مقالة منهجية

حقن الأسفل داخل القضيب لجرعات SOD1-ASOs لاستهداف الجهاز العصبي المركزي بدقة وفعالية تنبؤية في فئران ALS المصابة ب SOD1-G93A البشرية

1.2K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/69788

⸱

فبراير 24, 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Biogen

في هذه المقالة

ملخص

تفصل هذه المقالة طرق التوصيل داخل الفصائل للعلاجات الموجهة للجهاز العصبي المركزي في الفئران البالغة، مع التركيز على دقة البروتوكول وتمكين الحقن المتكرر. يتضمن نتائج دراسة تحقق حيث قللت أوليغونوكليوتيدات مضادة من تعبير SOD1 الطافور في فئران نموذج SOD1-ALS، مما يدعم فائدة هذا النهج في البحث ما قبل السريري على الأمراض التنكسية العصبية.

الملخص

يوفر إعطاء العلاجات الموجهة للجهاز العصبي المركزي (CNS) عبر المركز (IT) طريقا طفيفا التوغل لتوصيل الدواء مباشرة إلى السائل الدماغي الشوكي (CSF)، مما يسهل تحسين الخصوصية وتفاعل الأهداف. بينما يعد قسطرة تقنية التقنية معيارا للولادة المستمرة في الفئران، إلا أن تطبيقها في الفئران محدودة بسبب القيود التشريحية وارتفاع خطر حدوث مضاعفات مرتبطة بالإجراءات، بما في ذلك إصابات العمود الفقري والعدوى. لتجاوز هذه القيود، استخدمنا تقنية الثقب الحاد بالإبر لتوصيل الأدوية بتقنية المعلومات في الفئران البالغة، مما وفر بديلا قابلا للتكرار وأقل توغليا متوافقا مع أنظمة الجرعة الفردية أو المتكررة. في نموذج فأر معدل وراثيا للتصلب الجانبي الضموري (ALS) الذي يحمل طفرة SOD1-G93A، حققنا توصيل فعال لتقنية المعلومات الأوليجونكليوتيدات المضادة للحساسية (ASOs) التي تستهدف جين SOD1. وقد أدى هذا النهج إلى تقليل تعبير SOD1 الطفرا بشكل فعال وحسن بشكل كبير من النمط الظاهري للمرض، كما أظهرت تقييمات الفيزيولوجيا الكهربائية والمؤشرات الحيوية. تؤكد هذه النتائج صحة كل من طريقة توصيل المعلومات وفعالية العلاج، مع نتائج مماثلة لإعطاء الجهاز الداخلي البطيني (ICV). والأهم من ذلك، أن هذه التقنية تعكس الإجراءات المستخدمة في الدراسات السريرية البشرية، مما يوفر أهمية وفائدة انتقالية قوية في التقييم قبل السريري للتدخلات الموجهة من الجهاز العصبي المركزي. على الرغم من أن الخبرة التقنية مطلوبة لضمان الاتساق وتجنب التأثيرات غير المستهدفة، إلا أن استراتيجية تقديم تكنولوجيا المعلومات هذه تمثل منهجية قوية وقابلة للتكرار وذات صلة سريرية لتعزيز تطوير العلاج في نماذج الحيوانات الصغيرة.

المقدمة

في هذه الدراسة، نصف بروتوكول حقن داخل القطب القطني (IT)، ونقارنه مع التوصيل داخل الجهاز الدماغي البطيني (ICV)، ونقيم النتائج الديناميكية الدوائية والتحمل لتوجيه تطوير العلاجات الموجهة للجهاز العصبي المركزي. تمثل العلاجات المستهدفة بالحمض النووي الريبي، وخاصة الأوليجونكليوتيدات المضادة للحس (ASOs)، وسيلة واعدة لأمراض الجهاز العصبي المركزي من خلال تمكين التعديل بعد النسخ لتعبير الجينات. تعد هذه الأساليب ذات صلة خاصة بالاضطرابات التنكسية العصبية، حيث يؤكد فقدان الخلايا العصبية التدريجي الحاجة إلى تدخلات دقيقة وموضعية وفي الوقت المناسب لتعديل تقدم المرض المحتمل. هنا، نقارن مباشرة فعالية بروتوكول حقن تكنولوجيا المعلومات مع توصيل ICV لعلاجات ASO.

في الدراسات ما قبل السريرية، تم استخدام حقن القطن داخل الجرعة في الفئران البالغة (ذكر أو إناث، بعمر 30-70 يوما، وزن 13-20 جرام) لتوصيل العوامل الدوائية أو الناقلات البيولوجية مباشرة إلى السائل الدماغي الشوكي (CSF) لجهاز الجهاز العصبي المركزي المستهدف 1,2. عادة ما تعطى أحجام الحقن التي تتراوح بين 5-10 ميكرولتر ببطء للحد من الزيادات العابرة في ضغط السائل النخاعي والارتجاع، مع تحقيق الوصول داخل العضلات عبر الفضاء بين الفقرات L5-L6 1,2. يعتمد النجاح الإجرائي على تقنية دقيقة لتجنب الإصابات العصبية، حيث يؤثر العمر ووزن الجسم على حجم وتعامل السائل النخاعي. استخدام إبر دقيقة (مثل إبرة 27-30 جيلون مرتبطة بحقنة هاميلتون بسعة 25 ميكرولتر) يتيح توصيلموثوق 2. تشمل التحديات التقنية الرئيسية تقليل خسائر الفراغ الميت، ومنع الحقن الخاطئ وتسرب التخدير فوق الجافية، وتقليل التباين المعتمد على المشغل الذي قد يؤثر على دقة الجرعات وتوزيع السائل الدماغي الدماغي.

يظل تطوير علاجات فعالة لاضطرابات الجهاز العصبي المركزي تحديا كبيرا بسبب التعقيد الهيكلي وتباين الخلايا في الجهاز العصبي المركزي. تعيق هذه الميزات توصيل الأدوية المستهدف وتقيد التوزيع الحيوي عبر حواجز تشريحية وفسيولوجية متعددة، مما يستلزم استراتيجيات توصيل متخصصة. تنشأ عقبة رئيسية من الحواجز الفسيولوجية والتشريحية في جميع أنحاء الجهاز العصبي المركزي التي تحد من اختراق الأدوية. يتم تغليف الدماغ والحبل الشوكي بثلاث طبقات سحائية: الجاف الجافي، والركب العناكبي، والعضلة العمودية الصغيرة، والتي، مع الحاجز الدموي-الدماغي (BBB)، توفر دفاعا قويا ضد العلاجات المتداولة والجزيئات الأخرى في الدم. على الرغم من ضرورتها للحفاظ على استقرار الجهاز العصبي المركزي، إلا أن هذه الحواجز تعيق بشكل كبير توصيل الجزيئات الكبيرة المحبة للماء مثل ASOs، والأجسام المضادة وحيدة النسيلة، والناقلات الفيروسية 1,2,3,4. توفر إدارة تكنولوجيا المعلومات وسيلة لتجاوز هذه القيود من خلال إدخال العلاجات مباشرة إلى السائل الدماغي داخل الفضاء تحت العنكبوتية. يسهل هذا المسار توزيع الأدوية عبر حجرات الجهاز العصبي المركزي، مما يعزز اختراق الأنسجة بشكل أوسع، وبالتالي يمكن من التفاعل الفعال مع الأهداف المعبر عنها في أنواع خلايا متنوعة داخل الجهاز العصبي المركزي. منذ استخدامه الأولي من قبل هيلدن وويلكوكس في عام 1980 لتوصيل المورفين في الفئران1، أصبحت حقن تكنولوجيا المعلومات طريقة أكثر استخداما لتوصيل مجموعة متنوعة من العوامل العلاجية، بما في ذلك الجزيئات الصغيرة، والبيولوجيات، وناقلات العلاج الجيني، وASOs 5,6,7,8,9,10.

ASOs هي أوليجونوكليوتيدات أحادية السلسلة مصممة كيميائيا لربط تسلسلات الحمض النووي الريبي المكملة وتعديل التعبير الجيني من خلال آليات مثل تحلل RNase بالهيدروجين، وتعديل التوصيلات، والتثبيط الفراغي للترجمة11،12،13،14،15. تعزز التحسينات الكيميائية مثل تعديلات العمود الفقري للفوسفوروثيويت، واستبدالات 2'-O-ميثوكس إيثيل (2'-MOE)، وبقايا الإيثيل المقيدة من استقرارها، وارتباطها، ومقاومتها للنوكليازات6. وقد دعمت هذه الخصائص تطبيقها في استهداف الجينات الممرضة المرتبطة بالاضطرابات العصبية الوراثية. أظهرت العلاجات المبنية على ASO التي تعطى داخل العضلات فوائد سريرية في أمراض مثل ضمور عضلات العمود الفقري (SMA) والتصلب الجانبي الضموري (ALS)12،13،14،15. على سبيل المثال، يعزز نوسينرسن (سبينرازا) إدراج الإكسون 7 في نسخ SMN2 لتعويض فقدان SMN1 في SMA 7,14. كما تم استكشاف استراتيجيات مماثلة تستهدف نسخ هنتنغتين الطفرة في مرض هنتنغتون12,13. على الرغم من أن هذه التجارب أنهيت في أوائل16 عاما، إلا أنها تؤكد استمرار الاهتمام بأساليب ASO الموجهة من CNS.

ALS هو اضطراب تنكسي عصبي قاتل يتميز بتنكس تدريجي لكل من الخلايا الحركية العلوية والسفلية. يصيب المرض بين 6 و9 أفراد لكل 100,000 حول العالم ويحدث بمعدل يقارب حالتين لكل 100,000 شخص-سنة، ويظهر ضعف عضلي وتشنجات متزايدة تدريجيا، حيث يموت معظم المرضى بسبب فشل تنفسي عصبي عضلي خلال سنتين إلى ثلاث سنوات بعد بدء الأعراضفي 17. بينما تكون معظم الحالات متقطعة (sALS)، حوالي 10٪ منها عائلية (fALS)، مما يوفر رؤى حول الدوافع الوراثية للمرض. من بين أكثر الجينات التي تم دراستها هو ديسيوتاز فائق أكسيد Cu/Zn 1 (SOD1)، الذي يمثل ما يقارب 15 إلى 20٪ من متلازمة التصلب الطبيعي، وأقل من 2٪ من متلازمة التصلب الوراثي، ويتم توريثه بطريقة سائدة جسدية18. يشفر SOD1 إنزيما مضادا للأكسدة سيتوبلازميا يقوم بإزالة سموم أنواع الأكسجين التفاعلية عن طريق تحويل جذور الأكسجين الفائقة إلى بيروكسيد الهيدروجين. تظهر أشكال SOD1 الطفرة، مثل G93A وA4V وH46R، عدم استقرار شكلي، مما يؤدي إلى تجمع البروتينات وزيادة الوظيفة السامة التي تساهم في الإجهاد التأكسدي، وخلل الميتوكوندريا، والسمية الإثارية 19,20,21,22,23,24,25 . علاوة على ذلك، يتفاقم مرض مرض التصلب الجانبي الضموري بسبب الآليات غير الخلوية المستقلة التي تشمل الخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا النجمية، والتي تساهم في بيئة التهابية مزمنة وإصابة عصبية تقدمية26،27،28،29. لذا، فإن كتم تعبير SOD1 باستخدام ASOs يقدم طريقا علاجيا واعدا للتخفيف من مسببات الأمراض.

