تصف هذه المقالة: (1) توصيل جزيئات الاختبار عن طريق الفم إلى الفئران حديثة الولادة منذ DOL 6؛ و(2) التقييم خارج الجسم لوظيفة حاجز الظهارة القولونية في الخزعات من جراء DOL 10 إلى الفطام (DOL 20) من خلال تقييم نفاذية الخلايا الجانبية وعبر الخلايا باستخدام غرف الاستخدام.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
التجويز الفموي في جراء الفئران حديثة الولادة والتقييم الوظيفي لسلامة حاجز الأمعاء باستخدام غرف ال ussing
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
تؤكد الأدلة المتزايدة أهمية أول 1000 يوم من الحياة في تشكيل محور الأمعاء والميكروبيوم. تعد هذه النافذة المبكرة في الحياة حاسمة في تحديد المسارات الفسيولوجية طويلة الأمد والتكيفات المناعية، مما قد يؤثر على قابلية الإصابة بالأمراض المرتبطة بخلل الحواجز وخلل الحاجز. يتطلب فهم أعمق للآليات الأساسية تقييما شاملا للمعايير الفسيولوجية الرئيسية، بما في ذلك نفاذية الخلايا والخلايا في أمعاء حديثي الولادة. يعد تقييم هذه المعايير ضروريا لتوضيح كيف يمكن أن يؤثر التعرضات المبكرة للجزيئات الخارجية على سلامة الأمعاء والنتائج الصحية طويلة الأمد. لذلك، يصف الجزء الأول من هذا المقال إعطاء جزيئات مهمة في جراء الفئران عن طريق الفم منذ يوم الحياة السادس، مع تقليل التوتر وخطر الإصابة وأكل لحوم البشر. تستخدم إبر تغذية 24 جالون ذات الأطراف المستديرة المزلقة لإزالة جراء الفئران التي تزن على الأقل 2.5 جرام. الجزء الثاني يوضح التقييم خارج الجسم للنفاذية فوق الخلوية وعبر الخلايا باستخدام اختبارات حجرة أوسينغ على عينات القولون من الجراء بين DOL-10 والفطام. تستخدم منزلقات بدون دبابيس معدلة للخزعات الصغيرة مع غرف أوسينغ لتركيب عينات قولونية حديثي الولادة. تمت إضافة المجس شبه الخلوي FITC-Dextran بقوة 4 كيلو دالتون والعلامة العابرة للخلايا بيروكسيداز الفجل الحرس 44 كيلو دالتون النوع السادس إلى الحجرة القمية للنظام في بداية الاختبار. يتم جمع العينات في الحجرة الجانبية القاعدية عند 0 دقيقة، 30 دقيقة، 60 دقيقة، 90 دقيقة، و120 دقيقة لقياس مرور المجس. يتم قياس مرور كلا العلامتين بشكل مباشر (FITC) وبشكل غير مباشر (HRP) بواسطة قارئ لوحة، يحسب باستخدام منحنيات قياسية، ويعبر عنه كتدفق كهربائي.
المقدمة
تلعب سلامة حاجز الأمعاء دورا أساسيا في الحفاظ على الصحة العامة من خلال تنسيق الاستجابة المناعية المخاطية وتنظيم النفاذية الانتقائية للظهارة المعوية. يتحكم هذا النظام الحاجز في مرور العناصر الغذائية مع منع انتقال مسببات الأمراض والمستضدات والسموم إلى الدورة الدموية الجهازية1. الاضطراب المزمن لهذه الواجهة، المرتبط بزيادة نفاذية الأمعاء، والذي يشار إليه عادة باسم "الأمعاء المتسربة"، أصبح الآن ليس فقط نتيجة بل أيضا كعامل لحالات التهابية مزمنة ومجموعة من الأمراض خارج الأمعاء2.
على سبيل المثال، ثبت أن ضعف وظيفة حاجز الأمعاء هو عنصر رئيسي في اضطرابات المناعة الذاتية والأيضية مثل مرض الأمعاء الالتهابي (IBD)، والتهاب المفاصل مجهول السبب للشباب، والسكري من النوع الأول (T1D). يبرز هذا حالة حاجز الأمعاء كمؤشر حيوي رئيسي، وأيضا كهدف علاجي لمنع بدء العمليات الفسيولوجية المرضية في أقرب وقت ممكن ولمنع تطور الالتهاب الحاد إلى الحالة المزمنة 3,4,5,6.
في هذا السياق، تمثل فترة حديثي الولادة نافذة فريدة وحساسة للغاية من التطور، حيث يؤثر تأسيس ونضج واجهة الأمعاء والميكروبيوتا بشكل عميقعلى صحة الأمعاء والجهازية مدى الحياة. في هذه المرحلة المبكرة، يظهر الظهارة المعوية والجهاز المناعي حساسية متزايدة لكل من العوامل الداخلية والخارجية، حيث يشهد نموا وتمايز سريعا بينما يتكيف في الوقت نفسه مع استعمار الميكروبات والتغيرات الغذائية. قد تلعب الاضطرابات التي تعيق سلامة حاجز الأمعاء خلال هذه الفترة التنموية الحرجة دورا محوريا في ظهور طيف واسع من الاضطرابات الحادة والمزمنة في وقت لاحق من الحياة. تشمل هذه الحالات الأمراض المنيعة مثل حساسية الطعام، والأمراض المزمنة الأكثر شدة مثل التهاب الأمعاء الالتهابي (IBD)، وJIA، وT1D 7,8,9. تبرز هذه الأمراض كيف أن العمليات الفسيولوجية المرضية غالبا ما تنشأ مبكرا، حيث تحدث البداية عادة بين الطفولة وبداية البلوغ10,11. لذلك، فإن فهم الآليات التي تحكم وظيفة حاجز الأمعاء لدى الأطفال الجدد أمر ضروري لتطوير استراتيجيات وقائية وعلاجية تهدف إلى تقليل عبء العديد من الأمراض المزمنة.
في هذا السياق، هناك حاجة ملحة لأدوات موثوقة وذات صلة فسيولوجية لدراسة سلامة حواجز الأمعاء، وآليات الأمراض المزمنة، والالتهابات بشكل خاص داخل بيئة حديثي الولادة. يجب أن تسمح هذه الأدوات بتكرار اختبارات تجريبية مثبتة بالفعل في سياق البالغين دون التضحية بالدقة والفعالية. بالإضافة إلى ذلك، أصبح من الضروري بشكل متزايد دراسة التأثيرات قصيرة وطويلة المدى للعديد من المرشحات الجزيئية ذات الاهتمام، والتي من المتوقع أن يكون لها تأثيرات مفيدة أو ضارة على توازن الأمعاء في سياق حديثي الولادة. من بين الأدوات المتاحة، يمثل إعطاء الجفاف الفموي في جراء الفئران حديثة الولادة طريقة أكثر من موثوقة لتوصيل جزيئات ذات أهمية في مرحلة تطور محددة. يسمح بإجراء تحقيقات محكمة حول تأثير المركبات النشطة الحيوية أو الأدوية أو المستقلبات الميكروبية على نضج الأمعاء ووظائف الحاجز.
الجزء الأول من هذا المقال يصف طريقة لقياس جراء الفئران منذ يوم الحياة (DOL) 6، مما يسمح بدراسة التدخلات قبل وأثناء وبعد التوسع الهائل في أعداد أنواع ميكروبيومات الأمعاء الناتج عن تنوع الغذاء. وبالتالي، تتيح هذه التقنية إجراء تحليلات طولية لتأثيرات العلاج على صحة الأمعاء أثناء نمو وتطور الجراء.
في الجزء الثاني من هذا المقال ومكمل هذا النهج، يوفر التقييم خارج الجسم لوظيفة حاجز الظهارة القولونية باستخدام حجرات اليوسينغ مقياسا حساسا وكميا لخصائص النفاذية. يسمح تقييم نفاذية الخلايا فوق الخلوية وعبر الخلايا في خزعات القولون من فئران حديثة الولادة (مثل جراء DOL 10) بتحديد دقيق لتأثير عدة مرشحين رئيسيين على سلامة ووظيفة حاجز الظهارة. النقل شبه الخلوي هو آلية سلبية تحدث في الأساس عبر الفضاء بين الخلايا في طبقة الظهارة. يسمح بمرور مذاب صغيرة مدفوعة بتدرجات كهروكيميائية وأوزوز من التجويف إلى الجانب القاعدي. يتم تنظيم هذه الآلية بشكل رئيسي بواسطة بروتينات عائلة الوصلات الضيقة، مثل كلودينات وأكلودين. النقل عبر الخلية، على النقيض من ذلك، هو آلية نشطة تسمح بامتصاص مذاب أكبر ويحدث عبر الخلايا الظهارية عبر قنوات وحاملات ومضخات محددة.
يخضع فلوريسين إيزوثيوسيانات (FITC)-ديكستران (4 كيلو دالتون) بشكل رئيسي لنقل الخلايا بسبب حجمه، بينما يتم نقل بيروكسيداز الفجل الحار (HRP؛ 44 كيلو دالتون) بشكل انتقائي إلى الجانب القاعدي عبر الخلايا. وبالتالي، يمكن قياس هذه العلامات غير الداخلية تقييما مميزا للنفاذية فوق الخلوية وعبر الخلايا على التوالي. يحافظ اختبار حجرة أوسينغ باستخدام FITC وHRP على بنية الأنسجة ويسمح بقياس نفاذية الخلايا والخلايا على التوالي لأي جزء من الجهاز الهضمي في الوقت الحقيقي. يقدم هذا المزيج من تحليل حجرة حديثي الولادة وتحليل حجرة أوسينغ استراتيجية قوية لدراسة كيفية تأثير جزيئات محددة على وظيفة حاجز الأمعاء على الفور وعلى مدى فترات زمنية طويلة، مما يوجه استراتيجيات للتخفيف من الالتهاب والوقاية من الأمراض المزمنة منذ المراحل الأولى من الحياة.
باختصار، يصف هذا البروتوكول إجراءين تجريبيين تكميليين يسمحان ب: (1) إعطاء جزيئات ذات أهمية في الفترة المبكرة لحديثي الولادة لجراء الفئران (الخطوة 1)؛ (2) تقييم نفاذية كل من الخلايا الزائدة وعبر الخلايا في أجزاء الجهاز الهضمي من حديثي الولادة إلى الجراء الذين يفطمون باستخدام غرف اليوسينغ (الخطوات 2-6).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تم إجراء جميع إجراءات وفقا للوائح الوطنية المعمول بها وتمت الموافقة عليها من وزارة التعليم العالي والبحث والابتكار الفرنسية عبر منصة APAFIS (رقم التفويض: APAFIS#23855) والمنح من الوكالة الوطنية للبحث (ANR): 11-IDEX-0005-02، ANR-24-CE15-7152، و18-IDEX-0001. المواد المستخدمة والمواد المستخدمة مدرجة في جدول المواد.
1. غافاج جراء الفئران حديثي الولادة
ملاحظة: الطريقة التالية مقتبسة من فرانسيس وآخرون 12. بينما يسمح البروتوكول الأصلي بفحص جراء الفئران منذ DOL 2، لم يتم إجراء التغطية قبل DOL 6 هنا، لأن المتطلبات التقنية في الأعمار السابقة جعلت العملية أكثر تحديا. بالإضافة إلى ذلك، فإن استخدام الجراء الأصغر سنا يعقد الدراسات لأنه يزيد من خطر فقدان خلال الأيام الأولى من العلاج، مما يتطلب مجموعات أكبر.
- تحضير وإعداد حلول Gavage
- زن كل جرو على حدة.
- ضبط تركيز وحجم محلول الجافاج بحيث لا يتجاوز الحجم الكلي المعطى 20 ميكرولتر لكل جرام من وزن الجسم.
ملاحظة: في الظروف القياسية، نادرا ما يكون وزن جراء الفئران أقل من 2.5 جرام في DOL 6. - اغسل إبرة تغذية ذات طرف مستدير بسعة 24 جرام عن طريق غسلها جيدا بماء منزوع الأيون، ثم بمحلول 70٪ إيثانول باستخدام حقنة، ثم قم بتعقيم الجهاز.
ملاحظة: ينصح باستخدام إبرة تغذية منفصلة لكل مجموعة علاج لمنع التلوث المتبادل. - ضع مناشف ورقية نظيفة على وسادة تدفئة معقمة مضبوطة على ~38 درجة مئوية.
- اغسل القفازات بنسبة 70٪ إيثانول قبل فتح أقفاص للحد من انتقال الروائح إلى الجراء وتقليل خطر أكل لحوم.
- انقل السد إلى قفص منفصل في غرفة أخرى لتقليل التوتر الناتج عن أصوات الجراء المحتملة.
- فرك قفازات التنظيف بمواد تعشيش لتقليل خطر انتقال الروائح الخارجية إلى الجراء أثناء التجويف.
- قس الطول بين عملية الزيفوئيد (الطرف السفلي من عظمة القص) وخطم الجرو لتحديد أقصى طول إدخال على إبرة التغذية (الشكل 1A,B).
- التغطية داخل المريء لجراء الفئران
- اربط رأس الإبرة بحقنة بطريقة معقمة واسحب كمية أكبر من الحجم المطلوب من محلول الجافاج لإعطاء كامل الحجم المطلوب دون أي خطر من حدوث فقاعات هواء، لأنها تزيد بشكل كبير من خطر الشفط.
- باستخدام الإبهام والسبابة في اليد غير المسيطرة، اضغط الجلد بين لوح الكتف بلطف لرفع الجرو.
ملاحظة: لا تسحب الكثير من الجلد من ظهر الجرو، لأن ذلك قد يسبب الاختناق. - أمسك الجرو في وضع شبه أفقي وأدخل إبرة التغذية بلطف في تجويف الفم، مقدما إياه عموديا على البلعوم حتى يصل إلى مؤخرة الحلق (الشكل 1C).
- مع الحفاظ على نفس الزاوية والعمق، حرك الإبرة إلى الجزء الأيمن أو الأيسر من تجويف الفم لتجنب اللسان.
- قم بضبط زاوية الإبرة ببطء مع إمالة رأس الجرو برفق إلى الخلف، حتى تصطف الحقنة والرأس والظهر، مع ميل الرأس قليلا نحو الخلف (الشكل 1D).
- دون تطبيق أي ضغط، دع الحقنة تنزل ببطء تحت وزنها حتى تقترب علامة الإدخال القصوى من مستوى الخطم أو تصل إلى مستوى الخطم (الشكل 1E).
ملاحظة: إذا واجهت مقاومة، قم بتدوير الحقنة بلطف عن طريق دحرجها ذهابا وإيابا بين الأصابع لتسهيل النزول. إذا لم تتقدم المحقنة بعد، حاول تعديل زاوية الإدخال أو إعادة الإجراء باستخدام إبرة تغذية مشحمة بمحلول الجافاج. لا ينبغي أن تبقى الإبرة مدخلة لأكثر من 20 ثانية لتجنب الاختناق. - بمجرد الوصول إلى الحد الأقصى لعلامة الإدخال أو إغلاقها، قم بتوزيع الحجم المطلوب بسرعة. إذا تم المقاومة أثناء توزيع الحجم، تحقق من محاذاة رأس الحقنة والخلف واضبط عمق الإدخال.
ملاحظة: ينصح بتوزيع الكمية بسرعة، حيث أن إدخال الإبرة لفترة طويلة يزيد بشكل كبير من خطر الاختناق والمقاومة واحتمال إصابة. - بمجرد إعطاء الحجم الصحيح، اسحب الإبرة بلطف على نفس الزاوية المستخدمة للإدخال.
- ضع الجرو على منشفة الورق التي وضعت سابقا على وسادة التدفئة وراقب عملية التعافي. يجب أن يعود نمط التنفس الطبيعي خلال أقل من 20 ثانية.
ملاحظة: ظهور فقاعات من فم يشير إلى الشفط ويتطلب القتل الرحيم الفوري في الجراء الأصغر من عمر 14. وجود كمية صغيرة جدا من الدم في فم بسبب آفة بين الفم الفموي والمريء يتطلب مراقبة، لكنه لا يتطلب القتل الرحيم المنهجي. إذا كان تعافي الجرو غير مؤكد، ضعه على جانبه. إذا لم يحاول أن يعيد تصحيح نفسه، فعليك القتل الرحيم فورا. - بمجرد تأكيد تعافي، أعد الجرو إلى العش وأعد تجميعه مع والدته.
ملاحظة: حتى DOL 10، الجراء لديهم حركة منخفضة ويمكنهم البقاء على وسادة التدفئة حتى يكتمل تجويف كل جرو في القفص. يجب عدم ترك الجراء الأكبر سنا دون مراقبة على الوسادة، فقد يحاولون الهروب.
الشكل 1: غافاج جرو الفأر الوليد في DOL 10. يتم قياس المسافة بين الخطم وعملية إكسيفويد (A)، مما يسمح بتحديد أقصى طول إدخال على إبرة التغذية (B). يتم إدخال إبرة التغذية في الجزء الأيسر أو الأيمن من تجويف الفم (C). بمجرد الوصول إلى مؤخرة الحلق، يتم تعديل زاوية الإبرة حتى يتم محاذاة الحقنة والرأس وظهر (D). يسمح للإبرة بالانزلاق بلطف للأسفل دون مقاومة حتى تقترب من الوصول إلى الحد الأقصى للإدخال (E). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
2. القتل الرحيم لجرو الفأر الوليد وسحب القولون
- تنفيذ القتل الرحيم باستخدام الطريقة المناسبة التي تفرضها القوانين الوطنية.
ملاحظة: ينصح بقطع رأس الجراء حتى DOL 10 وخلع عنق الرحم للجراء في سن أعلى من DOL 10. لا ينصح بالقتل الرحيم مع ثاني أكسيد الكربونأو التخدير، لأن الجراء تظهر تحملا كبيرا لهذه الطرق. - ضع المقتل تحت المجهر البصري.
- ضع 70٪ إيثانول على بطن.
- باستخدام الملقط، اضغط على جلد البطن والصفاق السفلي وقم بعمل شق بطني عرضي كبير باستخدام مقص دقيق (عمودي على المحور الخلفي-الخلفي) دون قطع الأمعاء.
- أدخل المقص الدقيق بلطف في الشق وقم بتمديد الجرح جانبيا عبر الصفاق من كلا الجانبين.
- باستخدام الملقط والمقص الدقيق، افتح الأجزاء العلوية والسفلية من الصفاق من منطقة الصدر إلى أسفل الحوض (الشكل 2A).
- حدد الجزء البعيد من القولون وقم بعمل شق مواز لمحوره، باتجاه المستقيم.
- قم بعمل شق في الجزء النهائي/المستقيم من القولون لتحريكه.
- اسحب القولون بلطف وتقدم نحو الساق، مع إزالة أجزاء محتملة من الأنسجة الضامة أو الدهنية.
- حرر القولون من البطن عن طريق القطع عند نقطة الالتقاء اللفائفي فوق الأيثار (الشكل 2B).
- تخلص من الساقط وبعض المليمترات الأولى من القولون القريب، ثم اجمع واحدة أو عينتين من القولون القريب أكبر من حجم فتحة منزلق أوسينغ (الشكل 2C).
ملاحظة: ينصح بإجراء خزعتين كبيرتين، لأن القولون الوليدي هش للغاية ويمكن أن يتمزق أو يتعرض للتمزق أو الثقب بسهولة أثناء التنظيف والتركيب. - مع إغلاق المقص، أزل بلطف محتوى البراز من الخزعة المسطحة بتطبيق ضغط خفيف وانزلاق من الطرف القريب إلى الطرف البعيد.
- ضع قطعة القولون الفارغة في مخزن KRB البارد جدا.
الشكل 2: تشريح القولون لجرو DOL 10. يتم قطع البشرة والبريتونيوم للجرو وفتحهما على خطوتين لتجنب الشق غير الإرادي للقولون، حتى يتم كشف كامل تجويف البطن (أ). يتم تحرير القولون من البطن عبر أول قطع في الجزء البعيد/الشرجي، يليه قطع ثان فوق السيمور (B). يتم التخلص من المليمترات الأولى من القولون القريب، ويتم جمع عينة إلى عينة إلى اثنتين من القولون أكبر من حجم فتحة منزلقات أوسينغ (C). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
3. اختبار نفاذية القولون باستخدام خزعات الفئران في غرف أوسينغ
- تحضير الاختبار
- في اليوم الذي سبق يوم تجربة أوسينغ. لضمان أفضل ظروف الاختبار، يوصى بتحضير عدة محاليل في اليوم السابق للتجربة. يتم إعداد هذه الحلول كما هو موضح في الجدول 1.
ملاحظة: تشير الجداول التالية إلى المبالغ المطلوبة ل 12 غرفة استخدام، مع زيادة كبيرة تبلغ 10 أضعاف KRB للسماح بالتقارير الإضافي.
ملاحظة: يمكن تخزين محلول KRB 10x عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 6-12 شهرا. - في يوم التجربة، قبل 30 دقيقة من قتل الرحيم:
- جهز 400 مل من مخزن KRB، كما هو موضح في الجدول 2.
ملاحظة: يجب خلط KRB 10x، والماء منزوع الأيون، والبيكربونات مسبقا وفقاعها باستخدام غاز الكربوجين (95٪ أوكسيدالكربون؛ 5٪ ثاني أكسيد الكربون) لمدة 15 دقيقة قبل إضافة CaCl2 لتجنب الهطول. - باستخدام نظام كربوجين (95٪ أوسيدالكربون 2؛ 5٪ ثاني أكسيد الكربون)، قم بعمل فقاعة في مخزن KRB الطازج لمدة 15 دقيقة.
- قسم 400 مل من مخزن KRB إلى قسمين وحضر 200 مل من كريبس-جلوكوز، و200 مل من كريبس-مانيتول، ومحلول HRP كما هو موضح في الجدول 3.
- جهز 400 مل من مخزن KRB، كما هو موضح في الجدول 2.
- إعداد النظام
- قم بتسخين نظام الاستخدامات إلى 37 درجة مئوية.
- قم بتجميع الغرف مسبقا كما يلي:
- ارفع أقفال كل فتحة.
- ضع الغرف في فتحاتها دون تشديد النظام.
- أدخل أنبوبي تزويد الغاز في كل جزء من الحجرات.
- إدخال الأقطاب الأربعة في الفتحات الأمامية (إذا كانت متوفرة - غير مغطى هنا) أو ختم الفتحات الأربعة باستخدام مخاريط 200 ميكرولتر مملوءة بالغراء قبل التجربة.
- ضع الصواني تحت الغرف تحسبا لتسربات محتملة.
- تركيب الأنسجة
- جفف عينة القولون التي تم تنظيفها سابقا بمنشفة ورقية لإزالة الرطوبة الزائدة.
- ضع قطعة القولون تحت عدسة مكبرة وأدخل برفق شديد أحد شفرات المقص الدقيق في الجزء المضيء لفتحه (الشكل 3A).
ملاحظة: يمكن إجراء القطع في حركة واحدة بمجرد إدخال المقص بالكامل. يجب أن يكون جزء القولون المستخدم مستقيما قدر الإمكان مع تجنب الالتواء. - باستخدام ملقط دقيق، ثبت النسيج على الجزء الأبيض من المنزلق مع إبقاء الجزء المضيء مرفوعا باتجاه المشغل. يجب أن يكون النسيج خاليا من آثار الدهون والبراز والتجاعيد والثقوب والتمزق، ويجب أن يغطي الفتحة على نطاق واسع (الشكل 3B).
- أغلق السلايدر تحت المجهر الثنائي وتحقق من احتمال إزاحة النسيج. يجب أن يكون هناك تشوه طفيف في النسيج مرئيا عند الضغط على المنزلق، مما يشير إلى أن السلايدر مغلق بإحكام.
ملاحظة: قم بتركيب المنزلقات في غرفة اليوسينغ (الشكل 4) وابدأ خطوة التوازن بشكل فردي بمجرد أن تكون جاهزة، لمنع جفاف العينة. - مع الحفاظ على ضغط خفيف على السلايدر لإبقائه مغلقا، أدخل المنزلق في غرفة اليوسينغ، مع التأكد من أن الجزء الشفاف من المنزلق (اللومين) يواجه اليسار.
- أغلق كلا المزلاجين وشد البرغي الموجود على اليمين حتى تصبح الحجرة محكمة الإغلاق ولا يمكن للمنزلق التحرك.
- الإعداد النهائي والتوازن
- أضف 4 مل من كريبس-مانيتول إلى الحجرة اليسرى (الحافة العليا).
- أضف 4 مل من كريبس-جلوكوز إلى الحجرة اليمنى (الجانبية) من الحجرة.
- ضع قطعة صغيرة من البارافيلم بين كلا الحجرين لتجنب التلوث المتبادل.
- افتح مدخل الغاز (95٪O2 / 5٪ ثاني أكسيد الكربون) واضبط المخرج بين 1-2 فقاعة/ثانية.
- قم بإزالة أي فقاعات كبيرة موجودة على النسيج أو في الجسم باستخدام ماصة باستور.
- دع النظام يتوازن لمدة تصل إلى 20-30 دقيقة.
- جهز محلول FITC 4kDa + HRP + Mannitol كما هو موضح في الجدول 4.
- في اليوم الذي سبق يوم تجربة أوسينغ. لضمان أفضل ظروف الاختبار، يوصى بتحضير عدة محاليل في اليوم السابق للتجربة. يتم إعداد هذه الحلول كما هو موضح في الجدول 1.
- بدء اختبار نفاذية القولون
- بمجرد الوصول إلى توازن النظام، استبدل 200 ميكرولتر من كريبس-مانيتول من الحجرة القمية (يسار) ب 200 ميكرولتر من محلول FITC 4Kd + HRP + مانيتول وبدء مؤقت فورا. اغسل الطرف بحركات لطيفة في الحجرة وتخلص من الطرف بين كل غرفة.
- لكل حجرة، اجمع 2 × 100 ميكرولتر (مكررات) من الحجرة الأساسية (اليمنى) ووضع الأحجام في صفيحة سوداء مكونة من 96 بئر. غط اللوح بورق الألمنيوم لتجنب التحلل الضوئي لتركيب FITC الموجود في اللوحة.
- استبدل فورا 200 ميكرولتر الذي تم جمعه سابقا ب 200 ميكرولتر من كريبس-جلوكوز الطازج.
- كرر الخطوات (2) و(3) كل 30 دقيقة حتى تصل إلى نقطة الزمن 2 ساعة، للحصول على نقاط الزمن: T0، T30، T60، T90 وT120.
- أغلق اللوح بورق الألمنيوم لتجنب التحلل الضوئي لجهاز FITC ثم تابع إلى قياس الكمية في FITC.
| MgCl2 1M | |||
| ميغاوات (g/mol) | الحجم النهائي = 20 مل | التركيز النهائي | |
| ميلي-كيو H2O | نأتقل إلى المجلد النهائي | ||
| MgCl2، 6H2O | 203.3 | 4.066 ج | 1 م |
| KRB 10X | |||
| ميغاوات (g/mol) | المجلد النهائي = 1 لتر | التركيز النهائي | |
| ميلي-كيو H20 | نأتقل إلى المجلد النهائي | ||
| NaCl | 58.44 | 70 جرام | 1.198 م |
| KCl | 74.55 | 3.4 ج | 45.6 ملليمول |
| Na2HPO4 ، 2H2O | 177.99 | 1 ج | 5.62 مللي مولار |
| NaH2PO4 ، 2H2O | 156.01 | 2.3 ج | 14.7 مللي مولار |
| MgCl2 1M | 5 مل | 5 مللي مولار | |
| بيكربونات 750 ملليمتر | |||
| ميغاوات (g/mol) | الحجم النهائي = 250 مل | التركيز النهائي | |
| ميلي-كيو H2O | نأتقل إلى المجلد النهائي | ||
| NaHCO3 | 84 | 15.75 جرام | 750 مللي مولار |
| CaCl2 2M | |||
| ميغاوات (g/mol) | الحجم النهائي = 50 مل | التركيز النهائي | |
| ميلي-كيو H2O | نأتقل إلى المجلد النهائي | ||
| CaCl2 | 111 | 11.098 ج | 2 م |
الجدول 1: تحضير المحلول في اليوم السابق لتجربة أوسينغ.
| مخزن KRB (400 مل) | ||
| الحجم | التركيز النهائي | |
| KRB 10X | 40 مل | 1X |
| H2O (ملي-كيو) | 352 مل | |
| بيكربونات 750 ملليمتر | 8 مل | 15 مللي مولار |
| CaCl2 2M | 240 ميكرولتر | 1.2 مللي مولار |
الجدول 2: تحضير مخزن KRB في يوم تجربة أوسينغ.
| كريبس-جلوكوز/مانيتول (200 مل لكل منهما) | ||||
| الحجم النهائي = 200 مل | التركيز النهائي | |||
| مخزن KRB | نأتقل إلى المجلد النهائي | |||
| الجلوكوز | 360 ملغ | 10 مللي مولار | ||
| أو | ||||
| مانيتول | 364 ملغ | 10 مللي مولار | ||
| حل HRP | ||||
| الحجم النهائي = 1480 ميكرولتر | التركيز النهائي | |||
| كريبس-مانيتول | نأتقل إلى المجلد النهائي | |||
| HRP | 13 ملغ | 8.8 ملغ/مل | ||
الجدول 3: تحضير محاليل كريبس-جلوكوز/مانيتول وHRP في يوم تجربة أوسينغ.
| FITC 4kDa + HRP + محلول مانيتول | ||
| ل12 غرفة | الحجم | التركيز النهائي |
| معدل ضربات القلب (8.8 ملغ/مل) | 1345 ميكرولتر | |
| كريبس-مانيتول | 1155 ميكرولتر | |
| FITC 4Kd | 166.6 ملغ | 16.66 مللي موتر |
الجدول 4: تحضير محلول FITC بقوة 4 كيلو دالتون + HRP + مانيتول في يوم تجربة Ussing.
الشكل 3: تركيب عينة من القولون من جرو DOL 9. يتم إدخال شفرة واحدة من زوج دقيق من المقصات في الجزء الضوئي من العينة لقطعها في حركة واحدة (A). يتم تركيب العينة المفتوحة على فتحة منزلق أوسينغ بحيث يكون الجانب الضوئي مواجها نحو المشغل (B). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 4: صورة لغرف أوسينغ المجهزة بالكامل. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
4. تقييم نفاذية الخلايا القولونية من خلال قياس FITC
- إعداد معايير FITC
- قم بتخفيف محلول FITC بمقدار 4Kd + HRP + مانيتول في كريبس-جلوكوز لتحضير التخفيفات القياسية كما هو موضح في الجدول 5 والشكل 5.
- ترسيب: 2 × 100 ميكرولتر (مكرر) من كل تخفيف قياسي من n°1 حتى n°7 في اللوح. أغلق اللوحة بورق الألمنيوم لحمايتها من الضوء حتى تبدأ قراءة اللوحة.
- جمع البيانات: باستخدام قارئ اللوحات، ضبط طول موجة الإثارة إلى 485 نانومتر والانبعاث إلى 535 نانومتر، واقرأ اللوحة في أقرب وقت ممكن.
ملاحظة: ينصح بقراءة اللوح عند كسب أمثل ومع كسب معين يدويا لتسهيل مقارنة القيم بين الألواح والسماح باستيفاء البيانات إذا حدث خطأ أثناء تخفيف المعايير. - تخزين اللواح: بعد تخزين بيانات قياس FITC، تخزين الألواح المغلقة بورق الألمنيوم عند درجة حرارة 4 درجات مئوية طوال الليل إذا كان من المقرر إجراء قياس HRP خلال الأيام التالية، أو تجميد عند -80 درجة مئوية للتخزين لفترة أطول.
الشكل 5: تمثيل بصري لتحضير التخفيف القياسي ل FITC. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
| تخفيف معايير FTIC | |||||||
| شاب | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 |
| التخفيف | 1:10000 من حل سهم FITC | 1:2 من التخفيف رقم 1 | 1:2 من التخفيف رقم 2 | 1:10 من التخفيف رقم 1 | 1:2 من التخفيف رقم 4 | 1:2 من التخفيف رقم 5 | |
| كريبس-جلوكوز | |||||||
| FITC (ميكرومتر) | 1.66 | 0.83 | 0.415 | 0.166 | 0.083 | 0.0415 | 0 |
الجدول 5: تحضير التخفيف القياسي ل FITC في يوم تجربة Ussing.
5. تقييم نفاذية الخلايا عبر القولون من خلال قياس معدل HRP
- في اليوم السابق ليوم اختبار قياس معدل ضربات القلب (HRP):
- ضمان الظروف المثلى في يوم الاختبار؛ يتطلب تحضير عدة محاليل في اليوم السابق للتجربة. يتم إعداد هذه الحلول كما هو موضح في الجدول 6.
ملاحظة: تشير الجداول التالية إلى الكميات المطلوبة للوحة واحدة بسعة 96 بئر. يمكن جمع معايير HRP وتخزينها عند -20 °م أو -80 °م لمدة تصل إلى عدة أشهر. بسبب عدم الاستقرار، استخدم فقط مخازن كربونات أو بيكربونات طازجة. - عند تحضير محلول الأجسام المضادة لتقنية HRP، قم بتغطية صفيحة ميكرولوفية شفافة ذات 96 بئر بسعة 100 ميكرولتر لكل بئر. لفها بورق الألمنيوم وحضنها طوال الليل عند درجة حرارة 4 درجات مئوية.
- ضمان الظروف المثلى في يوم الاختبار؛ يتطلب تحضير عدة محاليل في اليوم السابق للتجربة. يتم إعداد هذه الحلول كما هو موضح في الجدول 6.
- في يوم اختبار قياس HRP:
- جهز مخزن حجب BSA بنسبة 5٪ كما هو موضح في الجدول 7.
- تخلص من محتويات الطبق واغسل ب 280 ميكرولتر من PBS Tween أربع مرات مع دقيقة واحدة من الهز بسرعة 350 دورة في الدقيقة بين كل غسل.
- أضف 200 ميكرولتر من مخزن حجب BSA لكل بئر.
- أغلق اللوح بورق الألمنيوم وقم بالحضانة على هزاز بسرعة 500 دورة في الدقيقة لمدة ساعة واحدة على الأقل. وفي هذه الأثناء، قم بإذابة وتخفيف العينات (1:10 أو 1:50) وتحضير التخفيف المعياري كما هو موضح في الجدول 8.
- تخلص من محتويات الطبق واغسل ب 280 ميكرولتر من PBS Tween أربع مرات مع دقيقة واحدة من الهز بسرعة 350 دورة في الدقيقة بين كل غسل.
- أضف 50 ميكرولتر من العينات القياسية أو المخففة، وأغلق اللوحة، وحضن عند 300 دورة في الدقيقة لمدة ساعة واحدة عند RT.
- أثناء الحضانة، أحضر كوانتا بلو إلى RT وحضر الحل العامل كما هو موضح في الجدول 9.
- تخلص من محتويات الطبق واغسل ب 280 ميكرولتر من PBS Tween أربع مرات مع دقيقة واحدة من الهز بسرعة 350 دورة في الدقيقة بين كل غسل.
- أضف 100 ميكرولتر من محلول كوانتا بلو العامل لكل بئر عند RT أو 37 درجة مئوية (1.5-90 دقيقة، 30 دقيقة في المتوسط).
ملاحظة: يمكن متابعة تقدم الفحص بظهور فلورة زرقاء قوية تحت مصدر ضوء فوق بنفسجي. - أضف 100 ميكرولتر من محلول QuantaBlu Stop لكل بئر لإيقاف نشاط البيروكسيداز. قم بإغلاق لوحة الإغلاق واحتضن لمدة 10 دقائق عند RT تحت التحريك عند 350 دورة في الدقيقة.
- باستخدام قارئ اللوحات، اضبط طول موجة الإثارة إلى 315 نانومتر والانبعاث إلى 470 نانومتر. اقرأ الطبق بأسرع وقت ممكن.
ملاحظة: ينصح بقراءة اللوح عند كسب أمثل ومع كسب معين يدويا لتسهيل مقارنة القيم بين الألواح والسماح باستيفاء البيانات إذا حدث خطأ أثناء تخفيف المعايير. بدلا من مجموعة QuantaBlu Fluorogenic Peroxidase Substrates، يمكن استخدام ركائز بيروكسيداز أخرى مثل تتراميثيل بينزيدين (تقاس عند 450 أو 650 نانومتر مع أو بدون استخدام محلول التوقف على التوالي)، لكن استخدام هذا البديل يأتي على حساب حساسية أقل.
| حل BSA | |||
| ميغاوات (g/mol) | الحجم النهائي = 12.7 مل | التركيز النهائي | |
| ميلي-كيو H2O | نأتقل إلى المجلد النهائي | ||
| BSA | 66430 | 1.27 جرام | 100 ملغ/مل |
| كريبس-جلوكوز + BSA | |||
| ميغاوات (g/mol) | الحجم النهائي = 30 مل | التركيز النهائي | |
| كريبس-جلوكوز | نأتقل إلى المجلد النهائي | ||
| حل BSA | 60 ميكرولتر | 0.2 ملغ/مل | |
| PBS Tween | |||
| ميغاوات (g/mol) | الحجم النهائي = 500 مل | التركيز النهائي | |
| PBS 1X | نأتقل إلى المجلد النهائي | ||
| توين-20 | 500 ميكرولتر | 0.1% | |
| كربونات الصوديوم سول. | |||
| ميغاوات (g/mol) | الحجم النهائي = 3.22 مل | التركيز النهائي | |
| ميلي-كيو H2O | نأتقل إلى المجلد النهائي | ||
| نا2CO3 | 105.99 | 34.13 ملغ | 0.1 م |
| بيكربونات الصوديوم سول. | |||
| ميغاوات (g/mol) | الحجم النهائي = 12.7 مل | التركيز النهائي | |
| ميلي-كيو H2O | نأتقل إلى المجلد النهائي | ||
| NaHCO3 | 84 | 106.68 ملغ | 0.1 م |
| الطلاء pH 9.6 | |||
| المجلد النهائي ≈ 11 مل | |||
| كربونات الصوديوم سول. | 2.58 مل | ||
| بيكربونات الصوديوم سول. | أضف حتى درجة حموضة = 9.6 (~8.4 مل) | ||
| معيار HRP 10 ميكرومولار | |||
| التركيز الأولي | الحجم النهائي = 5 مل | التركيز النهائي | |
| كريبس-جلوكوز | نأتقل إلى المجلد النهائي | ||
| حل HRP | 8.8 ملغ/مل | 50 ميكرولتر | 0.088 ملغ/مل |
| حل BSA | 100 ملغ/مل | 10 ميكرولتر | 0.2 ملغ/مل |
| معيار HRP 1.5 نانومتر | |||
| التركيز الأولي | الحجم النهائي = 15 مل | التركيز النهائي | |
| كريبس-جلوكوز | نأتقل إلى المجلد النهائي | ||
| معيار HRP 2,0 ميكرومولار | 0.088 ملغ/مل | 2.25 ميكرولتر | 13.2 نانوغرام/مل |
| حل BSA | 0.2 ملغ/مل | 3 ميكرولتر | 40 نانوغرام/مل |
| محلول الأجسام المضادة لمعدل ضربات القلب (HRP) | |||
| التركيز الأولي | الحجم النهائي = 10 مل | التركيز النهائي | |
| مخزن الطلاء | نأتقل إلى المجلد النهائي | ||
| الأجسام المضادة المضادة لتقنية HRP | 5.6 ملغ/مل | 8.93 ميكرولتر | 5 ميكروغرام/مل |
الجدول 6: تحضير المحلول في اليوم السابق لتجربة HRP.
| مخزن حجب BSA | |||
| التركيز الأولي | الحجم النهائي = 25 مل | التركيز النهائي | |
| PBS 1X | 12.5 مل | ||
| حل BSA | 100 ملغ/مل | 12.5 مل | 50 ملغ/مل |
الجدول 7: تحضير المخزن المؤقت لمنع BSA في يوم تجربة HRP.
| المعيار | كريبس-جلوكوز + BSA | معيار HRP 1.5 نانومتر | FMOL HRP/50 μL |
| فراغ | 1000 ميكرولتر | 0 ميكرولتر | 0 |
| 1 | 993.75 ميكرولتر | 6.25 ميكرولتر | 0.09375 |
| 2 | 987.5 ميكرولتر | 12.5 ميكرولتر | 0.1875 |
| 3 | 975 ميكرولتر | 25 ميكرولتر | 0.375 |
| 4 | 950 ميكرولتر | 50 ميكرولتر | 0.75 |
| 5 | 900 ميكرولتر | 100 ميكرولتر | 1.5 |
| 6 | 850 ميكرولتر | 150 ميكرولتر | 2.25 |
| 7 | 800 ميكرولتر | 200 ميكرولتر | 3 |
| 8 | 700 ميكرولتر | 300 ميكرولتر | 4.5 |
| 9 | 600 ميكرولتر | 400 ميكرولتر | 6 |
| 10 | 400 ميكرولتر | 600 ميكرولتر | 9 |
| 11 | 200 ميكرولتر | 800 ميكرولتر | 12 |
الجدول 8: التحضير القياسي لخطة HRP في يوم تجربة HRP.
| حل كوانتا بلو العملي | |
| الحجم النهائي = 12 مل | |
| محلول الركيزة QuantaBlu | 10.8 مل |
| محلول بيروكسيد كوانتا بلو المستقر | 1.2 مل |
الجدول 9: تحضير حلول كوانتا بلو العملية في يوم تجربة HRP.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
القياس القياسي لمنحنى وتركيز الآبار
تم طرح متوسط قيمة الطلقات الفارغة من كل بئر في اللوحة. مع قيم الامتصاص على المحور Y والتكثفات على المحور X، تم إنشاء منحنى قياسي باستخدام دالة "استيفاء منحنى قياسي" من منشور GraphPad. إذا تم محاذاة جميع النقاط القياسية، يوفر نموذج "الخط" أفضل النتائج. بدلا من ذلك، يوفر نموذج "سيغمويدال، 4 PL، X هو تركيز" مرونة ودقة كبيرة مع استيفاء منحنى قياسي غير خطي (الشكل 6). تم لصق قيم امتصاص العينات على محور Y تحت المعيار واسترجاع التركيزات من "قيم...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
تمكن الجرعة الفموية من إعطاء جرعة ضوء دقيقة ومحددة بشكل متكرر للفئران حديثة الولادة الفردية. على النقيض من ذلك، فإن التغذية الطوعية، رغم كونه بديلا قابلا للتطبيق، تتطلب وقتا أطول لكل لإيصال كمية مركبة أقل مع دقة جرعات أقل12. علاوة على ذلك، يستوعب التجويق الفموي كميات أكبر من تلك الممكنة عبر الطرق القابلة للحقن، مما يسهل زيادة الجرعات الإجمالية عند تركيزات أقل وبالتالي يقلل من السمية المحتملة عند الإعطاء13. العبور عبر الجهاز الهضمي ...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
يعلن المؤلفون أنه لا توجد لديهم مصالح مالية متنافسة.
شكر وتقدير
تم تنفيذ هذا العمل بدعم مالي من مختبر التميز INFLAMEX-11-IDEX-0005-02، وجائزة من مؤسسة العنداء (2025، AP-RM-24-012)، ومنح ANR Diab1GUT (ANR-24-CE15-7152). أجريت الدراسة ضمن إطار اتحاد INFIBREX واستفادت من دعم خطة الاستثمار "فرنسا 2030"، التي أطلقتها الحكومة الفرنسية ونفذتها جامعة باريس سيتي ضمن برنامج IdEx "مبادرة التميز" (ANR-18-IDEX-0001). نشكر منصة غرفة الأبحاث الفنية في مركز أبحاث الالتهاب بصدق على دعمهم الكبير، ونشكر بشكل خاص لألكسندرا ويلمتز ومود لو غال على مساعدتهما الخبيرة. نود أيضا أن نعبر عن امتناننا الصادق لمنصة مرافق في مركز أبحاث الالتهاب على دعمهم الأساسي، مع شكر خاص لإيزابيل رينو وغيوم أنسلميه.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 10 مرات DPBS بدون Ca & MG | دولبيكو | 14200091 | |
| الأجسام المضادة المضادة لتقنية HRP | الموقع البيولوجي الإسكندنافي | GTX10183 | بيروكسيداز الفجل الحارس أحادي النسيلة IgG [2H11] |
| مكبرة ثنائية العين | أوليمبوس | SZ61 | لا حاجة لمواصفات. |
| صفيحة سوداء ذات 96 بئر مسطح القاع | ثيرموفيشر ساينتيفيك | 137101 | يجب أن تكون الألواح سوداء ومتكيفة مع قراءات الفلورة. يجب إزالة الغطاء أثناء القراءة. |
| BSA | ميرك | A4503 | |
| فئران C57BL/6J | نهر تشارلز | 632C57BL/6J | |
| CaCl2 | ميرك | 2382 | |
| غلاف شفاف بسعة 96 بئر شفاف مسطح قاع مرتفع | كورنينغ | 9018 | |
| D-(+)-جلوكوز | ميرك | G8270 | |
| H2O المقطر | |||
| دي-مانيتول | ميرك | M4125 | |
| الملقط الدقيق | FST | 11445-12 | |
| مقص دقيق | FST | 14058-09 | |
| FITC-Dextran 4Kd | FD4 | مختبرات TdB | حساس للتدهور الضوئي. |
| وسادة التدفئة | مينيريف | 20 031 01 | |
| HRP | ميرك | P8375 | |
| MgCl2، 6H2O | ميرك | M2670 | |
| ميلي-كيو H2O | |||
| نظام استخدام P2300 EasyMount ونظام الاستخدام الغرف | الأدوات الفسيولوجية | EM6-C-CE | يجب أن تكون الأنظمة والغرف والمنزلقات جميعها متوافقة. |
| منزلق غرفة النفوذ P2306 | الأدوات الفسيولوجية | PI-P2306 | تتوفر نماذج مختلفة من السلايدرات لأحجام وأشكال مختلفة من الأنسجة. |
| مجموعة ركيزة بيروكسيداز فلوروجينية من QuantaBlu | ثيرموفيشر ساينتيفيك | 15169 | |
| إبر تغذية قابلة لإعادة الاستخدام ذات طرف دائري | FST | 18061-24 | عيار 24، قطر رأس 1.25 مم، رأس دائري. يجب غسله بماء معقم، إيثانول بنسبة 70٪ وأن يكون معقم قبل الاستخدام. |
| بيكربونات الصوديوم | ميرك | S6297 | |
| كربونات الصوديوم | ميرك | S7795 | |
| مقياس الطيف الفوتوني | TECAN | سبارك 10 إم | يطلب وجود قارئ لوحات ذو اكتساب علوي إذا تم استخدام الألواح السوداء 137101. |
| توين-20 | ميرك | P7949 |
المراجع
- Di Vincenzo, F., Del Gaudio, A., Petito, V., Lopetuso, L. R., Scaldaferri, F. Gut microbiota, intestinal permeability, and systemic inflammation: A narrative review. Intern Emerg Med. 19 (2), 275-293 (2024).
- Mu, Q., Kirby, J., Reilly, C. M., Luo, X. M. Leaky gut as a danger signal for autoimmune diseases. Front Immunol. 8, 598(2017).
- Sorini, C., et al. Loss of gut barrier integrity triggers activation of islet-reactive T cells and autoimmune diabetes. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (30), 15140-15149 (2019).
- An, J., et al. The role of intestinal mucosal barrier in autoimmune disease: a potential target. Front Immunol. 13, 871713(2022).
- Picco, P., et al. Increased gut permeability in juvenile chronic arthritides: a multivariate analysis of the diagnostic parameters. Clin Exp Rheumatol. 18 (6), 773-778 (2000).
- Dunleavy, K. A., Raffals, L. E., Camilleri, M. Intestinal barrier dysfunction in inflammatory bowel disease: underpinning pathogenesis and therapeutics. Dig Dis Sci. 68 (12), 4306-4320 (2023).
- Borrego-Ruiz, A., Borrego, J. J. Early-life gut microbiome development and its potential long-term impact on health outcomes. Microbiome Res Rep. 4 (2), 20(2025).
- Di Costanzo, M., De Paulis, N., Biasucci, G. Butyrate: A link between early life nutrition and gut microbiome in the development of food allergy. Life (Basel). 11 (5), 384(2021).
- Kindgren, E., Ahrens, A. P., Triplett, E. W., Ludvigsson, J. Infant gut microbiota and environment associate with juvenile idiopathic arthritis many years prior to disease onset, especially in genetically vulnerable children. eBioMedicine. 93, 104654(2023).
- Borowitz, S. M. The epidemiology of inflammatory bowel disease: clues to pathogenesis. Front Pediatr. 10, 1103713(2023).
- Leete, P., et al. The effect of age on the progression and severity of type 1 diabetes: potential effects on disease mechanisms. Curr Diab Rep. 18 (11), 115(2018).
- Francis, F., et al. Probiotic studies in neonatal mice using gavage. J Vis Exp. (143), e59074(2019).
- McClain, R. M., et al. Neonatal mouse model: review of methods and results. Toxicol Pathol. 29 (Suppl), 128-137 (2001).
- Thomson, A., et al. The Ussing chamber system for measuring intestinal permeability in health and disease. BMC Gastroenterol. 19, 98(2019).
- Clarke, L. L. A guide to Ussing chamber studies of mouse intestine. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 296 (6), G1151-G1166 (2009).
- Westerhout, J., Wortelboer, H., Verhoeckx, K. Ussing chamber. The Impact of Food Bioactives on Health: in vitro and ex vivo models. , (2015).
- Hempstock, W., Ishizuka, N., Hayashi, H. Functional assessment of intestinal tight junction barrier and ion permeability in native tissue by Ussing chamber technique. J Vis Exp. (171), e62468(2021).
- Sjögren, E., Eriksson, J., Vedin, C., Breitholtz, K., Hilgendorf, C. Excised segments of rat small intestine in Ussing chamber studies: A comparison of native and stripped tissue viability and permeability to drugs. Int J Pharm. 505 (1), 361-368 (2016).
- Moussaoui, N., et al. Changes in intestinal glucocorticoid sensitivity in early life shape the risk of epithelial barrier defect in maternal-deprived rats. PLoS One. 9 (2), e88382(2014).
- Gleeson, J. P., et al. The enhanced intestinal permeability of infant mice enables oral protein and macromolecular absorption without delivery technology. Int J Pharm. 593, 120120(2021).
- Birchenough, G. M. H., et al. Postnatal development of the small intestinal mucosa drives age-dependent, regio-selective susceptibility to Escherichia coli K1 infection. Sci Rep. 7 (1), 83(2017).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
