يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة بحثية

يقوم RNA الدائري ZBTB46 بتخفيف الاستماتة المبرمجة والإجهاد التأكسدي في خلايا بطانة الإنسان المصابة بالبوليسكاريد من خلال تعديل إشارات ERBB2-AKT

247 مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/69765

⸱

فبراير 13, 2026

1Department of Emergency, Fuzhou University Affiliated Provincial Hospital, Fujian Provincial Hospital, 2Fujian Provincial Key Laboratory of Emergency Medicine

في هذه المقالة

ملخص

يرتبط الإصابات الحادة المرتبطة بالإنتان (SA-AKI) بمعدلات وفيات كبيرة. تجد هذه الدراسة أن حالة circZBTB46 منخفضة التنظيم في HUVECs المستحثة بواسطة LPS (SA-AKI in vitro). يزيد التعبير المفرط من فعالية HUVEC، ويقلل من الاستماتة المبرمجة والالتهاب والإجهاد التأكسدي بالارتباط بإشارات ERBB2/AKT، مما يشير إلى هدف علاجي محتمل مرتبط ب SA-AKI.

الملخص

تعد الحمض النووي الريبي الدائري منظمات ناشئة لاستجابات الإجهاد، ومع ذلك لا تزال أدوارها في إصابة البطانة التي تؤدي إلى إصابات الكلى الحادة المرتبطة بالإنتان غير محددة بشكل كامل. افترضنا أن الحمض النووي الريبي الدائري ZBTB46 (circZBTB46) يمنح حماية بطانية من خلال تفعيل إشارات ERBB2-AKT. باستخدام نموذج قائم على الخلايا حيث تم تحدي خلايا بطانة الأوردة السرية البشرية باستخدام الدهون البوليسكاريدية، قمنا بقياس تعبير circZBTB46 واختبرنا تأثيرات تعبيره القسري على البقاء، والموت المبرمج، والوسطاء الالتهابي، وتوازن الأكسدة والاختزال. قامت اختبارات بقاء الخلايا وقياس تدفق الخلايا بتقييم البقاء والخلايا المبرمجة. تم قياس اختبارات التوربنت المناعية المرتبطة بالإنزيمات الإنترلوكين-6، عامل نخر الورم-α، والإنترلوكين-1β، بينما تم تقييم أنواع الأكسجين التفاعلية، والمالونديالديهايد، وإنزيم الأكسجين الفائق، والكاتالازات كمؤشرات للإصابة التأكسدية والقدرة المضادة للأكسدة. لتحديد الآلية، أجرينا تحليل النسخات النصية باستخدام تحليل إثراء مجموعات الجينات، وأكدنا وجود بروتينات مسار باستخدام Western blotting، وقمنا بتقييم الضرورة باستخدام مثبط ERBB2 AG-825. ثبط بولي السكاريد الدهني حوالي ZBTB46. زاد تعبير CircZBTB46 من قابلية البقاء، وخفض الاستماتة المبرمجة، وقلل السيتوكينات المضادة للالتهابات وأنواع الأكسجين التفاعلية، وقلل من المالونديالديهايد، ورفع من نشاط ديسموتاز وكاتالاز الفائق أكسيد الكربون. دعمت تحليلات النسخ والبروتين تنشيط محور ERBB2-AKT، كما أن الحصار الدوائي ل ERBB2 خفف من الحماية الخلوية وعكس مكاسب توازن الأكسدة والاختزال. تحدد هذه النتائج circZBTB46 كفرامل داخلية لتلف البطانة الناجم عن الدهون البولي سكاريد من خلال إشارات ERBB2-AKT وتشير إلى circZBTB46 كعقدة ميكانيكية وهدف علاجي محتمل لإصابة الكلى الحادة المرتبطة بالإنتان.

المقدمة

الإنتان، وهو سلسلة التهابية جهازية تهدد الحياة تبدأ بغزو مرضي، غالبا ما تصل إلى فشل متعدد الأعضاء1. في هذا السياق الحرج، يظهر SA-AKI كمضاعفة رئيسية وذات أهمية سريرية في وحدات العنايةالمركزة 2. تتميز هذه الحالة بتدهور مفاجئ في قدرة ترشيح الكلى بالتزامن مع العدوى الجهازية، وتظهر معدلات وفيات تتجاوز معدلات AKI غير التعفن بمقدار 38٪-42٪ في المجموعات السريرية2. حوالي 60٪ من الأشخاص الذين تم تشخيصهم بتعفن الدم أو الصدمة الإنتانية متوقع إصابتهم بمرض SA-AKI3. لذلك، أصبح SA-AKI تحديا كبيرا في العناية المركزة، حيث ساهم بشكل كبير في معدلات المراضة والوفيات4. في الوقت الحالي، لا تزال آلية SA-AKI غير مفهومة بشكل كامل. على الرغم من أن الدراسات ما قبل السريرية شملت خلل الدورة الدموية الدقيقة، وتغيرات في الأيض الخلوي، واختلالات في نظام رينين-أنجيوتنسين-ألدوستيرون (RAAS)، وخلل وظائف الميتوكوندريا، واضطراب الالتهاب، إلا أن الآلية الفسيولوجية المرضية ل SA-AKI لا تزال بعيدة المنال، وهناك حاليا نقص في التدابير المثلى لدعم التشخيص المبكر والإدارة المستمرة 5,6,7,8 . يتميز SA-AKI بارتفاع ارتفاع في الموت المبرمج، والإجهاد التأكسدي المفرط، والالتهاب9. ضمن هذا الإطار البحثي، تم استخدام عدادة السكريات الدهنية (LPS) في نظام مختبر لمحاكاة مظاهر AKI المرتبطة بالإنتان في خلايا بطانة الأوردة السرية البشرية (HUVECs) لاستكشاف الهدف الأولي5.