نموذج الفأر المعدل وراثيا SOD1-G93A (سلالة جاكس #: 004435)، الذي يعبر عن الشكل البشري الطافر ل SOD1 تحت سيطرة محفز SOD1 الداخلي البشري، يعيد عن كثب السمات السريرية لمرض ALS، بما في ذلك العجز الحركي المبكر، والتنكس العصبي للحبل الشوكي، وقصر فترة البقاء30. أظهرت الدراسات قبل السريرية السابقة أن إعطاء ASOs الخاصة ب SOD1 من خلال الولادة المستمرة داخل البطين باستخدام مضخات أسموزية في فئران SOD1-G93A في اليوم بعد الولادة 65 بجرعة يومية تبلغ 100 ميكروغرام لمدة 28 يوما متتالية يؤدي إلى تثبيط كبير لمستويات SOD1، وتقليل الاستجابات الالتهابية العصبية، وتأخر ظهور العلامات السريرية، وتحسن الأداء الحركي31. علاوة على ذلك، ارتبط الانخفاض الناتج عن ASO لمستوى SOD1 لدى الأشخاص المصابين ب SOD1-ALS بانخفاض مستويات سلسلة الخيوط العصبية الخفيفة (NfL)، وهي مؤشر حيوي دم يدل على تلف المحور العصبي32. في هذا البحث، أجرينا ASOs المستهدفة ل SOD1 عبر حقن تكنولوجيا المعلومات في فئران SOD1-G93A وقمنا بتقييم تأثيرها عبر قراءات الجزيئات والكهروفسيولوجيا والمؤشرات الحيوية. كشف التحليل الكمي لأنسجة الحبل الشوكي عن انخفاضات كبيرة في مستويات mRNA في SOD1. أظهرت التقييمات الكهربائية الفسيولوجية لجهود عمل العضلات المركبة (CMAPs) الحفاظ على الوظائف العصبية العضلية. في الوقت نفسه، انخفضت مستويات NfL في المصل، مما يعكس تخفيف الإصابة العصبية المستمرة.

لتقييم التوزيع المكاني والفعالية النسبية لطرق توصيل الجهاز العصبي المركزي البديلة، أدرجنا ذراعا مقارنا يستخدم حقن البطين الداخلي (ICV)، حيث يتم إدخال العامل العلاجي إلى البطينين الجانبين لنشره عبر تدفق السائل الشوكي الشوكي على طول الفراغات الظهرية وحول الأوعية الدموية33. من خلال مقارنة طرق إعطاء تقنية المعلومات والعلاج بالحقن الخلفي، هدفنا إلى تحديد الفروقات في النتائج الدوائية واستهداف الأنسجة، وبالتالي تحسين استراتيجيات التوصيل لعلاجات ASO الموجهة من الجهاز العصبي المركزي. بالإضافة إلى ذلك، لتقييم جدوى الترجمة، أجرينا دراسات تحمل مستقلة شملت ما يصل إلى أربع حقن تكنولوجيا معلومات لكل حيوان بفاصل ثمانية أسابيع. في جميع الأنظمة التي تم اختبارها، لم تلاحظ علامات واضحة على الضيق أو المراضة، مما يدعم تحمل جرعات I-ASO في سياق البقاء. تتوافق هذه النتائج مع التقارير السابقة التي أظهرت تحمل الحقن المتكررة داخل الجرعة في الفئران34.

تدعم الموافقات التنظيمية الأخيرة لتقديم ASO في تكنولوجيا المعلومات على السريرية من خلال الموافقات التنظيمية الأخيرة لمشروع Tofersen (QALSODY)® لمرض ALS35 المرتبط ب SOD1. أظهرت الدراسات السريرية تفاعلا قويا في الأهداف، وانعكس ذلك في انخفاض في بروتين السائل النخاعي SOD1، تلاها انخفاض في مستويات السلاسل الخفيفة في الخيوط العصبية، وهي علامة حيوية لإصابة العصبية المحورية. على الرغم من أن الهدف الأساسي لم يتحقق في المرحلة الثالثة الأولى من تجربة VALOR، إلا أن التحليلات المتكاملة بما في ذلك الامتداد مفتوح المعلم أشارت إلى فوائد محتملة لبدء العلاج المبكر35.

تظهر البيانات مجتمعة أن توصيل تقنية المعلومات لمضادات الحمض النووي المستهدفة SOD1 في نموذج الفأر ALS من SOD1-G93A يحقق تحطيما جزيئيا فعالا، وتحسينا للمؤشرات الحيوية، والحفاظ على الوظائف مع تحمل مناسب. تدعم هذه النتائج تقديم تقنية المعلومات ASO كنهج عقلاني وعملي سريريا لاضطرابات الجهاز العصبي المركزي الوراثية، وتوفر إطارا قويا ما قبل السريري لاستمرار التطور الانتقالي.

البروتوكول

تمت الموافقة على جميع الإجراءات هنا وأجريت وفقا لبروتوكولات معتمدة من الاتحاد الدولي للعلوم والاتصالات وإرشادات النظافة الكيميائية والسلامة الحيوية المؤسسية.
ملاحظة: أجر دراسات على فئران معدلة وراثيا C57BL/6J (JAX #000664) وSOD1-G93A (JAX #004435) تم إيجادها في ظروف قياسية (دورة ضوء/ظلام لمدة 12 ساعة، 22-24 درجة مئوية، الوصول المناسب للطعام والماء).

1. تطبيق ASOs المعدلة كيميائيا على استهداف SOD1

  1. استخدام أوليغونيوكليوتيدات مضادة للحساسية (ASOs) المثبتة لاستهداف النيوكليوتيدات 613-629 تحديدا ضمن المنطقة غير المترجمة (UTR) من جين SOD1 البشري (RefSeq: NM_000454.5)36: A*GoToG*T*T*T*A*T*T*ToToA*T*C
  2. تتضمن تعديلات كيميائية مثبتة لتعزيز الاستقرار والفعالية، من خلال دمج MOE (2'-O-Methoxyethyl) (المشار إليه بخط عادي)، cEt (الإيثيل المقيد) (مائل)، DNA (خط عريض)، روابط الفوسفات (o)، وروابط الفوسفوروثيوات (*)، كما ذكر سابقافي 36. يقدم الملف التكميلي 1 كيمياء ASO مع ترميز الألوان المقابل.
  3. جهز ASO للتحكم غير المستهدف بدون تكامل لجينومات البشر أو القوارض، باتباع نفس نظام التعديل للاستخدام كضابط: C*CoToAoT*A*G*G*A*C*T*A*T*C*C*AoGoA*A

2. إعداد والتعامل مع حلول ASO في ظروف معقمة

  1. إعادة تكوين ASO في السائل الدماغي الشوكي الاصطناعي المعقم (aCSF؛ الجدول 1) إلى تركيز 10 ملغ/مل في ظروف معقمة، مستهدفا حجم حقن نهائي يبلغ 10 ميكرولتر (100 ميكروغرام) لكل حيوان.
  2. اخلط المحلول بلطف باستخدام ماصة معقمة للحفاظ على السلامة الجزيئية، ثم قم بتدوير خفيف لمدة 5-10 ثوان لضمان خلطه جيدا.
  3. قم بترشيح المحلول المخفف عبر فلتر حقن معقم بحجم 0.2 مم لإزالة الجسيمات والملوثات.
  4. يتم تقسيم المحلول النهائي معقم إلى أنابيب الطرد المركزي الدقيق المعقمة وتخزينها عند 4 درجات مئوية في وحدة مراقبة وتحكم في درجة الحرارة لمدة تصل إلى أسبوع، مع تجنب دورات التجميد والذوبان للحفاظ على الاستقرار.

3. تحضير الفأر قبل الحقن داخل القضيب

  1. وزن كل فأر إلى أقرب 0.1 جرام باستخدام ميزان رقمي، ثم انقله إلى مخروط أنف وتحفز التخدير باستخدام الإيزوفلوران بتركيز 2-2.5٪ من الأكسجين؛ راقب العمق باستمرار وتأكد من مستوى الجراحة عن طريق فقدان رد فعل الدواسات.
  2. جهز وسادة تسخين يتم التحكم بها حراريا وضبطها على 37 درجة مئوية لدعم الفئران أثناء التحضير والتعافي.
  3. ضع مزلق العيون على كلتا العينين مباشرة بعد تحفيز التخدير لمنع جفاف القرنية. ثم ضع الفأر في وضع الاستلقاء البطني على وسادة التدفئة لمنع انخفاض حرارة الجسم، وتقليل الضغط الفسيولوجي، ودعم الوظائف القلبية الدموية والتنفسية الطبيعية طوال العملية.
  4. أعط البوبرينورفين تعليق حقن ممتد المفعول (1.3 ملغ/مل) تحت الجلد بجرعة 3.25 ملغ/كغ باستخدام حقنة معقمة بإبرة 25 جاما وحقن 0.05 مل لكل 20 جرام من وزن الجسم قبل الإجراء.
  5. احلق منطقة أسفل الظهر من منتصف الجانب إلى حزام الحوض، ثم قم بتعقيم المنطقة باستخدام مسحات متناوبة من كحول الأيزوبروبيل والبوفيدون-يود، وكرر العملية ثلاث مرات، ودع الموقع يجف تماما في الهواء.

