مقالة منهجية

نمذجة مقاومة الإنسولين في الخلايا الدهنية باستخدام نسبة الأوعية الدموية البثوية المشتقة من نسيج دهني تحت الجلد لدى الفأر

DOI:

10.3791/69769

⸱

مارس 27, 2026

 ,  , 
1State Key Laboratory of Pathogenesis, Prevention and Treatment of High Incidence Diseases in Central Asia, Xinjiang Key Laboratory of Molecular Biology for Endemic Diseases, Department of Biochemistry and Molecular Biology, School of Basic Medical Sciences, Xinjiang Medical University, 2Changzhou Third People's Hospital

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تقدم هذه الدراسة بروتوكولا تجريبيا يستخدم الجزء الوعائي البثوي المستخرج من نسيج دهني تحت الجلد للفأر ومعالج بالديكساميثازون لمحاكاة مقاومة الأنسولين. من خلال الحفاظ على تعقيد الأنسجة الدهنية، يوفر منصة فسيولوجية أصيلة للبحث الميكانيكي.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

مقاومة الأنسولين في الأنسجة الدهنية هي سمة مركزية في اضطرابات الأيض مثل السكري من النوع الثاني، ومع ذلك تعتمد العديد من النماذج المخبرية على خطوط خلايا خالدة تعكس بشكل غير كامل تعقيد الخلايا في نسيج الدهون الأصلي. هدف هذا البروتوكول هو إنشاء طريقة قابلة للتكرار وقابلة للعمل تجريبيا لنمذجة مقاومة الإنسولين في الخلايا الدهنية باستخدام الخلايا دهنية أولية مشتقة من الجزء الوعائي السمكي (SVF) في نسيج الدهون تحت الجلد للفأر. يصف البروتوكول عزل خلايا SVF عن طريق الهضم الإنزيمي، وتمايزها الدهن إلى خلايا دهنية ناضجة محملة بالدهون، ثم تحفيز مقاومة الإنسولين باستخدام ديكساميثازون. يتم تعريف مقاومة الأنسولين عمليا والتحقق من صحتها من خلال قراءات وظيفية وجزيئية، بما في ذلك تقليل امتصاص واستهلاك الجلوكوز المحفز بالإنسولين، بالإضافة إلى انخفاض فسفرة البروتينات الرئيسية لإشارات الأنسولين في مسار PI3K-AKT. من خلال الحفاظ على التغاير الخلوي المستخرج من SVF، يوفر هذا النهج نظاما قائما على الخلايا الأولية يدعم دراسة إشارات الإنسولين في الخلايا الدهنية تحت ظروف تقترب بشكل أقرب من فسيولوجيا الأنسجة الدهنية مقارنة بخطوط الخلايا التقليدية. يهدف هذا البروتوكول إلى الباحثين الباحثين عن منصة موحدة لدراسة آليات مقاومة الإنسولين في الخلايا الدهنية أو لتقييم التدخلات الأيضية، مع الاعتراف بأن القراءات تعكس استجابات من ثقافة مختلطة مشتقة من SVF بدلا من مجموعة من الخلايا الدهنية المنقية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أصبح مرض السكري من النوع الثاني (T2DM) واحدا من أسرع الأمراض الأيضية غير المعدية نموا على مستوى العالم، حيث تجاوز إجمالي عدد المرضى الآن 537 مليون ومن المتوقع أن يتجاوز 783 مليون بحلول عام 2045. تظهر ميزاته الفسيولوجية المرضية الأساسية على شكل مقاومة الأنسولين الطرفية للأنسجة (IR)، مصحوبة بخلل تدريجي في وظائف الخلايا β2. تكمن جوهر الأشعة تحت الحمراء في التأثيرات البيولوجية المتناقصة بشكل كبير الناتجة عن تركيز الأنسولين الفسيولوجي في الأعضاء المستهدفة، مما يؤدي إلى انخفاض امتصاص الجلوكوز، وزيادة إنتاج الجلوكوز الكبدي، وضعف تثبيط الدهون3. نسيج الدهون هو أحد أهم الأعضاء المستهدفة للإنسولين. السمنة تسبب فقدان حساسية الخلايا الدهنية للأنسولين، مما يقلل من امتصاص الجلوكوز، ويثبط تخليق ثلاثي الجليسيريد، وفي الوقت نفسه يزيد من تحلل الدهون ويفرز المزيد من الأحماض الدهنية الحرة، مما يزيد من مقاومة الأنسولين الجهازية 4,5.

