يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة بحثية

وين يانغ دينغ تشوان تانغ يخفف من إعادة تشكيل مجرى الهواء بسبب الربو عن طريق تثبيط تنشيط الخلايا الليفية المدفوعة ب M2 بواسطة البلعم

195 مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/69737

⸱

مارس 24, 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Traditional Chinese Medicine, The Third Affiliated Hospital of Qiqihar Medical University, 2Department of Respiratory, The First Affiliated Hospital of Heilongjiang University of Chinese Medicine, 3Department of Clinical Pharmacy, The Third Affiliated Hospital of Qiqihar Medical University, 4Department of Central Laboratory, The Third Affiliated Hospital of Qiqihar Medical University, 5Department of Stomatology, The Third Affiliated Hospital of Qiqihar Medical University, 6Department of Magnetic Resonance, The Third Affiliated Hospital of Qiqihar Medical University

في هذه المقالة

ملخص

تصف هذه المقالة دراسة حول تنظيم تليف الأرومات الليفية الرئوية بواسطة وينيانغ دينغتشوان ديكوكشن من خلال تثبيط استقطاب البلاعم M2.

الملخص

دراسة تأثيرات وين يانغ دينغ تشوان تانغ (WYDCT) على وظيفة الأرومات الليفية، وإعادة تشكيل مجرى الهواء في الربو، والآلية الأساسية. تم استخدام IL-4 لتحفيز استقطاب M2 في بلاعم RAW264.7، ثم عولجت البلعم المستقطبة بتقنية WYDCT لدراسة تأثيره على الأرومات الليفية في رئة الفئران. تم تعريض خلايا RAW264.7 المستقطبة لعلاجات مختلفة ثم تم زراعتها مع الأرومات الليفية. تم تقييم مستويات علامات M1 وM2، وشكل الخلايا، وتركيز IL-6. تم تحليل مستوى بروتين STAT3. تم تحليل قدرة الأرومات الليفية، وتكاثرها، وتكوين المستعمرات، وتعبير PCNA، وتعبير الفيبرونكتين، COL1A1، و α-SMA باستخدام اختبارات متنوعة، بما في ذلك اختبارات PCR في الوقت الحقيقي، وWestern blot، وCCK-8، وEdu، وتألق المناعي، وتكوين المستعمرات. عكس WYDCT التغيرات الشكلية الناتجة عن IL-4 في خلايا RAW264.7، وخفض مستويات مؤشرات M2 (Arg-1، CD206) وIL-6، وخفض تعبير STAT3 في خلايا RAW264.7، بينما أعاد التكميلات ب IL-6 تأثير WYDCT على مؤشرات M2. علاوة على ذلك، أدى WYDCT إلى تثبيط قدرة البعم الليفية على بقاء وتكاثرها، وتقليل تعبير PCNA، وتقليل مؤشرات التليف (الفيبرونكتين، COL1A1، α-SMA)، مما يشير إلى أن WYDCT يثبط قابلية العيش والتكاثر والتليف في الخلايا الليفية الرئوية من خلال تثبيط استقطاب البلاعم M2، حيث قد يلعب مسار إشارة IL-6/STAT3 دورا رئيسيا.

المقدمة

الربو، المعروف أيضا بالربو القصبي، هو حالة التهابية مستمرة في الممرات التنفسية1. غالبا ما يرتبط هذا المرض بالتعرض للمسببات للحساسية، ودرجات الحرارة الباردة، والمهيجات ذات الطبيعة الفيزيائية والكيميائية، وتتميز بتسرب الخلايا الالتهابية، وتضيق مجرى التنفس، وإفراز المخاط، وتشنج القصبات2. حاليا، هناك ما لا يقل عن 300 مليون مريض ربو حول العالم، وزيادة الانتشار يزداد عامابعد عام. في عام 2015، توفي 400,000 شخص بسبب الربو، مماجعلها قضية صحية عالمية خطيرة. تواجه الصين نفس المشكلة، حيث أظهرت الدراسات معدل انتشار الربو بنسبة 4.2٪، ويشمل حوالي 45.7 مليون مريض بالغ، مع معدلات تحكم أقل مقارنة بالدول المتقدمة 6.7. تتأثر رفاهية الأفراد المتأثرين بهذا المرض بشكل كبير، مما يؤدي إلى عبء مالي كبير على العائلات.

