مقالة منهجية

منصة مبتكرة للتمدد والتصوير الخلوي في المختبر

DOI:

10.3791/69779

⸱

مارس 10, 2026

 ,  ,  ,  , 
1Department of Bioengineering, Northeastern University

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا، نقدم جهازا جديدا يطبق موجات الإجهاد متساوية الخواص وأحادية المحور على الخلايا مع دعم الزراعة على الركائز ذات الصلابة القابلة للتعديل ومصفوفات البروتين القابلة للتخصيص. تمكن هذه المنصة البسيطة والاقتصادية الباحثين من دراسة كيفية تنظيم الإشارات الميكانيكية لوظيفة الخلايا في الدراسات الأساسية والسياقات المتعلقة بالأمراض.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تستجيب الخلايا للإشارات الميكانيكية من بيئتها، مثل التغيرات في صلابة المصفوفة خارج الخلية (ECM) والإجهاد الدوري، الذي ينظم العمليات الخلوية بما في ذلك تحديد مصير الخلية، والتواصل بين الخلايا، والتطور. تساهم التغيرات في هذه القوى في أو تدفع تقدم الأمراض في حالات مثل الربو وارتفاع ضغط الدم والسرطان. بينما يمكن لأجهزة التمدد في المختبر الحالية فرض إجهادات أحادية المحور أو متساوية الخواص، إلا أنها غالبا ما تستخدم صلابة غير فسيولوجية، وتحد من التصوير الحي، أو لا تحقق أملات إجهاد عالية ذات صلة بالظروف الفسيولوجية والمرضية. هنا، نقدم جهاز ممتد متوافق مع المجهر يطبق إجهادا متساويا أو أحادي المحور مسيطر عليه على الخلايا الملتصقة على أطباق الزراعة المرنة. تتميز هذه الأطباق بمعامل يونغ قابل للضبط وتتوافق مع مجموعة متنوعة من طلاءات البروتين المصفوفة للتصاق الخلايا، مما يسمح بتعديل مستقل لصلابة الركيزة وتركيب ECM. والأهم من ذلك، أن سهولة تشغيل الجهاز تتأجج بفضل تصميمه الذي يعمل بمحرك متدرج، والذي يدعم توليد موجات دورية قابلة للبرمجة. نظهر قدرة الجهاز من خلال قياس ديناميكيات الكالسيوم داخل الخلايا وقوى الجر الخلوي في خلايا العضلات الملساء في مجرى الهواء البشري الأولي تحت التمدد الميكانيكي. توفر هذه المنصة أداة متعددة الاستخدامات للتحقيق في تأثير الإشارات الميكانيكية على وظيفة الخلايا في السياقات الصحية وذات الصلة بالأمراض.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تتعرض الخلايا لقوى ميكانيكية من بيئتها المحيطة تلعب دورا حاسما في تنظيم العديد من جوانب وظيفة الخلية، بما في ذلك تحديد مصير الخلية 1,2، والتواصل بين الخلايا 3,4، والنمو الصحي 2,5. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تؤدي التغيرات في هذه القوى الميكانيكية إلى زيادة تقدم المرض وبداية المرض، بما في ذلك إعادة تشكيل المصفوفة خارج الخلايا (ECM)6 ونمو الورم 7,8,9,10. يمكن للخلايا أن تستشعر وتستجيب لهذه الإشارات الميكانيكية، والتي تشمل تغيرات في صلابة ECM4، بالإضافة إلى الإجهاد الدوري في أعضاء مثل القلب والرئتين والعضلات11,12. أظهرت الدراسات المخبرية أن صلابة وتركيب ECM يمكن أن يؤثر على صلابة الهيكل الخلوي، سواء في حالة الراحة أو بعد التعرض لمنبهات الانقباض13. فحصت العديد من الدراسات المخبرية والفورية كيف تؤثر السلالات العابرة والثابتة والدورية على الخلايا والأنسجة، مما أظهر أن الاستجابات تختلف حسب نوع الإجهاد ومعدله وسعته14. على سبيل المثال، وجدت دراسات حديثة أن التمدد المؤقت يقلل من صلابة الخلايا الملتصقة بنسبة الإجهاد المطبق، حيث تؤدي الزيادة المستمرة في الإجهاد إلى زيادة سريعة أولية في الصلابة، تليها استرخاء تدريجي15. بالإضافة إلى ذلك، يتأثر إشارات الكالسيوم، وهو المنظم الجزيئي الأساسي لتوليد القوة، بقوى التمدد والقوى الميكانيكيةالأخرى 4,16,17,18,19,20. دراسة كيفية تأثير الصلابة والإجهاد على المسارات الميكانيكية البيولوجية تتطلب تعديل كلا العاملين أثناء مراقبة الاستجابات الخلوية. لذلك، طورنا جهاز تمدد خلوي جديد متوافق مع المجهر قادر على تحفيز تمدد متساوي الخواص أو أحادي المحور، مع تحكم مستقل في صلابة الركيزة، وطلاء البروتين المصفوفي، ومجموعة من الموجات القابلة للبرمجة.