في الحالات الفسيولوجية، ينشط الأنسولين مسار PI3K-AKT لنقل ناقل الجلوكوز 4 (GLUT4) إلى غشاء الخلية، مما يعزز امتصاص الجلوكوز وتخليق الدهون الثلاثية في الخلايا الدهنية. في الوقت نفسه، يثبط الأنسولين نشاط ليباز الدهون ثلاثية الجليسيرات (ATGL) والليباز الحساس للهرمونات (HSL) على سطح قطرات الدهون، مما يمنع تحلل الدهون6. عندما يحدث الالتهاب بالأشعة تحت الحمراء، فإن ضعف إشارات الإنسولين يضعف تثبيط الدهون، مما يؤدي إلى إطلاق هائل للأحماض الدهنية الحرة (FFAs) في مجرى الدم. ينتج عن ذلك إفراز هائل من الدهون الزائدة في مجرى الدم، مما يسبب ترسيب الدهون الثلاثية خارج الرحم في أعضاء مثل الكبد والعضلات الهيكلية والبنكرياس. هذا يسبب تسمم الشفاه والتهابا مزمنا، مما يساهم في بداية وتطور مرض السكريالثاني النوع السابع. لذلك، فإن إنشاء نموذج ناضج لخلايا دهنية يعيد إنتاج خصائص الأشعة تحت الحمراء في الجسم الحي أمر حاسم لتوضيح الآليات الجزيئية للأشعة تحت الحمراء وتطوير استراتيجيات تدخل جديدة.

حاليا، أصبح خط الخلايا الليفية الجنينية للفأر 3T3-L1 أداة كلاسيكية للدراسات المختبرية لخلايا الدم تحت الحمراء بسبب دورة الحث القصيرة وقابليته الجيدة للتكاثر 8,9. ومع ذلك، فإن الأصل الجنيني لخلايا 3T3-L1، وخلفيتها الجينية الموحدة، وقابليتها للانحراف الظاهري بعد مرور طويل الأمد تؤدي إلى اختلافات كبيرة في السلوك الأيضي مقارنة بالخلايا الدهنية البالغة في الموقع، مما يحد من قيمتها الطبية الانتقالية10,11. على النقيض من ذلك، فإن الجزء الوعائي العضلي (SVF) المعزول من نسيج دهني تحت الجلد للقوارض غني بالخلايا الجذعية الدهنية متعددة القدرات (ASCs). تظهر الخلايا الدهنية الناضجة التي تم تمييزها من هذه الخلايا السحرية خصائص شكلية ووظيفية ونسخية تشبه أكثر تلك الخاصة بالخلايا الدهنية البيضاء الأصلية مقارنة بخط الخلايا 3T3-L1 المستخدم على نطاق واسع. وهذا يجعل الخلايا الدهنية المشتقة من SVF نموذجا تكميلا لدراسة إشارات الأنسولين ومقاومته في سياق يقترب بشكل أفضل من تعقيد الأنسجة الأولية12.

هذا البروتوكول مناسب بشكل خاص للباحثين الذين يهدفون إلى دراسة عمل الأنسولين في نموذج الخلايا الدهنية الأولي الذي يحتفظ بتغاير أكبر في الأنسجة مقارنة بخطوط الخلايا الخالدة. ومع ذلك، يجب على المستخدمين ملاحظة أن SVF هو مجموعة مختلطة تحتوي على خلايا بطانية ومناعية؛ لذلك، تعكس القراءات سلوك ثقافة تكون خلايا الدم فيها مكون رئيسي لكنه ليس حصريا. قد يكون هذا النموذج أقل ملاءمة للدراسات التي تتطلب مجموعة خلايا دهنية نقية ومتزامنة.

تقترح هذه الدراسة بروتوكولا لبناء نموذج خلوي مقاوم للأنسولين باستخدام الخلايا الدهنية الناضجة المشتقة من SVF. يوضح البروتوكول عملية عزل SVF بأكملها، وزراعته، وتمايزه، وتحفيز مقاومة الأنسولين، مع محاكاة حالة مقاومة الإنسولين للخلايا الدهنية في الجسم الحي. سيتم إجراء تقييم النماذج على مستويات استهلاك الجلوكوز، وشكل الخلية، والآليات الجزيئية. يوفر هذا أساسا تقنيا لدراسة الآليات الجزيئية الكامنة وراء مقاومة الأنسولين في الخلايا الدهنية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت الموافقة على جميع التجارب الحيوانية من قبل لجنة أخلاقيات التجارب الحيوانية في جامعة شينجيانغ الطبية (رقم الموافقة الأخلاقية: IAGUC-20240228-41).

1. عزل SVF

  1. الحيوانات التجريبية: استخدم فئران C57BL/6J بدرجة SPF تبلغ من العمر 4-6 أسابيع وتزن 9-11 جرام. احتواؤها على درجة حرارة 22 ± 2 درجة مئوية ضمن دورة ضوء وظلام مدتها 12 ساعة مع وصول مجاني للطعام والماء.
  2. تحضير التعقيم: قم بعمل جهاز تعقيم لجميع الأجهزة والمواد الاستهلاكية عند درجة حرارة 121 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. قبل التجربة، رش غطاء التدفق الطبقي بنسبة 75٪ من الإيثانول وأشعاعه بأشعة فوق بنفسجية لمدة ≥15 دقيقة. إجراء جميع الإجراءات ضمن خزانة السلامة البيولوجية من الفئة الثانية. ارتد قفازات وأقنعة معقمة.
  3. حصاد الأنسجة الدهنية: قتل الفئران عن طريق استنشاق ثاني أكسيد الكربون متبوعا بخلع عنقي. اغمر فورا في 75٪ إيثانول لمدة 10 دقائق لتعقيم السطح. باستخدام مقص عيون معقم، قم بعمل شق دائري على خط منتصف الصدر والبطن. قم بإجراء تشريح غير حاد لكشف النسيج الدهني الأبيض الإربي الثنائي الطرفين، الموجود على الجزء الداخلي من الفخذ والممتد نحو منطقة الخصية على شكل حرف V. قم بإزالة أي غدد لمفاوية ظاهرة بعناية. اجمع الأنسجة الدهنية في PBS المبرد مسبقا وقم بثلاث عمليات شطف سريعة.
  4. هضم الكولاجيناز: نقل الأنسجة الدهنية المغسولة فورا إلى طبق زراعة معقم وتفكيك إلى قطع بحجم 1-2 ملم مكعب. أضف 0.2٪ كولاجناز من النوع الثاني (مذاب في PBS من دولبيكو، درجة حموضة 7.4، مسخن مسبقا إلى 37 درجة مئوية) بحجم 1.5 إلى 2 ضعف حجم الأنسجة. حضن عند 37 درجة مئوية على هزاز بدرجة حرارة ثابتة عند 100 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق. اقلب القرص بلطف كل 3 دقائق لتجنب فرط الهضم.
  5. الإنهاء والترشيح: عند الانتهاء من الهضم، أضف كمية متساوية من الوسط الكامل المسخن مسبقا (DMEM/F-12 + 10٪ FBS + 1٪ بنسلين-ستريبتومايسين) عند 37 درجة مئوية لإنهاء التفاعل. استخدم الماصة بلطف 5x-8x باستخدام رأس ماصة 1 مل. قم بتصفية عبر مصفاة خلوية بحجم 70 ميكرومتر لإزالة شظايا الأنسجة غير المهضومة والخلايا الدهنية الناضجة.
  6. الطرد المركزي والغسيل: قم بجهاز الطرد المركزي بالترشيح بحرارة 300 × g لمدة 5 دقائق عند 25 درجة مئوية. تخلص بعناية من المادة الفائقة التي تحتوي على الخلايا الدهنية الناضجة. أعد تعليق الحبيبة في الوسط الكامل. الطرد المركزي مرة أخرى عند 300 × g لمدة 5 دقائق عند 25 درجة مئوية. كرر هذه الخطوة مرتين لإزالة الكولاجناز المتبقي وأي خلايا دهنية ناضجة.
  7. الزراعة والزراعة: أعد تعليق الحبيبة الأخيرة بعد 1 مل من الوسط الكامل. بذور بكثافة 4 عينات دهون أربية من الفئران لكل طبق زراعة خلايا بحجم 10 سم. حضانه عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون. قم بأول تغيير وسط بعد 24 ساعة لإزالة الخلايا غير الملتصقة. بعد ذلك، غير الوسيط كل 48 ساعة. امرر الخلايا عندما تصل إلى 80٪-90٪ من التقاء البعض.
    ملاحظة: لا تمر الخلايا عندما يتجاوز التقاء 90٪، لأن الخلايا قد وصلت إلى تثبيط التلامس وتقل قدرتها على التكاثر.

2. تحضير محلول العمل من النوع الثاني للكولاجناز.