4. الحقن المباشر داخل الحضار

  1. بعد التخدير وتحضير موقع الجراحة، انقل الفأر إلى منطقة حقن نظيفة وضعه في منطقة الاستلقاء البطنية على وسادة التدفئة.
  2. ضع الفأر في وضعية تقوس العمود الفقري لتسهيل اللمس والحقن.
    1. أدخل ملعقة منحنية تحت البطن عند مستوى أسفل الصدر إلى أعلى سطح قطني لتحفيز ثني خفيف للعمود الفقري وتوسيع الفراغات القطنية بين الفقرات الخامسة والسادسة (L5-L6، المفضلة) أو الرابعة والخامسة (L4-L5).
    2. تقدم حافة الإبرة بين الصفائح لدخول خزان الخزان القطني والوصول إلى المساحة تحت العنكبوتية مع تجنب الاتصال المباشر بالعظم لتحسين سلامة ودقة الحقن.
  3. ثبت حزام الحوض بلطف بين الإبهام والسبابة في يد واحدة ولمس الخط الأوسط الظهري باليد الأخرى لتحديد المساحة المستهدفة بين الفقرات L4-L5 أو L5-L6.
  4. محاذاة حقنة أنسولين معقمة بسعة 0.3 مل مزودة بإبرة 29 جراما، نصف بوصة، عمودية على سطح الجلد الظهري أو بزاوية 70-80°، مع توجيه الحافة للجمجمة. تقدم الإبرة حتى تواجه مقاومة طفيفة أثناء اختراقها لجسم الجافة، ثم استمر في الدخول إلى الفراغ داخل السرعة.
  5. أدخل بثبات حتى يدخل الطرف إلى الفراغ داخل السرعة، ويؤكد ذلك رد فعل حركة الذيل يشير إلى الدخول الناجح داخل السر.
  6. إذا واجه مقاومة كبيرة أو لم يلاحظ رد فعل حركة الذيل، اسحب الإبرة، وأعد تحديد العلامات التشريحية، وضبط وضع الإبر قبل إعادة محاولة الحقن. إذا تم تنفيذ المحاولة الأولية في الفضاء بين الفقرات L5-L6، فيجب تنفيذ المحاولة التالية في الفضاء بين الفقرات L4-L5.
  7. حقن 10 ميكرولتر من محلول ASO ببطء (أكثر من 10 ثوان) لتقليل تغيرات الضغط وتجنب ارتجاع السائل الشوكي. يمكن تثبيت الإبرة في مكانها لمدة 10 ثوان إضافية بعد الحقن.
  8. اسحب الإبرة بحذر عموديا وسلاسة لمنع تلف الأنسجة وتدفق العكس.
  9. راقب الفأر باستمرار خلال فترة التعافي، وراقب التنفس، والوظائف الحركية، ووضعية الجسم، وأي علامات على الألم أو الضيق.
  10. تأكد من استعادة الفأر للحركة والسلوك الطبيعي قبل إعادته إلى قفصه الأساسي.
  11. وثق جميع التفاصيل الإجرائية ذات الصلة، بما في ذلك موقع الحقن، وجرعة ASO، وحجم الحقن، وأي ملاحظات سلوكية أو فسيولوجية أثناء وبعد الإجراء، وفقا لبروتوكولات IACUC.

5. مراقبة الفئران ودعم التعافي بعد الحقن

  1. ضع كل فأر في حجرة فردية أو متباعدة جيدا داخل غرفة استرداد مسخنة مسبقا تحافظ على درجة حرارة 37 درجة مئوية.
  2. حافظ على التحكم في درجة حرارة الحجرة أثناء التعافي من التخدير لمنع انخفاض حرارة الجسم.
  3. راقب باستمرار معدل التنفس ونمطه، ووضعية الجسم والاستجابة للمحفزات اللمسية.
  4. راقب الفأر حتى يستعيد رد فعله الصحيح ويظهر حركة منسقة.
  5. تجنب الاكتظاظ لضمان وضوح الرؤية ومنع التداخل.

6. تحديد معايير العودة إلى قفص المنزل

  1. تأكد من أن الفأر مستقر بحركة منسقة وعفوية.
  2. تأكد من عدم وجود علامات ضيق، بما في ذلك التنفس المتقطع أو غير المنتظم، أو إصدار الأصوات، أو عدم الاستجابة لفترة طويلة.
  3. قدم دعما غذائيا ناعما، مثل مكمل حمية هلام كامل غذائيا، للمساعدة في الحفاظ على الترطيب والسعرات الحرارية بأقل جهد.

7. إجراء مراقبة ما بعد التعافي للفئران

  1. تحقق من السلوكيات الطبيعية مثل الاستكشاف، والعناية، والتفاعل الاجتماعي إذا كانت الفئران في مجموعة مأوى.
  2. راقب باستمرار أي علامات على التعافي غير الطبيعي، مثل الوضعية غير الطبيعية، الضعف أو الشلل، التنفس غير المنتظم، أو انخفاض الاستجابة، وأعد التقييم بسرعة إذا ظهرت هذه الأعراض.
  3. اطلب التدخل البيطري إذا تأخر التعافي أو تعرض للخطر.

8. الحقن داخل البطين الدماغي في البطين الجانبي باستخدام جراحة التاكسي الفراغية والرعاية بعد العملية

ملاحظة: تضمين ذراع مقارنة يستخدم حقن داخل البطين الدماغي (ICV) لتقييم التوزيع المكاني والفعالية النسبية، وتوصيل الحقن المبكرة إلى البطين الجانبيين لنشر السائل الدماغي الشوكي والمقارنة مع التوصيل داخل السرير. قم بحقن الحقن في ICV وفقا لبروتوكولات موحدة وراسخة للفئران37.

  1. تخدير الفأر بالإيزوفلوران بتركيز 2-2.5٪ من الأكسجين لعدم الحركة، ووضع الفأر في وضع الاستلقاء البطني على وسادة التسخين، ثم أعط البوبرينورفين التعليق الممتد للحقن (1.3 ملغ/ملليتر بوبرينورفين هيدروكلوريد) تحت الجلد عند 3.25 ملغ/كغ باستخدام حقنة معقمة بسعة 1 مل مع إبرة 25 جرام بتركيز 0.05 مل لكل 20 جرام من وزن الجسم قبل الإجراء. احلق فروة رأس الفأر باستخدام المقص.
  2. قم بإجراء جميع الإجراءات الجراحية تحت التخدير. حافظ على مجال معقم معقم طوال عملية ICV. استخدم فقط الأدوات المعقمة وتعامل معها بحذر لمنع ملامسة الأسطح غير المعقمة.
  3. ثبت الفأرة في إطار ستيريوتاكسي مع لوحة عرض رقمية في وضعية الاستلقاء القياسية. ضع الأسنان الأمامية في قضيب الأسنان الخاص بمحول الفأر لتثبيت الرأس، ثم ثبت المحول بأنابيب التنفس الشهيق والعادم التي توصل الإيزوفلوران. أدخل قضبان الأذن في الأذنين وشد البراغي لتثبيت الرأس بإحكام.
  4. قم بتعقيم المنطقة باستخدام مسحات متناوبة من كحول الأيزوبروبيل والبوفيدون-يود، وتكرار ذلك ثلاث مرات، وقم بعمل شق في منتصف الخط بمشرط معقم لكشف الجمجمة. استخدم رأس قطني معقم لإزالة الأنسجة الرخوة والتأكد من رؤية البريغما بوضوح.
  5. ضع علامة البريغما على الجمجمة. ضع الحقنة التي تحتوي على ASO مع إبرة (26-G، 26s/2"/2، على شكل نقطة) فوق البريغما مباشرة. محاذاة الإبرة مع إحداثيات الهدف: AP -0.3 مم، ML ±1.0 مم، DV -3 مم من سطح الجمجمة. ضع علامة على الجمجمة عند إحداثيات AP وML.
  6. قم بإنشاء ثقب في الإحداثيات المحددة ثم استخدم إطار استريوتاكتيكي لخفض إبرة الحقنة إلى عمق -3 مم من سطح الجمجمة. حقن المحلول بمعدل 10 ميكرولتر/دقيقة حتى يتم تسليم حجم إجمالي 10 ميكرولتر. بعد الانتهاء من الحقن، ثبت الإبرة في مكانها لمدة 4 دقائق، ثم قم بسحبها ببطء لتقليل الارتجاع.
  7. قم بخياطة شق فروة الرأس، وضع الفأر في غرفة تعافي مسخنة مسبقا بدرجة حرارة 37 درجة مئوية حتى يستيقظ تماما، ثم أعده إلى القفص المنزلي بعد التأكد من الثبات. قدم مكملا غذائيا هلاميا كاملا وراقب باستمرار علامات التعافي غير الطبيعي، مثل الوضعية غير الطبيعية، الضعف أو الشلل، التنفس غير المنتظم، أو انخفاض الاستجابة؛ أعد تقييم التقييم بسرعة إذا ظهرت أي من هذه الأعراض.

9. التقييمات الكهربائية الفيزيولوجية لجهود عمل العضلات المركبة (CMAP)

  1. تأكد من أن المجربين يعمىون عن كل من النمط الجيني ومجموعة العلاج لكل فأر لإزالة التحيز أثناء جمع البيانات والتحليل.
  2. قم بتخدير الفأر بالإيزوفلوران للحفاظ على عدم الحركة والراحة، وحافظ على درجة حرارة الجسم عند 37 درجة مئوية.
  3. تأكد من وجود تخدير كاف من خلال التأكد من فقدان رد فعل الدواسات.
  4. استخدم أقطاب إبرة أحادية القطب بسعة 28 جيجابايت للاستخدام مرة واحدة لكل من التحفيز والتسجيل. أدخل قطب التسجيل 1 مم في عضلة الظنبوب الأمامية.
  5. تحفيز العصب الوركي بالقرب من الشق الوركي باستخدام نبضات موجة مربعة أحادية الطور بسرعة 0.1 مللي ثانية ترسل كل ثانيتين، بدءا من 1.0 مللي أمبير وتزداد بزيادات 0.5 مللي أمبير حتى يتم تحقيق استجابة فوق الحد الأقصى (عادة 1.5-3.5 مللي أمبير).
  6. بمجرد تحديد العتبة فوق الحد الأقصى، سجل استجابات CMAP عند 0.5 مللي أمبير فوق هذا المستوى. قس سعة CMAP (من الذروة إلى الذروة) عند 0.8 مللي ثانية بعد التحفيز لاستبعاد الكمون ومتوسط السعات من الساقين الأيسر واليمنى لكل فأرة.

10. قياس مستويات pNFH في المصل

  1. اجمع 100 ميكرولتر من الدم الكامل عن طريق ثقب الأوردة في الوجه باستخدام أنابيب جمع الدم الشعرية التي تحتوي على محفز الجلطات وجل فصل المصل في النقاط الزمنية المحددة.
  2. عينات دم الطرد المركزي بوزن 2000 جرام لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية لعزل المصل.
  3. قم بقياس مستويات السلسلة الثقيلة من خيوط العصبي العصبية المفسفرة في المصل باستخدام كواشف اختبار مناعي موثقة لقياس pNFH في العينات البيولوجية على جهاز تحليل مناعي ميكروفلويد مؤتمت بالكامل يعتمد على الخرطوشة.

