يهدف البروتوكول المعروض إلى تطوير نموذج خلوي يحاكي السمنة البشرية. لتحقيق ذلك، يتم تمايز الخلايا الجذعية المشتقة من الدهون البشرية إلى خلايا دهنية، ثم يتم تسمينها باستخدام خليط من الأحماض الدهنية المختارة.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تمايز وتحفيز تراكم قطرات الدهون في الخلايا الدهنية البشرية كنموذج لدراسة السمنة في المختبر
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
تغير التغيرات المرتبطة بالسمنة في نسيج الدهون ملفات الإفرازات المحلية وتؤثر على التفاعلات مع الخلايا المحيطة الأخرى، بما في ذلك الخلايا السرطانية. الاستمرار في توصيل المغذيات يغير عملية الأيض لخلايا الدهون، مما يجعلها تعمل كخزان للدهون. عادة ما تعتمد الأبحاث حول آليات السمنة على نماذج حيوانية، لكنها لا تسمح بتحليل العمليات الأيضية على المستوى الخلوي. لذا، هناك حاجة لتطوير نموذج موثوق في المختبر للسمنة البشرية يمكنه المساعدة في استكشاف التغيرات في وظيفة الخلايا الدهنية السمينة مقارنة بنظيراتها النحيلة. يقدم هذا العمل بروتوكولا لتمييز الخلايا الدهنية البشرية عن الخلايا الجذعية المشتقة من الدهون، باستخدام مزيج من الأنسولين، إيزوبيوتيل-1-ميثيلزانثين، ديكساميثازون، والإندوميثاسين. لاحقا، تم حضانة الخلايا الدهنية المتمايزة مع مجموعة من الأحماض الدهنية، بما في ذلك اللينوليت، والبالميتات، والأوليات، لتعزيز تراكم الدهون. ونتيجة لذلك، تم إنشاء نموذج قيم يحاكي الخلايا الضخمة في ظروف السمنة، ويمكن استخدامه في دراسات إضافية.
المقدمة
يعتقد أن السمنة عامل خطر رئيسي لمجموعة واسعة من الأمراض، مثل اضطرابات الجهاز العضلي الهيكلي، أمراض القلب والأوعية الدموية، مقاومة الأنسولين، متلازمة الأيض، السكري، وأنواع مختارة من السرطان1. السمنة هي واحدة من أكثر مشاكل الصحة العامة وضوحا وأقل تقديرا، ولها أسباب متعددة العناصر. باختصار، السمنة تثار بسبب اختلال في التوازن بين السعرات الحرارية المستهلكة والمستهلكة، مما يؤدي إلى زيادة تخزين الدهون2. يؤدي فائض السعرات الحرارية إلى توسع مرضي وخلل في نسيج الدهون (AT)، وهو العنصر الأساسي في تحكم الجسم في توازن الطاقة.
الخلايا الدهنية هي المكون الخلوي الرئيسي في AT
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
استخدم تقنيات التعقيم لأداء جميع خطوات البروتوكول في غطاء زراعة خلايا التدفق الطبقي. راجع جدول المواد لمزيد من التفاصيل حول جميع المواد والمعدات. بروتوكول التمايز الموضح أدناه مناسب للخلايا الجذعية المشتقة من الدهون البشرية وقد يختلف بين أنواع الخلايا الأخرى وأصلها. المواد المستخدمة والمواد المستخدمة مدرجة في جدول المواد.
1. إعداد ADSCs للتميز
- تحضير وسط نمو ADSCs (ADSCs GM): مكمل وسط النسر المعدل من Dulbecco يحتوي على 1 جم/لتر جلوكوز مع 10٪ مصل أبقار جنيني (FBS)، 2 ملليمول جلوتامين ومضادات حيوية - محلول مضاد للفطريات (100 U/mL بنسلين، 100 ميكروغرام/ملتر ستربتومي....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
تسمح الطريقة الموضحة هنا بتمييز الخلايا الدهنية البشرية إلى خلايا دهنية ناضجة، تليها زيادة تراكم الدهون، مما يحاكي الخلايا الضخمة التي لوحظت في ظروف السمنة. المسار الزمني لتمييز ADSCs البشري موضح في الشكل 1. في اليوم 0، عندما تصل الخلايا إلى 100٪ من التقاء (الشكل 1A)، تظهر ADSCs شكلا ممدودا يشبه المغازل. في هذه المرحلة، يمكن تطبيق بروتوكول التمايز باستخدام محفزات تحتوي على DM أديبوجين. بعد 24 ساعة، تخضع الخلايا لتغيرات شكلية، وي.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
البروتوكول الحالي هو إجراء مكون من خطوتين قابل للتكرار لتمييز ADSCs، يليه الحضانة مع FAs لتحقيق نموذج خلوي يحاكي السمنة. الخطوة الحاسمة التي تحدد فعاليته هي عدد مرات ممرات ADSCs بعد عزلها. تؤدي الممرات المتعددة إلى انخفاض قدرة التمايز لهذه الخلايا10.
خلال تمايز الخلايا الدهنية، تنتقل الخلايا الدهنية من الخلايا المنقسمة إلى الخلايا الدهنية التي توقف النمو. توقف النمو في الخلايا قبل الدهنية هو خطوة أساسية لتحفيز التمايز1.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
يعلن المؤلفون أنه لا توجد لديهم مصالح مالية متنافسة معروفة أو علاقات شخصية قد تكون أثرت على العمل المبلغ عنه في هذه الورقة.
شكر وتقدير
تم تمويل المقال من قبل المركز الوطني للعلوم في بولندا، مع منح تلقتها دوروتا نوفاك (OPUS 22، رقم 2021/43/B/NZ3/01458) وألكسندرا سيميشييف (SONATA, 2020/39/D/NZ5/02330).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 3-إيزوبيوتيل-1-ميثيلزانثين (IBMX) | ميرك | I5879 | |
| 0.25٪ تريبسين/0.05٪ EDTA pH 7.2 | IITD PAN, Wroc آه، بولندا | 20-500 | |
| صفيحة ذات 96 بئر | الترمو | 130188 | |
| مضادات حيوية - محلول مضاد للفطريات | سيغما-ألدرتش | A5955 | |
| مصل البقر الألبومين (BSA) | سيغما-ألدرتش | A3294 | |
| عداد الخلايا | لا يوجد | لا يوجد | |
| الطرد المركزي | لا يوجد | لا يوجد | |
| ديكساميثازون | سيغما-ألدرتش | D4902 | |
| دولبيكو الوسيط المعدل (DMEM) | IITD PAN, Wrocآه، بولندا | 10-500 | يحتوي على 1 جم/لتر جلوكوز |
| خليط النسر المعدل من دولبيكو F12 | جيبكو | 11320-033 | |
| الإيثانول | تشيمبور | 113964200#1L | |
| مصل البقر الجنيني (FBS) | جيبكو | A5256701 | |
| الخلايا الجذعية المشتقة من الدهون البشرية hADSC | لونزا | PT-5006 | |
| الحاضنة | لا يوجد | لا يوجد | |
| إندوميثاسين | سيغما-ألدرتش | I8280-5G | |
| الأنسولين | سيغما-ألدرتش | I9278 | |
| المجهر المقلوب | لا يوجد | لا يوجد | |
| إل-جلوتامين | سيغما-ألدرتش | 25030-024 | |
| حمض اللينوليك ملح الصوديوم | سيغما-ألدرتش | L8134 | |
| فلورسنت ليبيد سبوت | البيوتيوم | 70065 | |
| محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) | الترمو | 10010023 | |
| سوديم أوليات | سيغما-ألدرتش | O7501 | |
| سوديم بالميتاتي | سيغما-ألدرتش | P9767 | |
| قارورة زراعة الخلايا T75 | الترمو | 130190 | |
| تريبان بلو | سيغما-ألدرتش | 95896HJ |
المراجع
- Lin, X., Li, H. Obesity: Epidemiology, pathophysiology, and therapeutics. Front Endocrinol. 12, 706978(2021).
- Wen, X., et al. Signaling pathways in obesity: Mechanisms and therapeutic interventions. Signal Transduct Target Ther. 7
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.