  1. المواد الكيميائية والمستهلكات: الحصول على كولاجناز النوع الثاني (نشاط ≥ 120 وحدة وحدة لكل ملغ); BSA (خالي من الأحماض الدهنية ≥ 98٪)؛ هيبس؛ PBS دولبيكو (يحتوي على Ca²⁺ 1.8 mmol/L، Mg²⁺ 0.9 mmol/L)، pH 7.2-7.4؛ فلتر معقم منخفض الارتباط بالبروتينات بحجم 0.22 ميكرومتر.
  2. تحضير محلول كولاجناز من النوع الثاني بنسبة 0.2٪: يزن 60 ملغ مسحوق كولاجناز النوع الثاني، 800 ملغ BSA، و48 ملغ HEPES في أنبوب طرد مركزي بحجم 50 مل. قم بتخفيف الكمية إلى 40 مل باستخدام PBS من Dulbecco. اضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.4 ± 0.1 باستخدام 1 M NaOH أو HCl. قم بالتعقيم عن طريق الترشيح عبر فلتر 0.22 ميكرومتر. أليكوت 5 مل لكل أنبوب وخزنها عند -20 درجة مئوية. تجنب تكرار دورات التجمد والذوبان.
  3. تحفز التمايز عندما تصل الخلايا إلى 100٪ من التقاء بعد المرور. الحالة المثلى للتمايز تشير إلى الخلايا التي تظهر شكلا يشبه الدوامة. استخدم محلول الحث I لأول 48 ساعة، ثم انتقل إلى محلول الحث II (الجدول 1).
  4. تأكيد التمايز الناجح بالمعايير التالية: بحلول اليوم الرابع من التحفيز، يكشف التلوين الأحمر الزيتي عن تراكم قطرات الدهون في معظم الخلايا (حوالي 50٪)، مصحوبا بزيادة ذات دلالة إحصائية (p < 0.05) في التعبير عن علامات التكون الدهنية الرئيسية.

3. تأسيس نموذج مقاومة الأنسولين

  1. اختر اليوم الرابع من التمايز كنقطة انطلاق لتحفيز مقاومة الإنسولين. تأكد تحت المجهر أن جميع الخلايا تظهر انتقالا شكليا من شكل المغزل إلى الشكل المستدير، حيث يمتلئ السيتوبلازم في معظم الخلايا بقطرات دهنية عالية المعامل الانكساري.
  2. استبدل الوسط بوسط حث II يحتوي على 1 ميكرومول/لتر ديكس واستمر في الزراعة لمدة 48 ساعة (الجدول 1). بعد هذا الإجراء، اعتبر نموذج الخلايا الدهنية المقاومة للإنسولين الذي تم تأسيسه. لاحظ أن هذه الخلايا لا تظهر أي تغييرات شكلية أخرى. استخدم هذه الخلايا مباشرة لاختبارات امتصاص واستهلاك الجلوكوز ولاكتشاف بروتينات مسار إشارات الإنسولين.
  3. معايير تأسيس نموذج مقاومة الأنسولين الناجح: بعد 48 ساعة من علاج الديكساميثازون، تأكد من أن قدرة امتصاص الجلوكوز في معظم الخلايا التي تحفز ب 100 نانومال إنسولين تنخفض بحوالي 40٪. أيضا، تأكيد انخفاض ذو دلالة إحصائية (p < 0.05) في مستويات الفسفرة في بروتينات مسار إشارات الإنسولين الرئيسية.
    ملاحظة: تتطلب هذه العملية إضافة مستمرة لوسط صيانة الحث II.

4. اكتشاف الجلوكوز المتبقي في المادة الفائقة للزراعة

  1. اجمع مواد الزراعة الخلوية في النقطة الزمنية المحددة. قم بإزالة الخلايا بالطرد المركزي عند 4 درجات مئوية و300 × جرام لمدة 5 دقائق.
  2. قياس تركيزات الجلوكوز في المواد الفائقة باستخدام مجموعة اختبار الجلوكوز أكسيداز-بيروكسيداز (GOD-POD). احسب التركيزات باستخدام الصيغة:
    تركيز الجلوكوز (mmol/L) = (A(عينة) - A(فارغ)) / (A(قياسي) - A(فارغ)) * C(قياسي)
    استهلاك الجلوكوز (mmol/L) = تركيز الجلوكوز في وسط خلوي خال (mmol/L) - تركيز الجلوكوز في المادة الفائقة للخلية (mmol/L)
    استهلاك الجلوكوز الطبيعي (mmol/mg) = استهلاك الجلوكوز الخام (mmol/L) / تركيز البروتين الخلوي الكلي (mg/L)

5. البقعة الغربية

  1. حفز الخلايا في النقطة الزمنية المحددة بإنسولين 100 نانومالتر في وسط كامل لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية لتفعيل مسار PI3K-AKT. بعد ذلك، أضف 200 ميكرولتر من مخزن تحلل الخلية إلى كل طبق زراعة خلوية بحجم 3.5 سم. احتضن على الثلج لمدة 30 دقيقة. الطرد المركزي عند 13,040 × g لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. انقل المادة الفائقة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد بسعة 1.5 مل. قم بقياس تركيز البروتين باستخدام محلول BCA العامل.
  2. حمل العينات على جل SDS-PAGE بنسبة 8٪. شغل الجل بجهد 80 فولت حتى تصل العينات إلى واجهة الجل المكدس/الفصل. زد الجهد إلى 120 فولت واستمر حتى يتم حل نطاقات العلامات بالكامل. قم بالنقل بتيار ثابت 200 مللي أمبير لمدة ساعتين.
  3. حضن الغشاء في درجة حرارة الغرفة مع حليب خالي الدسم 5٪ أو BSA لمدة ساعتين للحبس. اغسل الغشاء ثلاث مرات باستخدام TBST. بعد ذلك، حضانة الجسم المضاد الأولي طوال الليل عند 4 درجات مئوية. الأجسام المضادة الأولية (التخفيف): AKT: 1:1000، p-AKT (Ser473): 1:1000، β-الأكتين: 1:1000، PI3K p110α: 1:1000، فوسفو-PI3K p110: 1:1000، C/EBPα: 1:2000، FABP4: 1:2000.
  4. اغسل الغشاء ثلاث مرات باستخدام TBST. بعد ذلك، حضانة الأجسام المضادة الثانوية المرتبطة ب HRP في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. الأجسام المضادة الثانوية (التخفيف): IgG-HRP مضاد للفئران في الماعز: 1:5000، IgG-HRP مضاد للأرانب في الماعز: 1:5000.
  5. اكتشف الإشارة باستخدام تلألؤ كيميائي ECL. تصور وتسجيل نتائج التجارب باستخدام جهاز تصوير البقعة الغربية.
  6. حلل قيم التدرج الرمادي للأشرطة الناتجة باستخدام برنامج ImageJ.

6. اختبار صبغة امتصاص الجلوكوز

  1. قم بتجويع الخلايا في النقطتين الزمنيتين المحددة بشكل منفصل لمدة 12 ساعة باستخدام RPMI 1640 الذي يحتوي على 1٪ FBS لإزالة التداخل الناتج عن الجلوكوز القاعدي.
  2. بعد 10 دقائق من التحفيز ب 100 نانومال إنسولين، أضف 1 مل من محلول 1×2-NBDG لكل بئر. حضن الصفيحة عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة، محمية من الضوء.
  3. اغسل الخلايا مرتين إلى ثلاث مرات. أضف 1 مل من محلول التلوين الجاهز من هوشت إلى كل بئر. حضن الطبق عند حرارة 37 درجة مئوية في الظلام لمدة 10 دقائق. أضف محلول التلوين ببطء على طول الجدار الجانبي لوعاء الزراعة، مع تجنب الاتصال المباشر بطبقة الخلية لمنع انفصال الخلايا.
  4. اغسل الخلايا مرتين إلى ثلاث مرات، ثم أضف PBS. التقط صورا فلورية للخلايا باستخدام مجهر فلوري مقلوب.
  5. قم بإجراء تحليل كمي للصور باستخدام برنامج ImageJ. استخدم ImageJ لفصل كل قناة، معزولا إشارة امتصاص الجلوكوز (القناة الخضراء) عن إشارة الفلورة النووية (القناة الزرقاء).
  6. حول جميع الصور إلى صور رمادية بحجم 8-بت. تطبيق خوارزمية العتبة التلقائية الافتراضية لتحديد مناطق الإشارة الموجبة.
  7. قس متوسط شدة الفلورة داخل هذه المناطق المحددة. تطبيع إشارة فلورة امتصاص الجلوكوز عن طريق قسمة متوسط شدة الفلورة للقناة الخضراء على متوسط شدة الفلورة المقابلة للقناة الزرقاء.

7. صبغة O باللون الأحمر الزيتي

  1. قم بتخفيف محلول Oil Red O باستخدام ماء خال من RNase بنسبة 3:2. قم بترشيح المحلول بشكل متسلسل عبر ورق الترشيح وفلتر بحجم 0.22 ميكرومتر لتحضير محلول العمل.
  2. استنشق وسط زراعة الخلايا واغسله بلطف مرتين باستخدام PBS. أضف 4٪ بارافورمالديهايد لكل بئر وثبت الخلايا في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
  3. أضف المثبت واغسل الخلايا بماء مقطر مرتين. أضف 1 مل من محلول Oil Red O العامل إلى كل بئر. حضن الطبق في درجة حرارة الغرفة في الظلام لمدة 25 دقيقة.
  4. بعد التلوين، استنشق محلول التلوين. اغسل الخلايا جيدا بالماء المقطر لإزالة الخلفية والبقع الأثرية. أضف 1 مل من الماء المقطر لتغطية الخلايا. التقط صور الحقل الساطع فورا باستخدام مجهر مقلوب.

8. بوديبي

  1. قم بتخفيف محلول مخزن بوديبي بماء معقم بنسبة حجم 1:200 لتحضير محلول العمل.
  2. اغسل أغطية الخلايا باستخدام PBS معقم. أضف 30 ميكرولتر من محلول بارافورمالديهايد 4٪ إلى كل غطاء وثبت على درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
  3. استنشق المثبت واغسل ثلاث مرات باستخدام PBS. أضف 30 ميكرولتر من محلول BODIPY العامل إلى كل غطاء خلية. حضن في درجة حرارة الغرفة في الظلام لمدة 30 دقيقة.
  4. اغسل أغطية الغطاء ثلاث مرات باستخدام PBS. أضف 30 ميكرولتر من صبغة DAPI إلى كل غطاء للغطاء. حضن في درجة حرارة الغرفة في الظلام لمدة 10 دقائق لوضع علامات على نوى الخلية.
  5. اغسل أغطية الغطاء ثلاث مرات أخرى باستخدام PBS. تابع عملية التثبيت: أضف 10 ميكرولتر من وسط التثبيت المضاد للتلاشي على شريحة مجهر نظيفة. باستخدام الملقط، اقلب غطاء الخلية بلطف (جانب الخلية للأسفل) على وسط التثبيت. دع التركيب يجف في الظلام.
  6. التقط الصور فورا باستخدام مجهر كونفوكي بالليزر الماسح.

9. التحليل الإحصائي

  1. تضمنت كل تجربة ثلاث نسخ بيولوجية. حلل البيانات باستخدام برنامج GraphPad Prism 10.0. تقديم بيانات كمية تستوفي معايير التوزيع الطبيعي كمتوسط ± انحراف معياري (متوسط ± انحراف معياري). لمجموعتين تلبيان الطبيعية وتجانس التباين، تطبيق اختبار t المستقل للعينات. بالنسبة لمجموعات متعددة، إذا أجريت تحليل التحليل السطحي (ANOVA) أحادي الاتجاه، يعتبر p < 0.05 ذات دلالة إحصائية.