في السنوات الأخيرة، حظيت الحمض النووي الريبي الدائري (circRNAs)، وهي فئة تم تحديدها حديثا من جزيئات الحمض النووي الريبي غير المشفرة، باهتمام متزايد لدورها في أمراض مختلفة10. تمتلك ال circRNA بنية دائرية مستقرة وتشارك في العمليات الفسيولوجية والمرضية الخلوية من خلال العمل كإسفنجة جزيئية للميكروRNA (miRNAs)، أو تنظيم نسخ الجينات، أو المشاركة في تفاعلات البروتين11. أشارت الدراسات إلى أن الحمض النووي الريبي السيركي يشارك بشكل حاسم في تعديل الالتهاب، والإجهاد التأكسدي، ومسارات الاستماتة، مما يخلق تركيزا أكبر على الأبحاث حول آثارها المحتملة في الإنتان والحالات ذات الصلة، بما في ذلك إصابات الكلى الحادة12. على سبيل المثال، تم تحديد hsa_circ_0072463 كمؤشر تشخيصي وواعدة وهدف علاجي ل SA-AKI13. تم الإبلاغ عن Circ_001653 لتخفيف SA-AKI من خلال تجنيدBUD13 14. ومع ذلك، لا تزال الأهمية الوظيفية ل circRNA في SA-AKI غير مستكشفة إلى حد كبير.

تم تصميم هذه الدراسة لفحص تأثير circZBTB46 على وظيفة الخلايا البطانية، والإجهاد التأكسدي، والاستجابات الالتهابية باستخدام نظام SA-AKI في المختبر . من خلال بناء نموذج HUVEC الناتج عن LPS، درسنا إصابة البطانة تحت تحفيز السموم الداخلية. يجدر بالذكر أن HUVECs التي تواجه مشاكل LPS تمثل نموذج إجهاد بطاني السحابي المدفوع بالسموم الداخلية أو TLR4 ذو صلة بالفيزيولوجيا المرضية متعددة العوامل لإصابة الكلى الحادة المرتبطة بالإنتان النفسي، ولكن ليس مكافئا. يلتقط هذا النموذج بشكل أساسي تنشيط الالتهاب الذي يعبر عنه TLR4، والإجهاد التأكسدي، والاستجابات البطانية المرتبطة بالموت المبرمج، مع استبعاد المكونات الرئيسية في الجسم الحي مثل التغيرات الديناميكية الدموية، وسلاسل التكميم والتخثر، والأنماط الجزيئية المرتبطة بالضرر، والمحفزات الميكروبية غير المتجانسة. ضمن هذا الإطار التجريبي، بحثنا فيما إذا كان circZBTB46 يخفف من الإجهاد التأكسدي الناتج عن LPS والموت المبرمج من خلال تعديل مسار إشارة ERBB2، وبالتالي حماية وظيفة خلايا البطانة. حسب معرفتنا، توفر هذه الدراسة أول دليل يربط circZBTB46 باستجابات الإجهاد البطاني في سياق إصابة الكلى الحادة المرتبطة بالإنتان. من خلال توضيح الآليات الجزيئية الكامنة وراء حماية البطانة التي تعبر عن circZBTB46، قد يعمق هذا البحث فهم آليات SA-AKI الممرضة ويمهد الطريق لأساليب علاجية مبتكرة تركز على circRNA.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

يصف هذا البروتوكول الإجراءات التجريبية المستخدمة لدراسة تأثيرات تعديل circZBTB46 على الإشارات الالتهابية، والإجهاد التأكسدي، وتنشيط مسار ERBB2-AKT في HUVECs.

زراعة الخلايا
تم الحصول على خلايا HUVECs المستخدمة في هذه الدراسة من مصدر تجاري. تم استخدام HUVECs كنموذج تمثيلي لخلايا البطانة بسبب توفرها الواسع، وظروف الزراعة القابلة للتكرار، وكفاءة النقل العالي التي تسهل التلاعب الجيني والتحقيق الميكانيكي في مسارات الإشارات البطانية تحت ضغط الالتهاب 15,16. تم زراعة HUVECs في DMEM مع إضافة 10٪ (v/v) مصل البقر الجيني ومزيج مضاد حيوي-مضاد للفطريات بتركيز 1٪. تم الحفاظ على جميع الزراعة الخلوية تحت ظروف فسيولوجية قياسية في غرفة رطبة (37 درجة مئوية، 5٪ ثاني أكسيد الكربون2)، مما عزز التكاثر الخلوي المستمر مع الحفاظ على قابلية >95٪ كما أكد اختبار الاستبعاد الأزرق التريباني. على الرغم من أن الأوساط الخاصة بالبطانة (مثل EGM-2 أو M199 المكملة بمكملات نمو البطانة) غالبا ما يوصى بها للحفاظ على HUVEC على المدى الطويل، إلا أن DMEM استخدم في هذه الدراسة لضمان الاتساق عبر العلاجات التجريبية والتوافق مع تحفيز LPS واختبارات مثبطات الدواء. لاختبارات مثبطات AG-825، قم بحضن HUVECs ب DMEM طازج يحتوي على 10 ميكرومولار AG-825 لمدة ساعة واحدة. ثم أضف محلول LPS إلى الآبار لتحقيق تركيز نهائي يبلغ 10 ميكروغرام/مل، واستمر في الزراعة لمدة 24 ساعة. لتقليل الانجراف الظاهري المحتمل، استخدمت HUVECs عند أعداد مرور منخفضة وتعرضت لظروف تجريبية قائمة على DMEM فقط للاختبارات قصيرة الأمد. أجريت جميع التجارب الوظيفية ضمن فترات علاج محددة وليس خلال فترة زراعة طويلة.

النقل الخلوي
لتوضيح الدور البيولوجي ل circZBTB46، تم تخليق والتحقق من البلازميدات ذات التعبير الزائد (oe-circZBTB46) والبنى الضابطة السلبية المتطابقة (oe-NC) بواسطة GenScript. تم زرع HUVECs في صفائح ذات 6 آبار بكثافة 1 × 10⁵ خلايا لكل بئر وزرعت طوال الليل للوصول إلى ~70٪-80٪ التقاء عند النقل. لكل بئر، تم تخفيف حمض نووي بلازميدي بوزن 2.5 ميكروغرام (oe-circZBTB46 أو oe-NC) في 125 ميكرولتر من وسط مصل مختزل وخلط مع 2.5 ميكرولتر من مادة P3000 (أنبوب A). بالتوازي، تم تخفيف 3.75 ميكرولتر من ليبوفكتامين 3000 في 125 ميكرولتر من وسط مصل مختزل (أنبوب B). ثم تم دمج الأنبوب A وأنبوب B وخلطهما برفق وحضانهما في درجة حرارة الغرفة لمدة 15-20 دقيقة للسماح بتكوين المركب (الحجم المركب النهائي: 250 ميكرولتر/بئر). تمت إضافة المجمعات بشكل قطري إلى الخلايا في وسط كامل خال من المضادات الحيوية. بعد 6 ساعات من الحضانة عند 37 درجة مئوية، 5٪ ثاني أكسيد الكربون، تم استبدال وسط النقل بوسط نمو جديد كامل. تم زراعة الخلايا لمدة 48 ساعة قبل إجراء الفحوصات اللاحقة. جميع الإجراءات اتبعت تعليمات الشركة المصنعة.

النموذج المستحث بواسطة LPS
لتوليد نموذج SA-AKI في المختبر، تم زرع HUVECs (5 ×10 5 خلايا/بئر) التي تم نقلها بواسطة oe-circZBTB46 أو NC في صفائح بئر 96 وحافظت عليها لمدة 24 ساعة حتى يتم تحقيق التقاء بنسبة 80٪. بعد ذلك، خضعت هذه الخلايا لعلاج ب LPS عند 10 ميكروغرام/مل لمدة 24 ساعة. كانت HUVECs بدون معالجة LPS هي المجموعة الضابطة.

qRT-PCR
استخرج الحمض النووي الريبي الكلي من HUVECs باستخدام كاشف تجاري. تم إجراء النسخ العكسي لتخليق cDNA باستخدام مجموعة الكواشف التجارية. تم تنفيذ PCR الكمي (qPCR) في ثلاث نسخ باستخدام نظام PCR في الوقت الحقيقي إلى جانب مزيج رئيسي. تم معايرة كميات التعبير للجينات المستهدفة مقابل U6، مع إجراء تحليل باستخدام طريقة 2−ΔΔCT رقم 17,18. لتحليل تعبير circRNA، استخدم RNA النووي الصغير U6 كمرجع داخلي للتطبيع، حيث يستخدم عادة لقياس الحمض النووي الريبي الصغير غير المشفر وقد أبلغ عن أنه يظهر تعبيرا مستقرا نسبيا عبر ظروف التجارب قصيرة الأمد في المختبر. يتم سرد تسلسلات البادئية المستخدمة في هذه الدراسة كما يلي:

circZBTB46-Forward: 5'-CGGCGCTCATGAGTAAGAAC-3'

circZBTB46-الخلف: 5'-CGCCTCTTCTACAGACTGGG-3'

U6-مهاجم: 5'-TGCTATCACTTCAGCAGCAGCA-3'

U6-الخلف: 5'-GAGGTCATGCTAATCTTCTG-3'.

اختبار CCK-8
تم تقييم فعالية HUVEC باستخدام CCK-8 تم شراؤه تجاريا. باختصار، تم زرع الخلايا في صفيحة مكونة من 96 بئرا، وخضعت الخلايا لزراعة الالتصاق لمدة 24 ساعة. بعد ذلك، أضيف 10 ميكرولتر من محلول CCK-8 إلى كل بئر، وتم حضن الخلايا بدرجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة ساعتين. تم استخدام قارئ ميكرولفيد لقياس الكثافة البصرية (OD) عند طول موجي قدره 450 نانومتر. أظهرت الملاحظات الأولية أن 10 ميكروغرام/مل من LPS قلل بشكل كبير من صلاحية HUVECs، مما أدى إلى اختيار هذا التركيز للعمليات التجريبية اللاحقة.

قياس التدفق الخلوي
في البداية، تم فصل HUVECs بتريبسين خال من EDTA وفقا للإجراءات القياسية. وفقا لإرشادات الشركة المصنعة لمجموعة اختبار الاستماتة Annexin V-APC/PI، تم طرد مركزها على مواد الخلايا بحرارة 1000 x g لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية، بعد التفكك الإنزيمي. ثم تم غسل الخلايا المغطاة بالحبيبات مرتين باستخدام PBS البارد جدا تحت ظروف مماثلة وأعيد تعليقها في 100 ميكرولتر من محلول الارتباط 1x. تمت معالجة كل عينة بمحلول 5 ميكرولتر من محلول التلوين Annexin V-FITC المترافق، و5 ميكرولتر من محلول تلوين يوديد البروبيديوم (PI)، تلاها حضانة لمدة 10 دقائق في الظلام عند درجة حرارة الغرفة (20-25 درجة مئوية). وأخيرا، أضيف 400 ميكرولتر من حاجز الارتباط 1x إلى جميع العينات، وتم تحليل الاستماتة المبرمجة خلال ساعة واحدة باستخدام مقياس تدفق خلوي. تم تحديد الفعاليات أولا من قبل FSC/SSC لاستبعاد الحطام. لتحليل الاستماتة، تم تطبيق بوابات الربع على مخطط Annexin V-FITC مقابل PI باستخدام ضوابط مناسبة (غير مصبوغ وضارب ملونة/تعويضية) لتعريف مجموعات الحياة (Annexin V-/PI-)، والاستماتة المبكرة (Annexin V+/PI-)، والاستماتة المتأخرة (Annexin V+/PI+)، والنخرية (Annexin V-/PI+). تم تطبيق نفس قالب البوابات والعتبات على جميع العينات.

اختبار ELISA
تم قياس تركيزات العوامل الالتهابية - عامل نخر الورم - α (TNF-α)، الإنترلوكين-6 (IL-6)، والإنترلوكين-1β (IL-1β) - في المادة الفائقة لمركبات HUVEC المزروعة باستخدام مجموعات ELISA المتوفرة تجاريا. على وجه التحديد، تم استخدام مجموعة ELISA البشرية TNF-α، ومجموعة ELISA البشرية IL-6، ومجموعة ELISA البشرية IL-1β وفقا لتعليمات الشركات المصنعة. لكل اختبار، تم تحميل 50 ميكرولتر من مادة الزراعة الخلوية غير المخففة في كل بئر. تم توليد منحنيات قياسية باستخدام التخفيفات التسلسلية المقدمة (TNF-α: 0-1000 pg/mL؛ IL-6: 0-500 pg/m; IL-1β: 0-200 pg/mL). بعد العينات والإضافة القياسية، تم حضن الألواح عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة، تلتها خمس غسلات باستخدام مخزن الغسيل. ثم أضيف الجسم المضاد للكشف المقترن بالبيوتين وحضانه عند 37 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة. بعد خطوة غسل أخرى، أضيف ستريبتافيدين-HRP وحضن عند حرارة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. بعد الغسل النهائي، أضيفت ركيزة 3,3',5,5'-تترا ميثيل بينزيدين (TMB) وحضنتها عند حرارة 37 درجة مئوية في الظلام لمدة 15 دقيقة. تم إنهاء التفاعل بمحلول التوقف، وتم قياس الامتصاص فورا عند 450 نانومتر مع طول موجي مرجعي 630 نانومتر. تم اختبار كل عينة ومعيار في نسخة، وشملت جميع التجارب ثلاث نسخ بيولوجية مستقلة. تم تقييم مستويات مؤشرات الإجهاد التأكسدي - مالونديالديهيد (MDA)، وإنزيم الأكسجين الفائق (SOD)، والكاتالاز (CAT) - في المادة الفائقة باستخدام مجموعة MDA ELISA ومجموعة ELISA من نوع SOD ومجموعة CAT ELISA على التوالي، وفقا للبروتوكولات المقدمة19، 20، 21. في اختبارات MDA وSOD، تم استخدام 40 ميكرولتر من المادة الفائقة لكل بئر دون تخفيف؛ بالنسبة ل CAT، تم تخفيف العينات بنسبة 1:10 باستخدام مخزن الاختبار قبل التحميل. تم إعداد منحنيات قياسية وفقا لمواصفات المجموعة (MDA: 0-60 nmol/m؛ القطر: 0-100 وحدة وحدة لكل مل؛ CAT: 0-100 U/mL). تم تنفيذ خطوات الحضانة كما يلي: MDA - 60 دقيقة عند 37 درجة مئوية؛ SOD - 60 دقيقة عند 37 درجة مئوية؛ القطط - 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. تم غسل الألواح 4 مرات بين خطوات الحضانة الرئيسية. تم تحقيق تطور اللون بإضافة الركائز المعنية والاحتضان عند 37 درجة مئوية (MDA: 15 دقيقة؛ SOD: 20 دقيقة؛ القط: 15 دقيقة). تمت قراءة الامتصاص عند 450 نانومتر ل SOD وCAT، و532 نانومتر ل MDA. تم إجراء جميع القياسات في آبار مكررة وتكررت عبر ثلاث نسخ بيولوجية مستقلة.

تسلسل الحمض النووي الريبي
تم استخراج إجمالي الحمض النووي الريبي من HUVECs باستخدام كواشف تجارية وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. تم تقييم نقاء وتركيز الحمض النووي الريبي باستخدام مقياس طياف ضوئي بقياس الامتصاص عند 260 نانومتر و280 نانومتر (A260/A280)، وتم تقييم سلامة الحمض النووي الريبي باستخدام محلل حيوي. تم استخدام عينات RNA فقط التي تحمل رقم سلامة RNA (RIN) ≥ 7 في إعداد المكتبة لاحقا. تمت إزالة الحمض النووي الريبوزومي أثناء تحضير المكتبة باستخدام إجراء قياسي لاستنزاف الحمض النووي الريبوزي بواسطة شركة تجارية. عند الضرورة، تم تطبيق معالجة RNase R قبل بناء المكتبة لهضم RNA الخطي بشكل انتقائي وإثراء أنواع RNA دائرية. ثم تم تنفيذ تجزئة الحمض النووي الريبي تحت ظروف حرارة مرتفعة وفقا للبروتوكول القياسي لدليل إعداد مكتبة RNA لتوليد شظايا RNA بحجم مناسب. تم إعداد مكتبات التسلسل باستخدام مجموعة تحضير مكتبة RNA وفقا لتعليمات الشركة المصنعة وتم ترتيبها على منصة Illumina باستخدام استراتيجية تسلسل مزدوج النهايات بطول قراءة 150 bp (PE150). كان عمق التسلسل كافيا لدعم التحليل على مستوى النسخ. تمت معالجة قراءات التسلسل الخام باستخدام إجراءات مراقبة الجودة القياسية لإزالة تسلسلات المحولات والقراءات منخفضة الجودة. تم محاذاة القراءات النظيفة مع الجينوم المرجعي البشري، وتم قياس مستويات تعبير الجينات وفقا لعدد22,23. تم تحديد الجينات المعبر عنها بشكل تفاضلي (DEGs) بين HUVECs المعبر عن circZBTB46 وHUVECs المعالجة بNC تحت تحفيز LPS باستخدام طرق إحصائية معتمدة. تم إجراء تحليل إثراء مجموعات الجينات (GSEA) لتحديد مسارات الإشارات المرتبطة بفرط تعبير circZBTB46. تم تصنيف الجينات بناء على التعبير التفاضلي بين مجموعات التجريب. تم استخدام مجموعات جينية منسقة من قاعدة بيانات التواقيع الجزيئية (MSigDB) لتحليل الإثراء. تم تقييم دلالة الإثراء بناء على درجة الإثراء الطبيعية (NES) ومعدل الاكتشاف الكاذب (FDR)، حيث اعتبر FDR < 0.25 ذات دلالة إحصائية. تم الاستعانة بمصادر خارجية لتسلسل الحمض النووي الريبي الريبي وجميع التحليلات الحيوية المعلوماتية المرتبطة بها.

تحديد مستويات المسح المبكر
لفحص مستويات DEGs، تم مقارنة مستويات التعبير بين مجموعتين مختلفتين عبر حزمة برنامج R الخاصة ب DESeq (2012). تم تعريف عتبات الدلالة الإحصائية ك p < 0.05 مع |log2FC| القيمة تتجاوز 0.58. تم توليد خريطة الحرارة بواسطة حزمة Pheatmap R، واستخدم مخطط البركان حزمة Goplot2 R للرسم.

تحليل الإثراء الوظيفي
تم إجراء تحليلات إثراء GO وKEGG المستمدة من النسخ الخطية باستخدام المنصة الإلكترونية EnrichR، وتم رسم مخطط الفقاعات بناء على حزمة GOplot R. تم استخدام برنامج GSEA، بناء على مصفوفة التعبير وملفات مجموعة الجينات المقدمة من قاعدة بيانات MSigDB، مع تعيين معلمات التحليل (مثل عدد التبديلات والطرق الإحصائية). تم تقييم إثراء مجموعات الجينات باستخدام درجة الإثراء المطبعة (NES)، وقيمة P، وقيمة FDR، مما وفر استكشافا معمقا للوظائف والآليات البيولوجية المحتملة للجينات المعبر عنها بشكل تفاضلي.

البقعة الغربية
تم استخراج البروتين الكلي من HUVECs (حوالي 1 × 10⁶ خلايا) باستخدام محلول تحلل RIPA مع مكمل بمثبطات للبروتياز والفوسفاتاز. تم تحديد تركيز البروتين باستخدام مجموعة قياس كمية بروتين BCA. تم حل كميات متساوية من البروتين (20 ميكروغرام لكل مسار) عن طريق الرحلان الكهربائي على جل كبريتات الصوديوم الدوديسيل والبولي أكريلاميد 10٪ (SDS-PAGE) عند 80 فولت لمدة 30 دقيقة، تلاها 120 فولت لمدة 60 دقيقة. بعد ذلك، تم نقل البروتينات إلى أغشية فلوريد البوليفينيليدين (PVDF) باستخدام نظام نقل رطب عند 100 فولت لمدة 90 دقيقة عند 4 درجات مئوية. تم حجب الأغشية بحليب خالي من الدهون بنسبة 5٪ في محلول ملحي مخزن بتريس-مع 0.1٪ Tween-20 (TBST) لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة، تلاها الحضانة مع تخفيف الأجسام المضادة الأولية في نفس المخزن الحائز (عادة 1:1000 للبروتينات المستهدفة و1:5000 لGAPDH) عند 4 درجات مئوية خلال الليل. الأجسام المضادة الأساسية المستخدمة كانت كما يلي: ERBB2، p-AKT، AKT، وGAPDH. بعد الحضانة، تم غسل الأغشية 3 مرات (10 دقائق لكل غسلة) باستخدام TBST ثم حضنت بأجسام مضادة ثانوية مضادة لبيروكسيداز الفجل الحار (HRP) مضادة للأرانب (1:5000 في حاجز الحاجز) لمدة ساعة في درجة حرارة الغرفة. بعد ثلاث غسلات إضافية من TBST (كل منها 10 دقائق)، تم تصور أشرطة البروتين باستخدام مجموعة الركيزة الغربية للتلألؤ الكيميائي المعزز (ECL) وتم تصويرها باستخدام نظام تصوير. تم قياس شدة النطاق باستخدام البرمجيات.

التحليل الإحصائي
تم إجراء التقييمات الإحصائية باستخدام GraphPad Prism 10. تعرض البيانات كوسائل ± الخطأ القياسي للمتوسطات (SEMs). تم تعريف قيمة p < 0.05 للدلالة على الدلالة الإحصائية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

تحليل qRT-PCR لتعبير circZBTB46 في نموذج SA-AKI في المختبر
أجريت هذه المجموعة من التجارب لاختبار فرضية أن تعبير circZBTB46 يتغير تحت تحفيز LPS وأن تعديل circZBTB46 يؤثر على بقاء الخلايا البطانية واستماتة المبرمج في نموذج SA-AKI في المختبر . في البداية، تم فحص تعبير circZBTB46 تحت ظروف التحكم وفي نظام SA-AKI في المختبر . كما هو موضح

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

خلال الإنتان، تقوم الأنماط الجزيئية المرتبطة بالممرضات (PAMPs)، مثل LPS التي تطلقها الممرضات، بتنشيط مستقبلات شبيهة ب Toll (مثل TLR4)، مما يطلق استجابة التهابية جهازية26. تؤدي هذه العملية إلى إفراز عدة وسطاء التهابيين مثل TNF-α، IL-6، وIL-1β، مما يؤدي إلى عاصفة سيتوكينية27. في الوقت نفسه، يضر LPS مباشرة بخلايا البطانة الوعائية، مما يؤدي إلى اضطرابات في الدورة الدموية الدقيقة، وزيادة نفاذية الأوعية الدموية، والجلطات التي تعيق تدفق الدم الكلو...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يعلن المؤلفون عدم وجود مصالح متنافسة. يعلن المؤلفون أن النتائج الرئيسية المعروضة في هذه المخطوطة لم تنشر سابقا ولا تزال قيد النظر للنشر في مكان آخر.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
AG-825 (مثبط ErbB2)ميدكيم إكسبريسHY-1019710 μ M تعني حصار المسار
المحلل الحيوي Agilent 2100أجيلينتG2939BAسلامة الحمض النووي الريبي (RIN&ge؛ 7)
الأجسام المضادة AKTبروتين تك60203-2-IgWB (1:15000)
مجموعة الاستماتة Annexin V-APC/PIعلم اللابE-CK-A327كشف الاستماتة المبرمجة
مضاد حيوي-مضاد فطرياتجيبكو15240062تركيز 1٪
مجموعة قياس بروتين BCAبيوتايمP0012تركيز البروتين
مجموعة كات إليساميميانMM-0897H2إنزيم مضاد للأكسدة
مجموعة CCK-8دوجيندوCK04اختبار بقاء الخلايا
تسلسل CircRNAشركة فوتشو هوارونغ كيهوي للتكنولوجيا الحيوية المحدودة.PE150تسلسل CircRNA وجميع التحليلات الحيوية المعلوماتية المرتبطة
جهاز قياس تدفق سايتو فليكسبيكمان كولترB53000تحليل الاستماتة المبرمجة
DMEMجيبكو (إنفيتروجين)11965092وسط زراعة الخلايا
مجموعة ركيزة ECLميليبورWBKLS0100اكتشاف البروتينات
الأجسام المضادة ERBB2سينو بيولوجيا100271-T32WB (1:10000)
مصل الأبقار الجنيني (FBS)الصناعات البيولوجية04-001-1ACSمكمل 10٪ (v/v)
الأجسام المضادة GAPDHبروتين تك60004-1-IgWB (1:50000)
HUVECsنظام بروسيلCP-H082مصدر خط الخلية
IL-1 & بيتا؛ مجموعة إليساميميانMM-0181H2عامل الالتهاب
مجموعة IL-6 إليساميميانMM-0049H2عامل الالتهاب
إلومينا نوفاسيك 6000إلومينا20012850تسلسل الحمض النووي الريبي
ليبوفكتامين 3000إنفيتروجينL3000008كاشف النقل
LPS (الإشريكية القولونية O111:B4)سيغما-ألدرتشL263010 μ g/mL لنموذج SA-AKI
مجموعة MDA ELISAميميانMM-2037H2مؤشر الإجهاد التأكسدي
نانو دروب 2000ثيرمو فيشرND-2000قياس كمية الحمض النووي الريبي
مجموعة مكتبة الحمض النووي الريبي NEBNext Ultra IINEBE7770Sتحضير مكتبة RNA-seq
بلازميد oe-circZBTB46GenScriptالتوليف المخصصمتجه تعبير زائد circZBTB46
بلازميد oe-NCGenScriptالتوليف المخصصمتجه التحكم السلبي
p-AKT (Ser473) الأجسام المضادةبروتين تك66444-1-IgWB (1:1200)
مجموعة كاشف RT برايم سكريبتتاكاراRR047Aتخليق cDNA
أغشية PVDFميليبورIPVH00010نقل البقعة الغربية
نظام QuantStudio 5ثيرمو فيشرA28137PCR في الوقت الحقيقي
ريبونوكلياز RلوسيجنRNR07250إزالة rRNA
مخزن تحليل RIPAبيوتايمP0013Bاستخراج البروتين
RNAiso Plusتاكارا9109استخراج الحمض النووي الريبي الكلي
طقم إيليزا من SODميميانMM-25469H2إنزيم مضاد للأكسدة
تي بي جرين بريمكس إكس تاكتاكاراRR420Aكاشف qPCR
TNF-&; مجموعة إليساميميانMM-0122H2عامل الالتهاب

المراجع

  1. Vincent, J. L. Current sepsis therapeutics. EBioMedicine. 86, 104318(2022).
  2. White, K. C., et al. Sepsis-associated acute kidney injury in the intensive care unit: incidence, patient characteristics, timing, trajectory, treatment, and associated outcomes. Intensive Care Med. 49 (9), 1079-1079 (2023).
  3. Poston, J. T., Koyner, J. L. Sepsis-associated acute kidney injury. BMJ. 364, k4891(2019).
  4. Bora, E. S., Arda, D. B., Erbas, O. The renoprotective effect of tibolone in sepsis-induced acute kidney injury. Biomed Pap Med Fac Univ Palacky Olomouc Czech Repub. 168 (4), 311-318 (2024).
  5. van der Slikke, E. C., et al. Sepsis is associated with mitochondrial DNA damage and a reduced mitochondrial mass in the kidney of patients with sepsis-AKI. Crit. Care. 25 (1), 36(2021).
  6. Kuwabara, S., Goggins, E., Okusa, M. D. The pathophysiology of sepsis-associated AKI. Clin J Am Soc Nephrol. 17 (7), 1050-1069 (2022).
  7. Pais, T., Jorge, S., Lopes, J. A. Acute kidney injury in sepsis. Int J Mol Sci. 25 (11), 5924(2024).
  8. Sun, J., et al. Mitochondria in sepsis-induced AKI. J Am Soc Nephrol. 30 (7), 1151-1161 (2019).
  9. Zheng, Q., et al. PRDM16 suppresses ferroptosis to protect against sepsis-associated acute kidney injury by targeting the NRF2/GPX4 axis. Redox Biol. 78, 103417(2024).
  10. Beltrán-García, J., et al. Circular RNAs in sepsis: biogenesis, function, and clinical significance. Cells. 9 (6), 1544(2020).
  11. Xu, X., et al. CircRNA inhibits DNA damage repair by interacting with host gene. Mol Cancer. 19 (1), 128(2020).
  12. Chen, Y., et al. Non-coding RNAs in sepsis-associated acute kidney injury. Front Physiol. 13, 830924(2022).
  13. Peng, X., et al. Discovery and verification of mmu_Circ_26986/hsa_Circ_0072463 as a potential biomarker and intervention target for sepsis-associated acute kidney injury. Cell Mol Life Sci. 81 (1), 154(2024).
  14. Li, X., et al. Circ_001653 alleviates sepsis-associated acute kidney injury by recruiting BUD13 to regulate KEAP1/NRF2/HO-1 signaling pathway. J Inflamm (Lond). 21 (1), 37(2024).
  15. Hunt, M. A., Currie, M. J., Robinson, B. A., Dachs, G. U. Optimizing transfection of primary human umbilical vein endothelial cells using commercially available chemical transfection reagents. J Biomol Tech. 21 (2), 66-72 (2010).
  16. Kocherova, I., et al. Human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) co-culture with osteogenic cells: from molecular communication to engineering prevascularised bone grafts. J Cell Mol Med. 23 (8), 5253-5267 (2019).
  17. Duan, Z. Y., et al. U6 can be used as a housekeeping gene for urinary sediment miRNA studies of IgA nephropathy. Sci Rep. 8 (1), 10875(2018).
  18. Veryaskina, Y. A., Titov, S. E., Zhimulev, I. F. Reference genes for qPCR-based miRNA expression profiling in 14 human tissues. Med Princ Pract. 31 (4), 322-332 (2022).
  19. Demirci-Çekiç, S., et al. Biomarkers of oxidative stress and antioxidant defense. Arch Biochem Biophys. 724, 109077(2022).
  20. Ighodaro, O. M., Akinloye, O. A. First line defence antioxidants—superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT) and glutathione peroxidase (GPx): their fundamental role in the entire antioxidant defence grid. Alexandria J Med. 54 (4), 287-293 (2018).
  21. Del Rio, D., Stewart, A. J., Pellegrini, N. A review of recent studies on malondialdehyde as toxic molecule and biological marker of oxidative stress. Nutr Metab Cardiovasc Dis. 15 (4), 316-328 (2005).
  22. Li, H., Durbin, R. Fast and accurate short read alignment with Burrows–Wheeler transform. Bioinformatics. 25 (14), 1754-1760 (2009).
  23. FastQC: a quality control tool for high throughput sequence data. , https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ (2026).
  24. Dauphinee, S. M., Karsan, A. Lipopolysaccharide signaling in endothelial cells. Lab Invest. 86 (1), 9-22 (2006).
  25. Li, F., et al. Qiliqiangxin alleviates Ang II-induced CMEC apoptosis by downregulating autophagy via the ErbB2–AKT–FoxO3a axis. Life Sci. 273, 119239(2021).
  26. Cicchinelli, S., et al. PAMPs and DAMPs in sepsis: a review of their molecular features and potential clinical implications. Int J Mol Sci. 25 (2), 962(2024).
  27. Das, U. N. Infection, inflammation, and immunity in sepsis. Biomolecules. 13 (9), 1322(2023).
  28. Zhou, W. Y., et al. Circular RNA: metabolism, functions and interactions with proteins. Mol Cancer. 19 (1), 172(2020).
  29. Li, S., et al. CircZBTB46 predicts poor prognosis and promotes disease progression of myelodysplastic syndromes and acute myeloid leukemia. Clin Exp Med. 23 (8), 4649-4664 (2023).
  30. Fu, Y., et al. Circular RNA ZBTB46 depletion alleviates the progression of atherosclerosis by regulating the ubiquitination and degradation of hnRNPA2B1 via the AKT/mTOR pathway. Immun. Ageing. 20 (1), 66(2023).
  31. Long, F., et al. CircZBTB46 protects acute myeloid leukemia cells from ferroptotic cell death by upregulating SCD. Cancers (Basel). 15 (2), 459(2023).
  32. Uckun, F. M., Qazi, S. Upregulated expression of ERBB2/HER2 in multiple myeloma as a predictor of poor survival outcomes. Int J Mol Sci. 24 (12), 9943(2023).
  33. Moutafi, M., et al. Quantitative measurement of HER2 expression to subclassify ERBB2-unamplified breast cancer. Lab Invest. 102 (10), 1101(2022).
  34. Wei, D., et al. KIF11 promotes cell proliferation via ERBB2/PI3K/AKT signaling pathway in gallbladder cancer. Int J Biol Sci. 17 (2), 514-526 (2021).
  35. Fan, K., et al. ERBB2 S310F mutation independently activates PI3K/AKT and MAPK pathways through homodimers to contribute to gallbladder carcinoma growth. Med Oncol. 39 (5), 64(2022).
  36. Zhu, W., et al. Macrophage migration inhibitory factor facilitates the therapeutic efficacy of mesenchymal stem cell-derived exosomes in acute myocardial infarction through upregulating miR-133a-3p. J Nanobiotechnol. 19 (1), 61(2021).
  37. Du, H., et al. Anti-leukemia activity of polysaccharide from Sargassum fusiforme via the PI3K/AKT/BAD pathway in vivo and in vitro. Mar Drugs. 21 (5), 289(2023).
  38. Wang, W., et al. Hydroxysafflor yellow A ameliorates alcohol-induced liver injury through PI3K/Akt and STAT3/NF-κB signaling pathways. Phytomedicine. 132, 155814(2024).
  39. Yao, L., et al. Finerenone ameliorates mitochondrial dysfunction via PI3K/Akt/eNOS signaling pathway in diabetic tubulopathy. Redox Biol. 68, 102946(2023).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

CircZBTB46إصابة عديد السكاريد الشحميتنظيم الموت الخلوي المبرمجمقايسة حيوية الخليةقياس التدفق الخلويإصابة الكلى الحادة
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.