11. عزل الحمض النووي الريبي وأداء RT-qPCR

  1. سحق أنسجة الحبل الشوكي العنقي والصدر باستخدام خرزة فولاذية بقطر 6 مم في مطحنة خرز تذبذب عالية الطاقة قابلة للبرمجة بالتجميد لعملية سحق العينات بسرعة 1000-1200 ضربة في الدقيقة لمدة 30-40 ثانية.
  2. توحيد النسيج المطحون (15 ملغ) باستخدام خرزات خزفية بقطر 2.8 مم في مادة تحلل وكاشف استخراج RNA القائم على الفينول-غوانيدينيوم الثيوسياناتي بسعة 700 ميكرولتر باستخدام مجانس ميكانيكي عالي السرعة قائم على الخرزات بسرعة 5.62 م/ث لمدة دورتين مدتها 30 ثانية.
  3. استخلاص إجمالي الحمض النووي الريبي باستخدام معالجة DNase على العمود، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
  4. تخليق cDNA باستخدام نظام كاشف نسخ عكسي عالي السعة لتخليق cDNA.
  5. لاكتشاف qPCR، صمم مجموعات برايمر/مجسات مخصصة لاكتشاف الجين المعني الذي يستهدف الإكسون 4 من جين SOD1 البشري:
    الأساس الأمامي (5′-TGGTGTGGCCGATGTGTCTA-3′)،
    الأساس العكسي (5′-ATGATGCAATGGTCTCCTGAGA-3′)
    المسبار (5′-6FAM-TGAAGATTCTGTGTGATCCA-MGB/NFQ-3′)
  6. استخدم GAPDH الفأر (معرف اختبار TaqMan: Mm99999915_g1) كجين للنظافة.
  7. إجراء qPCR على جهاز PCR كمي عالي الإنتاجية (qPCR) باستخدام 20 نانوغرام من cDNA لكل تفاعل، ومزيج رئيسي QPCR قائم على المجسات سريع الدوران، وبادئات جينية محددة، ومجسات تحلل فلورية للكشف عن نسخ التنظيف (VIC/MGB) والهدف (FAM/MGB).

12. التحليل الإحصائي للبيانات

  1. قدم بيانات من مقاييس الحياة (CMAP)، وتحليل pNFH في المصل، وتحليل التعبير الجيني كمتوسط ± الانحراف المعياري (SD).
  2. تقييم الدلالة الإحصائية بين المتوسطات الجماعية باستخدام تحليل التثبيط العشوائي أحادي الاتجاه، تليها اختبار المقارنات المتعددة لتوكي، معتبرة p < 0.05 ذات دلالة إحصائية.
  3. استخدم برامج التحليل الإحصائي المناسبة لإنشاء الرسوم البيانية وأداء جميع التحليلات، بما يتوافق مع تلك التي أجريت في الدراسة.

النتائج

لتوصيف دقيق وكفاءة الإعطاء داخل المحور (IT) بدقة في الفئران البالغة، أجرينا أولا تجارب تحقق أساسية باستخدام صبغة إيفانز الزرقاء (0.5٪) كمؤشر بصري لتدفق السائل الشوكي ونفاذه للأنسجة. تم تخدير الفئران البرية البالغة من النوع C57BL/6J (السلالة #000664؛ الوزن 25-30 جرام) بالإيزوفلوران (2-2.5٪) في الأكسجين للقضاء على آثار الحركة، وتم تجهيز المنطقة القطنية تحت ظروف معقرة. تم إجراء حقن التقنية التقنية عن طريق الثقل القطني في الفراغ تحت العنكبوتية بجرعات تصاعدية مفردة 20 ميكرولتر، 30 ميكرولتر، و50 ميكرولتر لتقييم الجرعة/الحجم وعلاقة شدة التلوين. تم تأكيد وضع الإبر الصحيح من خلال ملاحظة حركة الذيل أو المقاومة السلبية أثناء الحقن.

خلال 5 دقائق من توصيل الصبغة، تم تثقيب الفئران عبر القلب بمحلول ملحي بارد بالفوسفات (PBS) لإزالة الصبغة المتبقية من الأوعية الدموية. ثم تم استخراج الحبل الشوكي بلطف وتصويرها تحت إضاءة قياسية على خلفية محايدة. كشف الفحص البصري عن توزيع ثابت وموحد من الظهر إلى البطن للون إيفانز الأزرق في جميع الفئران التي تلقت الصبغة. ارتبطت أحجام الحقن الأعلى بتشبع الصبغة عبر محور الروستروكودا، رغم أن الفأر الذي حقن بحجم 20 ميكرولتر أظهر أيضا صبغة قوية. على النقيض من ذلك، لم تظهر الفئران التي لم تتلق صبغة إيفانز الزرقاء (مجموعة التحكم التي حقنت بمحلول ملحي معقم) عدم وجود تلوين أو تلوين خلفية مرئي في نسيج الحبل الشوكي (الشكل 1). تظهر هذه النتائج أن حقن تكنولوجيا المعلومات في الفئران تمكن من توصيل المذاب بسرعة وقابلة للتكرار عبر الحبل الشوكي. تشمل قيود هذه التجارب غياب التقييم الكمي لتوزيع الصبغة وغياب تحليل توزيع الصبغة عند حجم حقن 10 ميكرولتر المستخدم لإعطاء ASO. ومع ذلك، تم إجراء القياس التكميمي في قياسات تفاعل الأهداف اللاحقة على مستوى التعبير الجيني في فئران SOD1-G93A البشرية باستخدام تحليل التعبير الجيني الخاص ب SOD1 البشري. تم اختيار حجم الحقن البالغ 10 ميكرولتر المستخدم في التجارب اللاحقة لإعطاء ASO لضمان جرعات آمنة ومتسامحة جيدا في الفئران، ومن المتوقع أن يوفر تعرضا كافيا لجهاز الجهاز العصبي المركزي بناء على الدراسات السابقة38.

استنادا إلى هذا التحقق التشريحي، قمنا بعد ذلك بتقييم الأهمية الوظيفية لتقديم تكنولوجيا المعلومات باستخدام ASOs المستهدفين الطفرة SOD1، وهي استراتيجية علاجية موثقة في نماذج SOD1-ALS. تظهر الفئران المعدلة وراثيا نصف الزيجوت SOD1-G93A، التي تحمل جين SOD1 الطافور البشري، تنكرا عصبيا حركيا متوقعا وتدهورا عصبيا عضليا، مما يجعلها نموذجا ما قبل سريريا راسخا. عند عمر 5 أسابيع، وقبل ظهور الأعراض، تلقت الفئران جرعة واحدة من I-Pot من ASO الخاص ب SOD1 بتركيز 100 ميكروغرام في 10 ميكرولتر. تم اختيار هذه الجرعة بناء على دراسات تحسين سابقة أجريت باستخدام إعطاء ICV في الفئران كما أبلغ عنها McCampbell وآخرون (2018)36. لمقارنة الفعالية بين التوصيل بتقنية التقنية وحقن ICV، تلقت مجموعة منفصلة حقن ICV بنفس جرعة ASO باستخدام التوصيل المجسم. تلقت الضوابط نظام ASO غير نشط (التحكم غير المستهدف) عبر مسار تقنية المعلومات.

بعد خمسة أسابيع من العلاج (عند عمر 10 أسابيع)، خضعت الفئران لاختبار جهد عمل العضلات المركب (CMAP) تحت تخدير خفيف بالإيزوفلوران. كشفت تسجيلات CMAP من عضلات الأطراف الخلفية التي استخرجت بواسطة بروتوكولات تحفيز العصب الوركي الموحدة الحفاظ على السعة بشكل كبير في كل من المجموعات المعالجة ب IT-وICV مقارنة بالمجموعات غير النشطة المعالجة ب ASO (p < 0.0001 عبر تحليل ANOVA أحادي الاتجاه مع اختبار Tukey Posthoc). ومن المهم أن الحفاظ على السعة لم يختلف بشكل كبير بين طرق توصيل تقنية المعلومات وطرق التوصيل في ICV (صفحة > 0.05)، مما يشير إلى حماية عصبية عضلية مماثلة (الشكل 2A).

لتقييم العلامات الحيوية الجهازية لسلامة الخلايا العصبية، تم قياس مستويات سلسلة الألياف العصبية الفوسرية (pNFH) في المصل باستخدام اختبار التلميض الكهربائي الكيميائي عالي الحساسية. أظهرت عينات الدم المأخوذة في فترة ال 5 أسابيع بعد الحقن انخفاضا بنسبة >40٪ في تركيز pNFH في الفئران المعالجة ب ASO مقارنة بالعناصر الضابطة المعالجة بالمركبات (p < 0.0001)، دون ملاحظة فرق كبير بين طرق العلاج بتقنية التقنية وسرطان الدم الخلفي (الشكل 2B). تؤكد الاستجابة الجزيئية الموحدة للمؤشر الجزئي البيانات الكهروفسيولوجية، مما يشير إلى أن توصيل تقنية المعلومات يخفف بفعالية من العمليات التنكسية العصبية في هذا النموذج ALS.

لتقييم التفاعل المستهدف ل SOD1-ASO على المستوى الجزيئي، أجرينا عملية PCR كمية عكسية (RT-qPCR) على أنسجة الحبل الشوكي العنقي والصدري المفصولة. تم استخراج إجمالي الحمض النووي الريبي باستخدام بروتوكول قائم على الأعمدة، لضمان نقاء عالي (A260/A280>1.8)، تلاها تخليق cDNA مع تمهيد عشوائي للسداسي. كشف تضخيم PCR الكمي الذي يستهدف نصوص SOD1 البشري، والذي تم تطبيعه إلى GAPDH، عن انخفاض متوسط بنسبة 60٪ بعد توصيل تقنية المعلومات و35٪ بعد توصيل ICV، وكلاهما مهم مقارنة بضوابط ASO غير النشطة (p < 0.0001 لكليهما). أظهرت المقارنة المباشرة بين مسارات الولادة تعطلا أكبر بشكل ملحوظ في توصيل تقنية المعلومات (p < 0.0001)، مما يشير إلى تفاعل أكثر فعالية في الهدف في الحبل الشوكي من خلال الوصول المباشر للعمود الفقري (الشكل 3). هناك حاجة إلى دراسات إضافية لتقييم التفاعل المستهدف في مناطق أخرى من الجهاز العصبي المركزي.