10. السلامة والتخلص من النفايات

  1. التعامل مع أنسجة الحيوانات
    1. قم بأداء جميع الإجراءات المتعلقة بالخلايا الأولية في خزانة السلامة الحيوية من الفئة الثانية تحت ظروف معقمة.
    2. صنف جميع نفايات الأنسجة الحيوانية، والأعضاء غير المستخدمة، والمستهلكات الملوثة كنفايات بيولوجية خطرة. ضع هذه النفايات في أكياس مخصصة للخطر البيولوجي، ومعالجتها عبر التعيين، ثم التخلص منها أخيرا.
  2. التعامل مع ديكساميثازون
    1. ارتد القفازات والأقنعة الطبية ومعاطف المختبر عند وزن مسحوق ديكس. قم بإجراء تحضير المحلول داخل غطاء بخار كيميائي.
    2. اجمع النفايات الملوثة ب Dex بشكل منفصل وتخلص منها كنفايات كيميائية.
  3. التعامل مع المواد البيولوجية الخطرة
    1. قم بتعقيم أسطح العمل وداخل خزائن السلامة الحيوية بنسبة 70٪ إيثانول جيدا قبل بدء إجراءات التجريب.
    2. تأكد من أن جميع النفايات السائلة الناتجة عن زراعة الخلايا يتم تعقيم الحقن لجعلها غير معدية قبل التخلص منها.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أظهرت خلايا SVF المعزولة من iWAT في فئران C57BL/6J تعليق مثقوب عند البذر الأولي في أطباق الزراعة. حوالي 40٪ من الخلايا أكملت الالتصاق الأولي بعد 18 ساعة من البذر؛ بحلول اليوم الخامس بعد البذر، كانت الخلايا منتشرة بالكامل، حيث وصلت نسبة التقاء إلى 95٪ (الشكل 1A,B). عندما وصلت الخلايا إلى التقاءها وأظهرت ترتيبا مميزا يشبه الدوامة، تم استبدال وسط التمايز. بحلول اليوم الرابع من التحفيز، ظهرت العديد من قطرات الدهون الانكسارية داخل الخلايا، حيث شكلت الخلايا الدهنية الناضجة حوالي ث...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تشير الأبحاث المكثفة إلى أن نماذج الخلايا القائمة على SVF تقدم قيمة فريدة في محاكاة السمات المرضية للأنسجة الدهنية. ومع ذلك، فإن دورة البناء الطويلة لهذه النماذج، التي تتطلب عادة حوالي 14 يوما لعزل الأنسجة، والزراعة الأولية، والتمايز المحفز، وعلاج البراعة، تطرح تحديات على الاستمرارية التجريبية واستقرار الحالة الخلوية. لمعالجة هذه التحديات، اعتمدت هذه الدراسة وحسنت سير عمل تجريبي يركز على التدابير الرئيسية التالية: (1) اختيار فئران صغار سليمة تبلغ من العمر 3-4 أسابيع تزن حوالي 10 جرام كمص...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصرح المؤلفون بعدم وجود تضارب مصالح في هذا العمل.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد حظي هذا العمل بدعم من المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (82260177) والمختبر الرئيسي الحكومي لأمراض المرض عالية الحدوث والوقاية منها وعلاجها في آسيا الوسطى (SKL-HIDCA-2023-2020). لم يكن للجهة الممولة أي تأثير على تصميم أو تنفيذ أو تفسير هذه الدراسة. لم تشارك وكالة التمويل في كتابة أو تقديم هذا المخطوطة للنشر.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
0.22 μ مرشح mبايوشاربBSF-XS-0232-01
2-NBDGبيوتايمS0561M
3-إيزوبيوتيل-1-ميثيلزانثينسيغما15879
4٪ بولي فورمالديهايدبايوشاربBL1278A
70 & mu; مصفاة خلية MبايوشاربBS-70-CS
ضد AKTبروتين تك10175
Anti-C/EBPαأبكلونAB40764
مضاد FABP4تكنولوجيا الإشارات الخلوية  عقد 2120
مكافحة ال pAKT (Ser473)بروتين تك28731
Anti-PI3K البيوس10657R
Anti-pPI3K (ص110)البيوس6417R
مضاد وبيتا;-أكتينبروتين تك60008
مجموعة اختبار بروتين BCAثيرمو فيشر23225
بوديبي 493/503إنفيتروجينD3922
BSA سيغماA7030
شرائح تسلق الخلايا Biosharp بايوشاربBS-14-RC
طبق زراعة الخلايا، 100 مم × 20 ممكورنينغ430167
طبق زراعة الخلايا، 35 مم × 10 ممكورنينغ430165
حل DAPIسولاربيولوجيا28718-90-3
ديكساميثازونسيغماD2915
DMEM/F-12جيبكوC11330500BT
دولبيكو' س PBSسيتيفاSH30264.02
أنبوب إيبندورفكورنينغMCT-175-C 
FBSلايف-آي لابAC03L0555
مجهر الفلورةلايكاDMi8
جلوكوز أكسيداز-بيروكسيدازنانجينغ جيانتشنغF006-1-1
مضاد للفئران من الماعز IgG-HRPبكين تشونغشان جينتشياوZB-2305
IgG-HRP مضاد للأرانب من الماعزبكين تشونغشان جينتشياوZB-2301
منشور جراف بادالإصدار 10.0.0/
هيبسBioFroxx1112GR025
هوكستبايوشاربBL803A
ImageJالإصدار 1.54p/
الأنسولينسولاربيولوجيا18040
المجهر الكونفوكلي بالليزر الماسحنيكون  Ti-E
تركيب مكافحة التلاشي الوسيطسولاربيولوجياS2100
محلول صبغة زيت أحمر OسيغماO0625-25G
البنسلين-ستريبتوميسينهايكلونSV30010
مخزن RIPAثيرمو فيشر89901
روزيغليتازونسيغماR2408
RPMI 1640فيفا سيلC3010-0500
مسحوق الحليب خالي الدسمBioFroxx1132GR500
مخزن TBSسولاربيولوجياT1060
الكولاجيناز من النوع الثانيسيغماC6885

