارورة بمساحة 25 سم².
  3. ضع القارورة المصابة الجديدة في حاضنة تحتوي على 5٪ ثاني أكسيد الكربون، وجو رطب، ودرجة حرارة 37 درجة مئوية.

8. قياس كمية التاكيزويت

  1. إزالة الوسط من قارورة الزراعة التي تحتوي على طفيليات خروجا حديثا باستخدام ماصة باستور وانقله إلى أنبوب مخروطي بحجم 15 مل.
  2. قم بجهاز الطرد المركزي للأنبوب عند 760 × جرام في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقتين. عندما تنتهي دورة الدوران، يرى حبيبة مرئية في أسفل الأنبوب.
  3. تخلص من السوبرناتانت بعناية.
  4. أعد تعليق الحبيبات الطفيلية ب 1 مل من RPMI-1640 متوسطة طازجة مع 2٪ FBS.
  5. توحيد تعليق الطفيليات باستخدام خلاط الدوامات.
  6. نقل 10 ميكرولتر من تعليق الطفيليات إلى أنبوب بحجم 1.5 مل يحتوي على 490 ميكرولتر من محلول الفورمالديهايد بنسبة 4٪ (تخفيف بنسبة 1:50) باستخدام ماصة ذات طرف معقم.
  7. اتبع الخطوات الموضحة في 6.10 إلى 6.12.
  8. حدد عدد التاكيزويتات لكل 1 مل.
    ملاحظة: عدد التاكيزويتات (لكل مل) = [(عدد عدد التاكيزويتات المربع)/4] × Fd × 104
    حيث:
    عامل التخفيف (Fd) = 50

9. تحضير اختبار البلاك للجزيئات النشطة المتصدعة من مكتبة كيميائية

ملاحظة: يهدف هذا الاختبار إلى تحديد الجزيئات التي تقلل من تكاثر T. gondii بأكثر من 50٪ عند تركيز 1 ميكرومول. قبل بدء هذا الاختبار، يجب إجراء اختبار السمية الخلوية (مثل طريقة MTS أو طريقة MTT) لضمان أن تركيزات المركبات المستخدمة في اختبار البلاك ليست سامة لخلايا المضيف.

  1. تأكد من أن الزراعة الخلوية وصلت إلى التقاء 100٪ في صفائح ال 12 أو 6 آبار.
  2. تخلص من الوسط القديم وأضف 1 أو 2 مل من المتوسط RPMI-1640 الطازج مع 2٪ FBS لكل بئر في الألواح ذات ال 12 و6 بئر على التوالي.
  3. أضف المركبات التي سيتم اختبارها في كل بئر بتركيز مطلوب. للفحص الأولي، يوصى بتركيز 1 ميكرومول.
    ملاحظة: استخدم الصيغة التالية لحساب الحجم الذي يجب إضافته إلى كل بئر.
    V (μL) = (التركيز النهائي في البئر (μM) × الحجم داخل البئر (μL)/(محلول مخزن (μM))
  4. أضف 600 تاكيزويت (للوحة 12 بئر) أو 1000 تاكيزويت (للوحة ذات 6 آبار) من سلالة RH إلى كل بئر.
    ملاحظة: قد تحدث اختلافات في تكاثر الطفيليات بسبب اختلافات في موردي وسط الزراعة أو FBS، أو في خطوط الخلايا المستخدمة. لذلك، ينصح بإجراء تجربة تجريبية لتحديد العدد الأمثل للطفيليات لكل حالة مختبرية. قم بتعديل كمية الطفيلي المستخدمة في هذه التجربة إذا لزم الأمر.
  5. ضع الصفائح في الحاضنة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربونوجو رطب لمدة 7 أيام دون أي اضطراب.
    تحذير: يجب عدم تحريك أو لمس الصفائح خلال فترة الحضانة التي تستمر 7 أيام. إذا حدث ذلك، ستتلف التجربة.

10. تلوين الصفائح باللون البنفسجي الكريستالي واكتساب الصور

  1. بعد 7 أيام، أزل الوسط من كل بئر.
  2. اغسل كل بئر بعناية باستخدام 1x PBS في درجة حرارة الغرفة.
  3. تخلص من PBS وأضف بعناية 1 مل من الكحول 70٪ إلى كل بئر. اتركه في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة، ثم تخلص منه.
  4. أضف محلول البنفسجي الكريستالي 0.5٪ واتركه واقفا لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  5. أزل محلول البنفسج الكريستالي.
  6. اغسل كل بئر بعناية مرة واحدة بالماء منزوع الأيون.
    تحذير: عند إزالة الوسط أو PBS أثناء خطوات الغسيل، لا تلمس طرف الماصة قاع البئر، لأن ذلك قد يضر بسلامة الطبقة الأحادية. أثناء خطوات الغسيل، لا ترمي نفاثا من PBS أو الكحول مباشرة على الخلايا. أضفها جيدا على طول حدود البئر.
  7. ضع الطبق مقلوبا على ورق ماص لتصريف الماء الزائد واتركه يجف في درجة حرارة الغرفة لمدة 24 ساعة.
  8. صور الألواح باستخدام ماسح ضوئي عالي الدقة28,29 أو نظام توثيق تصوير مهيأ لخيار الجل الأزرق Coomassie 21,22,30.

11. اختبار الانعكاس

ملاحظة: الهدف الأساسي من اختبار قابلية العكسية باستخدام تاكيزويتات T. gondii هو تحديد ما إذا كانت قدرة تكاثر الطفيليات المعالجة قد ألغيت تماما أو تقلصت بعد إزالة المركبات من وسط الزراعة31.

  1. زرع صفيحة ذات 6 آبار باستخدام خلايا NHDF كما هو موضح في الخطوة 6. لكل بئر، أضف 1 ×10 5 خلايا معاد تثبيتها في 2 مل من RPMI-1640 المكملة مع 10٪ FBS.
    ملاحظة: بمجرد وصول طبقة الخلية الأحادية إلى 100٪ التقاء في كل بئر، تكون الصفيحة جاهزة لاختبار اللويحة.
  2. تخلص من المتوسط وأضف 1 × 104 تاكيزويت معلق في 2 مل من الوسط الطازج مع 2٪ من FBS في كل بئر.
  3. بعد السماح للتاكيزويتات بالتفاعل مع خلايا NHDF لمدة ساعة، أضف المركبات المختارة بتركيز نهائي قريب من قيمة تركيز التثبيط بنسبة 90٪ (IC90). يستخدم بئر يحتوي فقط على مخفف الدواء كوسيلة تحكم إيجابية.
  4. عالج التاكيزويتات لمدة 4 أيام في الحاضنة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربونوجو رطب.
  5. بعد فترة المعالجة التي تستمر 4 أيام، اغسل الطبق ثلاث مرات ب 1x PBS عند 37 درجة مئوية لضمان إزالة المركبات بالكامل.
  6. أضف إلى كل بئر 2 مل من الوسط الطازج بدون المركبات وحافظ على اللوح في الحاضنة لمدة 7 أيام إضافية.
  7. صبغ اللوح بصبغة بنفسجية كريستالية وصورها كما هو موضح في الخطوة 10.

12. تحليل الصور باستخدام برنامج ImageJ

  1. افتح الصور باستخدام برنامج ImageJ32.
  2. اختر المنطقة المقابلة لبئر واحد باستخدام أداة الاختيار البيضاوي (الشكل 1A,B).
    ملاحظة: عند الاختيار، تجاهل المناطق على حدود الآبار التي تظهر عيوبها. توجد هذه عادة على حواف البئر.
  3. نسخ وإنشاء صورة جديدة: انسخ المنطقة المحددة بالضغط على Ctrl + C؛ إنشاء ملف صورة جديد بالضغط على Ctrl + N؛ ألصق الصورة المنسوخة في نافذة سوداء جديدة باستخدام Ctrl + V.
    ملاحظة: عند إنشاء الصورة الجديدة، استخدم الإعدادات الافتراضية: 8-بت، املأ باللون الأسود، 512 × 512 بكسل، وشريحة واحدة (الشكل 1C).
  4. انتقل إلى: الصورة > ضبط العتبة >، أو اضغط Ctrl + Shift + T (الشكل 1D).
  5. في نافذة العتبة، اختر خيارات هوانغ وريد، ثم انقر على تلقائي (الشكل 1E).
  6. انقر على التحليل، ثم اختر تحليل الجسيمات (الشكل 1F). احتفظ بالخيارات الافتراضية في النافذة التي تظهر وانقر على موافق (الشكل 1G).
  7. ستفتح نافذة جديدة. انسخ القيمة المعروضة في نسبة المساحة (مميزة بمستطيل أحمر في الشكل 1H) لحساب نسبة انتشار أو تثبيط الطفيليات.
  8. كرر هذه الخطوات لكل بئر على الطبق.
  9. لحساب نسبة الانتشار، استخدم الصيغة التالية:
    نسبة الانتشار = (٪ المنطقة المعالجة بشكل جيد/٪ التحكم الجيد في المنطقة) × 100
  10. لحساب نسبة التثبيط، استخدم الصيغة التالية:
    نسبة التثبيط = [1- (نسبة المنطقة المعالجة جيدا/نسبة التحكم الجيد في المنطقة)] × 100

الشكل 1
الشكل 1: تحليل خطوة بخطوة للنتائج في برنامج ImageJ. (أ) اختيار أداة "بيضاوي". (ب) اختيار منطقة الاهتمام في الصورة. (ج) نافذة صورة جديدة (Ctrl + N) مع الإعدادات الموصى بها. (د) خطوات لتحليل العتبة بعد لصق المنطقة المعنية في نافذة الصورة الجديدة. (ه) اختيار خيارات هوانغ والأحمر في نافذة العتبة، مما يؤدي إلى ملء جميع المناطق البيضاء باللون الأحمر. (و) تسلسل الخطوات المستخدمة في "تحليل الجسيمات". (G) الإعداد المستخدم لتحليل الجسيمات. (ح) تظهر نتيجة نسبة المساحة المدمرة الإجمالية في نافذة الملخص. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

13. التحليل الإحصائي

  1. نظم البيانات في جدول بيانات إكسل داخل برنامج Office بعد حساب نسبة تثبيط الانتشار.
  2. افتح برنامج GraphPad Prism 5.0، وانقر على XY (أسفل الجدول الجديد والرسم البياني البياني).
  3. في قسم Y (أسفل "X:شريط الخطأ"), أدخل عدد تكرارات البيانات (عادة ثلاث نسخ بيولوجية). قد يختلف هذا العدد حسب عدد التكرارات التي يتم تنفيذها.
  4. اختر المتوسط فقط بجانب المخطط ولا تقم باختيار "إدخال وقيم خطأ الرسم تم حسابها في مكان آخر"، ثم انقر على الإنشاء.
  5. ضع بيانات التركيز على المحور X وبيانات نسبة تثبيط الانتشار في الأعمدة A، A:Y1، A:Y2، A:Y3، A:Y4، A:Y5.
  6. انقر على = تحليل ثم اضغط على تحويل، ثم موافق. ستفتح نافذة جديدة. في هذه النافذة الجديدة، انقر على تحويل قيم X باستخدام X = Log(X)، ثم انقر على إنشاء رسم بياني جديد للنتائج، ثم موافق.
  7. انقر على = تحليل ثم على Normalize. ستفتح نافذة جديدة. في قسم كيف يعرف 0٪؟، انقر واضبط Y = 0.0. في قسم كيف يعرف 100٪؟، اضغط واضبط Y = 100؛ اختر النسب المئوية وانقر على إنشاء رسم بياني جديد للنتائج.
  8. انقر على الرمز: تناسب منحنى مع انحدار غير خطي موجود أعلاه = تحليل. انقر على استجابة الجرعة - التثبيط، ثم على اللوغاريتيم (المثبط) مقابل الاستجابة الطبيعية - ميل متغير، ثم اضغط على موافق.
    ملاحظة: ستفتح نافذة تعرض النتائج التالية: IC50 (تركيز مثبط 50٪)، وفترة الثقة 95٪، وقيمة R2. هذه القيم ضرورية ويجب تضمينها في جدول النتائج داخل المقال.
  9. لتقدير تركيزات مثبطة أخرى، مثل IC25 أو IC90 أو IC95، استخدم الرابط (https://www.graphpad.com/quickcalcs/Ecanything1.cfm)، Quick Calcs - GraphPad؛ EC: التركيز الفعال. أبلغ عن IC50 وHillSlope اللذين حصل عليهما برنامج Prism لكل اختبار مخدر.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لتقييم اختبار البلاك بعد العلاج، فإن العوامل الإيجابية (الخلايا المصابة بالتاكيزويتات وغير المعالجة) والسلبية (الخلايا غير المصابة التي تحتوي على 0.1٪ DMSO) هي الأهمية. في نهاية التجربة، يجب أن يظهر بئر التحكم الإيجابي فراغات فارغة محددة جيدا مع بقايا من الخلايا الملتصقة (الشكل 2). على النقيض من ذلك، يجب أن يعرض بئر التحكم السالب طبقة أحادية سليمة بدون فراغات. يعد التحكم السلبي أمرا حاسما لتأكيد سلامة الطبقة الأحادية وقابلية بقاء الخلايا طوال فترة التجربة. يعمل الضابط الإيجابي كمرجع لحساب نس...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعد توحيد البروتوكولات الجديدة للاختبارات المضادة للتكاثر خطوة أساسية لدفع البحث العلمي حول تحديد الأدوية المستقبلية. يقدم البروتوكول المعروض هنا نهجا بديلا لتقييم نشاط الجزيئات النشطة حيويا في المختبر ضد التاكيزويتات في T. gondii. نظرا لأن T.gondii طفيلي إلزامي داخل الخلية يتحرك عبر حركة الانزلاق، فعندما تخرج الطفيليات من خلية متحللة، ستغزو الخلايا الواقعة بالقرب من الخلية المصابة سابقا. وبالتالي، مع تكاثر الطفيلي، يسبب مناطق تدمير محددة جيدا (

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون أنهم لا يواجهون تضارب مصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويشكر المؤلفون أيضا تمويل المجلس الوطني للأمراض والبيسكي (CNPq)، ومؤسسة أمبارو في بيسكيسا دي ميناس جيرايس (FAPEMIG)، وCAPES/PROEX. يرغب المؤلفون في شكر برو ريتوريا دي بيسكيزا من الجامعة الفيدرالية لميناس جيرايس على دعمه لهذا البحث. ESMD (CNPq 308082/2023-0) وRWAV (CNPq 305574/2021-3) هما زملاء إنتاجية CNPq.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
0.05٪ Trypsin-EDTAتقنيات الحياة25300-062
ماصة مصلية بسعة 10 ملأولينK17-110
جهاز الطرد المركزي بأنبوب فالكون بحجم 15 ملفانيمالموديل: 206
ماصة مصلية بحجم 5 ملأولينK17-115
صفيحة زراعة ذات 6 آبارسارستيدت833920
التوازن التحليليميتلر توليدو  الطراز: AB204 الرقم التسلسلي: 1116473813
مضاد حيوي-مضاد للفطريات (100X)تقنيات الحياة15240-062
الماصة الأوتوماتيكيةكاسفيK1-AID
الطرد المركزيإبندورفالرقم التسلسلي للطراز 5415 R: 0023591
حاضنة CO2مؤسسة PHCرقم الطراز: MCO-230AICUVL-PA الرقم التسلسلي: 210360090
زجاجة الزراعة 25 سم2سارستيدت833910
مكبر الصوت ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO)ميرك 1,02,95,21,000
إيثانول P.Aميرك1,00,98,31,000
مصل الأبقار الجنيني (FBS)تقنيات الحياة12657-029
الفورمالديهيد 37-38٪بانريك131328
GraphPad Prism برنامج جراف باد-الإصدار 8.0.1
ImageJ  البرمجيات  --الإصدار 1.52e
أنظمة توثيق التصويربيو-رادالنموذج:  نظام تصوير كيمي دوك MP رقم تسلسلي: 734BR2249
غطاء التدفق الطبقيفيكو دو برازيلالطراز: VLFS-09
إل-جلوتامين 200 مللي مولار (100X)تقنيات الحياة25030-081
أنبوب ميكرو 0.5 ملسارستيدت72,699
الأرومة الليفية الجلدية الطبيعية لحديثي الولادة (NHDF)لونزاCC-3132بسخاء من الدكتورة شيلا نارديلي، من فيوكروز باران&aaacute;؛ البرازيل
حجرة نيوباور 0.100 مم 0.0025 مم2نيو بتيكس7301-1
مقياس الدرجة المئويةميكرونالالطراز: B374 الرقم التسلسلي: 30/37
Pipette 20-200 وميكرو؛ Lكاسفي بيسك22032893
Pipette 2-20 وميكرو؛ Lلابميت برو656630226
بيبيت  0.2-2 وميكرو؛ Lلابميت برو556610114
بيبيت  1000-5,000 وميكرو؛ Lعلم واحدYM4A021482
بيبيت  100-1000 وميكرو؛ Lأبحاث إبندورف بلسQ34354C
فوسفات البوتاسيوم مونوبيسيك  (KH2PO4) P.A السينث01F2002.01.AF
RPMI-1640 متوسطسيغما-ألدريتش R0883
كلوريد الصوديوم (NaCl) P.A. كرومولين كو&ياكوت؛ ميكا فينا -
فوسفات الصوديوم ثنائي القاعدي (Na2HPO4) P.A.CRQ Produtos Quimicos EireliR2715920500
نصيحة 1.000 وميكرو؛ Lسارستيدت7,01,186
النصيحة 10 والتفاصيل الدقيقة؛ Lسارستيدت7,03,010
نصيحة 5,000 وميكرو؛ Lسارستيدت70,11,83,001
نصيحة  200 وميكرو؛ Lسارستيدت7,03,030
معصمة النقل   (3.5 مل) سارستيدت86,11,71,001
أنبوب 15 ملسارستيدت6,25,54,502
بلورة البنفسجميرك101408
خلاط الدوامةفينيكسالطراز: AP56 الرقم التسلسلي: 6633
حمام الماءهيموكيميكا دو برازيلالطراز: HM1003 الرقم التسلسلي: 700001556