يعتبر تجديد مجرى الهواء عاملا حاسما في علاج الربو الذي يصعب التحكم فيه8. لذلك، يصبح علاج الربو المزمن المستمر نقطة محورية. غالبا ما تتضمن الممارسة السريرية استخدام الكورتيكوستيرويدات المستنشقة مع موسعات الشعب الهوائية، والتي يمكن أن تخفف الأعراض بفعالية لدى المرضى9. ومع ذلك، فإن هذه العلاجات لها بعض الآثار الجانبية وقد تكون أقل فعالية في تحسين الأعراض لبعض المرضى. بالإضافة إلى ذلك، يميل الربو إلى العودة بعد التوقف عن تناول الدواء. أظهرت الأبحاث أن تنشيط الخلايا الليفية في الرئة مرتبط بإعادة تشكيل مجرى الهواء أثناء تقدم الربو10. عند التفعيل، تخضع الخلايا الليفية الرئوية لتحول ظاهري وتفرز بروتينات رئيسية لتحفيز ترسيب المصفوفة خارج الخلية (ECM) - وهي السمة المرضية الأساسية لإعادة تشكيل مجرى الهواء. على وجه التحديد، يعمل الفيبرونكتين كهيكل مبكر لتجميع ECM، مما يعزز تجنيد وتثبيت مكونات المصفوفة الأخرى؛ COL1A1 (سلسلة الكولاجين α1 من النوع الأول) هو البروتين الهيكلي الرئيسي في ECM، وتراكم مفرط يؤدي إلى سماكة جدار مجرى الهواء وتصلابته؛ يشير α-SMA (α أكتين العضلات الملساء) إلى تحول الخلايا الليفية إلى أروم ليفية عضلية ذات قدرات قوية على الانقباض والإفراز، مما يسرع ترسيبا ECM وتليف مجرى الهواء.

يعد IL-6 عامل الإشارة السيتوبلازمي الأهم لتنشيط مسار STAT311. رفع مستوى IL-6 يفعل مسار STAT3. في نسيج الرئة المصاب بالربو، يزداد بشكل ملحوظ في تعبير الرنين المغناطيسي والبروتينات في STAT3 والفوسفوريلة. مسار الإشارات IL-6/STAT3 هو أحد الأهداف لعلاج الربو. أكدت الدراسات أن تنشيط مسار الإشارات IL-6/STAT3 مرتبط بالتهاب مجرى الهواء في الربو، ويمكن لتثبيط هذا المسار أن يقلل من التهاب مجرى الهواء12,13. يرتبط IL-6/STAT3 أيضا باستقطاب M2 للبلاعميات. أظهرت دراسات أجنبية أن تعبير IL-6 يقلل بشكل كبير من تنشيط STAT3 في المراحل اللاحقة، مما يرتبط بانخفاض أعداد سطح الورم، وتقليل تكاثره، وانخفاض أعداد البلاعم M2 في الكبد.

يمكن تصنيف الخلايا المناعية المعروفة باسم الخلايا البلعمية إلى أنماط ظاهرية مميزة، وهي التنشيط الكلاسيكي (M1) والتنشيط البديل (M2)، وكل منهما يؤدي أدوارا فريدة15. يمكن أن تحفز بلاعم M1 تفاعلات التهابية وتلف الأنسجة، بينما تعزز البلاعم M2 تكاثر الخلايا وتسهل شفاء الجروح وإصلاح الأنسجة. أظهرت الأبحاث أن إعادة تشكيل مجرى الهواء في الربو مرتبطة ببلاعم M216. أظهرت التجارب المخبرية أن تحفيز استقطاب M2 للبلاعم باستخدام IL-4 يعزز بشكل كبير قدرة تكاثر الخلايا الإيجابية ل α-SMA17. يعد تثبيط استقطاب البلاعم في M2 نهجا فعالا لعلاج إعادة تشكيل مجرى الهواء في حالات الربو.

ينتمي الربو إلى فئة "شياو بينغ" في الطب الصيني التقليدي. العوامل المرضية لشياو بينغ تتعلق بشكل رئيسي بالبلغم. ينتج إنتاج البلغم عن خلل بين الين واليانغ في الأحشاء، إلى جانب عوامل خارجية مثل مسببات الأمراض الخارجية، والنظام الغذائي، وحالات ما بعد المرض، التي تؤثر على حركة سوائل الجسم، مما يؤدي إلى الركود والتراكم. مع استمرار استكشاف آليات الطب الصيني التقليدي في علاج الربو، أظهرت المزيد من الدراسات أن الطب الصيني التقليدي له تأثيرات كبيرة في تخفيف التهاب مجرى التنفس، وتقليل الإفراز المفرط للمخاط، وتثبيط إعادة تشكيل مجرى الهواء18,19. في شياو بينغ، تتأثر الرئة بشكل أساسي، تليها الطحال والكلى. المرضى المصابون بشياو بينغ يعانون من نقص في طاقة الطاقة الرئوية وضعف الدفاع ضد مسببات الأمراض الخارجية، مما يؤدي إلى فقدان انتشار طاقة الرئة وإصابة متكررة طويلة الأمد في طاقة اليانغ تشي، مما يؤدي إلى نقص في الرئة. نقص اليانغ يؤدي إلى دوران غير طبيعي لسوائل الجسم، والتي تتكثف إلى بلغم. مع النوبات طويلة الأمد، يؤثر البلغم البارد على يانغ الطحال والكلى، مما يؤدي إلى نمط من نقص اليانغ بين الرئة والطحال والكلى، وعدم توازن الين واليانغ، وزيادة السيطرة أو النقص في البنية، ودوران غير طبيعي لسوائل الجسم. الرئة لا تستطيع تفريق السوائل، والطحال لا يستطيع تحويل الماء والجوهر، والكلى لا تستطيع تبخير وتحويل السوائل، مما يؤدي إلى تكثف البلغم وتكوين السبات الذي يظهر على شكل ربو. لذلك، نقص اليانغ هو السبب الجذري لشياو بينغ، ويعد السكون البلغمي من سماته. يتكون وين يانغ دينغ تشوان تانغ من 12 نوعا من الأعشاب الطبية الصينية، بما في ذلك إبيميديوم (15 جم)، الإيفيدرا (معالجة) (10 جرام)، الجنسنغ (15 جرام)، أستراجالوس (15 جم)، جينكو بيلوبا (15 جم)، فلوس فارفاراي (15 جم)، نواة المشمش المر (15 جم)، بينيليا تيرناتا (معالجة) (10 جرام)، شيساندرا شينينسيس (10 جرام)، دودة الأرض (10 جرام)، بيرسيكا (10 جرام)، والعرقسوس (معالجة) (10 جرام). هذه التركيبة العشبية مشتقة من التركيبة المعدلة لدينغ تشوان تانغ في كتاب "شي شينغ تشونغ مياو فانغ" ولها تأثيرات في تدفئة اليانغ، وتعزيز الطاقة، وحل البلغم، وتعزيز الدورة الدموية، وتخفيف السعال والربو. تم إثبات الفعالية السريرية لهذا العلاج، مما دفع إلى إجراء تحقيقات تجريبية حالية حول آليته لمعالجة إعادة تشكيل مجرى الهواء في حالات الربو.

