مقالة منهجية

طرق القياس الميداني لشكل الميتوكوندريا في خلايا العضلات والشوان الطرفية للفئران

DOI:

10.3791/69732

⸱

أبريل 10, 2026

 ,  ,  ,  , 
1Department of Kinesiology and Sport Management, College of Education and Human Development, Texas A&M University, College Station, 2National Institutes of Health

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

حقن موضعية لصبغة ميتوكوندريا نهاية ميتوكوندريا خلية شوان في الجسم الحي للمجهر الكونفوكلي. تستخدم هذه الطريقة إثبات المفهوم الذي تم إثباته في أنسجة العضلات الهيكلية من فئران ذات عضلات سليمة أو مريضة لتوفير تصور ميتوكوندريا بدقة عالية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يستخدم شكل الشبكات الميتوكوندرية على نطاق واسع كمؤشر على صحة الخلية؛ ومع ذلك، لا يزال قياس بنية الميتوكوندريا داخل الأنسجة السليمة تحديا تقنيا. خلايا شوان النهائية (tSCs)، التي تعتبر ضرورية للحفاظ على وتجديد الوصلات العصبية العضلية، يصعب تحليلها بشكل خاص في الموقع بسبب موقعها التشريحي وحساسيتها لاضطراب الأنسجة. يصف هذا البروتوكول نهجا قابلا للتكرار لتصنيف وقياس شكل شبكة الميتوكوندريا ثلاثية الأبعاد في العضلات الهيكلية الكاملة وفي tSCs في الفئران باستخدام المجهر الكونفوكالي القياسي. تستخدم الطريقة توصيل صبغة ميتوكوندرية حساسة لجهد الغشاء في الجسم الحي ، تليها معالجة الأنسجة بسرعة وتصوير كونفوكالي عالي الدقة. يتم تحليل مجموعات الصور لقياس الاتصال بالشبكة الميتوكوندرية، والمساحة، والتجزئة. يتم التحقق من صحة البروتوكول أولا في العضلات الهيكلية الضمورية والسليمة لتأكيد الفروق المتوقعة في شكل الميتوكوندريا، ثم يتم تكييفه لاحقا لرؤية وقياس الشبكات الميتوكوندرية في tSCs التي تم تحديدها باستخدام فئران S100β المراسلة. يتيح هذا النهج تحليل شكل الميتوكوندريا داخل الأنسجة العصبية العضلية السليمة دون الحاجة إلى مراسلين ميتوكوندريا معدلين وراثيا أو منصات تصوير متخصصة. يتطلب البروتوكول فقط المعدات المتوفرة عادة في مرافق الجامعة الأساسية ويمكن تكييفها مع أنسجة رقيقة أو سطحية أخرى.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الميتوكوندريا هي عضيات بلاستيكية بشكل ملحوظ تعمل كرئتين للخلية، تستهلك الأكسجين أثناء التنفس الخلوي لدعم إنتاج الأدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP) استجابة للطلب الأيضي1. بينما كان يعتقد سابقا أنها عضيات منفصلة، أصبح من المفهوم الآن أن الميتوكوندريا متكاملة للغاية 2,3,4، وتشارك ركيزة الطاقة عبر شبكتها وفقا للمتطلبات المحلية. يوفر التكامل ميزة واضحة على العزل: حيث تدعم الميتوكوندريا المتصلة عجز الطاقة، وتحافظ على التدرجات الكهروكيميائية للفسفرة التأكسدية أثناء زيادة الطلب الأيضي. في الواقع، توزيع وحجم وشكل الميتوكوندريا يناسب احتياجات الطاقة في محيطها5. في الصحة، يتم الحفاظ على الدوران المنتظم لشبكات الميتوكوندريا من خلال تكوين الميتوكوندريا، وأحداث الاندماج والانشطار، والميتوفاهيا 2,3. التكوين الحيوي للميتوكوندريا ضروري للحفاظ على صحة الميتوكوندريا وتوسعه. الطلب الأيضي، مثل التمارين البدنية، يزيد من تعبير المستقبل المنشط بواسطة متكاثر البيروكسيسوم γ المنشط المشارك 1α (PGC-1α)5. تحدث هذه العملية عبر إشارات التحمل الأولية، وبشكل خاص الارتفاع الناتج عن التمرين لأنواع الكينازي البروتيني المنشط ب AMPK والكالسيوم والأكسجين التفاعلي 6,7. يوسع الاندماج الشبكات، مما يعزز البقاء ويكمل العجز، بينما يخفف الانشطار من المزيد من الضرر الميتوكوندري من خلال الاستبعاد التفضيلي للمنطقةالمختلة 2,3,8. بمجرد إزالتها، يجب أن تخضع المناطق المستبعدة لعملية الميتوفاه، مما يمنع تراكم العضيات والبروتينات المختلة6،9.

تشكل العضلات الهيكلية حوالي 40٪ من كتلة الجسم وتعتمد على الميتوكوندريا في الأيض الهوائي والإشارات الخلوية للحفاظ على التوازن10. بشكل عام، في حالات خلل العضلات الهيكلية، تتأثر آليات التحكم في جودة الميتوكوندريا10. تقيس التحقيقات في خلل العضلات عادة التنفس الميتوكوندري، وحجمه، والشكل، وإنتاج أنواع الأكسجين التفاعلي (ROS) لتقييم جودة الميتوكوندريا 3,10. وفي هذا الصدد، خلال خلل العضلات المطول، يقل التنفس الميتوكوندري، بينما يزداد ROS، وتنقسم الشبكات 3,10. تنشأ الاضطرابات في شكل الميتوكوندريا بشكل كبير من تنشيط بروتينات الانشطار الميتوكوندري، وهي البروتين المرتبط بالدينامين 1 (DRP1) والانشطار الميتوكوندري 1 (FIS1)2,8,11. استجابة لضمور العضلات، يقوم FIS1، الذي يقيم على سطح الغشاء الخارجي للميتوكوندريا، بتجنيد DRP1 ليتم التقليب مع عدة ديمرات DRP1 لإنشاء خيط حول الميتوكوندريا، مع تقليل حجمه حتى يتم "قرص" جزء معين من الميتوكوندريا، مما يعزز التجزئة 3,11. معا، فإن فرط نشاط انشطار الميتوكوندريا، وتقليل اندماج الميتوكوندريا الجديدة، والانقسام الميتوكوندري غير الوظيفي، هي مسؤولة عن ظهور شبكات الميتوكوندريا غير الوظيفية، مثل تلك الموصوفة في العضلات غير النشطةأو المريضة 2,12.

الوصلة العصبية العضلية (NMJ) هي موقع الإثارة العضلية. تنتشر جهود الفعل التي تبدأ في السوما على طول المحاور العصفورية، ومغلفة بواسطة خلايا شوان المييلينية (SCs)، وتنتهي عند الخلايا الميالية المغناطيسية التي تغلف بواسطة خلايا شوان الطرفية (tSC). يمكن للجماهير العصبية أن تتجدد بعد الإصابة. ومع ذلك، تقل احتمالية وسرعة التجدد مع زيادة المسافة بين موقع الإصابة وNMJبمقدار 13,14. بعد إصابة العصب عن طريق القطع أو السحب أو التمدد، تتمايز الخلايا العصبية إلى حالة شبيهة بمولد المولد المزيل 15,16. تتكاثر الخلايا الذرية المزائلة وتعمل بالتعاون مع البلعم لإعادة تشكيل البيئة المحلية من أجل التجدد عن طريق إزالة الحطام بين موقع الإصابة وجذع المحور القريب عبر التنكس واليري17,18. تشير الخلايا النارية المهاجرة إلى استجابة التهابية تعيد تشكيل البيئة لتجديد الأعصاب بنجاح18. يحدث تجديد الأعصاب داخل الغلاف العصبي الذي يتكون من الغلاف العصبي بواسطة الخلايا الصلبة الشبيهة بالسلف، والتي تشكل أشرطة من بونجر، ومن خلالها تنمو المحاور العصبيةمن جديد 19. ثم يمتد الجذع المحوري ليبدأ إعادة التعصيب14. بعد إعادة التعصيب، يمكن للما قبل المشبك أن يتجدد بالكامل، بشرط أن تعيد tSCs الاستثمار في NMJ20.

يختلف شكل الميتوكوندريا بشكل ملحوظ بين أنواع الخلايا، ويتوافق مع وظيفة الأنسجة21. تشير التقارير من أنسجة الكبد إلى أن الميتوكوندريا أكثر تماسكا وكرويا، بينما الميتوكوندريا في المادة البيضاء في الدماغ أكثر استطالة وأنبوبية22. عند التحدي، مثل حالات الشيخوخة والإجهاد التأكسدي، تظهر الميتوكوندريا في هذه الأنسجة نمطا ظاهريا يشبه الدونات. ومع ذلك، في الخلايا العظمية، ارتبط تكوين وتجزئة الدونات الميتوكوندرية بزيادة إفراز الميتوكوندريا والحويصلات المشتقة من الميتوكوندريا، ومع نضج الخلايا العظمية23. بينما تم فحص شبكات الميتوكوندريا في العضلات العظمية بشكل موسع عبر عدة أنواع، لا تزال هناك قيود في تصوير شبكات الميتوكوندريا من الخلايا الميتوكوندرية من الخلايا العصبية المحيطية. هذه الأنسجة يصعب التقاطها داخل بيئتها الأصلية، حيث يتغير هيكل الخلايا بشكل كبير بعد العزل، ويصعب استهداف هذه الأنسجة بالصبغة في الجسم الحي دون تحميل العضلات الهيكلية المصاحبة.

يمكن تصنيف تقنيات التصوير المستخدمة لالتقاط شكل الميتوكوندريا في الأنظمة الحية إما كمجهر ضوئي أو إلكتروني5. مع المجهر التقليدي لالتقاط الضوء، يمكن للأصباغ أن تضع علامات على الخلايا الحية، ويمكن وسم الخلايا الثابتة مناعة، ويمكن تصنيف الميتوكوندريا جينيا 5,24. عادة ما يتطلب تصوير الخلايا الحية حضانة الخلايا لمدة 20–60 دقيقة قبل تحليل التألق. توجه الأصباغ إلى الميتوكوندريا عبر جهد الغشاء، وبالتالي قد تتغير في ظروف الجهد الغشائي المعدل5. من الناحية النظرية، من الممكن التقاط الشكل الميتوكوندري لعناصر tSCs داخل العضلة العظمية عبر تحميل الصبغة؛ ومع ذلك، سيتطلب ذلك تصوير الأنسجة الكاملة وتقنيات وسم مفصلة. على وجه الخصوص، يلتقط الميتوكوندريا داخل الهياكل السليمة، دون تدخل من وضع علامات العضلات الهيكلية. لتجاوز هذه القيود، تم استخدام صبغة الفلورسنت الميتوكوندرية لوضع علامات على العضلات الهيكلية الحية في الفئران السليمة والمصابة بالضمور، تلاها وضع علامة على ميتوكوندريا tSC للتصوير في الجسم الحي والتصوير في الموقع. تم اختيار عضلة الظنبوب الأمامية (TA) لتحسين تصوير العضلات الهيكلية بسبب موقعها التشريحي السطحي، وحجم الحقن المميز جيدا وتشتت اللفافة العضلية 25,26,27، وملاءمتها للقياسات الوظيفية المتزامنة. تم اختيار عضلة الألوية العظمى (GM) لتصوير tSC بناء على طريقة الحقن المعتمدة28,29، وبنيتها الرقيقة التي تقلل من الفلورة الخلفية، والموقع السطحي البطني للوصلات العصبية العضلية بين العضلة المعدلة وراثيا وعضلات الألوية الوسطى، مما يتيح وضع علامات تفضيلية على tSCs قبل ألياف العضلات الهيكلية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ذكر بالغ عمره ستة أشهر (n=3) من نوع DBA/2J [النوع البري (WT)] (RRID: IMSR_JAX:000671) وD2.B10-DMDD2.mdx/J [D2.mdx (mdx)] (RRID: IMSR_JAX:013141)، بينما ذكر وأنثى بالغين من ثلاثة إلى خمسة أشهر (n=8) من B6؛ تم استخدام D2-Tg(S100-EGFP)1Wjt/J (S100B) (RRID: IMSR_JAX:005621) [أيضا مع WT دون وجود اختلافات عن DBA] من مستعمرة مستمرة من فئران يحتفظ بها الباحثون. يتم تلخيص سير العمل التجريبي العام لحقن الحمض النووي والجيناتري، ومعالجة الأنسجة، والتصوير في الشكل 1. إضافة D2. تم التبرع بفأر MDX من قبل الباحثين لتصوير Tsc في MDX (n=1). تمت الموافقة على جميع إجراءات الحيوانات من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوانات المؤسسية في جامعة تكساس إيه آند إم (AUP 2022-0215) وأجريت وفقا لدليل المجلس الوطني للبحوث لرعاية واستخدام الحيوانات المخبرية (الطبعة الثامنة)30. تم إجراء القتل الرحيم عن طريق خلع عنق الرحم تحت جرعة زائدة مخدرة من إيزوفلوران.

1. تحضير محلول عمل صبغة الميتوكوندريا الفلورية بحجم 2 ميكرومولار

  1. تعليق صبغة الميتوكوندريا (50 ميكروغرام) في 322 ميكرولتر من كبريتات ثنائي ميثيل (DMSO) وفقا لتعليمات الشركة المصنعة لتحضير محلول مخزن بسعة 200 ميكرومتر.
  2. لتحضير 30 مل من محلول العمل 2 ميكرومول، انقل 300 ميكرولتر من محلول المخزون 200 ميكرومولار إلى 29.7 مل من محلول ملحي معقم. اخلط جيدا.
  3. أليكوت 250 ميكرولتر من محلول 2 ميكرومولار يعمل في أنابيب الطرد المركزي الدقيق ويخزن عند -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
    ملاحظة: لم يلاحظ أي تدهور قابل للكشف في الإشارة بعد 3 سنوات من التخزين عند -80 درجة مئوية.

2. الصبغة وتحضير الحيوانات

  1. قم بإذابة واحدة مجمدة قبل 15 دقيقة من التجربة. اسحب المحلول في حقنة أنسولين بسعة 30 جيلون، 1 سم مكعب.
  2. تخدير الحيوان بالإيزوفلوران. ضع مرهم العيون، احلق موقع الحقن، وحافظ على درجة حرارة الجسم باستخدام مصباح تدفئة مع مسبار درجة حرارة موضوع بين الحيوان ومصدر الحرارة.
  3. نظف موقع الحقن المحلق بكحول الأيزوبروبيل بنسبة 70٪.

3. إعطاء ووظيفة صبغة الميتوكوندريا في عضلات الظنبوب الأمامية (TA)

  1. إدارة صبغة TA
    1. حقن 50 ميكرولتر من صبغة الميتوكوندريا بقوة 2 ميكرومولار في عضلة TA اليمنى لفئران WT وD2.mdx المخدرة.
    2. أدخل الإبرة عند الوتر البعيد باتجاه الركبة واضغط على المكبس أثناء سحب الإبرة على مسار الحقن.
    3. حضن الصبغة في الجسم الحي لمدة ساعة قبل التشريح.
  2. قياسات وظائف عضلة TA
    1. بعد 45 دقيقة من حضانة الصبغة، يتم تخدير الفأر باستخدام الإيزوفلوران (2٪–3٪ تحفيز، 1.5٪–2٪ صيانة في الأكسجين).
    2. كشف عضلة TA اليسرى جراحيا مع الحفاظ على الأنسجة المحيطة. اربط الوتر البعيد بحزمة التحميل في نظام اختبار العضلات.
    3. لف العضلة المكشوفة بمسح مختبر واغسل العضلات عند 3 مل في الدقيقة مع محلول ملحي معقم 0.9٪ مسخن إلى 40 درجة مئوية. حافظ على درجة حرارة العضلات عند 32 درجة مئوية باستخدام مصباح حراري.
    4. ضع أقطاب أسلاك البلاتين/الإيريديوم عبر عضلات البطن لتحفيز مباشر.
    5. قم بتثبيت شعاع الحمل على ميكرومتر وضبط الطول الأمثل (L0) باستخدام انقباضات التوتر (Tw) عند 1 هرتز. سجل L0 باستخدام كاليبر رقمي.
    6. تحفز أقصى انقباضات التيتانيك (P0) ثلاث مرات عند 140 هرتز مع 60 ثانية راحة بين الانقباضات. سجل أعلى قيمة قوة (g). احصل على معلومات باستخدام نظام وظائف العضلات باستخدام برنامج التحليل.
  3. معالجة أنسجة TA
    1. بعد الحضانة، عزل وتشريح عضلة TA قبل القتل الرحيم.
    2. ضع حزم ألياف عضلية معزولة في بارافورمالديهيد بنسبة 4٪ في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة مع تحريك الألياف بلطف تحت المجهر المجسم.
      تحذير: البارافورمالديهايد سام ويجب التعامل معه بغطاء بخار كيميائي مع ارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة (معطف المختبر، القفازات، وحماية العين).
    3. أضف صبغة حمض نووي مستمر للخلية إلى تركيز نهائي بين 5–10 ميكروغرام/مل لتحديد النوى.
    4. غسل العينات ثلاث مرات في محلول ملحي مخبأ بالفوسفات (PBS) لمدة 5 دقائق لكل منها لإزالة الصبغة الزائدة.
    5. جفف العينات بشكل متتالي بمحلول 50٪، 75٪، و100٪ إيثانول لمدة 5 دقائق لكل منها.
    6. حضن العينات بشكل متسلسل في محاليل تنظيف الأنسجة I وII لمدة 30 دقيقة لكل منهما في درجة حرارة الغرفة باستخدام حجم كاف لغمر الأنسجة بالكامل.
    7. ضع حزم TA النظيفة على غطاء منزلق وسطحه بلطف باستخدام كتلة زجاجية (2.5 سم × 2 سم × 1 سم؛ الكتلة 7.8 جم)26.

4. تصوير عينات عضلات TA

  1. صور عينات العضلات باستخدام مجهر كونفوكلي للحصول على مقاطع بصرية ثلاثية الأبعاد عالية الدقة.
  2. التقاط صور Z-stack على عمق يقارب 100 ميكرومتر للعضلات باستخدام عدسة موضوعية مكبرة بزاوية 63x (N.A. 1.40).
  3. استخدم برنامج الكونفوكال الخاص بنظام التصوير بطول موجة إثارة 646 نانومتر لتوفير أكبر وضوح مع أقل خلفية في الصورة.
  4. التقاط الصور باستخدام وضع فك الالتفاف، باستخدام معلمات "النظام المحسن" بأحجام خطوات 1 ميكرومتر.
    ملاحظة: لمكافحة الجفاف والتبييض الضوئي، انقل الأنسجة إلى محلول تنظيف الأنسجة II وضعها على غطاء داخلي. ضع قطرتين من محلول التنظيف 2 مباشرة على النسيج قبل التصوير.

5. تحميل وتصوير صبغة عضلة GM tSC

  1. استخدم فئران S100β لتحديد الفلورية المحددة ل tSCs.
  2. قم بإجراء شق جلدي صغير فوق عضلة GM. حقن 75 ميكرولتر من صبغة ميتوكوندرية فلورية حمراء بعيدة بعمق 2 ميكرومتر تحت الميكرومول، قبل إغلاق الجرح25.
  3. أغلق الجرح ودع الصبغة تحتضن لمدة 45 دقيقة لوضع علامات انتقائية على tSCs دون وضع علامات كبيرة على ألياف العضلات الأساسية.
  4. قم بتشريح عضلات GM وضعها فورا في محلول ملحي معقم مبرد بنسبة 0.9٪. قم بتقليم الدهون الزائدة والأنسجة الضامة بسرعة.
  5. انقل المديرين المفصلين إلى غطاء للتصوير.
  6. فقط عند استخدام فئران D2.mdx، أضف صبغة مستقبلات الأستيل كولين الفلورية (AChR) بتخفيف 1:500 إلى حوض التشريح الدقيقي. حضن النسيج لمدة 30 دقيقة لرؤية المكونات ما بعد المشبكية للوصلة العصبية العضلية (NMJ).
  7. استخدم هذا النهج المزدوج للتمييز بين الميتوكوندريا بعد المشبكية والميتوكوندريا الخاصة ب tSC.
    تحذير: الحد من تشريح وتنظيف الطبيب المعدلة إلى ما لا يزيد عن 10 دقائق قبل وضعه على غطاء للتصوير لتقليل التغيرات الشكلية بعد التشريح. هذا الحد الزمني ضروري لتقليل التغيرات الشكلية بعد التشريح وتدهور الميتوكوندريا.
  8. إجراء المجهر الكونفوكلي للحصول على مقاطع بصرية ثلاثية الأبعاد عالية الدقة.
  9. التقاط صور Z-stack على عمق يقارب 16 ميكرومتر لأقراص tSC باستخدام عدسة هدف مكبر 20x (N.A. 0.75). احصل على صور تمثيلية عالية الدقة لأجهزة tSC الفردية باستخدام عدسة هدف مكبر 63x.
  10. تنفيذ إجراءات التثبيت لتقليل جفاف الأنسجة والتبييض الضوئي أثناء جلسة التصوير.
    تحذير: نقل الأنسجة المالحة إلى غطاء المجهر (غطاء)، مع التأكد من أن الجانب البطني يواجه للأسفل لإجراء المجهر المقلوب.
  11. ضع 2 ميكرولتر من وسط التركيب العام على السطح الظهري لل GM.
  12. قم بتسطيح النسيج بلطف باستخدام كتلة زجاجية معايرة (2.5 سم × 2 سم × 1 سم؛ الكتلة 7.8 جم) لضمان مستوى تصوير متجانس.

6. المجهر بشعاع الأيونات المركز

  1. إجراء المجهر الإلكتروني الماسح بشعاع الأيونات المركزة (FIB-SEM) وفقا للبروتوكولات السابقة26.
    1. تطبيق FIB-SEM تحديدا لتأكيد وتصور السمات الشكلية الجديدة التي تم تحديدها أثناء التصوير الكونفوكلي.

7. تحليل الصور

  1. عينات عضلات TA
    1. إجراء تحليل كمي للمقاطع البصرية الكونفوكالي (1 ميكرومتر) من مسوحات TA (حوالي 75–112 ميكرومتر) باستخدام برنامج تحليل الصور المدعوم بالذكاء الاصطناعي.
      ملاحظة: قم بأداء عدة جلسات تدريبية تحت إشراف قبل التقسيم الآلي لتعزيز تكيف الخوارزميات.
    2. استيراد مقاطع بصرية مفردة (Z-slices) لتعليم البرنامج كيفية الاحتفاظ بالمعلومات البكسلية التي تمثل صبغة الميتوكوندريا البيضاء مع استبعاد الخلفية السوداء.
    3. طور أقنعة صور لمراجعة المحققين لضمان تحليل عالي الجودة ودقة.
    4. يتم فصل أكوام الصور ثلاثية الأبعاد إلى أقسام بصرية واحدة وفقا لتحسين الخوارزميات.
    5. اختر كل شريحة Z خامسة من كل صورة ثلاثية الأبعاد للتحليل، حيث تمثل كل نقطة بيانات متوسط هذه الأقسام الفردية لكل عينة.
    6. قم بقياس شكل الميتوكوندريا لاشتقاق مقاييس التوزيع المكاني وربط الشبكات.
    7. توحيد عتبات الشدة، إعدادات كشف الحواف، ومعايرة حجم الفوكسل عبر جميع العينات لتقليل التباين التجريبي.
  2. tSCs على عينات GM
    1. تجميع أقسام بصرية بحجم 1 ميكرومتر في مكدسات Z (حوالي 6–25 ميكرومتر بسماكة) وفصل الصور إلى قنوات لونية فردية باستخدام برنامج تحليل الصور ثنائية الأبعاد.
    2. قم بمعايرة البرمجيات باستخدام أشرطة المقياس وتطبيق العتبة لتحسين تصور الميتوكوندريا tSC مع أقل تداخل في الخلفية.
    3. قم بإجراء الثنائية وإزالة الضوضاء الخلفية لعزل ميتوكوندريا tSC أو tSCs لقياس المساحة وعدد الجسيمات.
    4. حفظ الصور الثنائية لضمان معالجة متسقة وإجراء جميع تجارب التصوير تحت ظروف متطابقة لضمان قابلية التكرار عبر النسخ البيولوجية.

8. الكيمياء المناعية

  1. تم تضمين عينات عضلة TA اليسرى في مركب درجة حرارة القطع المثلى (OCT) لتقييم مساحة المقطع العرضي (CSA).
    1. عينات مقسمة بسماكة 10 ميكرومتر باستخدام جهاز تجميد مضبوط على -17°م ويتم جمعها على شرائح المجهر.
    2. قم بصبغ مقاطع العضلات للامينين لتحديد حدود ألياف العضلة باستخدام الأجسام المضادة الأولية للأرنب المضادة للامينين (1:400) والأجسام المضادة الثانوية رودامين المضادة للأرانب (1:400).
    3. تركيب الشرائح باستخدام وسط تثبيت مناسب قبل التصوير.
  2. شرائح الصور باستخدام مجهر كونفوكلي عن طريق اختيار عشوائي 2–3 مناطق ذات اهتمام (580 × 580 ميكرومتر) لكل عينة مع هدف 20x (N.A. 0.75).
  3. قيم متوسطة عبر المناطق لكل عضلة وتحليل حوالي 400 ألياف عضلية لكل جزء عضلي TA.
  4. استخدم برنامج تقسيم العضلات شبه التلقائي لتحديد CSA (ميكرومتر2) عن طريق إخفاء ألياف العضلات.

9. التحليل الإحصائي

  1. الإبلاغ عن ملخص البيانات كمتوسط ± الخطأ المعياري للمتوسط (S.E.M.).
  2. إجراء تحليل إحصائي باستخدام برنامج إحصائي مخصص، باستخدام اختبارات t للطالب المعلمية غير المتوافقة لتحديد الدلالة بين فروق المتوسط الجماعية.
  3. إجراء انحدارات خطية بسيطة على CSA وقوة العضلات من عضلات TA، باستخدام هذه كمؤشرات لعلم أمراض DMD لمقارنة شكل الميتوكوندريا من عضلات TA وtSCs المعدلة وراثيا.
  4. تقييم معاملات ارتباط بيرسون r لتحديد العلاقة بين أمراض مرض DMD وأمراض الميتوكوندريا. عرف الدلالة الإحصائية ك P ≤ 0.05.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أظهرت شبكات الميتوكوندريا انخفاضات متوقعة في الاتصال
تعرض صور فلورية ثلاثية الأبعاد تمثيلية لمسح الكونفوكالي العضلي في مجموعتين، WT وMDX (الشكل 2). بالمقارنة مع مجموعة WT، يبدو أن الاتصال الميتوكوندري أقل في فئران mdx مقارنة ب WT (الشكل 2A–D). لوحظت أعداد أكبر من شظايا الميتوكوندريا الصغيرة في فئران mdx [<100 ميكرومترمربع] (وزن 17.3 ± 3.5٪؛ MDX 36.3 ± 4.9٪؛ P = 0.015) وعدد...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يرتبط موقع الميتوكوندريا داخل البنى الخلوية، بالإضافة إلى شكلها، بصحة الميتوكوندريا والطلب الأيضي21. نظرا للأهمية السريرية لصحة الميتوكوندريا، إلى جانب حركيات التنفس المتباينة والأشكال لأنواع الخلايا المختلفة، تم تطوير طريقة سهلة التطبيق تعتمد على المجهر الكونفوكلي لتقييم أشكال الميتوكوندريا في الخلايا الهيكلية بعد تقييم الطريقة الأولى في العضلات العظمية، مقدمة معلومات عن صحة الميتوكوندريا كما تشير المورفولوجيا، في نوع نسيج يصعب الحفاظ عليه في الجسم الحي ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لا توجد مصالح متنافسة بين المؤلفين.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يشكر المؤلفون الدكتورة ماريابان موثوتشامي، منديل رايمر، وبيتر نغيم على توفير فئران D2.mdx بسخاء لتقييم ميتوكوندريا tSC. وقد تم دعم هذا العمل من قبل منحة أبحاث الطلاب في معهد سيدني وجي. إل. هوفينز لطب الرياضة والأداء البشري، بالإضافة إلى تمويل من كلية التربية والتنمية البشرية في جامعة تكساس إيه آند إم. كما حظيت A.B.M. بدعم من قبل شركة NIH LRP (NIAMS، 2L40AR077899-02A3).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

```html

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
3-in-1 Whole Animal SystemAurora Scientific, Ontario, Canada1300Aنظام وظيفة العضلات مع برامج التحليل
AIVIA Leica Microsystems, Bellevue, WA, USA15برنامج تحليل الصور المدفوع بالذكاء الاصطناعي
anti-laminin MilliporeSigmaL9393-.2mLعلامة حدود الألياف العضلية
B6; D2-Tg(S100-EGFP)1Wjt/J Mouse StrainJackson Labs, Bar Harbor, MEJAX:005621S100β
Cryostar NX50 CryostatEpredia, Kalamazoo, MI, USAhttps://www.epredia.com/products/histology-instruments/cryotomy/cryostar-nx50Cryostat
D2.B10-DMDD2.mdx/J Mouse StrainJackson Labs, Bar Harbor, MEJAX:13141D2.mdx
DBA/2J Mouse StrainJackson Labs, Bar Harbor, MEJAX:00671WT
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)Fisher Scientific; Hampton, NJ, USABP231-100عامل استعادة تلطيخ الميتوكوندريا
Hoechst 33342Thermo Fisher ScientificH1399صبغة الأحماض النووية التي تخترق الخلايا
ImageJ/Fiji National Institutes of Health, Bethesda, MD, USASCR_002285برنامج التحليل ثنائي الأبعاد
Invitrogen ProLong Gold antifade reagent with DAPI Fisher Scientific, Hampton, NJ, USAP36941وسط التركيب
KimWipeKimberly-Clark, Irving, TX, USA06-666Aمناديل المختبر
Leica LAS_X software Leica Biosystems, Wetzlar, GermanySCR_013673برنامج confocal
MitoView Fix 640Biotium70075-50ugصبغة ميتوكوندريا فلورية أحمر بعيد
NIS-Elements Advanced Research software Nikon, Melville, NY, USASCR_014329برنامج تحليل المساحة المقطعية
Permount Mounting Medium Fisher Scientific, Waltham, MA 02454, USA#SP15-100وسط التركيب العام
Prism 9 software GraphPad Software, La Jolla, CA, USARRID: SCR_002798برنامج التحليل الإحصائي
Rhodamine (TRITC)Fisher Scientific; Hampton, NJ, USAAP132RMIجسم مضاد ثانوي
Stellaris 5 White Light Confocal Microscope and corresponding deconvolution softwareLeica Microsystems, Wetzlar, Germany158301313:158201310:158004752:
158301312:158301314:158401100:
158209011:158301130:158204510:
158301120:158401140:158204511:
15500332:15506428:15506517:155
13859:15521522:15525226:155252
32:15525314:15555009:15555017:
15555046:27100022:155933660:
155933666:155933668:158000640
:158002407:158003150:158004141
:158004201:158004421:158004423
:158200681:158202140:158203114:
158203200:158203220:158204201:
158204510:158204709:158301200:
9I_LL_STELLARIS_C:9T-CLSM-APP
_CLASSC:9WE_LAS_405:9WE_
LAS_WLL:9WE_LL_STELLARIS_C		مجهر confocal
SZ61Olympus, Breinigsville, PA, USAsz61مجهر stereo
Tissue-Plus O.C.T. Compound Scigen, Fischer Scientific, Hampton, NJ, USA23-730-571مركب درجة الحرارة المثلى للقطع
Visikol ISigma-Aldrich, St. Louis, MO, USAH1-30محلول تنقية الأنسجة 1
Visikol IISigma-Aldrich, St. Louis, MO, USAH2-30محلول تنقية الأنسجة 2
α-bungarotoxin 552Biotrend, Koln, Germany00014صبغة مستقبل الأستيل كولين
```

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Memme, J. M., Slavin, M., Moradi, N., Hood, D. A. Mitochondrial bioenergetics and turnover during chronic muscle disuse. Int J Mol Sci. 22 (10), 5179(2021).
  2. Iqbal, S., Hood, D. A. The role of mitochondrial fusion and fission in skeletal muscle function and dysfunction. Front Biosci. 20 (1), 157-172 (2015).
  3. Hyatt, H. W., Powers, S. K. Mitochondrial dysfunction is a common denominator linking skeletal muscle wasting due to disease, aging, and prolonged inactivity. Antioxidants. 10 (4), 588(2021).
  4. Katti, P., et al. Mitochondrial network configuration influences sarcomere and myosin filament structure in striated muscles. Nat Commun. 13, 6058(2022).
  5. Glancy, B. Visualizing mitochondrial form and function within the cell. Trends Mol Med. 26 (1), 58-70 (2020).
  6. Yan, Z., Okutsu, M., Akhtar, Y. N., Lira, V. A. Regulation of exercise-induced fiber type transformation, mitochondrial biogenesis, and angiogenesis in skeletal muscle. J Appl Physiol. 110 (1), 264-274 (2011).
  7. Powers, S. K., Nelson, W. B., Hudson, M. B. Exercise-induced oxidative stress in humans: Cause and consequences. Free Radic Biol Med. 51 (5), 942-950 (2011).
  8. Hyatt, H., Deminice, R., Yoshihara, T., Powers, S. K. Mitochondrial dysfunction induces muscle atrophy during prolonged inactivity: A review of the causes and effects. Arch Biochem Biophys. 662, 49-60 (2019).
  9. Drake, J. C., Yan, Z. Mitophagy in maintaining skeletal muscle mitochondrial proteostasis and metabolic health with ageing. J Physiol. 595 (20), 6391-6399 (2017).
  10. Chen, X., et al. Mitochondrial dysfunction: Roles in skeletal muscle atrophy. J Transl Med. 21 (1), 503(2023).
  11. Zhang, Z., Sliter, D. A., Bleck, C. K. E., Ding, S. Fis1 deficiencies differentially affect mitochondrial quality in skeletal muscle. Mitochondrion. 49, 217-226 (2019).
  12. Silva, K. A. S., et al. Angiotensin II suppresses autophagy and disrupts ultrastructural morphology and function of mitochondria in mouse skeletal muscle. J Appl Physiol. 126 (6), 1550-1562 (2019).
  13. Cattin, A. L., et al. Macrophage-induced blood vessels guide Schwann cell-mediated regeneration of peripheral nerves. Cell. 162 (5), 1127-1139 (2015).
  14. Caillaud, M., Richard, L., Vallat, J. M., Desmoulière, A., Billet, F. Peripheral nerve regeneration and intraneural revascularization. Neural Regen Res. 14 (1), 24-33 (2019).
  15. Girouard, M. P., Bueno, M., Julian, V., Drake, S., Byrne, A. B., Fournier, A. E. The molecular interplay between axon degeneration and regeneration. Dev Neurobiol. 78 (10), 978-990 (2018).
  16. Belanger, K., Dinis, T. M., Taourirt, S., Vidal, G., Kaplan, D. L., Egles, C. Recent strategies in tissue engineering for guided peripheral nerve regeneration. Macromol Biosci. 16 (4), 472-481 (2016).
  17. Waller, A. Experiments on the section of the glossopharyngeal and hypoglossal nerves of the frog, and observations of the alterations produced thereby in the structure of their primitive fibers. Philos Trans R Soc Lond. 140, 423-429 (1850).
  18. Napoli, I., et al. A central role for the ERK-signaling pathway in controlling Schwann cell plasticity and peripheral nerve regeneration in vivo. Neuron. 73 (4), 729-742 (2012).
  19. Jessen, K. R., Mirsky, R. The repair Schwann cell and its function in regenerating nerves. J Physiol. 594 (13), 3521-3531 (2016).
  20. Hastings, R. L., Mikesh, M., Lee, Y. I., Thompson, W. J. Morphological remodeling during recovery of the neuromuscular junction from terminal Schwann cell ablation in adult mice. Sci Rep. 10 (1), 11132(2020).
  21. Glancy, B., Kim, Y., Katti, P., Willingham, T. B. The functional impact of mitochondrial structure across subcellular scales. Front Physiol. 11, 541040(2020).
  22. Stahon, K. E., Bastian, C., Griffith, S., Kidd, G. J., Brunet, S., Baltan, S. Age-related changes in axonal and mitochondrial ultrastructure and function in white matter. J Neurosci. 36 (39), 9990-10001 (2016).
  23. Suh, J., et al. Mitochondrial fragmentation and donut formation enhance mitochondrial secretion to promote osteogenesis. Cell Metab. 35 (2), 345-360.e7 (2023).
  24. Laker, R. C., et al. A novel MitoTimer reporter gene for mitochondrial content, structure, stress, and damage in vivo. J Biol Chem. 289 (17), 12005-12015 (2014).
  25. Fernando, C. A., Pangan, A. M., Cornelison, D., Segal, S. S. Recovery of blood flow regulation in microvascular resistance networks during regeneration of mouse gluteus maximus muscle. J Physiol. 597 (5), 1401-1417 (2019).
  26. Hammers, D. W., et al. The D2.mdx mouse as a preclinical model of the skeletal muscle pathology associated with Duchenne muscular dystrophy. Sci Rep. 10 (1), 14070(2020).
  27. Willingham, T. B., Ajayi, P. T., Glancy, B. Subcellular specialization of mitochondrial form and function in skeletal muscle cells. Front Cell Dev Biol. 9, 757305(2021).
  28. Ramos, S. V., Hughes, M. C., Delfinis, L. J., Bellissimo, C. A., Perry, C. G. R. Mitochondrial bioenergetic dysfunction in the D2.mdx model of Duchenne muscular dystrophy is associated with microtubule disorganization in skeletal muscle. PLoS One. 15 (10), e0237138(2020).
  29. Rosen, H. G., et al. Inhibition of mitochondrial fission protein Drp1 ameliorates myopathy in the D2-mdx model of Duchenne muscular dystrophy. bioRxiv. , (2024).
  30. National Research Council. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. , 8th ed, National Academies Press. Washington, DC. (2011).
  31. Ino, D., Iino, M. Schwann cell mitochondria as key regulators in the development and maintenance of peripheral nerve axons. Cell Mol Life Sci. 74 (5), 827-835 (2017).
  32. Pareyson, D., Piscosquito, G., Moroni, I., Salsano, E., Zeviani, M. Peripheral neuropathy in mitochondrial disorders. Lancet Neurol. 12 (10), 1011-1024 (2013).
  33. Schröder, J. M., Sommer, C. Mitochondrial abnormalities in human sural nerves: Fine structural evaluation of cases with mitochondrial myopathy, hereditary and non-hereditary neuropathies, and review of the literature. Acta Neuropathol. 82 (6), 471-482 (1991).
  34. Schröder, J. M. Neuropathy associated with mitochondrial disorders. Brain Pathol. 3 (2), 177-190 (1993).
  35. Santosa, K. B., Keane, A. M., Jablonka-Shariff, A., Vannucci, B., Snyder-Warwick, A. K. Clinical relevance of terminal Schwann cells: An overlooked component of the neuromuscular junction. J Neurosci Res. 96 (7), 1125-1135 (2018).
  36. Morton, A. B., et al. Inducible deletion of endothelial cell Efnb2 delays capillary regeneration and attenuates myofibre reinnervation following myotoxin injury in mice. J Physiol. 602 (19), 4907-4927 (2024).
  37. Morton, A. B., Norton, C. E., Jacobsen, N. L., Fernando, C. A., Cornelison, D. D. W., Segal, S. S. Barium chloride injures myofibers through calcium-induced proteolysis with fragmentation of motor nerves and microvessels. Skelet Muscle. 9 (1), 27(2019).
  38. Sukhorukov, V. M., Dikov, D., Reichert, A. S., Meyer-Hermann, M. Emergence of the mitochondrial reticulum from fission and fusion dynamics. PLoS Comput Biol. 8 (10), e1002745(2012).
  39. Ferramosca, A., Zara, V. Mitochondrial carriers and substrate transport network: A lesson from Saccharomyces cerevisiae. Int J Mol Sci. 22 (16), (2021).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Mitochondrial MorphologyIn Situ QuantificationSkeletal MuscleTerminal Schwann CellsConfocal MicroscopyMitochondrial NetworkMembrane Potential DyeMitochondrial FragmentationNeuromuscular JunctionS100 Reporter Mice

مقالات ذات صلة