مجتمعة، تقدم هذه البيانات الشاملة تأكيدا مقنعا على حقن تكنولوجيا المعلومات كتقنية دقيقة وقابلة للتكرار وطفيفة التوغل لتوصيل ASOs إلى الجهاز العصبي المركزي (CNS) في نماذج الفوار. أظهرت إدارة تكنولوجيا المعلومات فعالية علاجية تعادل توصيل الالتهاب الداخلي عبر طيف واسع من مقاييس النتائج، بما في ذلك الحفاظ المستمر على الوظائف العصبية (CMAP)، وتطبيع المؤشرات الحيوية المرتبطة بالمرض (pNFH)، والتحليل الجزيئي القوي لنصوص SOD1 البشرية ضمن مناطق الجهاز العصبي المركزي المستهدفة. تؤكد هذه النتائج على مرونة تقديم تقنية المعلومات كطريق قابل للترجمة سريريا لعلاجات ASO الموجهة من الجهاز العصبي المركزي، حيث تقدم فعالية تعادل ICV مع الحفاظ على البساطة الإجرائية وتقليل التوغل. لذا، فإن تقنية المعلومات وتقديم العلاج الداخلي (ICV) هما نهجان قابل للتطبيق على حد سواء للتدخلات الموجهة للجهاز العصبي المركزي، حيث يوفران مرونة في البيئات ما قبل السريرية اعتمادا على سهولة الوصول التشريحي، وإمكانية الإجراءات، والسياق العلاجي. وهذا يضع تقديم تقنية المعلومات كمنصة ترجمة واعدة للعلاجات المستقبلية الموجهة لنظام CNS. لدعم الجهود الترجمية، نقترح إجراء دراسات ما قبل سريرية إضافية لتقييم توزيع الحراكية الدوائية داخل السائل الدماغي الشوكي، ومناطق الجهاز العصبي المركزي المختلفة، وامتصاص الخلايا المستهدفة باستخدام تقنيات مثل التهجين الفلوري في الموقع أو التألق المناعي.

الشكل 1
الشكل 1: تصور توزيع صبغة إيفانز الزرقاء بعد الحقن داخل الجرعة في الفئران البالغة. تم إعطاء صبغة إيفانز الزرقاء (0.5٪) عن طريق الحقن المباشر داخل الجرعة (IT) في فئران بالغة لتقييم توزيع الحبل الشوكي بشكل نوعي. تم تسليم ثلاث أحجام صبغة مختلفة 20 ميكرولتر، 30 ميكرولتر، و50 ميكرولتر في مجموعات تجريبية منفصلة (n = فأر واحد لكل حالة حجم). بعد الحقن، تم جمع الحبل الشوكي وغسلها لتقييم اختراق الصبغة كما يقيس بشدة التلوين على طول الأنسجة. تظهر صور نسيج الحبل الشوكي مدى تشتت الصبغة المرتبط بكل حجم حقن، مما يظهر زيادة تعتمد على حجم الجرعة في التغطية وشدة التلوين في جميع أنحاء الحبل الشوكي. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 2
الشكل 2: علاج الأوليجونكليوتيدات المستهدف ب SOD1 يستهدف الحساسية المضادة يعيد الوظائف الحركية ويقلل من مستويات الخيوط العصبية المرضية في الفئران. تلقت الفئران البالغة المعدلة وراثيا من نوع SOD1-G93A جرعة واحدة من أوليغونيوكليوتيد مضاد الحساسية النشط المستهدف SOD1 (SOD1-ASO) عبر حقن داخل القضيب (IT) أو حقن داخل البطين الدماغي (ICV) عند عمر 5 أسابيع، أو حقن ASO غير نشط عبر حقن IT. تم تقييم التأثير العلاجي عند عمر 10 أسابيع، أي بعد 5 أسابيع من العلاج. (أ) تم الحصول على تسجيلات جهد عمل العضلات المركب (CMAP) لتقييم الوظائف العصبية العضلية في الحيوانات المعالجة. أظهرت مجموعات معالجة SOD1-ASO (n = 5 - 6 لكل مجموعة) انعكاسا في انخفاض CMAP مقارنة بمجموعة الضابطة، مما يشير إلى التعافي الوظيفي. (ب) تم قياس مستويات النسيج العصبي الضخم (pNFH) على الأطراف من سلسلة الفسفورة العصبية الثقيلة (pNFH)، وهي مؤشر حيوي للتنكس العصبي، من المصل الذي تم جمعه في الأسبوع العاشر (n = 5 - 8 لكل مجموعة). أدى علاج SOD1-ASO إلى انخفاض كبير في مستويات pNFH المنتشرة مقارنة بالضابطة، مما يشير إلى تخفيف الضرر العصبي المرتبط بالمرض. تعرض جميع البيانات كمتوسط ± الدياني المتوسط. تم تحديد الدلالة الإحصائية باستخدام تحليل التباين أحادي الاتجاه (ANOVA) تلاه اختبار المقارنات المتعددة لتوكي، حيث تشير قيم p إلى ≤ 0.0001 إلى فروق قوية بين مجموعات العلاج. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 3
الشكل 3: يؤدي إعطاء SOD1-ASO إلى كبح تعبير mRNA البشري ل SOD1 بشكل كبير في الحبل الشوكي المعدل وراثيا من نوع SOD1-G93A. لتقييم كفاءة استهداف أوليغونيوكليوتيد مضاد SOD1 المستهدف للحس المضاد (SOD1-ASO) الذي يتم توصيله عبر الحقن داخل السرعة (IT) أو داخل البطين الدماغي (ICV)، تم تحليل قسم عنق الرقبة/الصدر من نسيج الحبل الشوكي من فئران معدلة وراثيا تم إعدامها في عمر 10 أسابيع (بعد 5 أسابيع من الإعطاء) لتعبير mRNA لجسم SOD1 البشري باستخدام التفاعل المتسلسل المتسلسل البوليميراز العكسي (RT-qPCR). تم قياس مستويات نسخ SOD1 البشرية وتطبيعها بالنسبة للتعبير في المجموعة غير النشطة التي عولجت ب ASO. يوضح الشكل تغير الطية في mRNA ل SOD1 البشري (تم تطبيعه إلى GAPDH) لكل مجموعة معالجة (n = 5-7 فئران لكل مجموعة)، مما يبرز انخفاض كبير في التنظيم استجابة لإعطاء SOD1-ASO. تعرض البيانات كمتوسط ± الدياني المتوسط. تم تحديد الفروق الإحصائية بين المجموعات باستخدام تحليل التباين أحادي الاتجاه (ANOVA)، تلاه اختبار المقارنات المتعددة لتوكي، حيث تشير قيم p إلى ≤ 0.0001 إلى فروق قوية بين مجموعات العلاج. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

المكونFWكمية الإضافة (لكل لتر أو كجم)الوحدات
فوسفات الصوديوم ثنائي الهيدرات أحادي الأساس0.034g
فوسفات الصوديوم اللامائي البازي1420.111g
كلوريد الصوديوم58.448.766g
كلوريد البوتاسيوم74.560.224g
ديهيدرات كلوريد الكالسيوم147.020.206g
كلوريد المغنيسيوم سداسي الهيدرات0.163g
الماء (ميلي-كيو)993g
بولوكسامر 1880.01g

الجدول 1: تركيب aCSF.

الشكل الإضافي 1: تموضع الفأر للحقن داخل القضيب في أسفل الظهر. ملعقة منحنية أو سكوبولا موضوعة تحت البطن تقوم بثني العمود الفقري، مما يوسع المساحة بين الفقرات. تستهدف الحقن مستوى L4-L5 أو L5-L6، مع محاذاة صحيحة على محور العمود الفقري الإنسي كما هو موضح. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الملف التكميلي 1: تسلسل وكيمياء ASO. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

المناقشة

تمثل تقنية الحقن المباشرة داخل المحور (IT) المعروضة هنا طريقة طفيفة التوغل لكنها فعالة للغاية لتوصيل العوامل العلاجية إلى الجهاز العصبي المركزي (CNS)، خصوصا في نماذج القوارض الصغيرة مثل الفئران. يعد هذا الإجراء بالعصا العمياء تحديا تقنيا لكنه أثبت أنه قابل للتكرار وذو صلة سريرية عند إجراؤه بواسطة حقنة مدربة. تستخدم هذه الطريقة تشريحا دقيقا وتقنية فعالة لتوفير وصول سريع إلى الجهاز العصبي المركزي دون الحاجة إلى القسطرة، وهو تبسيط مهم له فوائد كبيرة لتوسيع الدراسات قبل السريرية؛ ومع ذلك، ستستفيد أهميتها الترجمية من تقييم كمي إضافي والتحقق المنهجي الموحد 5,8,10.