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. NCD Risk Factor Collaboration (NCD-RisC). Worldwide trends in underweight and obesity from 1990 to 2022: a pooled analysis of 3663 population-representative studies with 222 million children, adolescents, and adults. Lancet. 403 (10431), 1027-1050 (2024).
  2. Stumvoll, M., Goldstein, B. J., van Haeften, T. W. Type 2 diabetes: principles of pathogenesis and therapy. Lancet. 365 (9467), 1333-1346 (2005).
  3. Arkan, M. C., et al. IKK-beta links inflammation to obesity-induced insulin resistance. Nat Med. 11 (2), 191-198 (2005).
  4. Li, M., et al. Trends in insulin resistance: insights into mechanisms and therapeutic strategy. Signal Transduct Target Ther. 7 (1), 216(2022).
  5. Miao, Z., et al. The causal effect of obesity on prediabetes and insulin resistance reveals the important role of adipose tissue in insulin resistance. PLoS Genet. 16 (9), e1009018(2020).
  6. Santoro, A., McGraw, T. E., Kahn, B. B. Insulin action in adipocytes, adipose remodeling, and systemic effects. Cell Metab. 33 (4), 748-757 (2021).
  7. Segalla, L., Chirumbolo, S., Sbarbati, A. Dermal white adipose tissue: Much more than a metabolic, lipid-storage organ. Tissue Cell. 71, 101583(2021).
  8. Hoehn, K. L., et al. IRS1-independent defects define major nodes of insulin resistance. Cell Metab. 7 (5), 421-433 (2008).
  9. Zhou, X., Wang, L. L., Tang, W. J., Tang, B. Astragaloside IV inhibits protein tyrosine phosphatase 1B and improves insulin resistance in insulin-resistant HepG2 cells and triglyceride accumulation in oleic acid (OA)-treated HepG2 cells. J Ethnopharmacol. 268, 113556(2021).
  10. Liu, X., Liu, X. N., Li, T. J., Liu, B. Research Progress of the Differentiation of 3T3-L1 Preadipocytes into Mature Adipocytes. Zhongguo Yi Xue Ke Xue Yuan Xue Bao. 39 (5), 727-731 (2017).
  11. Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. What we talk about when we talk about fat. Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).
  12. Zuk, P. A., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Eng. 7 (2), 211-228 (2001).
  13. Tan, S. X., et al. Selective insulin resistance in adipocytes. J Biol Chem. 290 (18), 11337-11348 (2015).
  14. Zebisch, K., Voigt, V., Wabitsch, M., Brandsch, M. Protocol for effective differentiation of 3T3-L1 cells to adipocytes. Anal Biochem. 425 (1), 88-90 (2012).
  15. Wang, T., Sharma, A. K., Wolfrum, C. Novel insights into adipose tissue heterogeneity. Rev Endocr Metab Disord. 23 (1), 5-12 (2022).
  16. Taniguchi, C. M., et al. Divergent regulation of hepatic glucose and lipid metabolism by phosphoinositide 3-kinase via Akt and PKClambda/zeta. Cell Metab. 3 (5), 343-353 (2006).
  17. Jacinto, E., et al. SIN1/MIP1 maintains rictor-mTOR complex integrity and regulates Akt phosphorylation and substrate specificity. Cell. 127 (1), 125-137 (2006).
  18. Cozzone, D., et al. Isoform-specific defects of insulin stimulation of Akt/protein kinase B (PKB) in skeletal muscle cells from type 2 diabetic patients. Diabetologia. 51 (3), 512-521 (2008).
  19. Sakoda, H., et al. Dexamethasone-induced insulin resistance in 3T3-L1 adipocytes is due to inhibition of glucose transport rather than insulin signal transduction. Diabetes. 49 (10), 1700-1708 (2000).
  20. Burén, J., Liu, H. X., Jensen, J., Eriksson, J. W. Dexamethasone impairs insulin signalling and glucose transport by depletion of insulin receptor substrate-1, phosphatidylinositol 3-kinase and protein kinase B in primary cultured rat adipocytes. Eur J Endocrinol. 146 (3), 419-429 (2002).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

PI3K AKT

مقالات ذات صلة