في الماضي، ابتكر الباحثون أجهزة مماثلة لفرض حركات وتمارين ميكانيكية محددة على الزراعة والأنسجةالخلوية 21,22. أبسط حالة، وهي الحركة أحادية المحور، هي تمدد ميكانيكي يفرض على بعد واحد. على سبيل المثال، تم تطوير بعض الأجهزة لفرض التمدد الميكانيكي والإجهاد على شرائط الأنسجة23 وألياف الكولاجين24، أو لمحاذاة اتجاه الخلايا وتحفيز هجرة الخلايا25. يشير التمدد المتساوي الخواص إلى نوع من التمدد حيث تطبق قوة متساوية على هلام أو ركيزة من جميع الاتجاهات، مما يؤدي إلى إجهاد منتظم عبر المادة. يحاكي هذا التمدد توزيع القوة المتساوي الذي تمر به الخلايا في بيئات فسيولوجية معينة، مثل داخل الحويصلات الهوائية للرئتين، حيث تتعرض الخلايا للتمدد والانقباض الكعبري أثناء عملية التنفس26,27.

أجهزة النقالات الحالية لديها عدة قيود تحد من استخدامها في الأبحاث المتعلقة بعلم الأحياء الميكانيكية. تستخدم العديد من التصاميم قيم صلابة الركيزة تتجاوز النطاق الفسيولوجي النموذجي لتحمل الإجهاد الميكانيكي ودعم وزن وسط زراعة الخلايا28. ومع ذلك، قد يؤثر استخدام مثل هذه الصلابة غير الفسيولوجية أيضا على سلوك الخلية، مما قد يحد من صلة النموذج ببيئات الأنسجة الطبيعية29. بالإضافة إلى ذلك، بعض تصاميم النقالات تعيق المسار الموضوعي أو الضوء، مما يمنع التصوير، بينما تستخدم أخرى أغشية سميكة جدا للملاحظة الواضحة28. حتى عندما تكون النقالات متوافقة مع المجاهر وتستخدم ركائز رقيقة، فإن مشاكل مثل ترهل الغشاء وفقدان التركيز شائعة. تستخدم المنصات التجارية مثل فليكسيل تشوهات تعتمد على الفراغ لشد الأغشية المرنة. بينما يمكن لهذا النهج توليد حقول انفعال مستقرة ومتجانسة، إلا أنه غير محسن لمجهر الخلايا الحية، وتتطلب التكوينات المتوافقة مع المجهر ملحقات إضافية مكلفة. بالإضافة إلى ذلك، يمكن لهذه المنصات تحقيق أقصى ضغط يبلغ فقط 21.8٪30، في حين أن الإلهام العميق يمكن أن تنتج سلالات تتجاوز 30٪، مع لوحظات أعلى في أمراض مثل الربو ومرض الانسداد الرئوي المزمن31.

لذلك، صممنا جهاز تمدد خلايا جديد يتيح التحكم الدقيق في المواد في صلابة الركيزة وتركيب ECM، مع السماح بتطبيق السلالات المتغيرة متساوية الخواص وأحادية المحور على الخلايا اللاصقة. هذه المنصة مناسبة جدا للباحثين الذين يحققون في أسئلة ميكانيكانوبيولوجيا والذين يحتاجون إلى تصوير حي أثناء التحفيز الميكانيكي باستخدام ركائز ذات صلابة فسيولوجية ذات صلبة. يستخدم الجهاز نهجا ميكانيكيا مستوحى من هندسة كرة هوبرمان ثنائية الأبعاد، التي تتوسع وتنكمش عبر مفاصل تشبه المقص (الشكل 1، الشكل الإضافي 1). محرك خطوة واحد يدفع 16 ذراعا مرتبة شعاعيا عبر آلية ربط، مما ينتج توسعا وانكماش منسقا لثمانية أعمدة تثبيت. يولد هذا التكوين إجهادا متجانسا داخل المستوى عن طريق تطبيق إزاحة شعاعية متساوية على جميع الأعمدة في آن واحد. التصميم الفريد والمساحة المدمجة للجهاز يسهل تصوير الخلايا الحية باستخدام مجهر فلوري مقلوب أثناء التمدد المتساوي الخواص وأحادي المحور في المستوى، بتكلفة أقل بكثير من البدائل التجارية. يتم التحكم في محرك الخطي الخطي بواسطة رمز أردوينو مخصص، مما يتيح أشكال موجية دورية قابلة للبرمجة مع فترات وسعات قابلة للتعديل. في هذه الدراسة، نظهر أن الجهاز يقدم سلالات دقيقة وقابلة للتكرار تتراوح بين أقل من 1٪ إلى 15٪، بسعة هندسية تتجاوز 200٪. بالإضافة إلى ذلك، نقوم بقياس تأثيرات التمدد الميكانيكي على ديناميكيات الكالسيوم داخل الخلايا وقوى الجر الخلوي لخلايا العضلات الملساء في مجرى الهواء البشري الأولي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم الحصول على خلايا العضلات الملساء في مجرى الهواء البشري الأولي (ASMCs) المستخدمة في هذه الدراسة من ATCC (فيرجينيا)، وتم إلغاء تحديد معلومات المتبرعين وفقا لإرشادات NIH. تمت الموافقة على هذه الدراسة من قبل لجنة السلامة الحيوية في جامعة نورث إيسترن قبل إجراء التجارب.

ملاحظة: للحصول على تعليمات حول تصنيع الجهاز وكذلك أبعاد الجهاز، يرجى مراجعة ملف CAD المتوفر في مستودع GitHub الخاص بنا: https://github.com/Breathe-Lab/A-Novel-Platform-for-In-Vitro-Cellular-Stretching-and-Imaging.

1. تصميم قالب مطبوع ثلاثي الأبعاد

  1. أبعاد العفن المتساوي الخواص
    1. القطر الخارجي للقالب هو 37 مم.
    2. الارتفاع الخارجي للقالب هو 4.1 مم.
    3. سمك الجدار الخارجي هو 2.1 مم.
    4. سمك قاعدة القالب هو 2 مم.
    5. تقع فتحات التثبيت على بعد 2 مم من الحافة.
    6. مساحة بئر زراعة الخلايا الداخلية يبلغ قطرها 20 مم وعمقها 1.9 مم.
      ملاحظة: يجب أن يكون سمك مساحة زراعة الخلايا 200 ميكرومتر لقالب PDMS المكتمل 200 ميكرومتر.
  2. أبعاد القالب أحادي المحور
    1. الأبعاد الخارجية للقالب هي 41 مم × 12 مم × 4 مم (طول × عرض × ارتفاع).
    2. فتحات التثبيت تبعد 3 مم عن الحافة العرضية و4 مم من حافة الطول مع عمق عمود 1 مم.
    3. سمك الجدار الخارجي هو 1.5 مم على الحافة العرض و2 مم على حافة الطول.
    4. أبعاد بئر زراعة الخلايا الداخلية هي 26 مم × 5.5 مم × 1 مم (طول × عرض × ارتفاع).
    5. سمك القاعدة هو 2 مم.
      ملاحظة: تم تصميم القوالب باستخدام SolidWorks، وطبعت ثلاثية الأبعاد باستخدام نظام راتنج رمادي سائل من FormLabs، وتصنيعها في مساحة تصنيع جامعة نورث إيسترن.
  3. تعليمات فقط للاستخدام الأولي للقالب
    1. صنفرة الحواف الخشنة لطباعة القالب.
    2. غط القالب السلبي بطلاء أظافر شفاف لتسهيل إزالة قالب PDMS بعد المعالجة. اترك القالب ليجف في الهواء لمدة 24 ساعة.

2. تصنيع جل شفاف بصريا ومرن مع صلابة قابلة للتعديل للركيزة لزراعة الخلايا

ملاحظة: ارتد معدات الحماية الشخصية المناسبة (قفازات، معطف مختبر، حماية للعين) عند التعامل مع PDMS و NuSil.

  1. أضف قاعدة سيلغارد 184 وعامل المعالجة بنسبة 10:1 حسب الوزن في طبق بلاستيكي.
  2. اخلط بقوة باستخدام مثبط اللسان (أو أداة مشابهة) لمدة 2-3 دقائق.
  3. قم بإزالة الغاز من الخليط لمدة ساعة.
  4. صب خليط PDMS في القالب السالب المخصص (الشكل 2A,B).
    1. أضف 1.3 جرام إلى القالب متساوي الاتجاه.
    2. أضف 0.5 جرام للقالب أحادي المحور.
      ملاحظة: حرص على توزيع الجل بشكل متساو على القالب.
  5. قم بإزالة الغازات من القالب لمدة ساعة.
  6. اترك الجل في القالب يستقر على سطح مستو في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين.
  7. يجفف عند 60 درجة مئوية طوال الليل.
  8. خلط الجزأين A وB من NuSil Gel-8100 بنسب متساوية (1:1) لمدة 15 دقيقة.
    1. امزجه مع رابط سيلغارد 184 عند 0.36٪ من الحجم الكلي لإنتاج ركيزة بصلابة 13 كيلو باسكال 32.
    2. لا تضيف أي رابط متقاطع لإنتاج ركيزة بصلابة 0.3 كيلو باسكال.
  9. قم بإزالة الغاز من الخليط لمدة 30 دقيقة.
  10. قم بإزالة جل PDMS بعناية من القالب المخصص. ضع الجل على غطاء بحجم 40 مم.
    ملاحظة: احرص على عدم تمزيق الجل لأنه هش.
  11. اسكب خليط NuSil على المنطقة السالبة من هلام PDMS.
    1. الهلام متساوي الخواص: 100 ميكرولتر.
    2. الجل أحادي المحور: 50 ميكرولتر.
  12. قم بطلاء جل PDMS المعنيين بخليط NuSil باستخدام طبقة سبين كوبر لمدة 50 ثانية عند 7 x g للحصول على سمك ركيزة موحد يبلغ 100 ميكرومتر.
  13. اترك الهلام يستقر على سطح مستو في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين قبل أن يجفف عند 60 درجة مئوية طوال الليل.
    ملاحظة: يرجى التأكد من أن جميع خطوات المعالجة تتم على سطح مستو. الجل غير المتساوي لن يسمح ببقاء المنطقة الكاملة المعنية في مستوى التصوير بالمجهر. إذا أظهر التصوير تباين في التركيز عبر مجال الرؤية، فقد يكون الجل قد تجالف على سطح غير مستو ويجب إعادة تشكيله.
  14. تخزين أطباق زراعة الخلايا المكتملة في أطباق بتري مغطاة حتى الاستخدام (الشكل 2D-E).

3. طلاء البروتين المصفوفة

  1. أضف 500 ميكرولتر من بولي-إل-ليسين (PLL، 500 ميكروغرام/مل) إلى كل ركيزة.
  2. حضن في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة.
  3. غسل الركائز 3 × مع 1 مل من PBS، تليها 3 × مع 1 مل من محلول HEPES 10 مللي مولار (pH 8.0).
  4. أضف 500 ميكرولتر من mPEG-SVA (50 ملغ/مل) إلى كل ركيزة.
  5. حضن في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة.
  6. اغسل الركائز 3 × مع 1 مل من PBS.
  7. استبدل PBS ب 500 ميكرولتر من PLPP (14.5 ملغ/مل).
  8. باستخدام نظام الميكروباترنينج PRIMO مع برنامج ليوناردو، يمكنك إسقاط النمط المحدد مسبقا على سطح الركيزة بضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة 30 ثانية.
  9. اغسل الركائز 3 × ب 1 مل من PBS وضعها تحت الأشعة فوق البنفسجية لمدة 15 دقيقة للتعقيم.
  10. أضف 500 ميكرولتر من الجيلاتين المتقارن بنسبة فلوريسين 0.1٪ إلى كل ركيزة.
  11. حضن في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة.
  12. اغسل 3 × ب 1 مل من PBS.
    ملاحظة: لرؤية الأنماط، حضانة الجيلاتين المرافق بالفلورسين بنسبة 0.1٪ لمدة ساعة في درجة حرارة الغرفة.
  13. تابع التصوير.

4. زراعة خلايا العضلات الملساء في مجرى الهواء البشري في الأطباق المطاطية

ملاحظة: قم بجميع إجراءات زراعة الخلايا في غطاء أمان حيوي باستخدام تقنية المعقم القياسية.

  1. احصل على خلايا العضلات الملساء في مجرى الهواء البشري الأولي (ASMCs) من ATCC (فيرجينيا) وتأكد من إزالة الهوية عن معلومات المتبرع وفقا لإرشادات NIH. تأكيد موافقة لجنة السلامة البيولوجية المؤسسية قبل بدء التجارب.
  2. استخدم خلايا من ثلاثة ممرضين أصحاء من الجنسين والأعمار المختلفة، وليس لديهم تاريخ من الربو أو الأمراض. مثال: أنثى واحدة (عمرها 18 سنة) واثنان من الذكور (أعمارهم 34 و59 سنة).
  3. زراعة الخلايا في ظروف قياسية (37 درجة مئوية، 5٪ CO ₂) واستخدام الخلايا حتى المقطع 6 لجميع التجارب.
  4. تنمو الخلايا في وسط النمو الكامل التالي:
    1. DMEM/F12 (500 مل)
    2. مصل البقري الجيني 10٪ (FBS) (50 مل)
    3. 1× البنسلين/الستربتوميسين (5 مل)
    4. 1× الأحماض الأمينية غير الأساسية MEM (5 مل)
    5. أمفوتيرسين B (0.5 مل)
  5. قم بتبديل الخلايا إلى وسط خال من المصل قبل القياسات لمدة لا تقل عن 24 ساعة. حضر وسط خال من المصل مع:
    1. طائرة هام F-12 متوسطة (500 مل)
    2. 1 × البنسلين/الستربتوميسين (5 مل)
    3. أمفوتريسين B (50 ميكروغرام/لتر)
    4. 1× الأحماض الأمينية غير الأساسية MEM (5 مل)
  6. قم بتعقيم أطباق زراعة الخلايا القابلة للتمدد بالأشعة فوق البنفسجية لمدة 15 دقيقة.
  7. حضن أطباق معقمة تحتوي على جيلاتين بنسبة 0.1٪ لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة قبل الزراعة (الشكل 2F).
    1. بالنسبة للركائز المزخرفة:
      1. الخلايا البذرية في زراعة الخلايا المرنة تنتشر بكثافة 10.4 خلايا/سم2.
      2. حضن في وسط مصل بنسبة 10٪ لمدة 10 دقائق لتعزيز الالتصاق بالمناطق النمطية.
      3. اغسل الآبار باستخدام PBS لإزالة الخلايا غير المتصلة.
      4. املأ الآبار بمتوسط مصل 10٪ وحضن لمدة 24 ساعة.
      5. استبدلها بوسط خال من المصل وحضن لمدة 24 ساعة قبل القياسات.
    2. للركائز غير المنقوشة:
      1. الخلايا البذرية عند الكثافة المطلوبة: 102 خلية/سم2 للخلايا المعزولة. 103 خلايا/سم 2 للخلايا المتناثرة. 104خلايا/سم2 للخلايا المتلاطمة.
      2. حضن في وسط مصل 10٪ لمدة 24 ساعة.
      3. استبدلها بوسط خال من المصل وحضن لمدة 24 ساعة قبل القياسات.

5. تصوير وتحليل الكالسيوم الفلوري

  1. ممرات ASMC تجوع المصب لمدة 24 ساعة.
  2. جهز صبغة FLIPR Ca2+ 6 وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
  3. اخلط صبغة FLIPR Ca2+ 6 مع وسط خال من المصل بنسبة 1:1.
  4. حضن الخلايا باستخدام محلول FLIPR Ca ² ⁺ 6 عند 37 درجة مئوية و5٪ CO ₂ لمدة ساعتين.

6. إعداد التصوير

  1. استخدم مجهر لايكا DMi8 مقلوب مزود ب:
    1. كاميرا DFC6000 لايكا
    2. محرك لايكا LED8 الخفيف
    3. 5×/0.12 هدف جاف
  2. اضبط الإثارة على 480/40 نانومتر والانبعاث عند 527/50 نانومتر.
  3. التقاط صور 16 بت بمعدل إطارات 2 هرتز أثناء تجارب التمدد.

7. تحليل البيانات

  1. استيراد تسلسلات الصور إلى فيجي (ImageJ) 33.
  2. حدد مناطق الاهتمام (ROIs) يدويا في السيتوبلازم لكل خلية.
  3. استخرج متوسط قيم شدة التدرج الرمادي لكل عائد استثمار على مدى الزمن.
  4. معالجة بيانات شدة الفلورة باستخدام سكريبت MATLAB مخصص.
    ملاحظة: شدة الفلورة تتناسب مع السيتوسوليك [Ca2+].

8. قياسات وتحليل قوة الجر

ملاحظة: جميع الرموز، بما في ذلك تلك الخاصة بتحليل الصور، وميكروسكوب قوة الجر، والتحكم الحركي، متوفرة في مستودع GitHub الخاص بنا: https://github.com/Breathe-Lab/A-Novel-Platform-for-In-Vitro-Cellular-Stretching-and-Imaging

  1. طبقة من خرز فلورية لتغطية طبقة من خرز الفلورسنت لتكون علامات ائتمانية لمجهر قوة الجر.
  2. تحضير محلول 0.025٪ من ميكروكرات فلورية حمراء معدلة بالكربوكسيلات بقطر 1 ميكرومتر في HBSS عن طريق تخفيفه إلى نسبة 1:4000.
  3. Vortex هو محلول الخرز لمدة 10 ثوان.
  4. أضف محلول الخرزات إلى الجل.
    1. 880 ميكرولتر إلى هلام متساوي الخواص.
    2. 420 ميكرولتر إلى هلام أحادي المحور.
  5. حضن في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة للسماح للخرزات بالالتصاق.
  6. بعد ساعة، أزل المحلول بحذر.
    ملاحظة: صب محلول الخرز بلطف على الجل الطري. الإزالة غير السليمة تمنع توزيع الخرزات بشكل صحيح.
  7. امسح أي محلول متبقي بلطف باستخدام عود قطن أو كيموائب.
  8. تخيل الخرزات باستخدام مجهر لايكا DMi8 المزود بهدف جاف 10x/0.32.
  9. التقط الصور في حالة ما قبل التمدد وبشكل مستمر طوال بروتوكول التمدد.
    ملاحظة: قم بإجراء جميع التصوير في مركز الركيزة حيث يكون تجانس الإجهاد الأعلى. إذا لزم الأمر، أعد تركيز المجهر في الوضع المشدود قبل التقاط الصور.
  10. تحليل الصور باستخدام رمز MATLAB مخصص يعتمد على مجهر قوة الجر فورييه لحساب متجهات الإزاحة وحقول الإجهاد المستوية المقابلة 34.
  11. تمثيل البيانات كمتوسط N تجارب.

9. معايرة جهاز شد الخلايا

  1. أضف 500 ميكرولتر من H₂O إلى البئر لمحاكاة وزن وسط زراعة الخلايا والحفاظ على رطوبة نمط البروتين.
  2. للبروتوكولات المتعلقة بإنشاء أنماط بروتينية محددة، يرجى مراجعة القسم 3 بعنوان "طلاء البروتين المصفوف".
  3. أنماط الفلورسنت في الصورة كل 400 ميكرومتر من خطوات إزاحة المحرك، وترتفع إلى حد أقصى 2800 ميكرومتر، ثم تعود إلى الصفر بزيادات عكسية قدرها 400 ميكرومتر.
  4. توصيف العلاقة بين الإزاحة الخطية من المحرك الخطي والتشوه المتساوي لطبق زراعة الخلايا القابل للتمدد على المستويين الكبير والإقليمي من خلال قياس التغيرات في المساحة والانحراف في الحروف النمطية البروتينية الفلورية التي تكتب "BREATHE" على الركيزة المرنة أثناء التمدد. استخدم صندوق تحيط مستطيل يشمل جميع الحروف لحساب مساحة وانحراف الكلمة بأكملها.
  5. تطبيق تقسيم الصور في MATLAB لقياس هذه المعاملات لكل حرف فردي.
  6. عرف الإزاحة الصفرية بالأبعاد غير الممتدة لطبق زراعة الخلية.
  7. كرر كل تجربة عبر آبارين إلى ثلاثة آبار زراعة خلايا قابلة للتمدد معدة بشكل مستقل لضمان قابلية التكرار.