مقارنة بالعلاجات الدوائية الحالية للربو، مثل الكورتيكوستيرويدات المستنشقة، ومنشطات β2، والأدوية البيولوجية المعتمدة على الأجسام المضادة وحيدة النسيلة التي تستهدف IgE أو IL-5، تقدم Wen Yang Ding Chuan Tang (WYDCT) استراتيجية علاجية متعددة الأهداف وأكثر أمانا. الكورتيكوستيرويدات التقليدية تخفف التهاب مجرى الهواء بفعالية، لكنها غالبا ما ترتبط بآثار جانبية مثل تثبيط المناعة، واختلال التوازن الهرموني، والانتكاس عند الانسحاب. العوامل البيولوجية، رغم أنها أكثر تحديدا، إلا أنها مكلفة وتقتصر على أنماط معينة من الربو. وعلى النقيض من ذلك، فإن WYDCT، المستمدة من نظرية الطب الصيني التقليدي حول "تدفئة اليانغ وحل البلغم"، تؤثر بشكل شامل على تنظيم توازن المناعة، وتقليل التهاب مجرى الهواء، وقمع إعادة تشكيل مجرى الهواء، كما أظهر في الدراسات السريريةوالتجريبية 20. قد يؤدي تركيبه متعدد المكونات إلى تعديل استقطاب البلاعميات، وتنشيط الخلايا الليفية، وإطلاق السيتوكينات في الوقت نفسه، مما يوفر تحسنا أوسع وربما أكثر استدامة في أمراض الربو.

في هذه الدراسة، تم تحضير مستخلص الماء من وين يانغ دينغ تشوان تانغ (WYDCT) من اثني عشر عشبة بنسبة تقليدية ثابتة، مركزا إلى محلول نهائي بمقدار 1 جرام/مل (مكافئ دوائي خام)، وتم تصفيته لاستخدام زراعة الخلايا. تم تطبيق المستخلص بتركيزات 50 و100 و200 ميكروغرام/مل، والتي تم اختيارها بناء على اختبارات أولية لبقاء الخلايا لضمان عدم سمية الخلايا مع الحفاظ على النشاط الدوائي. تضمن النموذج في المختبر استقطاب M2 الناتج عن IL-4 لبلاعم RAW264.7 والزراعة المشتركة مع الخلايا الليفية الرئة في الفئران (خلايا L929)، مما مكننا من تقييم تأثيرات الخلايا الباراكرينية في البلاعم على تنشيط الخلايا الليفية والاستجابات المرتبطة بالتليف. توفر هذه التفاصيل إطارا قابلا للتكرار للدراسات المستقبلية التي تحقق في خصائص استجابة الجرعة والمسارات الميكانيكية ل WYDCT في إعادة تشكيل مجرى الهواء.

استنادا إلى النتائج السابقة، نفترض أن وين يانغ دينغ تشوان تانغ يمارس تأثيراته المضادة لإعادة تشكيل مجرى الهواء في الربو من خلال تثبيط استقطاب M2 للبلاعم وقمع تنشيط الخلايا الليفية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

أجريت هذه الدراسة وفقا للإرشادات الدولية والوطنية والمؤسسية للمعاملة الإنسانية للحيوانات، وبما يتوافق مع التشريعات ذات الصلة. تحديدا، تمت الموافقة على جميع الإجراءات المتعلقة بالفئران من قبل لجنة الرعاية الأخلاقية للحيوانات في المستشفى الثالث التابع لكلية تشيتشيهار الطبية (AECC-2022-009). تم إيواء الفئران في ظروف مختبرية قياسية مع إمكانية الوصول إلى الطعام والماء بحكم الراحة، وبذلت كل الجهود لتقليل المعاناة. تم تحديد ومراقبة نقاط نهاية إنسانية طوال فترة الدراسة.

1. تحضير مستخلص WYDCT

تم وزن الأعشاب الاثني عشر من وين يانغ دينغ تشوان تانغ وفقا للنسبة التقليدية: إبيميديوم (15 جرام)، إيفيدرا معالجة (10 جرام)، الجينسنغ (15 جم)، أستراجالوس (15 جم)، جينكو بيلوبا (15 جم)، فلوس فارفاراي (15 جم)، نواة المشمش المر (15 جرام)، بينيليا تيرناتا المصنعة (10 جرام)، شيساندرا شينينسيس (10 جرام)، دودة الأرض (10 جرام)، بيرسيكا (10 جرام)، وعرقسوس معالج (10 جرام).

تمت إضافة كمية الماء المقطر بعشرة أضعاف، وغلي الخليط لمدة 30 دقيقة. تم تكرار عملية الاستخراج مرتين، ودمجت الترشيح. تم تركيز المستخلص المدمج تحت ضغط منخفض إلى تركيز مكافئ للدواء الخام يبلغ 1 جرام/مل. تم ترشيح المستخلص عبر غشاء بحجم 0.22 ميكرومتر، وتم تجميعه، وتخزينه عند −20 درجة مئوية. تم تحضير تركيزات العمل (50، 100، و200 ميكروغرام/مل) عن طريق التخفيف مباشرة قبل الاستخدام.

2. زراعة الخلايا واستقطاب M2

تم إذابة وزرع خلايا RAW264.7 (ATCC، الولايات المتحدة الأمريكية) بكثافة 1 × 10⁶ خلية لكل طبق 10 سم في 10 مل DMEM مع 10٪ سيروم أبقار جنيني، 100 U/mL بنسلين، و100 ميكروغرام/مل ستريبتومايسين. تم حضن الخلايا عند درجة حرارة 37 درجة مئوية في غلاف جوي رطب يحتوي على 5٪ CO₂ لمدة 24 ساعة حتى يتم الوصول إلى التقاء بنسبة 80٪-90٪.

ثم تم استبدال وسط الزراعة ب DMEM طازج يحتوي على 20 نانوغرام/مل IL-4، وتم حضن الخلايا لمدة 24 ساعة إضافية لتحفيز استقطاب M2. بعد الحضانة، تم غسل الخلايا مرتين ب PBS ثم عولجت لاحقا بمستخلص WYDCT (محلول مخزون 10 ملغ/مل مخفف إلى التركيزات النهائية المشار إليها) لمدة 24 ساعة. في تجارب مكملات IL-6، تمت إضافة 50 نانوغرام/مل IL-6 خلال علاج WYDCT.

كانت الخلايا التي عولجت ب 0.1٪ DMSO هي الضابط السلبي. تم فحص شكل الخلية تحت مجهر مقلوب، وتم التقاط صور تمثيلية.

3. عزل وزراعة الأرومات الليفية في رئة الفئران

تم إعدام الفئران وفقا لبروتوكولات أخلاقية معتمدة. تم جمع فصوص الرئة ووضعها في محلول الملح المتوازن البارد لهانكس. تمت إزالة الأوعية الدموية الظاهرة والأنسجة الضامة، وتم تقطيع نسيج الرئة إلى قطع صغيرة (~1 مم3).

تم هضم شظايا الأنسجة بجرعة تريبسين 0.25٪ لمدة 40 دقيقة عند حرارة 37 درجة مئوية مع تحريك خفيف، تلاها هضم ثان بجرعة تريبسين 0.25٪ لمدة 30 دقيقة. تم طرد القرص الخلوي عند 300 × جرام لمدة 5 دقائق، وتم التخلص من المادة الفائقة، وأعيد تعليق الحبيبات في DMEM مع إضافة 10٪ مصل أبقار جنيني.

تم حضن التعليق لمدة 100 دقيقة للسماح للأرومات الليفية بالالتصاق، وبعد ذلك تم طرد الخلايا مرة أخرى عند 300 × جرام لمدة 5 دقائق لتعزيز التنقية. تم زرع الأرميات الليفية المنقاة في ألواح الزراعة المناسبة وحضنتها عند حرارة 37 درجة مئوية في جو رطب يحتوي على 5٪ CO₂ حتى تم الوصول إلى حوالي 80٪ من التقاء الماء.

4. الزراعة المشتركة للأرومات الليفية مع وسط مكيف

تم جمع المادة الفائقة من خلايا RAW264.7 المعالجة وتم طرد مركزها بحرارة 3000 × جرام لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. تم استبدال وسط زراعة الأرومات الليفية بالوسط المكيف بالبلاعم المجمع. تم حضن الأرومات الليفية لمدة 24 ساعة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية في غلاف جوي رطب يحتوي على 5٪ من ثاني أكسيد الكربون قبل إجراء الفحوصات الوظيفية. بعد الحضانة، تم جمع الأرومات الليفية لاستخراج الحمض النووي الريبي والبروتين لإجراء تحليلات qRT-PCR وWestern Blot لاحقة.

5. قابلية البقاء الخلوية (اختبار CCK-8)

تم زرع الخلايا الليفية بكثافة 5 × 10³ خلايا لكل بئر في صفائح بئر تحتوي على 100 ميكرولتر من وسط الزراعة. تم تعريض الخلايا للعلاجات الموصى بها لمدة 24 ساعة. بعد ذلك، أضيف 10 ميكرولتر من كاشف CCK-8 إلى كل بئر، وتم حضن الصفائح لمدة ساعتين عند درجة حرارة 37 درجة مئوية. تم قياس الكثافة البصرية (OD) عند 450 نانومتر باستخدام قارئ الألواح الدقيقة. تم حساب صلاحية الخلية على النحو التالي (OD_treated / OD_control) × 100٪. أجريت جميع التجارب باستخدام ثلاثة نسخ بيولوجية.

6. اختبار تكوين المستعمرة

تم زرع الخلايا بكثافة 1 × 10³ خلايا لكل بئر في صفائح مكونة من 6 آبار، مع ثلاثة آبار مكررة لكل حالة. تم حضن الألواح لمدة 10-14 يوما حتى تتشكل مستعمرات مرئية. تم صبغ المستعمرات بلون بنفسجي كريستالي بنسبة 0.1٪ لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد التلوين، تم غسل المستعمرات وتصويرها. تم إذابة الصبغة المرتبطة في حمض الأسيتيك بنسبة 30٪ لمدة 15 دقيقة، وتم قياس الكثافة البصرية عند 590 نانومتر. تم إجراء ثلاث تجارب مستقلة.

7. اختبار انتشار الوحدة التعليمية

تم علاج الخلايا كما هو موضح لمدة 24 ساعة. بعد ذلك، أضيف 100 ميكرولتر من 50 ميكرومولار EdU إلى كل بئر، وتم حضن الخلايا لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية. تم تثبيت الخلايا في بارافورمالديهيد بنسبة 4٪ لمدة 30 دقيقة ثم تم تبرييدها بجرعة 2 ملغ/مل جليسين لمدة 5 دقائق. تم نفخ الخلايا بنسبة 0.5٪ من ترايتون X-100 في PBS، ثم غسلها وحضنتها بمحلول تلوين أبولو لمدة 30 دقيقة. تم تلوين النوى ب Hoechst 33342 (1×) لمدة 30 دقيقة. تمت ملاحظة وتصوير الخلايا الموجبة ل EdU باستخدام مجهر فلوري.

8. إليسا ل IL-6

تم طرد مغذي خلايا RAW264.7 عند حرارة 3000 × جرام لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية. تم قياس مستويات IL-6 باستخدام مجموعة ELISA من Beyotime وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. تم قياس الامتصاص باستخدام قارئ الألواح الدقيقة، وتم حساب تركيزات IL-6 بناء على منحنى معياري.

9. التوهج المناعي

تم تثبيت الأسيتون الليفي في الأسيتون المبرد مسبقا لمدة 10 دقائق وغسلها ثلاث مرات باستخدام PBS. تم نفاذ الخلايا بنسبة 0.1٪ من تريتون X-100 لمدة 10 دقائق وتم حجبها بنسبة 1٪ من BSA في PBS لمدة 30 دقيقة. ثم تم حضن الخلايا بجسم مضاد أولي ضد PCNA (1:100) خلال الليل عند درجة حرارة 4 درجات مئوية. بعد الغسل ثلاث مرات باستخدام PBS، تم حضن الخلايا بجسم مضاد ثانوي مرافق مع FITC (1:200) لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. تم صبغ النوى بتقنية DAPI، وغسلها، وتصويرها باستخدام مجهر فلوري.

10. qRT-PCR

تم استخراج إجمالي الحمض النووي الريبي باستخدام كاشف تريزول (بيوتايم، الصين) وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. تم إجراء النسخ العكسي باستخدام مجموعة تخليق cDNA باستخدام 2 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي وبادئات عشوائية. تم إعداد تفاعلات PCR في حجم 20 ميكرولتر يحتوي على 10 ميكرولتر من خليط SYBR Green Master، و0.5 ميكرولتر من كل مبرايمر خاص بالجين (تركيز نهائي 0.5 ميكرومتر)، و1 ميكرولتر من قالب cDNA. شملت البادئات المستخدمة CD16، iNOS، Arg-1، CD206، الفيبرونكتين، COL1A1، α-SMA، وGAPDH (التسلسلات المقدمة).

تكونت ظروف الدورة الحرارية من إزالة الطبيعة الأولية عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، تلتها 40 دورة بدرجة حرارة 95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، و60 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، و72 درجة مئوية لمدة 30 ثانية. تم إجراء تحليل منحنى الانصهار من 60 درجة مئوية إلى 95 درجة مئوية بزيادات 0.5 درجة مئوية للتحقق من خصوصية التضخيم.

تحليل البيانات: تم حساب التعبير النسبي باستخدام طريقة 2^−ΔΔCT وتم تطبيعه إلى GAPDH. كانت البادئات كما يلي: CD16 (فأر): 5′- AGGAGCTGAGGAGGAGGAGG-3′ و 5′- TGAGGAGGAGGAGGAGGAGC-3′، iNOS (فأر): 5′-TGCTCCCCAGGAGATGTGTGT-3′ و5′-TGGTGTGTGTGTACGG-3′، Arg-1 (فأر): 5′- GCTGCTGCTGCTGCTGCTGG-3′ و 5′- GGTGGCTGCTGCTGTGTC-3′ 32، CD206 (فأرة): 5′- GGCTTCTATGAGCTGGGTGA-3′ و 5′- CTGGGCTTGGGTGTGTGTGTGTGTGTGTTGTTGTT-3′، فهرسة فيبرونكتين: 5'-CGTGGTGAGTGTGTCTGCC-3' و 5'-GAGGTCACAGTGTCTTGCTCT-3'، COL1A1 (فأرة): 5'-CCCTGGACCTGGCTCT-3' و 5'-GCGGGTCACCTTCTCTCTCTC-3'، α-SMA (فأر): 5'-CTGGAACAGCACACAGCTCTC-3' و 5'-GGGACATAGCACACAGCTCTC-3'، GAPDH (فأر): 5′- TGTGTCCGTCGTGGATCTGA -3′ و5′- CCTGCTTCACCACCTTCTTGAT-3′.

11. البقعة الغربية

تم تحلل الخلايا باستخدام مثبطات بروتياز تحتوي على مخزن RIPA الخامي. تم تحديد تركيزات البروتين باستخدام اختبار BCA. في SDS-PAGE، تم تحميل 60 ميكروغرام من البروتين في كل مسار من هلام بولي أكريلاميد بنسبة 10٪ وفصلها عند 120 فولت لمدة 1.5-2 ساعة. تم نقل البروتينات إلى غشاء PVDF باستخدام طريقة نقل رطب عند 100 فولت لمدة ساعة واحدة. بعد الحبس بحليب خالي الدسم بنسبة 5٪ في TBS-T لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة، تم حضان الغشاء بالأجسام المضادة الأولية (تخفيف 1:1000) طوال الليل عند 4 درجات مئوية. بعد الغسلات باستخدام TBS-T، تم حضن الغشاء بأجسام مضادة ثانوية متقاربة ب HRP (تخفيف 1:5000) لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. بعد غسلات إضافية، تم اكتشاف أشرطة البروتين باستخدام كاشف تلألؤ كيميائي ECL وتصويرها باستخدام نظام تصوير تلألؤ كيميائي. تم قياس شدة النطاق باستخدام برنامج ImageJ، وتم تطبيع مستويات البروتين إلى GAPDH كضابط داخلي.

12. التحليل الإحصائي

تم تحليل البيانات باستخدام SPSS 17.0. تم التعبير عن المتغيرات المستمرة كمتوسط ± انحراف معياري (SD). أجريت المقارنات بين مجموعتين باستخدام اختبار t غير مقترن، بينما أجريت المقارنات بين مجموعات متعددة باستخدام ANOVA أحادي الاتجاه تلتها اختبار LSD بعد الاختبار. تم اعتبار قيمة p أقل من 0.05 ذات دلالة إحصائية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

تأثيرات WYDCT على استقطاب الخلايا M2 لخلايا RAW264.7

راقبنا شكل خلايا RAW264.7 باستخدام مجهر ضوئي. كما هو موضح في الشكل 1A، تسبب تحفيز IL-4 في إطالة الخلايا، مما أدى إلى شكل أكثر استطالا يشبه المغزل مقارنة بالخلايا غير المعالجة. بالإضافة إلى ذلك، أظهرت الخلايا المحفزة ب IL-4 زيادة في الحبيبات السيتوبلازمية وأظهرت التصاق متزايد بالركيزة الزريعية. تشير هذه التغيرات الشكلية إلى أن تحفيز IL-4 له تأثير كبير على البنية الخلوية والنمط الظاهري لخلايا RAW2...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

كان هدف هذه الدراسة استكشاف تأثير WYDCT على نشاط الأرواح الليفية وإعادة تشكيل مجرى الهواء في الربو، بالإضافة إلى الآليات الكامنة وراء ذلك. تظهر النتائج الحالية أن WYDCT يمكن أن يثبط استقطاب M2 في بلاعم RAW264.7، مما يؤثر لاحقا على قابلية العيش والتكاثر والتليف في الخلايا الليفية الرئة في الفئران. علاوة على ذلك، لعب مسار الإشارة IL-6/STAT3 دورا رئيسيا في التوسط على هذه التأثيرات.

استقطاب البلعم هو عملية حاسمة في تكوين مرض الربو والتليف21...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

شكر وتقدير

نشكر بصدق جميع الشركاء الذين ساهموا في هذا المشروع البحثي. وقد دعم هذا العمل من خلال مصاريف تشغيل البحث العلمي الأساسي للجامعة في مقاطعة هيلونغجيانغ عام 2022 (رقم 2022-KYYWF-0827)، ونحن ممتنون لذلك.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
كاشف التهجين أبولو 643شركة قوانغتشو ريبو بيو المحدودةC10371-2
أرجيناز-1 (E4U1I) فأر mAb شركة تكنولوجيا الإشارات المحمولة، المحدودة.43933T
مجموعة تحديد تركيز بروتين BCAشركة بيوتايم للتكنولوجيا الحيوية المحدودة.P0012
IgG أصلي مضاد للأرانب من نوع BeyoBlot HRP (H+L)شركة بيوتايم للتكنولوجيا الحيوية المحدودة.A0210
حاضنة ثاني أكسيد الكربونشركة شنغهاي ليشين للمعدات العلمية المحدودة.HF240
CD206/MRC1 (E6T5J) XP® رابيت mAbشركة تكنولوجيا الإشارات المحمولة، المحدودة.24595T
مجموعة عد الخلايا-8شركة بيوتايم للتكنولوجيا الحيوية المحدودة.C0037
COL1A1 (E8F4L) XP Rabbit mAb شركة تكنولوجيا الإشارات المحمولة، المحدودة.72026T
ثنائي ميثيل سلفوكسيدشركة بيوتايم للتكنولوجيا الحيوية المحدودة.ST038-100ml
متوسط السكر عالي DMEMشركة جراند آيلاند البيولوجية11965092
EDUشركة بيوتايم للتكنولوجيا الحيوية المحدودة.ST067-250mg
FC&غاما؛ RIII/CD16 (F6K6G) تحليل الأرانب وتحليل التركيب (nbsp;شركة تكنولوجيا الإشارات المحمولة، المحدودة.71345T
مصل العجل الجنينيشركة جراند آيلاند البيولوجيةA5256701
الفيبرونكتين/الأجسام المضادة FN1  شركة تكنولوجيا الإشارات الخلوية63779S
ماعز مضاد للفأر مع FITC - IgG (H+L)شركة بيوتايم للتكنولوجيا الحيوية المحدودة.A0568
جهاز PCR الكمي الفلوريشركة ياروي للتكنولوجيا الحيوية المحدودةMA-6000
محلول تلوين الخلايا الحية Hoechst 33342 (100X)شركة بيوتايم للتكنولوجيا الحيوية المحدودة.C1029
iNOS (E1W4J) أرنب mAbشركة تكنولوجيا الإشارات المحمولة، المحدودة.70706SF
المجهر المقلوبشركة قوانغتشو مينغمي لتقنية الإلكترونيات البصرية المحدودة.MI52-N
LRRK2 T1348N mut RAW 264.7ATCCSC-6005
مخزن نفاذية الصبغ (مع ترايتون X-100)شركة بيوتايم للتكنولوجيا الحيوية المحدودة.P0096-100 مل
مجموعة ELISA IL-6 من ماوسشركة بيوتايم للتكنولوجيا الحيوية المحدودة.PI326
خلايا الأرومة الليفية في رئة الفئرانشركة ووهان بروسيل لايف تكنولوجي المحدودةCP-M006
تحليل mAb فأر PCNA (PC10)شركة تكنولوجيا الإشارات المحمولة، المحدودة.2586T
البنسلين-ستربتوميسينشركة جراند آيلاند البيولوجية15140148
ممر مؤتلف IL-4شركة بيوتايم للتكنولوجيا الحيوية المحدودة.P5916-5μ g
المورين المؤتلف IL-6شركة بيوتايم للتكنولوجيا الحيوية المحدودة.P5925-10μ g
أداة تسمية إنزيم ريدورايتو لايف ساينسزRT-6100
Stat3 (124H6) فأر mAb شركة تكنولوجيا الإشارات المحمولة، المحدودة.9139T
مقعد سوبركلينشركة جينان بيوبيس للتكنولوجيا الحيوية، المحدودة.BBS-SDC
SynGAP-α 2 (E4Y6I) تحليل الأرنب شركة تكنولوجيا الإشارات المحمولة، المحدودة.56927T
تحلل واستخلاص Thermo Fisher Scientific RIPAثيرموفيشر89901
تريزول (كاشف استخراج الحمض النووي الريبي الكلي)شركة بيوتايم للتكنولوجيا الحيوية المحدودة.R0016
β-الأجسام المضادة للأكتينشركة تكنولوجيا الإشارات المحمولة، المحدودة.4967S

المراجع

  1. Chetta, A., Calzetta, L. Bronchial asthma: An update. Minerva Med. 113 (1), 1-3 (2022).
  2. Medoff, B. D., Thomas, S. Y., Luster, A. D. T cell trafficking in allergic asthma: The ins and outs. Annu Rev Immunol. 26, 205-232 (2008).
  3. Ding, S., Zhong, C. Exercise and asthma. Adv Exp Med Biol. 1228, 369-380 (2020).
  4. Bateman, E. D., et al. Global strategy for asthma management and prevention: GINA executive summary. Eur Respir J. 31 (1), 143-178 (2008).
  5. GBD Risk Factor Collaborators. Global, regional, and national comparative risk assessment of 84 behavioural, environmental and occupational, and metabolic risks or clusters of risks, 1990-2016: A systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. Lancet. 390 (10100), 1345-1422 (2017).
  6. Huang, K., et al. risk factors, and management of asthma in China: A national cross-sectional study. Lancet. 394 (10196), 407-418 (2019).
  7. Bousquet, J., et al. Next-generation Allergic Rhinitis and Its Impact on Asthma (ARIA) guidelines for allergic rhinitis based on Grading of Recommendations Assessment, Development and Evaluation (GRADE) and real-world evidence. J Allergy Clin Immunol. 145 (1), 70-80.e3 (2020).
  8. Varricchi, G., et al. Biologics and airway remodeling in severe asthma. Allergy. 77 (12), 3538-3552 (2022).
  9. Cardet, J. C., Papi, A., Reddel, H. K. 34;As-needed" inhaled corticosteroids for patients with asthma. J Allergy Clin Immunol Pract. 11 (3), 726-734 (2023).
  10. Zhou, Z., et al. TGF-β1 promotes SCD1 expression via the PI3K-Akt-mTOR-SREBP1 signaling pathway in lung fibroblasts. Respir Res. 24 (1), 8(2023).
  11. Sun, J. Y., et al. An IL-6/STAT3/MR/FGF21 axis mediates heart-liver cross-talk after myocardial infarction. Sci Adv. 9 (14), eade4110(2023).
  12. Francisco, D., et al. Surfactant protein-A protects against IL-13-induced inflammation in asthma. J Immunol. 204 (10), 2829-2839 (2020).
  13. Xue, Y., et al. STAT3 and IL-6 contribute to corticosteroid resistance in an OVA and ozone-induced asthma model with neutrophil infiltration. Front Mol Biosci. 8, 717962(2021).
  14. Zhao, J., et al. PRMT1-dependent macrophage IL-6 production is required for alcohol-induced HCC progression. Gene Expr. 19 (2), 137-150 (2019).
  15. Landis, R. C., Quimby, K. R., Greenidge, A. R. M1/M2 macrophages in diabetic nephropathy: Nrf2/HO-1 as therapeutic targets. Curr Pharm Des. 24 (20), 2241-2249 (2018).
  16. Wang, Q., et al. Targeting M2 macrophages alleviates airway inflammation and remodeling in asthmatic mice via miR-378a-3p/GRB2 pathway. Front Mol Biosci. 8, 717969(2021).
  17. Wang, J., et al. FIZZ1 promotes airway remodeling through the PI3K/Akt signaling pathway in asthma. Exp Ther Med. 7 (5), 1265-1270 (2014).
  18. Bao, H. R., et al. Sinomenine attenuates airway inflammation and remodeling in a mouse model of asthma. Mol Med Rep. 13 (3), 2415-2422 (2016).
  19. Wei, L., et al. Effects of Shiwei Longdanhua formula on LPS-induced airway mucus hypersecretion, cough hypersensitivity, oxidative stress and pulmonary inflammation. Biomed Pharmacother. 163, 114793(2023).
  20. Wen, L., et al. Modified Dingchuan Decoction treats cough-variant asthma by suppressing lung inflammation and regulating the lung microbiota. J Ethnopharmacol. 306, 116171(2023).
  21. Shapouri-Moghaddam, A., et al. Macrophage plasticity, polarization, and function in health and disease. J Cell Physiol. 233 (9), 6425-6440 (2018).
  22. Fang, J., et al. TcpC inhibits M1 but promotes M2 macrophage polarization via regulation of the MAPK/NF-κB and Akt/STAT6 pathways in urinary tract infection. Cells. 11 (17), (2022).
  23. Nam, S. Y., et al. NecroX-5 ameliorates inflammation by skewing macrophages to the M2 phenotype. Int Immunopharmacol. 66, 139-145 (2019).
  24. Zhao, B., et al. Matrine suppresses lung cancer metastasis via targeting M2-like tumour-associated-macrophages polarization. Am J Cancer Res. 11 (9), 4308-4328 (2021).
  25. Braune, J., et al. IL-6 regulates M2 polarization and local proliferation of adipose tissue macrophages in obesity. J Immunol. 198 (7), 2927-2934 (2017).
  26. Zhang, B., et al. Hyperglycemia modulates M1/M2 macrophage polarization via reactive oxygen species overproduction in ligature-induced periodontitis. J Periodontal Res. 56 (5), 991-1005 (2021).
  27. Wang, Y., et al. Xuanfei Baidu Decoction protects against macrophage-induced inflammation and pulmonary fibrosis via inhibiting IL-6/STAT3 signaling pathway. J Ethnopharmacol. 283, 114701(2022).
  28. Liu, G., et al. Therapeutic targets in lung tissue remodelling and fibrosis. Pharmacol Ther. 225, 107839(2021).
  29. Ramaesh, K., Billson, F. A., Madigan, M. C. Effect of bile acids on fibroblast proliferation and viability. Eye (Lond). 12 (4), 717-722 (1998).
  30. Zhu, B., et al. Formononetin ameliorates ferroptosis-associated fibrosis in renal tubular epithelial cells and in mice with chronic kidney disease by suppressing the Smad3/ATF3/SLC7A11 signaling. Life Sci. 315, 121331(2023).
  31. Han, D., et al. Hesperidin inhibits lung fibroblast senescence via IL-6/STAT3 signaling pathway to suppress pulmonary fibrosis. Phytomedicine. 112, 154680(2023).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

البلعميات من النوع M2مسار IL-6 STAT3أرومات الليف الرئويةاستقطاب البلعمياتمؤشرات التليفلطخة ويسترنتفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.