تعتمد عملية حقن تكنولوجيا المعلومات الناجحة على عدة خطوات رئيسية. التحضير الدقيق للحيوانات أمر ضروري: يتم تحفيز التخدير أولا باستخدام حجرة ويتم الحفاظ عليه بمخروط أنف، ثم حلق منطقة أسفل الظهر وإعطاء المسكنات لضمان راحة الحيوان. يتم تحقيق تموضع الفأر بشكل صحيح عن طريق وضع ملعقة منحنية تحت البطن، مع ثني العمود الفقري لتوسيع المساحة بين الفقرات (الشكل التكميلي 1). الهدف من الحقن داخل القضيب الموضح هنا هو وضع حافة الإبرة داخل خزان الفقر القطني عن طريق دفعه بين الصفائح عند المستوى المناسب للفقرات. الاستهداف الدقيق للمساحة بين الفقرات بين صفائح L4 وL5 أو، ويفضل، صفائح L5 وL6، أمر بالغ الأهمية للوصول إلى الفضاء تحت العنكبوتية 5,10. الفضاء تحت العنكبوتية، المعروف أيضا بالمساحة داخل العرق، يقع بين العنكبوتية والبيا ماتر39. نظرا لأن الحبل الشوكي أقصر من القناة الفقرية، فإن مقاطع الحبل الشوكي الذيلي تقع بشكل أكثر توازنا مع مستويات الفقرات المقابلة. لتجنب الغموض، يتم تحديد مواقع الحقن حسب المساحة بين الفقرات بدلا من مستوى الحبل الشوكي. ومن الجدير بالذكر أن هناك تباين كبير في تقسيم الفقرات القطنية في الفئران، سواء داخل السلالات أو عبر السلالات40. يجب إجراء الحقن على طول الخط الأوسط للعمود الفقري لتجنب الانحراف الجانبي، الذي قد يؤدي إلى شلل الطرف الخلفي أو، في الحالات الشديدة، شلل بسبب إصابة الحبل الشوكي. عند إجراء الإصابة المباشرة في الحبل الشوكي في الموقع التشريحي الصحيح، يكون خطر الإصابة المباشرة في الحبل الشوكي ضئيلا. ومع ذلك، لا يزال هناك خطر صغير لتهيج أو تلف جذر العصب، مما يبرز أهمية التدريب الكافي للمشغلين والكفاءة الإجرائية لتقليل النتائج السلبية. يعمل رد فعل حركة الذيل كمؤشر مفيد على نجاح وضع الإبرة، مما يسمح للحقن بقياس العمق وتجنب الاختراق السطحي أو العميق جدا. تتطلب هذه التقنية ممارسة لإتقانها، وتتطلب تحكما ثابتا في العمق والزاوية وحجم الحقن لتجنب التدفق العكسي والتسرب إلى الأنسجة المحيطة. على الرغم من أننا نوصي بالحفاظ على حجم الحقن ≤10 ميكرولتر، فقد قمنا بتقييم ما يصل إلى 20 ميكرولتر دون آثار جانبية. حددت الدراسات السابقة حجم حقن داخل الجرعة 10 ميكرولتر كأفضل لتوصيل الدواء38. على الرغم من أن هذا يمثل 25-30٪ من إجمالي حجم السائل الدماغي في الفئران41.42، إلا أن الحد الأقصى المقبول لحجم الحقن داخل الجرعة في الفئران البالغة تم الإبلاغ عنه بأنه 30 ميكرولتر10. قد تتسبب أحجام الحقن التي تتجاوز الحدود الموصى بها إلى اضطراب ديناميكيات سائل دماغي شوكي، مما يؤدي إلى تغير ضغط السائل الشوكي الشوكي وزيادة خطر الآثار الجانبية. يقدر حجم السائل الشوكي الكلي في الفئران ب 35-40 ميكرولتر ويتغير من 12 إلى 13 مرة في اليومبمقدار 41.42، مما يعادل تجديدا كاملا تقريبا كل 1.8 ساعة42.43. بالنظر إلى التغير السريع في السائل الدماغي الدماغي والملاحظات التجريبية بالإضافة إلى الدراسات السابقة التي أظهرت الاستخدام الآمن لأحجام الحقن داخل السرير حتى 20-30 ميكرولتر دون مضاعفات، لا يتوقع أن يسبب حجم حقن 10 ميكرولتر آثارا جانبية10,44.

قابلية التوسع هي ميزة كبيرة لهذه التقنية. بمجرد إتقان الحقنات المدربة، يمكنها معالجة 10-12 حيوانا في الساعة، مما يسهل دراسات ما قبل السريرية الأكبر دون الأعباء اللوجستية لزرع القسطرة أو الطرق الجراحية الأكثر تدخلا. يتجنب هذا الإجراء الأجهزة المعقدة، ويقلل من توتر الحيوانات، ويقصر أوقات التعافي مقارنة بالقسطرة المزمنة، مما يجعله مناسبا للدراسات الطولية التي تتطلب تكرار الجرعات. لمحاكاة أنظمة الجرعات السريرية، قمنا بالتحقق من إعطاءات تقنية المعلومات المتسلسلة في الفئران، حيث قدمنا حتى أربع جرعات بفاصل ثمانية أسابيع. كانت هذه الحقن مقبولة جيدا، دون علامات ضيق أو تغيرات سلوكية أو علامات مرض، متوافقة مع الدراسات السابقة التي أبلغت عن عدم وجود تغييرات كبيرة في ديناميكيات السائل الشوكي أو بنية الحبل الشوكي بعد عدة علاجات تقنية تقنية34,45. لذا، تؤكد دراساتنا أن تكرار جرعات تكنولوجيا المعلومات ممكن مع فترات زمنية مناسبة، بما يتماشى مع نماذج العلاج البشري حيث يكون التفاعل المستهدف المستمر ضروريا لتحقيق الفائدة العلاجية. من خلال تجربتنا، تم إجراء هذه الحقن المتكررة بنجاح عبر نطاق عمر واسع يتراوح بين 5 إلى 29 أسبوعا. بينما يمكن أن يؤثر زيادة العمر وكتلة الجسم قليلا على وصول الحبل الشوكي إلى النسيج تحت الجلد، إلا أن الإدارة الناجحة لا تزال ممكنة مع عامل ماهر ماهر وماهر في التقنية ويعرف إحساس وضع الإبر. ومع ذلك، نلاحظ أن هناك عدة عوامل تتجاوز موقع الحقن وحجم الدفعة، وبشكل خاص سرعة الحقن والخصائص الفيزيائية للمحلول المحقون، مثل الكثافة بالنسبة للسائل الشوكي الدماغي، يمكن أن تؤثر بشكل كبير على توزيع المذابات داخل الجهاز العصبي المركزي. على الرغم من أن هذه المعايير لم تقاس أو تلاعب بها مباشرة في هذه الدراسة، إلا أن العمل الأخير الذي أجراه لينينجر وآخرون (2023) يظهر من خلال نموذج ميكانيكي للحركية الدوائية أن هذه العوامل تؤثر بشكل كبير على توزيع الأوليجونكليوتيد المضاد داخل الحيز (ASO) واستهداف الأنسجة46. وبناء عليه، نعترف بهذا كحد لدراستنا ونبرز سرعة الحقن وخصائص المحلول كمتغيرات مهمة للتحقيقات المستقبلية لتحسين توصيل الجهاز العصبي المركزي وملاءمته للترجمة. تسلط هذه النتائج معا الضوء على موثوقية وإمكانية تكرار جرعات تكنولوجيا المعلومات في نماذج ما قبل السريرية متعددة الجرعات، مما يدعم استخدامه في المشاركة المستهدفة المستدامة ونمذجة الترجمة للأنظمة العلاجية البشرية.

يوفر نهج تكنولوجيا المعلومات أيضا مرونة في الاختبارات العلاجية. يستوعب مجموعة واسعة من الأساليب، بما في ذلك ASOs، والجزيئات الصغيرة، والببتيدات، والناقلات الفيروسية، مما يتيح التقييم المباشر للتدخلات المستهدفة للجهاز العصبي المركزي. تضمن القدرة على توصيل كميات دقيقة ومتحكم بها من العلاجات إلى خزان الخزان القطني فعالية للحبل الشوكي وتعريض الجهاز العصبي المركزي بشكل أوسع مع الحد من الانتشار الجهازي. تسمح منعكسات الذيل والإشارات الإجرائية الأخرى بالتحقق في الوقت الحقيقي من نجاح التوصيل داخل السرعة، مما يعزز قابلية التكرار ويقلل من معدلات فشل التجارب 5,6,8,47.

أظهرت الدراسات السابقة على فئران SOD1-G93A أن مرض الأمراض يؤثر بشكل بارز على الحبل الشوكي، وخاصة المنطقة القطنية، مقارنة بالقشرة 29,48. لذلك، فإن هذه التقنية ذات صلة خاصة في سياق SOD1-ALS، وهو شكل وراثي من ALS ناتج عن طفرات في جين السوبر أكسيد ديسموتاز 1 (SOD1). تنتج هذه الطفرات تجمعات بروتين SOD1 غير مطوية بشكل خاطئ تؤدي إلى زيادة سامة في الوظائف داخل الخلايا العصبية الحركية، مما يؤدي إلى تدهور تدريجي في الأعصاب العضلية49,50. في هذه الدراسة، استخدمنا ASOs المستهدفين ل SOD1 لإثبات تفاعل ناجح مع mRNA المستهدف والتعافي الوظيفي. كشف تحليل RT-qPCR عن كبت كبير لنسخ SOD1 البشرية في الحبل الشوكي بعد إعطاء تقنية المعلومات، بينما أشارت تسجيلات CMAP إلى انعكاس في خلل الخلايا العصبية الحركية. علاوة على ذلك، أظهر تحليل المصل انخفاضا في مستويات السلسلة الثقيلة للخيوط العصبية الفسفرولية (pNFH)، وهي علامة حيوية للتنكس العصبي، مما يعزز فعالية الاستراتيجية العلاجية.

يتم التأكيد على أهمية هذا النموذج سريريا من خلال الموافقة الأخيرة من إدارة الغذاء والدواء الأمريكية على توفيرسن (QALSODY)،® وهو جهاز ASO مصمم لاستهداف mRNA ل SOD1 لعلاج SOD1-ALS35. يعطى توفيرسن عن طريق المسار للأشخاص المصابين ب SOD1-ALS وأظهر نشاطا دوائيا واضحا، بما في ذلك انخفاض في مستويات بروتين السائل النخاعي SOD1 (مؤشر غير مباشر على تفاعل الهدف) ومؤشر البلازما NfL (مؤشر إصابة المحورية والتنكس العصبي). في التحليلات المتكاملة لدراسة VALOR المرحلة 3 وOLE، ارتبط البدء المبكر للعلاج بالتوفيرسن بانخفاض في مقاييس الوظيفة السريرية والقوة وجودة الحياة، بالإضافة إلى تقليل خطر الأحداث المكافئة للوفاة35. تؤكد هذه البيانات أن المسار داخل الحفاضة كطريق قوي لعلاج ASO الموجه من خلال الجهاز العصبي المركزي، وتضيف وزنا انتقاليا قويا للدراسات ما قبل السريرية التي تستخدم استراتيجيات توصيل مماثلة.

بالإضافة إلى فائدته في مرض التصلب الجانبي الضموري (ALS)، أظهر مسار تقنية المعلومات نجاحا في ضمور عضلات العمود الفقري (SMA)14,51,52، حيث كان العلاج ASO Nusinersen (سبينرازا®) الذي يعطى من قبل تكنولوجيا المعلومات هو أول علاج معتمد 14,51,52. تتجاوز حقن تقنية المعلومات الحاجز الدموي الدماغي وتمكن التوزيع الحيوي الواسع النطاق لجهاز عصبي المركزي53، وهو أمر حيوي للأمراض التي تتميز بأمراض عصبية منتشرة. بينما تطرح الجرعات المتكررة تحديات لوجستية وتحمل، تستمر التطورات في تقنيات التركيب والتوصيل في جعل إدارة تكنولوجيا المعلومات أكثر جدوى للعلاج طويل الأمد.

تقدم إدارة تكنولوجيا المعلومات أهمية انتقالية أكبر للممارسة السريرية البشرية مقارنة بحقن ICV. تختلف حقن ICV وحقن IT في الفئران البالغة بشكل أساسي في موقعها المستهدف داخل الجهاز العصبي المركزي والتوزيع الناتج وتأثيرات المادة المعطاة. حقن ICV تنقل المواد مباشرة إلى السائل الدماغي الشوكي (CSF) داخل البطينين الجانبيين للدماغ، مستهدفة بشكل أساسي المواقع فوق الشوكية. على النقيض من ذلك، تنقل حقن تقنية المعلومات المواد إلى السائل النخاعي داخل الفضاء تحت العنكبوتية الشوكي، مستهدفة بشكل أساسي الحبل الشوكي. بينما تتجاوز كلتا الطريقتين الحاجز الدموي-الدماغي وتسمح بتوصيل الجهاز العصبي المركزي مباشرة، يمكن أن تؤدي إعطاء تقنية المعلومات إلى مدة أطول من التأثير54 لبعض المركبات وعادة ما تؤدي إلى نقل أقوى في الحبل الشوكي، بينما يمكن لل ICV تحقيق تركيزات محلية عالية في مناطق الدماغ المجاورة للبطينالجانبي 54. ومع ذلك، من المهم ملاحظة أن المركبات التي تدع إلى السائل الشوكي الشوكي يمكن أن تصل إلى الدماغ، رغم أن معدلالنقل بطيء جدا. وتنعكس هذه الاختلافات أيضا في المخاطر الإجرائية. حقن ICV تحمل احتمالية تلوث أعلى إذا تم تعرضها للتعقيم للخطر، بينما حقن تقنية المعلومات، رغم أنها ليست خالية من المخاطر، تحتوي على ضعف أقل متعلقة بالأجهزة. بعد الإجراء، قد تسبب حقن ال IT انزعاجا مؤقتا أو ردود فعل متعلقة بالطرف الخلفي، بينما ترتبط حقن ICV بعدم الراحة الفورية الأصيل، رغم أن التهيج الموضعي في الجمجمة لا يزال ممكنا.

تمتد التطبيقات المستقبلية لهذه التقنية إلى ما هو أبعد من الدراسات ما قبل السريرية الحالية. يمكن الاستفادة من توصيل تقنية المعلومات لتقييم العلاجات الموجهة للجهاز العصبي المركزي من الجيل القادم، بما في ذلك أدوات تحرير الجينات (مثل أنظمة CRISPR/Cas)، وأنماط تداخل الحمض النووي الريبي، والعلاجات الجينية المعتمدة على الناقلات الفيروسية. يمكن التكيف مع العلاجات المركبة التي تستهدف مسارات متعددة للجهاز العصبي المركزي، مما يسمح بتقييم تفاعلات دوائية في الوقت الحقيقي 55,56. علاوة على ذلك، يمكن دمج إدارة تكنولوجيا المعلومات مع وسائل التصوير لتتبع التوزيع واستهداف التفاعل في الحي، مما يسرع خطوط الأنابيب الانتقالية. توفر هذه التقنية أيضا منصة لدراسة استراتيجيات الطب الدقيق عبر نماذج الفئران المعرفة جينيا للأمراض العصبية، مما يسهل اكتشاف المؤشرات الحيوية، والتقييمات الوظيفية الطولية، وتقييمات السلامة قبل الترجمة السريرية.

في الختام، تمثل تقنية حقن التقنية القطنية المباشرة باستخدام تخدير إيزوفلوران طريقة طفيفة التوغل، سريعة، وقابلة للترجمة سريريا لتوصيل العلاجات إلى الجهاز العصبي المركزي للفأر. يوفر تطبيقه الناجح في نماذج SOD1-ALS وتوافقه مع الجرعات التسلسلية أساسا قويا لنشر أوسع في أبحاث علوم الأعصاب الانتقالية. مع تقدم المجال مع تزايد التركيز على تعديل جينات الجهاز العصبي المركزي، والعلاجات الموجهة للحمض النووي الريبي، والطب الدقيق، سيظل مسار تكنولوجيا المعلومات استراتيجية رئيسية لتوصيل الأدوية، تربط بين النماذج ما قبل السريرية والنجاح السريري.

الإفصاحات

SM و S-C L هما موظفان حاليان في شركة Biogen, Inc.، بينما TC وDF وYL وJD وMZ هم موظفون سابقون في الشركة. تم تزويد المؤلفين بأوليغونيوكليوتيدات الأنتيسينس التي نوقشت في هذا المقال من قبل شركة أيونيس فارماسيوتيكالز. توفيرسن (QALSODY) هو منتج تم تطويره بشكل مشترك بين شركتي Biogen وIonis Pharmaceuticals.

شكر وتقدير

نود أن نشكر شركة أيونيس للأدوية على تزويدها بشركات التنظيم المضاد الموصوف في المقال. نحن ممتنون لريان جامبل، ستيف غارافالو، أدريا مارتيغ، إيزابيل إيزازا، تاراس توتشكيفيتش، وديفيد كوسكي من Biogen على مساهماتهم الخبيرة التي عززت المخطوطة بشكل كبير من خلال مراجعاتهم الجوهرية.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
0.3 مل 29 جرام، حقنة أنسولين بطول نصف بوصة لحقن تكنولوجيا المعلوماتسميثس ميديكال4429-3
رأس مثقاب معقم بقطر 0.5 ممأدوات العلوم الدقيقة (FST) أو ما يعادلها1900705
خيوط برولين مونوفلامنت 5-0إيثيكون 8870H 
عيدان الكحولدايناركس1203
عيدان الكحولدايناركس1203
مسكن الألم - بوبرينورفين ممتد المفعولمطلوب وصفة طبية
مقص الحيواناتوال08787-450A
مجموعة النسخ العكسي عالية السعة لنظام البيوأنظمة التطبيقيةفيشر ساينتيفك43-688-14
مدمج Bead Ruptor 24شركة أومني إنترناشونال، إنك.19-070
جمع الدم وأنابيب فصل المصلبيكتون ديكنسون (BD)365967
ديهيدرات كلوريد الكالسيومجي تي بيكر1335
مضخة الحقنة الرقميةجهاز هارفارد70-4507
نظام إيلا للفحص المناعي الآليR& دي سيستمز600-100
مرهم العين-بورالوبديكرا17033-211-38
جينو/جرايندرSPEX SamplePrep2010
معقم جاف جرميناتور 500برينتري العلمي، أو ما يعادلهاGER 5287-120V
حقنة هاميلتون مع إبرة (26 ثانية/2"/2 (بنمط النقطة)هاميلتون8030026s/2"/2:                                                                                              26 ثانية: 26 هدف؛                                                                                                             2 بوصة طولا؛                                                                                                                             2: أسلوب النقاط
خليط تجانس الأنسجة الصلبة 2.8 مم سيراميك (أنابيب معززة بحجم 2 مل) (50/pk)فيشر ساينتيفك50-280-9286المورد: شركة ريفيتي هيلث ساينسز إنك
وسادة التدفئةك & H للتصنيع1060
منصة ICVستولتينغ502063
غرفة الإيزوفلوران مع نظام التفريغفيت كويب901820
هيهيدرات كلوريد المغنيسيومشركة EMD للكيماويات1.05832
مقص ميتزنباومأدوات العلوم الدقيقة (FST) أو ما يعادلها14016-14
اختبار اختبار Mouse GAPDH TaqMan ID Mm99999915_g1ثيرموفيشر ساينتيفيك4331182
أقطاب الإبر لنظام CMAP، 28 Gناتوس ميديكال (ماركة تيكا)#902-DMF25-TP
NutraGel: تغذية كاملةالخدمة الحيويةNGB-2
حامل إبرة أولسن-هيغارأدوات العلوم الدقيقة (FST) أو ما يعادلها12502-12
بولوكسامر 188موتشلر
كلوريد البوتاسيومجي تي بيكر3045
مضخم مسبق (ل CMAP)وورلد بريسيجن إنسترومنتس (WPI)SYS-DAM50
مجموعة pNFH من ProteinSimpleR& دي سيستمزSPCKB-PS-000519
مسحات بروفيدون-يوديددايناركس1201
كاشف تحلل QIAzol  تشياغن79306
نظام QuantStudio 12K Flexأنظمة حيوية تطبيقية4471087
سكوبولافيشربراند01-257-567
الإشارة v6.04تصميم كامبريدج الإلكترونيرقم التسلسل 061144CMAP Software  
غرفة استعادة الحيوانات الصغيرةوحدات العناية المركزة للحيوانات المحمولة من ثيرماكير موديل FW-1FW-1 
إطار ستيريوتاكسي حيوان صغير مع لوحة عرض رقميةKOPFموديل 940 
فئران SOD1 G93Aمختبر جاكسونمخزون # 004435
كلوريد الصوديومشركة EMD للكيماويات1.16224
فوسفات الصوديوم اللامائي البازيسيغما ألدريتش55136
فوسفات الصوديوم ثنائي الهيدرات أحادي الأساسسيغما ألدريتش3819
مشرط معقم قابل للتخلص مرة واحدةميد فيت إنترناشونال، أو ما يعادلهاMIL4410
الستائر المعقمةدايناركس4410
وسادات الشاش المعقمةدايناريكس أو ما يعادلهاDRX-3354
محلول ملحي معقمثيرموفيشر ساينتيفيك14190094
قفازات جراحية معقمةأنسل أو ما يعادلها20277290
عازل التحفيز (ل CMAP)وورلد بريسيجن إنسترومنتس (WPI)SYS-A365D
ستويلتينغ ميكرو دريل ستولتينغ58610
ملقط منحني جراحي (ملقط جريف - تيتانيوم)أدوات العلوم الدقيقة (FST) أو ما يعادلها11652-10
ملقط التثبيت الجراحي (ملقط جرايف - تيتانيوم)أدوات العلوم الدقيقة (FST) أو ما يعادلها11650-10
شريط جراحيدايناريكس أو ما يعادلها3572
حقنة لحقن مسكن الألم تحت الجلدBD309582
تاكمان فاست أدفانسد ماستر ميكسثيرموفيشر ساينتيفيك4444556
الماء (ميلي-كيو)
ميزان الوزنميتلر توليدو                                         نموذج XSR2002S23-112795
فئران النوع البري C57BL/6Jمختبر جاكسونمخزون # 000664

المراجع

  1. Hylden, J. L., Wilcox, G. L. Intrathecal morphine in mice: a new technique. Eur J Pharmacol. 67 (2-3), 313-316 (1980).
  2. Li, D., Li, Y., Tian, Y., Xu, Z., Guo, Y. Direct intrathecal injection of recombinant adeno-associated viruses in adult mice. J Vis Exp. (144), e58565(2019).
  3. Banks, W. A. Characteristics of compounds that cross the blood-brain barrier. BMC Neurol. 9 Suppl 1 (Suppl 1), S3(2009).
  4. Pardridge, W. M. The blood-brain barrier: bottleneck in brain drug development. NeuroRx. 2 (1), 3-14 (2005).
  5. Ajeeb, R., Clegg, J. R. Intrathecal delivery of macromolecules: clinical status and emerging technologies. Adv Drug Deliv Rev. 199, 114949(2023).
  6. Bennett, C. F., Swayze, E. E. RNA targeting therapeutics: molecular mechanisms of antisense oligonucleotides as a therapeutic platform. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 50, 259-293 (2010).
  7. Corey, D. R. Nusinersen, an antisense oligonucleotide drug for spinal muscular atrophy. Nat Neurosci. 20 (4), 497-499 (2017).
  8. Bey, K., et al. Efficient CNS targeting in adult mice by intrathecal infusion of single-stranded AAV9-GFP for gene therapy of neurological disorders. Gene Ther. 24 (5), 325-332 (2017).
  9. Kennedy, Z., Gilbert, J. W., Godinho, B. Intrathecal delivery of therapeutic oligonucleotides for potent modulation of gene expression in the central nervous system. Methods Mol Biol. 2434, 345-353 (2022).
  10. Stavrou, M., Georgiou, E., Kleopa, K. A. Lumbar intrathecal injection in adult and neonatal mice. Curr Protoc. 4 (6), e1091(2024).
  11. Zou, Z. Y., Liu, C. Y., Che, C. H., Huang, H. P. Toward precision medicine in amyotrophic lateral sclerosis. Ann Transl Med. 4 (2), 27(2016).
  12. Quemener, A. M., et al. The powerful world of antisense oligonucleotides: from bench to bedside. Wiley Interdiscip Rev RNA. 11 (5), e1594(2020).
  13. Rook, M. E., Southwell, A. L. Antisense oligonucleotide therapy: from design to the Huntington disease clinic. BioDrugs. 36 (2), 105-119 (2022).
  14. Neil, E. E., Bisaccia, E. K. Nusinersen: a novel antisense oligonucleotide for the treatment of spinal muscular atrophy. J Pediatr Pharmacol Ther. 24 (3), 194-203 (2019).
  15. Amanat, M., Nemeth, C. L., Fine, A. S., Leung, D. G., Fatemi, A. Antisense oligonucleotide therapy for the nervous system: from bench to bedside with emphasis on pediatric neurology. Pharmaceutics. 14 (11), 2389(2022).
  16. Kingwell, K. Double setback for ASO trials in Huntington disease. Nat Rev Drug Discov. 20 (6), 412-413 (2021).
  17. Mead, R. J., Shan, N., Reiser, H. J., Marshall, F., Shaw, P. J. Amyotrophic lateral sclerosis: a neurodegenerative disorder poised for successful therapeutic translation. Nat Rev Drug Discov. 22 (3), 185-212 (2023).
  18. Gros-Louis, F., Gaspar, C., Rouleau, G. A. Genetics of familial and sporadic amyotrophic lateral sclerosis. Biochim Biophys Acta. 1762 (11-12), 956-972 (2006).
  19. Valentine, J. S., Hart, P. J. Misfolded CuZnSOD and amyotrophic lateral sclerosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (7), 3617-3622 (2003).
  20. Rotunno, M. S., Bosco, D. A. An emerging role for misfolded wild-type SOD1 in sporadic ALS pathogenesis. Front Cell Neurosci. 7, 253(2013).
  21. Winkler, D. D., et al. Structural and biophysical properties of the pathogenic SOD1 variant H46R/H48Q. Biochemistry. 48 (15), 3436-3447 (2009).
  22. Kaur, S. J., McKeown, S. R., Rashid, S. Mutant SOD1 mediated pathogenesis of amyotrophic lateral sclerosis. Gene. 577 (2), 109-118 (2016).
  23. Rosen, D. R., et al. Mutations in Cu/Zn superoxide dismutase gene are associated with familial amyotrophic lateral sclerosis. Nature. 362 (6415), 59-62 (1993).
  24. Bruijn, L. I., et al. Aggregation and motor neuron toxicity of an ALS-linked SOD1 mutant independent from wild-type SOD1. Science. 281 (5384), 1851-1854 (1998).
  25. Gurney, M. E., et al. Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu, Zn superoxide dismutase mutation. Science. 264 (5166), 1772-1775 (1994).
  26. Peggion, C., et al. SOD1 in ALS: taking stock in pathogenic mechanisms and the role of glial and muscle cells. Antioxidants (Basel). 11 (4), 614(2022).
  27. Beers, D. R., et al. Endogenous regulatory T lymphocytes ameliorate amyotrophic lateral sclerosis in mice and correlate with disease progression in patients with amyotrophic lateral sclerosis. Brain. 134 (Pt 5), 1293-1314 (2011).
  28. Marchetto, M. C., et al. Non-cell-autonomous effect of human SOD1 G37R astrocytes on motor neurons derived from human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 3 (6), 649-657 (2008).
  29. Filipi, T., et al. Cortical glia in SOD1(G93A) mice are subtly affected by ALS-like pathology. Sci Rep. 13 (1), 6538(2023).
  30. Turner, B. J., Talbot, K. Transgenics, toxicity and therapeutics in rodent models of mutant SOD1-mediated familial ALS. Prog Neurobiol. 85 (1), 94-134 (2008).
  31. Smith, R. A., et al. Antisense oligonucleotide therapy for neurodegenerative disease. J Clin Invest. 116 (8), 2290-2296 (2006).
  32. Simonini, C., et al. Neurodegenerative and neuroinflammatory changes in SOD1-ALS patients receiving tofersen. Sci Rep. 15 (1), 11034(2025).
  33. Naseri Kouzehgarani, G., et al. Harnessing cerebrospinal fluid circulation for drug delivery to brain tissues. Adv Drug Deliv Rev. 173, 20-59 (2021).
  34. Duan, C., et al. Intrathecal administration of a novel siRNA modality extends survival and improves motor function in the SOD1(G93A) ALS mouse model. Mol Ther Nucleic Acids. 35 (1), 102147(2024).
  35. Miller, T. M., et al. Trial of antisense oligonucleotide tofersen for SOD1 ALS. N Engl J Med. 387 (12), 1099-1110 (2022).
  36. McCampbell, A., et al. Antisense oligonucleotides extend survival and reverse decrement in muscle response in ALS models. J Clin Invest. 128 (8), 3558-3567 (2018).
  37. DeVos, S. L., Miller, T. M. Direct intraventricular delivery of drugs to the rodent central nervous system. J Vis Exp. (75), e50326(2013).
  38. Bhusal, A., Suk, K. Protocol for delivering proteins, peptides, and shRNAs via the intrathecal route in the experimental allergic encephalomyelitis mouse model. STAR Protoc. 5 (3), 103219(2024).
  39. Rahman, M. M., Lee, J. Y., Kim, Y. H., Park, C. K. Epidural and intrathecal drug delivery in rats and mice for experimental research: fundamental concepts, techniques, precaution, and application. Biomedicines. 11 (5), 1413(2023).
  40. Rigaud, M., et al. Species and strain differences in rodent sciatic nerve anatomy: implications for studies of neuropathic pain. Pain. 136 (1-2), 188-201 (2008).
  41. Simon, M. J., Iliff, J. J. Regulation of cerebrospinal fluid (CSF) flow in neurodegenerative, neurovascular and neuroinflammatory disease. Biochim Biophys Acta. 1862 (3), 442-451 (2016).
  42. Law, V., et al. A murine Ommaya xenograft model to study direct-targeted therapy of leptomeningeal disease. J Vis Exp. (167), e62033(2021).
  43. Christensen, J., Li, C., Mychasiuk, R. Choroid plexus function in neurological homeostasis and disorders: the awakening of the circadian clocks and orexins. J Cereb Blood Flow Metab. 42 (7), 1163-1175 (2022).
  44. Wu, W., et al. In vivo imaging in mouse spinal cord reveals that microglia prevent degeneration of injured axons. Nat Commun. 15 (1), 8837(2024).
  45. Shi, L., et al. Repeated intrathecal administration of plasmid DNA complexed with polyethylene glycol-grafted polyethylenimine led to prolonged transgene expression in the spinal cord. Gene Ther. 10 (14), 1179-1188 (2003).
  46. Linninger, A. A., Barua, D., Hang, Y., Iadevaia, S., Vakilynejad, M. A mechanistic pharmacokinetic model for intrathecal administration of antisense oligonucleotides. Front Physiol. 14, 1130925(2023).
  47. Chen, Y., et al. Intrathecal delivery of antisense oligonucleotides in the rat central nervous system. J Vis Exp. 152, e60274(2019).
  48. Molnar-Kasza, A., et al. Evaluation of neuropathological features in the SOD1-G93A low copy number transgenic mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. Front Mol Neurosci. 14, 681868(2021).
  49. Munch, C., O'Brien, J., Bertolotti, A. Prion-like propagation of mutant superoxide dismutase-1 misfolding in neuronal cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (9), 3548-3553 (2011).
  50. Une, M., et al. SOD1-interacting proteins: roles of aggregation cores and protein degradation systems. Neurosci Res. 170, 295-305 (2021).
  51. Gidaro, T., Servais, L. Nusinersen treatment of spinal muscular atrophy: current knowledge and existing gaps. Dev Med Child Neurol. 61 (1), 19-24 (2019).
  52. Hoy, S. M. Nusinersen: first global approval. Drugs. 77 (4), 473-479 (2017).
  53. Metz, T., et al. Biodistribution of radioactively labeled splice-modulating antisense oligonucleotides after intracerebroventricular and intrathecal injection in mice. Nucleic Acid Ther. 34 (1), 26-34 (2024).
  54. Adank, D. N., et al. Comparative intracerebroventricular and intrathecal administration of a nanomolar macrocyclic melanocortin receptor agonist MDE6-5-2c (c[Pro-His-DPhe-Arg-Trp-Dap-Ala-DPro]) decreases food intake in mice. ACS Chem Neurosci. 11 (19), 3051-3063 (2020).
  55. Sharma, A., et al. Multiple doses of cell therapy and neurorehabilitation in amyotrophic lateral sclerosis: a case report. Clin Pract. 10 (3), 1242(2020).
  56. Modol-Caballero, G., et al. Gene therapy overexpressing neuregulin 1 type I in combination with neuregulin 1 type III promotes functional improvement in the SOD1(G93A) ALS mice. Front Neurol. 12, 693309(2021).

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

SOD1
حقن الأسفل داخل القضيب لجرعات SOD1-ASOs لاستهداف الجهاز العصبي المركزي بدقة وفعالية تنبؤية في فئران ALS المصابة ب SOD1-G93A البشرية
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.