10. عرض البيانات والاختبار الإحصائي

  1. بالنسبة لتجارب معايرة النقالات، عرف التجارب كعدد الدورات.
  2. عرض كل تجربة بشكل منفصل بدلا من دمجها في منحنى واحد لإظهار تكرار النظام.
  3. يشير إلى أشرطة الخطأ كانحراف معياري.
  4. استخدم تحليل أنوفاس أحادي الاتجاه لاختبار الفروق الدلالة في مجموعات البيانات التي تتأثر فيها ثلاث مجموعات أو أكثر بعامل مستقل واحد.
  5. استخدم تحليلات ANOVA ثنائية الاتجاه تليها مقارنات زوجية لاحقة لاختبار الفروق الدلالة في مجموعات البيانات المتأثرة بعاملين مستقلين.
  6. تطبيق اختبار t للمقارنات الزوجية عندما تكون البيانات موزعة بشكل طبيعي.
  7. تطبيق اختبار مجموع الترتيب مان-ويتني لمقارنة القيم الوسيطة عندما لا تكون البيانات موزعة بشكل طبيعي.
  8. أبلغ عن الاختبارات المحددة المستخدمة، وعدد العينات، والقيم المقابلة، مع النتائج.
  9. استخدم عتبة قيمة P مقدارها 0.05 لتحديد الفروق ذات الدلالة الإحصائية بين مجموعات البيانات.
  10. قم بإجراء اختبارات إحصائية باستخدام SigmaStat.
  11. أشكال الحبكة في GraphPad Prism وMATLAB.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يقوم جهاز الخلية بحدوث تغييرات ماكروسكوبية في المنطقة تعكس تشوهات موضعية. لتقييم السلوك المتساوي الخواص، قمنا بقياس تغيرات مساحة نمط بروتين الجيلاتين الفلوري الذي يشكل كلمة "BREATHE" على بئر زراعة خلوية قابلة للتمدد، إلى جانب حروفها الفردية، على ركيزة متساوية الخواص. أظهرت نتائجنا أن كل من الكلمة والحروف الفردية أظهرتا تغيرات متكافئة في المساحة (الشكل 3A,B). في الشكل 3B، تمثل الدوائر الزرقاء وأشرطة الخطأ متوسط و...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذا البروتوكول، نصف تصميم وتطوير والتحقق من صحتها وتنفيذ ممدد خلوي جديد متوافق مع المجهر يمكنه تقليد الإجهاد متساوي الخواص وأحادي المحور مع تصوير الخلايا الحية في الوقت نفسه. هذا الجهاز مضغوط ويمكن وضعه على مرحلة مجهر لايكا DMi8، حيث يحصر جميع الأجزاء المتحركة في مستوى واحد للسماح بالتصوير الحي مع الحفاظ على التركيز على الركيزة والخلايا الأساسية. تم ذلك باستخدام أذرع مائلة مستوحاة من هندسة كرة هوبرمان ثنائية الأبعاد. هذا التكوين ثنائي الأبعاد يقيد الحركة إلى مستوى واحد، وهو أمر ضروري ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لا يوجد لدى أي من المؤلفين مصالح متنافسة ليعلنها.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يشكر المؤلفون السيد نوح جوزيف على مساعدته في تصنيع القوالب. يشكر المؤلفون هيتور موراتو وغلين ثاير في منشأة الأدوات العلمية بجامعة بوسطن على مساعدتهما في تصنيع الجهاز. وقد تم دعم هذا العمل من خلال منحة مهنية #2047207 من مؤسسة العلوم الوطنية (NSF) التي منحت لهاريكريشنان باراميسواران. ابتكر ه.ب. البحث. طور S.E.S. وS.R.P. التصميم العام للجهاز، وصمم S.E.S. وH.P. التجارب متساوية الخواص. أجرت S.E.S تجارب القوالب متساوية الخواص، وحللت بيانات التجارب، وفسرت النتائج مع H.P. V.C. صممت القوالب أحادية المحور، وحسنت تحضير الجل وتزيين الخرز. أجرت B.M.G تجارب الهلام أحادي المحور، وحللت البيانات التجريبية، وفسرت النتائج مع H.P. وV.C. وأعدت S.E.S. وB.M.G الأرقام. ساهمت ب.م.ج، س.إي.إس، في.سي. وه.ب. في صياغة وتحرير المخطوطة. وافق مجلس المعالجة على النسخة النهائية من المخطوطة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
  دولبيكو' النسر المعدل' s متوسط/F12فيشر ساينتيفك12634010500 ملم 
كلوريد ثلاثي ميثيل أمونيوم (4-بنزويل بنزيل) (PLPP)ألف&إيكيوت؛ أوليلا يوجد14.5 ملغ/مل
0.1٪ فلوريسين الجيلاتين المترافق إنفيتروجينG13187
محلول الجيلاتين 0.1٪سيغما-ألدرتشES-006500 ملم 
1 & mu; كرات ميكروكرات فلورية حمراء معدلة بالكربوكسيلات ذات قطر mفلوسفراتF8816
1× محلول الأحماض الأمينية غير الأساسية MEMسيغما-ألدرتشM7145100 مل
1× البنسلين/الستربتوميسينفيشر ساينتيفك15-140-122100 مل
مصل البقر الجيني 10٪العلم الحراريA5256701500 ملم 
أنبوب 15 ملفيشر ساينتيفك14-959-53A
1x جلوتامين  فيشر ساينتيفكMT10010CM
مكمل نمو الإنسولين-ترانسفيرين-سيلينيوم واحدكورنينج لايف ساينسز25-800-CR
الأمفوتيرسين Bسيغما-ألدرتشA294225 & mu; ج/لتر
كرات المحاملماكماستر-كار لا يوجد
ديهيدرات كلوريد الكالسيومسيغما-ألدرتش223506
سكة العرباتماكماستر-كار لا يوجد
فليبر كا<سوب>2+ 6الأجهزة الجزيئيةR8190
منشور جراف باددوتماتكسلا يوجد
حم' إس F-12 متوسط سيغما-ألدرتشN8641500 ملم 
محلول الملح المتوازن لهانكس العلم الحراري14025092500 ملم 
مخزن HEPES العلم الحراري15630080100 مل
ليوناردو سوفتويرألف&إيكيوت؛ أوليلا يوجد
ماتلابماث ووركسلا يوجد
ميثوكسي بولي إيثيلين جليكول & ndash; سوكينيميديل فاليريت (mPEG-SVA)شركة لايسان بيولا يوجد50 ملغ/مل
Nusil Gel-8100Nusil لا يوجد
أطباق بتيريالعلم الحراري26399190 مم 
محلول ملحي مخزن بالفوسفات سيغما-ألدرتش10010023500 ملم 
بولي-إل-ليسين (PLL)سيغما-ألدرتشP8920500μ g/mL
خلايا العضلات الملساء في مجرى الهواء البشري الأولية ATCCPCS-130-011
وحدة PRIMO البصرية ألف&إيكيوت؛ أوليلا يوجد
البراغيماكماستر-كار لا يوجد
سيغما ستاتبرنامج النظاملا يوجد
سبين كواترلوريلالطراز WS-650MZ-23NPPB
مكونات ربط النقالة والمرحلة  منشأة الأدوات العلمية في جامعة بوسطنلا يوجدالفولاذ المقاوم للصدأ
مجموعة الأساس من سيلغارد 184 وأدوات المعالجةداوH047J8Q026
قارورة زراعة الأنسجة T-25 - غطاء فتحة التهوية، معقمسيل تريت229331
مثبط اللسان  العلم الحراري22-363-154