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Molan, A., Nosaka, K., Hunter, M., Wang, W. Global status of Toxoplasma gondii infection: systematic review and prevalence snapshots. Trop Biomed. 36 (4), 898-925 (2019).
  2. Bigna, J. J., et al. Global, regional, and country seroprevalence of Toxoplasma gondii in pregnant women: A systematic review, modelling and meta-analysis. Sci Rep. 10 (1), 12102(2020).
  3. Dian, S., Ganiem, A. R., Ekawardhani, S. Cerebral toxoplasmosis in HIV-infected patients: A review. Pathog Glob Health. 117 (1), 14-23 (2023).
  4. Wang, Z. -D., et al. Toxoplasma gondii Infection in Immunocompromised Patients: A Systematic Review and Meta-Analysis. Front Microbiol. 8, 389(2017).
  5. Layton, J., et al. Clinical spectrum, radiological findings, and outcomes of severe toxoplasmosis in immunocompetent hosts: A systematic review. Pathogens. 12 (4), 543(2023).
  6. Weiss, L. M., Dubey,, Jitender, P. Toxoplasmosis: A history of clinical observations. Int J Parasitology. 39 (8), 895-901 (2009).
  7. Fabiani, S., et al. Ocular toxoplasmosis, an overview focusing on clinical aspects. Acta Trop. 225, 106180(2022).
  8. Butler, N. J., Furtado, J. M., Winthrop, K. L., Smith, J. R. Ocular toxoplasmosis II: Clinical features, pathology and management. Clin Exp Ophthalmol. 41 (1), 95-108 (2013).
  9. Dunay, I. R., Gajurel, K., Dhakal, R., Liesenfeld, O., Montoya, J. G. Treatment of Toxoplasmosis: Historical perspective, animal models, and current clinical practice. Clin Microbiol Rev. 31 (4), e00057-e00117 (2018).
  10. Wei, H. -X., Wei, S. -S., Lindsay, D. S., Peng, H. -J. A systematic review and meta-analysis of the efficacy of anti-Toxoplasma gondii medicines in humans. PloS One. 10 (9), e0138204(2015).
  11. Shammaa, A. M., Powell, T. G., Benmerzouga, I. Adverse outcomes associated with the treatment of Toxoplasma infections. Sci Rep. 11 (1), 1035(2021).
  12. Hay, M., Thomas, D. W., Craighead, J. L., Economides, C., Rosenthal, J. Clinical development success rates for investigational drugs. Nat Biotechnol. 32 (1), 40-51 (2014).
  13. Paul, S. M., et al. How to improve R&D productivity: The pharmaceutical industry's grand challenge. Nat Rev Drug Discov. 9 (3), 203-214 (2010).
  14. Andrade, E. L., et al. Non-clinical studies required for new drug development - Part I: Early in silico and in vitro studies, new target discovery and validation, proof of principles and robustness of animal studies. Braz J Med Biol Res. 49 (11), e5644(2016).
  15. Brodniewicz, T., Grynkiewicz, G. Preclinical drug development. Acta Poloniae Pharmaceutica. 67 (6), 578-585 (2010).
  16. Dulbecco, R. Production of plaques in monolayer tissue cultures by single particles of an animal virus. Proc Natl Acad Sci U S A. 38 (8), 747-752 (1952).
  17. Roberts, C. O., Chaparas, S. D., McLaughlin, D. The use of the plaque assay in chemotherapeutic and dermal hypersensitivity studies on Toxoplasma gondii. Trans Am Microsc Soc. 95 (3), 470(1976).
  18. Mo, J., et al. Effect of the Pseudomonas metabolites HQNO on the Toxoplasma gondii RH strain in vitro and in vivo. Int J Parasitol Drugs Drug Resist. 21, 74-80 (2023).
  19. Barbosa, B. F., et al. Enrofloxacin is able to control Toxoplasma gondii infection in both in vitro and in vivo experimental models. Vet Parasitol. 187 (1-2), 44-52 (2012).
  20. Wall, G., Lopez-Ribot, J. L. Screening repurposing libraries for identification of drugs with novel antifungal activity. Antimicrob Agents Chemother. 64 (9), e00924-e01020 (2020).
  21. dos Santos, M., et al. Medicines for malaria venture pandemic box in vitro screening identifies compounds highly active against the tachyzoite stage of Toxoplasma gondii. Trop Med Infect Dis. 8 (12), (2023).
  22. Costa, A. L. O., et al. Antiproliferative and morphological analysis triggered by drugs contained in the medicines for malaria venture COVID-box against Toxoplasma gondii tachyzoites. Microorganisms. 12 (12), 2602(2024).
  23. Ufermann, C. -M., Müller, F., Frohnecke, N., Laue, M., Seeber, F. Toxoplasma gondii plaque assays revisited: Improvements for ultrastructural and quantitative evaluation of lytic parasite growth. Exp Parasitol. 180, 19-26 (2017).
  24. Condit, R. C. Principles of virology. Fields Virology. I, 25-57 (2007).
  25. Montazeri, M., et al. In vitro and in vivo evaluation of kojic acid against Toxoplasma gondii in experimental models of acute toxoplasmosis. Exp Parasitol. 200, 7-12 (2019).
  26. Ke, O. Y., Krug, E. C., Marr, J. J., Berens, R. L. Inhibition of growth of Toxoplasma gondii by qinghaosu and derivatives. Antimicrob Agents Chemother. 34 (10), 1961-1965 (1990).
  27. Liu, X., et al. Anti-Toxoplasma gondii effects of lipopeptide derivatives of Lycosin-I. Toxins. 15 (8), 477(2023).
  28. Emi, A., et al. Development of an automated plaque-counting program for the quantification of the Chikungunya virus. Sci Rep. 15 (1), 12429(2025).
  29. Sullivan, K., et al. High throughput virus plaque quantitation using a flatbed scanner. J Virol Methods. 179 (1), 81-89 (2012).
  30. Pereira Filho, A. A., et al. In vitro activity of essential oils from piper species (Piperaceae) against tachyzoites of Toxoplasma gondii. Metabolites. 13 (1), 95(2023).
  31. Martins-Duarte, E. S., et al. In vitro activity of N-phenyl-1,10-phenanthroline-2-amines against tachyzoites and bradyzoites of Toxoplasma gondii. Bioorg Medl Chem. 50, 116467(2021).
  32. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  33. Subramanian, G., et al. Targeted phenotypic screening in Plasmodium falciparum and Toxoplasma gondii reveals novel modes of action of medicines for malaria venture malaria box molecules. mSphere. 3 (1), e00534(2018).
  34. Dans, M. G., et al. Screening the medicines for malaria venture pathogen box for invasion and egress inhibitors of the blood stage of Plasmodium falciparum reveals several inhibitory compounds. Int J Parasitol. 50 (3), 235-252 (2020).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة