مقالة منهجية

طريقة مبسطة لتحويل نبات نبات البالميفورا بواسطة البكتيريا الزراعية

DOI:

10.3791/69753

⸱

مارس 20, 2026

 ,  , 
1Department of Plant Pathology, University of Georgia

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نقدم بروتوكولا بسيطا وفعالا وقابلا للتكرار لتحويل نبات Phytophthora palmivora بواسطة البكتيريا الزراعية، وهو أيضا قابل للتطبيق على P. capsici.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الفيتوفثورا هو جنس من الفطريات البومية يحتوي على العديد من مسببات الأمراض النباتية المدمرة، من بينها النوع واسع النطاق P . palmivora. لقد تقيدت الجينوميات الوظيفية لفيتوفثورا بسبب محدودية توفر طرق تحويل قوية وسهلة التنفيذ. من بين الطرق المتاحة، يعد التحول بوساطة البكتيريا الزراعية (AMT) جذابا بشكل خاص لأنه يتطلب معدات متخصصة قليلة وغالبا ما ينتج محولات مستقرة مع إدخال جيني بنسخة واحدة. تستخدم معظم بروتوكولات AMT لتحويل الفطريات والفطريات البوميسيتية أملاح متوسطة الحد الأدنى (MM) في وسط تحفيز الزراعة النباتية وزراعة الزراعة المشتركة. عادة ما يتضمن تحضير هذه الأوساط صنع وخلط محاليل مخزون متعددة، تحتوي بعضها على عدة مكونات بتركيزات مختلفة. العملية تستغرق وقتا طويلا وعرضة للأخطاء، مما يؤدي إلى نجاح غير متسق في التحويل. هنا، نقدم بروتوكول AMT مبسط وبسيط وقابل للتكرار لباربوكسترا بالميفورا يستخدم وسط قاعدي متوفر تجاريا من موراشيغ وسكوغ (MS) لتحضير وسط تحفيز وزراعة الزراعة المشتركة. وقد تم تطبيق هذا البروتوكول بنجاح أيضا لتحويل P. capsici وقد يطبق على أنواع أخرى من Phytophthora أيضا.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

فيتوفثورا، جنس من الفطريات البوية، يحتوي على العديد من أكثر مسببات الأمراض النباتية تدميرا في العالم، والمسؤولة عن خسائر اقتصادية جسيمة 1,2. من بينها، يعد نبات Phytophthora palmivora مرضا واسع النطاق يصيب العديد من المحاصيل الاقتصادية المهمة، بما في ذلك الكاكاو والبابايا3. وهو أكثر عوامل التسبب انتشارا لتعفن القرون السوداء في الكاكاو، وهي شجرة معمرة استوائية تنتج المكون الرئيسي لصناعة الشوكولاتة التي تبلغ قيمتها مليارات الدولارات 4,5,6. فهم آليات المرض الجزيئي لهذا الممرض المدمر أمر بالغ الأهمية لتصميم استراتيجيات جديدة وفعالة للسيطرة على الأمراض، والتحول الجيني هو أداة أساسية لتمكين مثل هذه التحقيقات.

تم تطوير عدة طرق لتحويل أنواع Phytophthora، بما في ذلك القصف الدقيقالمقذوف 7، وتحويل البروتوبلاستيد البوساطة ببوساطة بولي إيثيلين جليكول والكالسيوم (PEG/CaCl2) 8,9,10,11، وتحليل كهرباء الأبواغ 12,13,14، والتحويل بوساط الأجروبكتيريوم (AMT)15.16. من بين هذه الأساليب، يقدم AMT مزايا رئيسية لأنه عادة ما يولد تكامل جيني بنسخة واحدة15,16 وهو سهل نسبيا في التنفيذ دون الحاجة إلى معدات متخصصة.

تم تطوير بروتوكول للتحويل الفعال ل P. palmivora باستخدام AMT سابقا16. بهذه الطريقة، نجحنا في تحويل P. palmivora باستخدام تراكيب متعددة17,18. تستخدم هذه الطريقة وسائط تحفيز وزراعة مشتركة تعتمد على الوسط البسيط (MM) المعتمدة على الأزروباكتيريوم، والتي تستخدم عادة لتحويل الفطريات والقطريات البوميسيتية15،16،19. على الرغم من أن بروتوكول التحويل القائم على MM ثبت فعاليته في توليد المحولات، إلا أن إعداد حلول مخزون متعددة ودمجها لصنع وسائط يمكن أن يكون مهمة تستغرق وقتا طويلا وعرضة للأخطاء.

هنا، نقدم طريقة مبسطة جدا لعلاج AMT من P. palmivora باستخدام وسط قاعدة تجاري من موراشيغي وSkoog (MS) لاستبدال مكونات الوسط المعتمدة على ملح MM في وسط تحفيز وزراعة البكتيريا المشتركة 16. تلغي هذه الطريقة الحاجة لتحضير محاليل كيميائية متعددة، مما يجعل العملية أقل استهلاكا للوقت وأكثر قابلية للتكرار. علاوة على ذلك، يبدو أن هذا النهج يعطي كفاءة تحويل أعلى مقارنة بالطريقة16 الموصوفة سابقا، وينطبق أيضا على P. capsici.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. تحضير المحاليل المخزنة، والوسطاء، والمواد الأخرى اللازمة للتحويل

  1. محاليل مخزون المضادات الحيوية
    1. تحضير محاليل مخزونية من الكاناميسين (50 ملغ/مل)، G418 (15 ملغ/مل)، وسيفوتاكسيم (100 ملغ/مل): إذابة كميات مناسبة من المضادات الحيوية في الماء، تعقيم المحاليل بالفلترة، تحضير أليكوتات بحجم 1 مل، وتخزينها عند -20 درجة مئوية.
    2. تحضير محلول المرق من الريفامبيسين (15 ملغ/مل): ذيب الكمية المناسبة من الريفامبيسين في DMSO، حضر 1 مل من الريفامبيسين، لفها بورق الألمنيوم، وخزنها عند -20 درجة مئوية.
      ملاحظة: تأكد من تعقيم المحاليل الكيميائية المحضرة في DMSO باستخدام مرشحات الحقن المصنوعة من مواد متوافقة مع DMSO، مثل النايلون أو PTFE (التفلون).
  2. وسائط لنمو البكتيريا الزراعية
    1. الوسط السائل لوريا-بيرتاني (LB): لتحضير 250 مل من الوسط، أضف مسحوق 6.25 جرام رطل إلى 250 مل من الماء، قم بتعقيم المحلول، وخزنها في درجة حرارة الغرفة (RT).
    2. وسط الأجار الصغير: لتحضير 250 مل من الوسط، أضف 6.25 جرام مسحوق رطل و3.75 جرام أجار إلى 250 مل من الماء، قم بتعقيم المحلول، وخزن في RT. أضف المضادات الحيوية المناسبة إلى الأجار المائع المذاب قبل صنع الأطباق. تخزين الأطباق المكملة بالمضادات الحيوية عند درجة حرارة 4 درجات مئوية.
  3. وسائط نمو وتحول P. palmivora
    1. 10٪ أجار V8: لتحضير 500 مل، أضف 50 مل من عصير الخضروات الأصلي V8 100٪ إلى 450 مل من الماء. ثم أضف 0.5 جرام من CaCO3 إلى التعليق وحركه لخلطه جيدا. قم بتعقيم المحلول وصبه في الأطباق.
      ملاحظة: أضف المضادات الحيوية المناسبة عند الحاجة. تخزين الأطباق المكملة بالمضادات الحيوية عند درجة حرارة 4 درجات مئوية.
    2. الوسط السائل نصف القوة من موراشيغ وسكوج (نصف مليونال ثانية): أضف 2.15 جرام من الوسط القاعدي موراشيغي وسكوج (MS) إلى 950 مل من الماء، اضبط الرقم الهيدروجيني إلى 5.6 مع 1 نيوتن كيلو أوه، وأضف الماء حتى 1 لتر. استخدمه مباشرة لصنع نصف MS أجار (الخطوة 1.3.3)، ثم قم بتعقيم السائل المتبقي بنصف MS، وخزنه في RT.
    3. 1/2MS أجار لزراعة الزراعة المشتركة بين البكتيريا والزوسبور (AZCA): لتحضير 600 مل من AZCA، اخلط 567 مل من 1/2 MS سائل من الخطوة 1.3.2 مع 9 جرام أجار. قم بعمل معقم للمحلول وخزنها في RT.
    4. 50٪ جليسرول: اخلط 50 مل من الجلسرول مع 50 مل من الماء، استخدم المعقم المحلول وتخزينه في RT.
    5. 1M MES (pH 5.6): لتحضير 200 مل، أضف 39.048 جرام MES هيدرات إلى 160 مل من الماء، ثم اضبط الرقم الهيدروجيني إلى 5.6 باستخدام محلول NaOH. بعد ذلك، أضف ماء يصل إلى 200 مل، وقم بتعقيم المحلول بالفلتر، وخزنه في RT في ظروف مظلمة.
      ملاحظة: MES سيذوب تدريجيا مع زيادة الرقم الهيدروجيني. في البداية، استخدم 10 نيوتن NaOH لتقريب الرقم الهيدروجيني إلى 5.6، مما سيكاد يذيب البودرة. ثم أضف 1 نيوتن NaOH ليصل الرقم الهيدروجيني بالضبط إلى 5.6.
    6. 20٪ جلوكوز: قم بإذابة 10 جرام من الجلوكوز في 40 مل من الماء، ثم أضف الماء حتى 50 مل، ثم قم بتعقيم المحلول بالفلتر، وخزنها في RT.
    7. 200 ملليموتر أسيتوزيرينجون (AS): يذيب 40 ملغ 4'-هيدروكسي-3',5'-ثنائي ميثوكسي أسيتوفينون في 1 مل DMSO (انظر الملاحظة تحت 1.1.2) ويغطي المحلول بورق الألمنيوم. اجعله منعشا في يوم التحول.
    8. وسائط تحفيز البكتيريوم (AIM): لتحضير 40 مل من الوسط، أضف 400 ميكرولتر من 50٪ جليسرول، 400 ميكرولتر من 20٪ جلوكوز، 1.6 مل من 1 ملار MES (رقم الهيدروجيني 5.6)، 40 ميكرولتر من 200 ملليمول AS إلى 37.6 مل من محلول 1/2 مللي ثانية سائل (pH 5.6) (معد في الخطوة 1.3.2) في أنبوب معقم بحجم 50 مل. اخلط المحلول جيدا، غط الأنبوب بورق الألمنيوم، واستخدمه طازجا خلال عدة ساعات.
    9. أجار الزراعة المشتركة بين البكتيريا والزوبيبور (AZCA): لتحضير 600 مل من الأجار، أضف 6 مل من الجلسرول 50٪، 3 مل من 20٪ جلوكوز، 24 مل من 1 ملويتار MES (درجة الحموضة 5.6)، 600 ميكرولتر من 200 ملم AS إلى 567 مل 1/2 مللي غليسوط أجار (درجة الحموضة 5.6) (تم تحضيره في الخطوة 1.3.3). اسكب المحلول في الصحون وغطها بقطعة قماش سوداء لحمايتها من الضوء.
      ملاحظة: أضف المحاليل الكيميائية إلى نصف أجار الملي المغناطيسي المذاب (الخطوة 1.3.9) عندما تكون درجة الحرارة بين 55-60 درجة مئوية. أطفئ الأضواء في غطاء المحرك أثناء الخطوات 1.3.7-1.3.9 لأن AS حساس للضوء. قم بتنفيذ هذه الخطوات الثلاث في يوم التحول.
    10. بليتش آجار: لتحضير 1 لتر من الأجار، في 950 مل من الماء، أضف 0.5 جرام KH2PO4، 0.25 جرام MgSO4.7H 2O، 1 جرام L-أسباراجين، 5 جرام جلوكوز، 0.5 جرام مستخلص خميرة، 10 ميكرولتر ثيامين (100 ملغ/مل في الماء، مخزن عند 4 درجات مئوية)، 10 ملغ β-سيتوستيرول (مذاب في 3 مل إيثانول قبل الإضافة). حرك المحلول لإذابة جميع المكونات، ثم أضف الماء لرفع الحجم إلى 1 لتر. قسم المحلول إلى 500 مل وأضف 7.5 جرام أجار لكل 500 مل. قم بتعقيم المحلول، وأضف المضادات الحيوية المناسبة عندما تنخفض درجة الحرارة إلى 55 درجة مئوية، ثم اسكبه في أطباق.
    11. غشاء Hybond N+: اقطع الغشاء باستخدام صفائح الحماية إلى قطع بحجم 5 سم × 6 سم، ولف القطع بورق الألمنيوم، ثم قم بتعقيم الجهاز. عند وضع الغشاء المعقم على وسط AZCA، تعامل معه بملقط معقم، وتخلص من الأغطية الواقية.

2. زراعة P. palmivora

  1. قبل سبعة إلى ثمانية أيام من التحول، ازرع معزولة P. palmivora بابايا P116 على ألواح أجار جديدة مصنوعة 10٪ V8 عن طريق وضع سدادة أجار واحدة من زراعة فيتوفثورا (أو من المخزون) في مركز طبق بيتري.
    ملاحظة: للحصول على تركيز أعلى من الأبواغ الحيوانية، من المهم استخدام أجار V8 10٪ غير مصفى طازجا.
  2. حضن الصفائح عند 25 درجة مئوية تحت دورة ضوء 12 ساعة و12 ساعة مظلمة لمدة 7-8 أيام حتى التحول.

3. تحضير Agrobacterium tumefaciens

  1. قبل ثلاثة أيام من التحول، تم استخدام سلالة A. tumefaciens EHA105 التي تحمل pCB301TOR-GFP16 على صفيحة LB أجار مدعمة بريفامبيسين (15 ميكروغرام/مل) وكانامايسين (50 ميكروغرام/مل). حضن الطبق عند 28 درجة مئوية لمدة يومين.
    ملاحظة: يمكن إجراء التحضير الأولي للبكتيريوم الزراعي (الخطوة 3.1) قبل أسبوع من التحول، ويمكن تخزين الألواح عند 4 درجات مئوية بعد فترة الحضانة التي تستمر يومين.
  2. في اليوم السابق للتحويل، خذ كمية صغيرة من خلايا البكتيريا الزرية وزعها على صفيحة أجار جديدة من LB مدعمة بالمضادات الحيوية (كما هو موضح في الخطوة 3.1) باستخدام قاعدة وأسفل أنبوب طرد مركزي دقيق معقم بسعة 1.5 مل. لتسهيل الانتشار، أضف 20 ميكرولتر وسط سائل LB إلى مركز لوح LB Agar، وامزج الخلايا البكتيرية مع وسط LB، ثم وزعها بالتساوي عبر اللوحة. حضن الطبق عند حرارة 28 درجة مئوية طوال الليل لمدة تتراوح بين 16-18 ساعة.
  3. قم بتنظيف الخلايا التي نمت طوال الليل باستخدام رأس ماصة بحجم 1 مل وأعد تعليقها في وسط تحفيز البكتيريوم (AIM) بسعة 1 مل عن طريق التوصيل بالماصات صعودا وهبوطا. قم بتخفيف الخلايا إلى OD600 = 0.4 باستخدام AIM في أنبوب معقم بسعة 50 مل مغطى بورق الألمنيوم. اجعل ما لا يقل عن 5 مل للاستخدام في الحضانة المشتركة مع P. palmivora zoospores (الخطوة 5.1).
    ملاحظة: OD600 يتراوح من 0.1 إلى 0.8 سيسمح بتحويل ناجح. يستخدم OD600 = 0.4 بشكل روتيني لأن هذا التركيز أنتج أعلى كفاءة تحول عند استخدام وسط متوسط (MM) لتحفيز البكتيريا الزراعية ووسائط الزراعة المشتركة للتحويل16.
  4. حضن البكتيريا في RT تحت ظروف مظلمة لمدة 1.5-2 ساعة على هزاز منصة مع تحريك خفيف (حوالي 70 دورة في الدقيقة).
    ملاحظة: ينصح بإبقاء أضواء الغطاء مطفأة أثناء الخطوة 3.3 وتخفيف غطاء أنبوب 50 مل أثناء الحضانة (الخطوة 3.4).

4. إطلاق الأبواغ الحيوانية

  1. بعد ساعة واحدة من حضانة Agrobacterium tumefaciens (الخطوة 3.4)، أغمر طبق P. palmivora عمره 7-8 أيام بماء مبرد مسبقا بسعة 10 مل عند 4°C، ثم أزل فقاعات الهواء على سطح الوسط عن طريق النقر بلطف برأس الماصة، وحضن اللوح عند 4 درجات مئوية لمدة 15 دقيقة، تليها 15 دقيقة عند RT تحت الضوء.
  2. انقل الأبواغ الحيوانية المنبعثة بلطف (حوالي 7-8 مل) إلى أنبوب طرد مركزي معقم بسعة 15 مل مع ماصة دون إزعاج الميسيليوم والأبواغ.
  3. لقياس تركيز الزوسبور، انقل بعض تعليق الزوسبور (مثل 20 ميكرولتر) إلى أنبوب ميكرو طرد مركزي بسعة 1.5 مل وتخفيفه 10 مرات بالماء (180 ميكرولترH 2O ل20 ميكرولتر من زوزبور). قم بتدوير الأنبوب لمدة دقيقة واحدة لتغليف الأبواغ الحيوانية بسهولة العد، ثم عد عدد الأبواغ الحيوانية تحت المجهر باستخدام جهاز قياس الهيماتومي. اضرب العدد المعين في 10 لتحديد تركيز تعليق الزوسبور المحضر في الخطوة 4.2.
    ملاحظة: يتم قياس تركيز الأبواغ الحيوانية لحساب كفاءة التحول. عادة ما نستخدم تركيزات تتراوح بين 1.5 × 106 إلى 5 × 106 زوسبور لكل مل، مع نجاح في التحول.

5. الحضانة المشتركة للبكتيريوم الزراعي والأبواغ الحيوانية

  1. أضف 5 مل من البكتيريوم الزراعي (المحضر في الخطوة 3.4) إلى 5 مل من تعليق الزوبيبور (المحضر في الخطوة 4.2) في أنبوب معقم بحجم 50 مل مغطى بورق الألمنيوم. اخلط الأنبوب بلطف وحضنه عند RT لمدة ساعتين في الظلام. حافظ على الغطاء مرتخيا ولا تهز الأنبوب أثناء الحضانة المشتركة.
  2. خلال فترة الحضانة المشتركة (الخطوة 5.1)، جهز صفائح AZCA (الخطوة 1.3.9). عندما يتصلب الوسط، ضع قطعة واحدة من غشاء Hybond N+ المعقم (المعد في الخطوة 1.3.11) على كل لوحة AZCA وحافظ على الألواح في الظلام.
  3. بعد ساعتين من حضانة البكتيريوم والزوبيغر (الخطوة 5.1)، انشر 300 ميكرولتر من الخليط على كل غشاء Hybond N+ الموضوع فوق صفائح AZCA (الخطوة 5.2) مع طرف ماصة، تاركا الحواف خالية من السائل.
  4. اترك الخليط يجف في الهواء لمدة حوالي 10 دقائق في الغطاء بترك أطباق البتري مكشوفة. غط الألواح بمجرد توقف المحلول على الغشاء عن التدفق.
    ملاحظة: خلال الخطوات 5.1-5.4، أبق أضواء الغطاء مطفأة. إذا لزم الأمر، استخدم الأضواء أثناء إضافة وتوزيع الخليط على الأغشية (الخطوة 5.3).
  5. بعد التجفيف بالهواء، حضن الألواح على حرارة 25 درجة مئوية في الظلام لمدة يومين.

6. اختيار المحولات المقاومة ل G418

  1. بعد 48 ساعة من الحضانة المشتركة (الخطوة 5.5)، نقل أغشية Hybond N+ مقلوبة باستخدام ملقط معقم إلى ألواح Plich Agar مدعومة ب G418 (30 ميكروغرام/مل) وسيفوتاكسيم (100 ميكروغرام/مل). عند وضع الأغشية على الألواح، لا تسحبها على سطح الوسط.
    ملاحظة: يجب تحديد تركيز G418 لاختيار المحولات لكل عزل من P. palmivora ، حيث تلاحظ مستويات حساسية مختلفة لكل عزل. للقيام بذلك، ضع سدادة ميسيليوم قطرها 0.5 سم في مركز ألواح بليش أجار مع سلسلة من تركيزات G418 بزيادات 5 ميكروغرام/مل تبدأ من الصفر. جهز ثلاث ألواح مكررة لكل تركيز. حضن الألواح عند 25 درجة مئوية لمدة 7 أيام. حدد أدنى تركيز ل G418 الذي يثبط تماما نمو عزل الفيتوفثورا واستخدامه لاختيار المحولات.
  2. استخدم قاعدة أنبوب الطرد المركزي الدقيق المسطح بسعة 1.5 مل للضغط والانزلاق بلطف فوق سطح الغشاء للتأكد من أنه على اتصال وثيق مع الوسط. راقب الجانب السفلي من الألواح للتحقق من وجود فقاعات هواء بين الغشاء والوسط. اعصر فقاعة الهواء برفق، إن وجدت، باستخدام قاعدة نفس أنبوب الطرد المركزي المجهوري.
  3. حضن الصفائح تحت دورة إضاءة 12 ساعة و12 ساعة مظلمة عند 25 درجة مئوية لمدة 2-3 أيام.
  4. بعد 3 أيام من الحضانة، أزل الأغشية باستخدام ملقط معقم واستمر في حضانة الصفائح تحت نفس الظروف. يمكن إزالة الأغشية بعد يومين إذا ظهرت مستعمرات مرئية على الصفائح.
    ملاحظة: عادة ما تظهر المحولات خلال 1-3 أيام بعد إزالة الغشاء، لكن بعض المستعمرات قد تظهر لاحقا. للحصول على المزيد من المحولات، راقب الألواح لمدة أسبوع تقريبا بعد إزالة الأغشية.
  5. انقل المحولات إلى ألواح أجار V8 بنسبة 10٪ بنفس تركيز G418 أو تركيز منخفض بنسبة 30٪.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

باتباع هذا البروتوكول، أجرينا تجربتين مستقلتين لتحويل P. palmivora باستخدام A. tumefaciens EHA105 الحامل ل pCB301TOR-GFP16. كما هو متوقع، أدى الحضانة المشتركة للزوسباغ مع البكتيريا الزراعية إلى ظهور مستعمرات مقاومة ل G418 على صفائح بليتش أجار مدعومة ب 30 ميكروغرام/مل G418، في حين لم تلاحظ أي مستعمرات على صفائح التحكم دون عدوى بالأجروباكتيريوم (الشكل 1A). عدد المحولات المقاومة ل G418 لكل 107 أبواغالحيوان الناتجة من هاتين التجربتين كان 55 و50 على التوالي (الجدول 1)، وهو ما يقارب ضعف العدد الأعلى (27 ± 5) الذي تم الحصول عليه سابقا باستخدام البروتوكول16 السابق.

تم التحقق من وجود المحولات الحقيقية بطريقتين: أولا، ملاحظة تألق GFP باستخدام مجهر فلوري، وثانيا، تضخيم PCR لجزء 550 قطعة أساس من جين EGFP باستخدام Taq 2X Master Mix (NEB) مع زوج البرايمر EGFP-F2 (5'- GACGTAAACGGCCACCAAGTTC-3') وEGFP-R2 (5'-GGGTGCTCAGGTAGTAGGGTTG-3'). في التجربة (Exp) 1، أظهر 15 من أصل 18 محولا مقاومة ل G418، وفي Exp 2، أظهر 17 من أصل 21 محولا تألق GFP (الجدول 1، الشكل 1B). بالنسبة لسبعة محولات مقاومة ل G418 لم تظهر فلورة من كلا التجربتين، تم تأكيد أن ثلاثة منها محولات حقيقية بواسطة PCR (الشكل 1C). في المجموع، قدر معدل المحولات الحقيقية ب 90٪.

بالإضافة إلى ذلك، تمكنا أيضا من تحويل عزل القرع P. capsici بنجاح، PC2024-14sz، باستخدام A. tumefaciens EHA105 الحامل ل pCB301TOR-GFP، وفقا للبروتوكول مع تعديل طفيف في تحضير معلقات الزوبوسبور (تم تمديد فترة الحضانة عند 4 درجات مئوية بعد غمر صفيحة P. capsici عمرها 7 أيام بماء مبرد مسبقا إلى 30 دقيقة). عدد المحولات المقاومة ل G418 (30 ميكروغرام/مل) لكل 107 من تجربة واحدة كان 13. تمت ملاحظة تسعة محولات تحت مجهر الفلورة، وجميعها أنتجت فلورة (الملف التكميلي 1)، مما يشير إلى أنها محولات حقيقية.

figure-results-1
الشكل 1: تحويل P. palmivora باستخدام A. tumefaciens EHA105 الحامل pCB301TOR-GFP. (A) ظهور محولات P. palmivora المقاومة ل G418 على أجار Plich مع إضافة 30 ميكروغرام/مل G418. (ب) الكشف عن تعبير GFP تحت مجهر فلوري في سلالة محول تمثيلية وسلالة P. palmivora البرية (WT). تم التقاط الصور تحت قنوات الفلورية ذات المجال الساطع (BF) وGFP. (ج) تضخيم PCR ل EGFP من أربعة محولات مع فلورة GFP قابلة للكشف وسبعة بدون تألق GFP. تم استخدام زوج البرايمر العالمي ITS4/ITS520 لتضخيم منطقة الفاصل المكتوب الداخلي (ITS) للتحقق من سلامة الحمض النووي. المحولات التي لا تحتوي على فلورة GFP تبرز بنص عريض وخط تحت. الاختصارات: M = NEB 100 bp DNA السلم; WT = عزل P. palmivora P1 من النوع البري؛ N = PCR للتحكم السلبي باستخدام H2O كقالب. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

التجربةجرعةجرعة زائدة 600 من البكتيريوم الزراعيتركيز زوسبورات (/مل)حجم زوسبور (مل)عدد المحولات المقاومة ل G418عدد المحولات التي تحمل إشارة GFP قابلة للكشف (تم اكتشافها / ملاحظتها)عدد المحولات المقاومة ل G418/ 107 أبواغ حيوانية
10.41.8 × 1064.34315/1855
20.42.9 × 1064.66717/2150

الجدول 1: كفاءة التحول الجرويبكتيريا لبيريبوكيا بالميفورا باستخدام A. tumefaciens EHA105 الحامل ل pCB301TOR-GFP.

الملف التكميلي 1: تعبير GFP تحت مجهر فلوري في نوع بري (WT) P. capsici ومحول ممثل مولد باستخدام A. tumefaciens EHA105 الحامل pCB301TOR-GFP. تم التقاط الصور تحت قنوات الفلورية ذات المجال الساطع (BF) وGFP. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يستخدم هذا البروتوكول وسط موراشيغ نصف القوة ووسط سكوغ القاعدي (1/2 MS) لاستبدال مكونات أملاح الوسط الأدنى (MM) التي تستخدم عادة في وسائط تحفيز وزراعة الزراعة المشتركة للنباتات النباتية لتحويل الفطريات والفطريات. تحضير الوسائط القائمة على الملح المغناطيسي يتطلب صنع محاليل مخزون متعددة من عدة مواد كيميائية فردية ثم دمج هذه المحاليل19. يحتوي 1/2 MS أيضا على العديد من المكونات الكيميائية؛ ومع ذلك، وبما أن الميكروفونات متوفر تجاريا على نطاق واسع كمسحوق مخلوط مسبقا، فإن التحضير المتوسط مبسط لإذابة المسحوق في الماء. يقلل هذا التعديل بشكل كبير من وقت تحضير الوسائط ويقلل من احتمالية حدوث أخطاء بشرية. بالإضافة إلى ذلك، يحسن البروتوكول كفاءة التحول، مما ينتج عددا أكبر من المحولات مقارنة بالطريقة AMT16 التي تم وصفها سابقا. كما أنه فعال في تحويل P. capsici ومن المرجح أن يكون مناسبا لأنواع أخرى من Phytophthora . ولتعزيز قابلية تطبيقه الأوسع، فقد استخدم وسط التصلب المتعدد سابقا في الزراعة المشتركة بين سلالات Agrobacterium tumefaciens التي تعبر عن AtVIP1 (بروتين Arabidopsis thaliana VirE2 المتفاعل 1) وP. infestans zoospores، مما مكن من التحول الناجح ل P. infestans21.

من المهم ملاحظة أن هذا البروتوكول قد يولد نسبة منخفضة من الإيجابيات الكاذبة. من بين 39 محولا مقاومة ل G418 تم اختبارها بواسطة مراقبة الفلورة GFP أو PCR، أظهرت أربعة منها عدم وجود فلورة أو تضخيم ل EGFP (الجدول 1، الشكل 1C). نظرا لأن التكامل الجزئي ل T-DNA أثناء التحول بوساطة البكتيريا الزراعية ليس أمرا نادرا22,23، فمن الممكن أن يكون الجزء الوحيد من T-DNA الذي يحتوي على جين NPTII من البلازميد pCB301TOR-GFP16 قد تم دمجه في جينوم P. palmivora. بدلا من ذلك، قد تنتج الإيجابيات الكاذبة عن عدم وجود تلامس كاف بين الغشاء والوسط الانتقائي، مما يسمح بالهروب من الانتقاء G418. لذا فإن التأكد من بقاء الغشاء على اتصال كامل مع الوسط (الخطوة 6.2) أمر ضروري.

يمكن تبسيط هذا البروتوكول أكثر. على سبيل المثال، يمكن حذف MES في وسائط تحفيز البكتيريا الزراعية (AIM) وزراعة أجار الزراعة المشتركة بين البكتيريا والزوبوسبور (AZCA). يستخدم MES عادة كعامل مؤقت في الكيمياء الحيوية وتجارب علم الأحياء الجزيئي للحفاظ على درجة حموضة مستقرة؛ ومع ذلك، فإن تحضير محلول MES بسعة 1 M عند pH 5.6 يستغرق وقتا كافيا ويضيف إلى التكلفة. في AMT للنباتات، مثل الريحانالحلو 24 والبابايا25، تم استخدام وسائط تحفيزية وزراعة مشتركة مشابهة تعتمد على التصلب المتعدد المغلقة ( Agobacterium ) ووسائط الزراعة المشتركة بدون MES، مما يشير إلى أن MES قد لا يكون ضروريا لتحول P. palmivora . هناك حاجة إلى تجارب إضافية للتأكد من أن حذف MES لا يؤثر على كفاءة التحول.

بشكل عام، يوفر هذا البروتوكول المبسط منصة عملية ومتاحة للتلاعب الجيني الروتيني لباربوميفورا، وP. capsici، وربما فطريات بويضية أخرى. يدعم مجموعة واسعة من الدراسات الأساسية، مع وجود بعض الدراسات الانتقالية، بما في ذلك وضع العلامات الفلورية على مسببات الأمراض لتتبع ديناميكيات العدوى، ووضع علامات على البروتينات لفحص التمركز تحت الخلوي، والتحليلات الوظيفية من خلال تغييرات مستهدفة في التعبير الجيني أو تسلسلات ترميز البروتين. عند اقترانه بتحرير الجينوم المعتمد على CRISPR، من المتوقع أن يسرع البروتوكول في تحليل آليات المرض وتحديد عوامل الضراوة الرئيسية في هذه الممرضات المدمرة. ستتمكن هذه الرؤى الناتجة، بدورها، من تطوير استراتيجيات جديدة قائمة على آليات مكافحة الأمراض.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون عدم وجود تضارب مصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تحظى الدراسة بدعم من المؤسسة الوطنية للعلوم (جائزة NSF رقم 2418799) والمعهد الوطني للأغذية والزراعة (جائزة NIFA رقم 2023-67013-42262).

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
أنابيب الطرد المركزي الدقيق بسعة 1.5 ملVWR525-1126
4'-هيدروكسي-3',5' ثنائي ميثوكسايسيتوفينونTCID2666الأسيتوسرينجون (AS)
أنبوب 50 ملغرينر بيو-ون227261
الإيثانول المطلقكواشف فيشر الحيويةBP28184
أغاركواشف فيشر الحيويةBP1423-500
رقائق الألمنيوم
غشاء الهيبوند-N+ (30 سم × 3 م)سيتيفاRPN303B
كربونات الكالسيومسيغما-ألدرتش239216-500GCaCO3
سيفوتاكسيم صوديوم الملحالكيمياويات العلمية الحراريةAAJ6269006
D-(+)-جلوكوزسيغما-ألدرتشG8270-1KG
مجموعة DNeasy PowerLyzer الميكروبيةتشياغن12255-50
الملقط
مجهر الفلورةزايسمجهر فلوري ZEISS Axioscope 5 مع مجموعة مرشح 38 HE
كبريتات G418الكيمياويات العلمية الحراريةAC329400010
الجلسرولسيغما-ألدرتش911046-1L
مقياس الخلايا الدموية (خط سطوع)هاوسر العلمي
كبريتات الكاناميسينسانتا كروز للتكنولوجيا الحيويةSC-257635
إل-أسبارجين لامائيMP BiomedicalsICN10079425
إل بي بروث، ميلركواشف فيشر الحيويةBP1426-2
كبريتات المغنيسيوم هيبتاهيدراتسيغما-ألدرتش63138-250GMgSO4· 7H2O
ميس هيدريتسيغما-ألدرتشM2933-100G
موراشيغي وسكوغ المتوسط القاعديسيغما-ألدرتشM5519-50L
بيتري ديش (100 مم × 15 مم)VWR25384-342
فوسفات البوتاسيوم ثنائي الهيدروجينسيغما-ألدرتش1370391000KH2PO4
ريفامبيسينسانتا كروز للتكنولوجيا الحيويةSC-200910
تاك 2X ماستر ميكسNEBM0270L
هيدروكلوريد الثيامينسيغما-ألدرتشT4625-5G
مطياف الفوتومتري البصري فوق بنفسجيفيشر ساينتيفك14-385-355
V8 أصلي 100٪ عصير خضرواتشركة كامبل للحساء
فورتكسرفيشر ساينتيفك14-955-163
الماءدرجة علم الأحياء الجزيئي، منقاة باستخدام نظام تنقية المياه Mill-Q
مستخلص الخميرةأكروس611805000متوفر حاليا من خلال شركة ثيرمو ساينتيفيك كيميكلز
β-سيتوستيرولسيغما-ألدرتش85451-100G

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kamoun, S., et al. The top 10 oomycete pathogens in molecular plant pathology. Mol Plant Pathol. 16 (4), 413-434 (2015).
  2. Jones, J. D., Staskawicz, B. J., Dangl, J. L. The plant immune system: From discovery to deployment. Cell. 187 (9), 2095-2116 (2024).
  3. Tocafundo, F., et al. Direct and cross-pathogenicity of Phytophthora palmivora against cacao, papaya, and peach palm. Trop Plant Pathol. 46 (6), 664-673 (2021).
  4. Morales-Cruz, A., et al. Independent whole-genome duplications define the architecture of the genomes of the devastating West African cacao black pod pathogen Phytophthora megakarya and its close relative Phytophthora palmivora. G3 (Bethesda). 10 (7), 2241-2255 (2020).
  5. Ali, S., et al. PCR-based identification of cacao black pod causal agents and identification of biological factors possibly contributing to Phytophthora megakarya's field dominance in West Africa. Plant Pathol. 65 (7), 1095-1108 (2016).
  6. Marelli, J. -P., et al. Chocolate under threat from old and new cacao diseases. Phytopathology. 109 (8), 1331-1343 (2019).
  7. Cvitanich, C., Judelson, H. S. Stable transformation of the oomycete, Phytophthora infestans, using microprojectile bombardment. Curr Genet. 42 (4), 228-235 (2003).
  8. Judelson, H. S., Tyler, B. M., Michelmore, R. W. Transformation of the oomycete pathogen, Phytophthora infestans. Mol Plant Microbe Interact. 4 (6), 602-607 (1991).
  9. Wang, W., et al. an oxathiapiprolin-resistance gene, functions as a novel selection marker for Phytophthora transformation and CRISPR/Cas9 mediated genome editing. Front Microbiol. 10, 2402(2019).
  10. Dai, T., et al. An improved transformation system for Phytophthora cinnamomi using green fluorescent protein. Front Microbiol. 12, 682754(2021).
  11. Fang, Y., Cui, L., Gu, B., Arredondo, F., Tyler, B. M. Efficient genome editing in the oomycete Phytophthora sojae using CRISPR/Cas9. Curr Protoc Microbiol. 44 (1), 21A.1.1-21A.1.26 (2017).
  12. Evangelisti, E., Yunusov, T., Shenhav, L., Schornack, S. N-acetyltransferase AAC (3)-i confers gentamicin resistance to Phytophthora palmivora and Phytophthora infestans. BMC Microbiol. 19 (1), 265(2019).
  13. Dong, L., et al. Establishment of the straightforward electro-transformation system for Phytophthora infestans and its comparison with the improved PEG/CaCl2 transformation. J Microbiol Methods. 112, 83-86 (2015).
  14. Huitema, E., Smoker, M., Kamoun, S. A straightforward protocol for electro-transformation of Phytophthora capsici zoospores. Methods Mol Biol. 712, 129-135 (2011).
  15. Vijn, I., Govers, F. Agrobacterium tumefaciens mediated transformation of the oomycete plant pathogen Phytophthora infestans. Mol Plant Pathol. 4 (6), 459-467 (2003).
  16. Wu, D., Navet, N., Liu, Y., Uchida, J., Tian, M. Establishment of a simple and efficient Agrobacterium-mediated transformation system for Phytophthora palmivora. BMC Microbiol. 16 (1), 204(2016).
  17. Gumtow, R., Wu, D., Uchida, J., Tian, M. A Phytophthora palmivora extracellular cystatin-like protease inhibitor targets papain to contribute to virulence on papaya. Mol Plant Microbe Interact. 31 (3), 363-373 (2018).
  18. Pettongkhao, S., Navet, N., Schornack, S., Tian, M., Churngchow, N. A secreted protein of 15 kDa plays an important role in Phytophthora palmivora development and pathogenicity. Sci Rep. 10 (1), 2319(2020).
  19. Minz, A., Sharon, A. Electroporation and Agrobacterium-mediated spore transformation. Molecular and Cell Biology Methods for Fungi. Sharon, A. , Humana Press. Totowa, NJ. 21-32 (2010).
  20. Bellemain, E., et al. ITS as an environmental DNA barcode for fungi: An in silico approach reveals potential PCR biases. BMC Microbiol. 10 (1), 189(2010).
  21. Wang, L., et al. A modified Agrobacterium-mediated transformation for two oomycete pathogens. PLoS Pathog. 19 (4), e1011346(2023).
  22. Wu, E., et al. Optimized Agrobacterium-mediated sorghum transformation protocol and molecular data of transgenic sorghum plants. In Vitro Cell Dev Biol Plant. 50 (1), 9-18 (2014).
  23. Sun, L., et al. TDNAscan: A software to identify complete and truncated T-DNA insertions. Front Genet. 10, 685(2019).
  24. Navet, N., Tian, M. Agrobacterium-mediated transformation of sweet basil (Ocimum basilicum). Bio Protoc. 10 (22), e3828-e3828 (2020).
  25. Hasley, J., Dinulong, R. -J., Adhikari, A., Christopher, D., Tian, M. Genome editing of papaya using both Cas9 and Cas12a. bioRxiv. , (2025).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Agrobacterium TransformationPhytophthora PalmivoraZoospore Co IncubationGFP ExpressionGene Function AnalysisFluorescence MicroscopyOomycete TransformationMurashige Skoog MediumG418 SelectionProtein Localization

مقالات ذات صلة