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Alvarez, Y., Smutny, M. Emerging role of mechanical forces in cell fate acquisition. Front Cell Dev Biol. 10, 864522(2022).
  2. Vining, K. H., Mooney, D. J. Mechanical forces direct stem cell behaviour in development and regeneration. Nat Rev Mol Cell Biol. 18, 728-742 (2017).
  3. Liu, M., Tanswell, A. K., Post, M. Mechanical force-induced signal transduction in lung cells. Am J Physiol. 277, L667-L683 (1999).
  4. Stasiak, S. E., Jamieson, R. R., Bouffard, J., Cram, E. J., Parameswaran, H. Intercellular communication controls agonist-induced calcium oscillations independently of gap junctions in smooth muscle cells. Sci Adv. 6 (32), eaba1149(2020).
  5. Riley, D. J., Rannels, D. E., Low, R. B., Jensen, L., Jacobs, T. P. NHLBI workshop summary: effect of physical forces on lung structure, function, and metabolism. Am Rev Respir Dis. 142, 910-914 (1990).
  6. Humphrey, J. D., Dufresne, E. R., Schwartz, M. A. Mechanotransduction and extracellular matrix homeostasis. Nat Rev Mol Cell Biol. 15, 802-812 (2014).
  7. Gong, F., et al. An overview of the role of mechanical stretching in the progression of lung cancer. Front Cell Dev Biol. 9, 781828(2021).
  8. Jaalouk, D. E., Lammerding, J. Mechanotransduction gone awry. Nat Rev Mol Cell Biol. 10, 63-73 (2009).
  9. Tilghman, R. W., et al. Matrix rigidity regulates cancer cell growth and cellular phenotype. PLoS One. 5, e12905(2010).
  10. Hannezo, E., Heisenberg, C. -P. Mechanochemical feedback loops in development and disease. Cell. 178, 12-25 (2019).
  11. Das, S., Ippolito, A., McGarry, P., Deshpande, V. S. Cell reorientation on a cyclically strained substrate. PNAS Nexus. 1, pgac199(2022).
  12. Dartsch, P. C., Hämmerle, H., Betz, E. Orientation of cultured arterial smooth muscle cells growing on cyclically stretched substrates. Acta Anat. 125, 108-113 (1986).
  13. An, S. S., et al. Cell stiffness, contractile stress and the role of extracellular matrix. Biochem Biophys Res Commun. 382, 697-703 (2009).
  14. Arold, S. P., Bartolák-Suki, E., Suki, B. Variable stretch pattern enhances surfactant secretion in alveolar type II cells in culture. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 296, L574-L581 (2009).
  15. Trepat, X., et al. Universal physical responses to stretch in the living cell. Nature. 447, 592-595 (2007).
  16. Benavides Damm, T., Egli, M. Calcium 's role in mechanotransduction during muscle development. Cell Physiol Biochem. 33, 249-272 (2014).
  17. Ito, S., et al. A novel Ca2+ influx pathway activated by mechanical stretch in human airway smooth muscle cells. Am J Respir Cell Mol Biol. 38, 407-413 (2008).
  18. Ito, S. Stretch-activated calcium mobilization in airway smooth muscle and pathophysiology of asthma. Curr Opin Physiol. 21, 65-70 (2021).
  19. Ito, S., et al. Actin cytoskeleton regulates stretch-activated Ca2+ influx in human pulmonary microvascular endothelial cells. Am J Respir Cell Mol Biol. 43, 26-34 (2010).
  20. Tanaka, Y., Hata, S., Ishiro, H., Ishii, K., Nakayama, K. Quick stretch increases the production of inositol 1,4,5-trisphosphate (IP3) in porcine coronary artery. Life Sci. 55, 227-235 (1994).
  21. Brown, T. D. Techniques for mechanical stimulation of cells in vitro: a review. J Biomech. 33, 3-14 (2000).
  22. Kamble, H., Barton, M. J., Jun, M., Park, S., Nguyen, N. T. Cell stretching devices as research tools: engineering and biological considerations. Lab Chip. 16, 3193-3203 (2016).
  23. Fredberg, J. J., Bunk, D., Ingenito, E., Shore, S. A. Tissue resistance and the contractile state of lung parenchyma. J Appl Physiol. 74, 1387-1397 (1993).
  24. Shen, Z. L., Dodge, M. R., Kahn, H., Ballarini, R., Eppell, S. J. Stress-strain experiments on individual collagen fibrils. Biophys J. 95, 3956-3963 (2008).
  25. Atcha, H., et al. A low-cost mechanical stretching device for uniaxial strain of cells: a platform for pedagogy in mechanobiology. J Biomech Eng. 140, 0810051-0810059 (2018).
  26. Tschumperlin, D. J., Margulies, S. S. Equibiaxial deformation-induced injury of alveolar epithelial cells in vitro. Am J Physiol. 275, L1173-L1183 (1998).
  27. Meza, D., Abejar, L., Rubenstein, D. A., Yin, W. A shearing-stretching device that can apply physiological fluid shear stress and cyclic stretch concurrently to endothelial cells. J Biomech Eng. 138, 4032550(2016).
  28. Ursekar, C. P., et al. Design and construction of an equibiaxial cell stretching system that is improved for biochemical analysis. PLoS One. 9, e90665(2014).
  29. Pelham, R. J., Wang, Y. L. Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility. Proc Natl Acad Sci U S A. 94, 13661-13665 (1997).
  30. Cell stretching bioreactor FAQs. , Flexcell International. https://www.flexcellint.com/resources/faq (2024).
  31. Bossé, Y. The strain on airway smooth muscle during a deep inspiration to total lung capacity. J Eng Sci Med Diagn Ther. 2, 010802(2019).
  32. Yoshie, H., et al. Traction force screening enabled by compliant PDMS elastomers. Biophys J. 114, 2194-2199 (2018).
  33. Schindelin, J., et al. Fiji: an open source platform for biological image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  34. Butler, J. P., Toli ć-Nørrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings. Am J Physiol Cell Physiol. 282, C595-C605 (2002).
  35. Dessalles, C. A., Leclech, C., Castagnino, A., Barakat, A. I. Integration of substrate- and flow-derived stresses in endothelial cell mechanobiology. Commun Biol. 4, 764(2021).
  36. Ji, G., Barsotti, R. J., Feldman, M. E., Kotlikoff, M. I. Stretch-induced calcium release in smooth muscle. J Gen Physiol. 119, 533-543 (2002).
  37. Davis, M. J., Meininger, G. A., Zawieja, D. C. Stretch-induced increases in intracellular calcium of isolated vascular smooth muscle cells. Am J Physiol. 263, H1292-H1299 (1992).
  38. Naruse, K., Sokabe, M. Involvement of stretch-activated ion channels in Ca2+ mobilization to mechanical stretch in endothelial cells. Am J Physiol. 264, C1037-C1044 (1993).
  39. Arold, S. P., Bartol ák-Suki, E., Suki, B. Variable stretch pattern enhances surfactant secretion in alveolar type II cells in culture. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 296, L574-L581 (2009).
  40. Cell stretching bioreactors. , Flexcell International. https://www.flexcellint.com (2024).
  41. Mitrossilis, D., et al. Single-cell response to stiffness exhibits muscle-like behavior. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 18243-18248 (2009).
  42. Parameswaran, H., Lutchen, K. R., Suki, B. A computational model of the response of adherent cells to stretch and changes in substrate stiffness. J Appl Physiol. 116, 825-834 (2014).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة