Research Article

التعديل المعتمد على الليغاند الكولينية لاقتران الفسفرة التأكسدية في خلايا الورم العصبي BE(2)-C المنفذة للأديجيتونين

DOI:

10.3791/69789

⸱

April 28th, 2026

 , 
1Department of Psychology and Neuroscience, College of Psychology, Nova Southeastern University, 2Capillus

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نقدم بروتوكولا لاختراق غشاء البلازما بشكل انتقائي، مما يمكن من توصيل الركائز والمثبطات المستهدفة لتقييم الفسفرة التأكسدية للميتوكوندريا (OXPHOS) في الخلايا المزروعة، متغلبا على حواجز نقل أغشية البلازما التي تعيق عادة هذا التحليل. باستخدام هذه التقنية، أظهرنا كيف يتم تعديل وظيفة أكسفوس بواسطة محفزات ومنشطات موسكارينية.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

كان هدف هذه الدراسة تقييم وظيفة الفسفرة التأكسدية (OXPHOS) في الخلايا المزروعة باستخدام تركيبات محددة من الركيزة–المثبطات مع الاحتفاظ بالبنية الخلوية والسياق السيتوصولي المفقود في تحضيرات الميتوكوندريا المعزولة. نظرا لأن الخلايا السليمة ضعيفة النفاذية لعدة وسطيات دورة كريبس، فإن التقييم المباشر للتنفس المدعوم بالركيزة عبر نقاط دخول محددة لسلسلة نقل الإلكترونات (ETC) محدود التقييم. لتجاوز ذلك، طبقنا نفاذية غشاء البلازما الانتقائية بوساطة الأديتونين وأجرينا اختبارات اقتران وتدفق إلكترونيات معتمدة على محلل تدفق خارج الخلية في خلايا الورم العصبي BE(2)-C. لتحديد الاعتماد على نوع الخلية، تم تعديل الديجيتونين تجريبيا في خلايا HEK293 وخلايا العقد الظهرية الظهرية الأولية للجرذان باستخدام السوكسينات + روتينون لعزل التنفس المدفوع بالمعقد II–IV.

أظهر التنفس المدعوم بالسوكسينات مع تثبيط المركب I زيادة في استهلاك الأكسجين (O₂) المدفوع بالمركب II–IV في الخلايا غير المنفاذة مقارنة بالخلايا غير المنفاذة، مما يتوافق مع تحسين وصول الركيزة غير المنبعة من الغشاء إلى الميتوكوندريا. في المقابل، أظهر التنفس المدعوم بالركائز التي تدخل عبر مسارات نقل داخلية (مثل البيروفات/المالات) فروقا أصغر بين الحالات. باستخدام هذه المنصة لاختبار الروابط المسكارية، لاحظنا فروقا بين المنشطات والمضادات في استهلاك الأكسجين في اختبار الاقتران، بينما أظهر اختبار تدفق الإلكترونات تأثيرات مرتبطة بالرابطة ضئيلة تحت الظروف المختبرة. تشير هذه النتائج إلى أن تأثيرات الليغاند القابلة للكشف كانت أكثر وضوحا على مستوى الحالات التنفسية المعرفة بالاقتران مقارنة بأقصى قدرة نقل إلكترونيات. بشكل عام، توسع النفاذية الانتقائية إمكانية الوصول إلى الركيزة في اختبارات الطاقة الحيوية للخلايا المزروعة وتمكن من تحليل التعديل الدوائي للتنفس الميتوكوندري.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعد خلل أو إعادة برمجة استقلاب الطاقة الميتوكوندرية جوهريا في طيف واسع من الاضطرابات، بما في ذلك التنكس العصبي، والسرطان، والأمراض الالتهابية، والحالات القلبية الأيضية، واضطرابات وراثية متنوعة. لفهم أفضل لدور الأيض الميتوكوندري في مسببات الأمراض بشكل أفضل، تم تطوير عدة استراتيجيات تحليلية. تشمل هذه قياسات معدل استهلاك الأكسجين2 (OCR)، معدل التحمض خارج الخلوي (ECAR)، قياس ATP، استخدام الركيزة، تحليل التحليل أو تحليل مستقلبات دورة كريبس، وتتبع النظائر1. من بين هذه التقنيات، يعد التصوير الضوئي على الحروف البصرية مؤشرا رئيسيا على التنفس الميتوكوندري ويمكن تقييمه باستخدام أدوات مثل قياس التنفس عالي الدقة (HRR؛ مثل Oroboros O2k)2، أو قطب كلارك، أو محلل التدفق خارج الخلوي

يقيس نظام Oroboros O2k تركيزالأكسجين في غرفة محكمة الإغلاق باستخدام حساس O2 بولاروغرافي من نوع كلارك (POS)3,4,5، وهو مناسب لعينات مثل الميتوكوندريا المعزولة، والخلايا المنفاذة، ومتجانسات الأنسجة. يتكون من كاثود ذهب/بلاتين، أنود فضي، وخزان إلكتروليت KCl مفصول عن العينة غشاء بروبيلين الإيثيلين المفلور الفلوري الفائر 25 ميكرومتر O2 ومقاوم كيميائيا (FEP). يعمل قطب كلاركالثالث أيضا في غرفة مغلقة، حيث يكتشف التغيرات في تركيزالأكسجين 2 عبر قطب حساس ل O2، ويستخدم عادة للميتوكوندريا المعزولة أو معلقات الخلايا. على النقيض من ذلك، يقوم محلل التدفق خارج الخلوي بقياس الوضوح الضوئي الضوئي (OCR) وECAR في الخلايا الحية الملتصقة أو الميتوكوندريا المعزولة باستخدام حساسات فلورية مدمجة في صفائح دقيقة، مما يمكن من التحليل الأيضي عالي الإنتاجية. ميزة عملية لمنصة محلل التدفق خارج الخلوي هي التقييم الآلي متعدد المعلمات عبر ظروف متعددة بالتوازي، بينما توفر أنظمة الحجرة المغلقة (مثل أقطاب HRR أو كلارك) عادة إنتاجية أقل وتتطلب معالجة يدوية أكثر.

يعد محلل التدفق خارج الخلية مفيدا بشكل خاص لتقييم وظيفة الميتوكوندريا في الخلايا الملتصقة أو الخلايا المعلقة التي تستقر في أسفل الصفيحة الدقيقة. في الاختبارات باستخدام خلايا ملتصقة سليمة، يمكن تحليل أيض الطاقة الميتوكوندرية باستخدام ركائز مثل الجلوكوز أو البيروفات6. بدلا من ذلك، تسمح الفحوصات باستخدام كميات صغيرة من كسور الميتوكوندريا المخصبة بقياس تسلسلي للتنفس القاعدي، والتنفس المحفز بواسطة ADP (الحالة 3)، والتنفس أثناء الراحة (الحالة 4)، والتنفس غير المحفز باستخدام تركيبات من الركائز والمثبطات7. ومع ذلك، في أنظمة الخلايا السليمة، لا يمكن استخدام مستقلبات دورة حمض التريكربوكسيليك (TCA) التي لا يمكن استخدامها مباشرة لتقييم أيضها. بينما تسمح الميتوكوندريا المعزولة باستخدام مثل هذه المستقلبات بسبب غياب حواجز الغشاء البلازمي. تحليل نهج الطاقة الحيوية الميتوكوندرية المعزولة والمغنية له قيود: يمكن تعديل بنية الميتوكوندريا أثناء العزل، وتقل أو تغيب العوامل السيتوزوليكية التي تؤثر على أيض الميتوكوندريا ونقل المستقلبات. وبناء عليه، غالبا ما تستخدم طرق النفاذية الانتقائية كحل وسط يمكنه الاحتفاظ بجوانب من بنية الخلية مع تمكين الوصول المسيطر عليه إلى الميتوكوندريا. لتجاوز قيود استخدام الخلايا السليمة أو الميتوكوندريا المعزولة في الفحوصات الأيضية، يصف هذا البروتوكول طريقة لنفاذ خلايا الورم العصبي الملتصقة (BE(2)-C) باستخدام الديجيتونين. يسهل هذا النهج استيراد مستقلبات غير منفذة للخلايا عبر غشاء البلازما مع الحفاظ على الاستجابات الميتوكوندرية الوظيفية للركائز والمثبطات المحددة.

تعتمد انتقائية الديجيتونين على اختلافات في تركيب دهون الغشاء: فغشاء البلازما غني بالكوليسترول، بينما تحتوي أغشية الميتوكوندريا — وخاصة الغشاء الداخلي الميتوكوندري — على كمية قليلة جدا من الكوليسترول8. عند تركيزات منخفضة، يخترق الغشاء البلازما بشكل انتقائي وكامل بسبب محتواه العالي من الكوليسترول، بينما تتأثر أغشية الميتوكوندريا فقط عند تركيزات أعلى 9,10. يرتبط الديجيتونين بالكوليسترول ويشكل مسامات في غشاء البلازما، مما يسمح للجزيئات الصغيرة مثل وسيطة دورة TCA بالدخول إلى السيتوسول دون تعطيل بنية أو وظيفة الميتوكوندريا عند تحسينها بشكل صحيح. هذا النهج مناسب بشكل أفضل للخلايا المزروعة التي يمكن تغطيتها بشكل متكرر كطبقات أحادية ملتصقة في صفيحة تحليل تدفق خارج الخلية، ويتطلب معايرة تجريبية لتركيز الديجيتونين لكل نوع من أنواع الخلايا وكثافة البذر. تشمل مؤشرات التشغيل للحفاظ على سلامة الميتوكوندريا استجابات OCR قوية وحساسة للمثبطات (مثل الانخفاض المتوقع مع الروتينون/أنتيميسين A والتنفس المدفوع ب Complex IV مع الأسكوربات/TMPD)، إلى جانب غياب انهيار OCR يشير إلى زيادة النفاذ. لذلك، يجب إجراء تحسين الديجيتونين قبل المقارنات التجريبية وتكراره كلما تغيرت ظروف الزراعة أو كثافة الخلايا. علاوة على ذلك، يختلف تركيز الأمثل للديجيتونين حسب نوع الخلية ويجب تحديده تجريبيا لإنشاء نافذة نفاذية تسمح بدخول الركائز غير المنبعة (مثل السوكسنات) مع الحفاظ على وظيفة الميتوكوندريا الحساسة للمثبطات. في هذه الدراسة، نوضح هذا المبدأ من خلال تحسين الديجيتونين ليس فقط في خلايا BE(2)-C، بل أيضا في خلايا HEK293 وخلايا العقدة الظهرية الظهرية الأولية للجرذان (DRG).

تم إثبات هذا البروتوكول باستخدام خلايا الورم العصبي BE(2)-C، والتي تم عزلها أصلا من دماغ مريض ذكر مصاب بالورم العصبي. تعبر خلايا BE(2)-C عن مستقبلات مسكارينية مختلفة، خصوصا المستقبل الكوليني المسكاريني النوع 1 (CHRM1). في دراساتنا السابقة، أظهرنا أن CHRM1 مرتبط بالميتوكوندريا في كل من أجسام الخلايا وعصبات عصبية عصبية العقدة الظهرية للجرذان المزروعة، وكذلك في خلايا HEK293 التي تم تحويلها إلى CHRM111. علاوة على ذلك، فإن حذف Chrm1 الجيني في الفئران يغير جوانب متعددة من بنية ووظيفة الميتوكوندريا12,13. لذلك، نفترض أن خلايا BE(2)-C يمكن استخدامها لدراسة التأثيرات التعديلية للليغاندات المسكارينية على وظيفة OXPHOS. في هذا العرض، درسنا تأثيرات العوامل المسكارينية — بما في ذلك المنشطات الأستيل كولين، والمضاد المتحيز بيرينزيبين14، والأتروبين المضاد — على التنفس الميتوكوندري في وجود إما السوكسينات أو البيروفات/المالات كركائز وقارنا تأثيرها.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. الذوبان والطلاء الأولي

ملاحظة: الوسط الأساسي لخلايا BE(2)-C هو مزيج بنسبة 1:1 من وسط إيجل الأساسي، ومتوسط F12 المصمم من ATCC، مع إضافة مصل أبقار جنيني بنسبة 10٪ (FBS).

  1. إذابة الخلايا المجمدة BE(2)-C من كريوفيال في حمام ماء بدرجة حرارة 37 درجة مئوية. بعد إذابة الجليد، قم بعمل طرد مركزي على الخلايا بمقدار 200 × جرام لمدة 5 دقائق لإزالة الواقي الكريوآتي.
  2. أعد تعليق حبيبة الخلية في وسط نمو كامل وغطى الخلايا في طبق زراعة خلايا بقطر 10 سم. حضن الزراعة عند 37 درجة مئوية في حاضنة رطبة تحتوي على 5٪ ثاني أكسيد الكربون في الهواء حتى تصل الخلايا إلى التقارب الفرعي.

2. الزراعة الفرعية

  1. يزرع الخلايا في 2-3 ممرات لضمان وصولها إلى مرحلة نمو أسية مستقرة.

3. التربسينية وتحضير التعليق أحادي الخلية

  1. عندما تصل الزراعة إلى 60–80٪ من التلاقط، قم بتريبسين الخلايا. مرر تعليق الخلية عدة مرات عبر ماصات نقل ذات طرف دقيق مع أطراف مصقولة لتفكيك الكتل وتحقيق تعليق خلية واحدة.
  2. أضف وسط طازج يحتوي على FBS لتعادلية التريبسين. قم بعمل طرد مركزي على الخلايا على حرارة 200 × جرام لمدة 5 دقائق لإزالة الحبيبات.

4. بروتوكول البذر الخلوي لألواح زراعة الخلايا ذات 24 بئر المستخدم في محلل تدفق الخلايا خارج الخلية

  1. أعد تعليق الحبيبة في وسط كامل بتركيز نهائي يبلغ 10,000 خلية لكل 100 ميكرولتر لكل بئر.
  2. قم بزرع الخلايا بكثافة مثالية لضمان وصولها إلى التقاء كامل خلال يوم إلى يومين. اترك إما الآبار الأربعة أو بئر زاوية واحد فارغا، حسب التصميم التجريبي. هذه الآبار ستعمل كعناصر تحكم خلفية.
    ملاحظة: قد يتطلب ذلك تجربة وخطأ، بما في ذلك تعديلات على حجم الوسائط وتوقيتها.
  3. راقب الثقافة بحثا عن تغيرات في لون الوسط—فالاصفرار يشير إلى انخفاض في درجة الحموضة ويتطلب استبدالا فوريا بوسط جديد للحفاظ على صحة الخلايا.

5. التحضير لاختبار التحليل القائم على محلل التدفق خارج الخلوي

ملاحظة: تنسيقات اختبار الاقتران وتدفق الإلكترونات المستخدمة هنا تتبع سير عمل التنفس الميتوكوندري المعتمد على الصفائح الدقيقة7، مع تعديلات تشمل نفاذية خلايا BE(2)-C باستخدام معايرة الديجيتونين وشروط معالجة الرابطة المسكارينية.

  1. جهز المحاليل الأصلية ومحلول اختبار الميتوكوندريا مرتين (MAS). حضر مسبقا خلطتين من MAS ومحاليل المخزون العاملة (الركائز والمثبطات) (انظر الجدول 1، الجدول 2، والجدول 3).
  2. قم بتخزين جميع الحلول الجاهزة ونظام MAS عند -20 درجة مئوية للاستخدام المستقبلي، مما يسمح بإعداد التحليل بكفاءة.
    السلامة: روتينون، أنتي ميسين A، أوليغوميسين، FCCP، ديجيتونين، وTMPD خطرة ويجب التعامل معها وفقا لإرشادات السلامة المؤسسية. يجب تجهيز جميع محاليل المثبطات والتعامل معها بغطاء بخار كيميائي معتمد مع ارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة (معطف المختبر، قفازات النتريل، وحماية العين). يجب جمع المحاليل التي تحتوي على هذه المواد الكيميائية، بالإضافة إلى النفايات التي تحتوي على DMSO، والتخلص منها كنفايات كيميائية خطرة وفقا للأنظمة المؤسسية والمحلية. يجب تنظيف أسطح العمل بعد الاستخدام.
  3. ترطيب خرطوشة المستشعر
    1. في الليلة التي تسبق التجربة، قم بترطيب خرطوشة حساس محلل التدفق خارج الخلوي بإضافة 1 مل من مخزن معايرة خرطوشة المستشعر أو محلول ملحي مخزن الفوسفات (PBS، pH 7.4) إلى كل بئر. دع خرطوشة المستشعر تبقى طوال الليل (12–18 ساعة) في درجة حرارة الغرفة (20–25 درجة مئوية).
      ملاحظة: الحضانة في حاضنة خالية من ثاني أكسيد الكربون عند درجة حرارة 37 درجة مئوية ليست ضرورية، حيث أن الخرطوشة ستتوازن مع درجة حرارة الغرفة أثناء عملية التحميل. بمجرد وضعها في محلل التدفق خارج الخلوي للمعايرة، ستصل الخرطوشة إلى 37 درجة مئوية خلال حوالي 15 دقيقة.

6. يوم التجربة

ملاحظة: جهز جميع المحاليل طازجة، وضبط درجة الحموضة إذا لزم الأمر، واحتفظ بالتجميد حتى الاستخدام.

  1. قم بإذابة مخزون الركيزة المجمدة و2x MAS في درجة حرارة الغرفة (20–25 درجة مئوية) لمدة 15–30 دقيقة أو في حمام ماء بدرجة حرارة 37 °C لمدة 5–10 دقائق.
  2. جهز جميع محاليل الركيزة والحقن (انظر الجدول 4، الجدول 5، الجدول 6، والجدول 7) وتحقق من أن الرقم الهيدروجيني عند 7.4. قم بتعديل المحاليل إذا لزم الأمر واحتفظ بالمحلول في الثلاجة حتى الاستخدام. استخدم الجدول 4 والجدول 5 لاختبار الاقتران. لاختبار تدفق الإلكترونات، استخدم الجدول 6 والجدول 7.
  3. قم بتحميل المثبطات والركائز في منافذ الخرطوشة المناسبة للمستشعر واستعد لإجراء الاختبار. اعتمادا على نوع الاختبار—اختبار الاقتران أو اختبار تدفق الإلكترون 7 —يرجى الرجوع إلى الجدول 4 والجدول 5 أو الجدول 6 والجدول 7 على التوالي حسب الحاجة.
  4. جهز جميع الحلول العاملة للركيزة والمثبطات بأحجام نهائية محددة (الخلطات السائبة: 15 مل؛ خلطات حقن الخرطوشة: 2 مل لكل منفذ). حساب التركيزات لتحقيق التركيزات النهائية المطلوبة في البئر بعد الحقن (حجم البئر النهائي: 700 ميكرولتر بعد المنفذ D).
  5. أضف 450 ميكرولتر من محلول الاختبار المحضر إلى كل بئر من صفيحة محلل التدفق خارج الخلية ذات 24 بئرا تحتوي على روابط موسكارينية (تركيز الليجند النهائي: 1 ميكرومول؛ الحجم الكلي: 500 ميكرولتر). تأكد من أن كل بئر يحتوي بالفعل على 50 ميكرولتر من 1x MAS والخلايا المغمورة.
    ملاحظة: قم بتنفيذ هذه الخطوة مباشرة قبل تحميل اللوحة في المحلل.
  6. تحميل 50 ميكرولتر من كل كاشف جاهز في منفذ الحقن المقابل لخرطوشة المستشعر.

7. برمجة الأجهزة وتنفيذ الاختبارات

  1. شغل محلل التدفق خارج الخلية قبل ساعة إلى ساعتين على الأقل من التجربة للسماح للحاضنة الداخلية بالاستقرار عند 37 درجة مئوية. حافظ على حرارة الحجرة عند 37 درجة مئوية طوال فترة المعايرة وإجراء الاختبار.
  2. برمج المحلل لأداء دورات المزج والانتظار والقياس المناسبة وفقا للجدول 8.
  3. وضع علامات على الآبار والمجموعات التجريبية في البرنامج وفقا لتصميم التجريب.
  4. ابدأ عملية الفحص. اسمح للجهاز بمعايرة خرطوشة المستشعر (~15 دقيقة).
  5. جهز لوحة الفحص للتحميل أثناء معايرة الخرطوشة. تأخير التحميل إذا لزم الأمر؛ ستظل خرطوشة المستشعر مستقرة عند 37 درجة مئوية داخل الآلة.
  6. أكمل الفحص عند انتهاء دورة القياس النهائية بعد حقن المنفذ D. تابع فورا إلى التطبيع بعد الفحص وتحليل البيانات.

8. تحضير صفيحة الخلية لاختبار محلل التدفق خارج الخلية

  1. ابدأ بتحضير لوحة الخلية فور وضع خرطوشة المستشعر في المحلل للمعايرة. أضف 700 ميكرولتر من 1x MAS buffer إلى كل بئر يحتوي على خلايا ملتصقة. حضن في درجة حرارة الغرفة (20–25 درجة مئوية) لمدة دقيقة واحدة.
  2. استنشق المخزن بحذر دون إزعاج الخلايا المتصلة. كرر خطوة الغسيل لمدة لا تقل عن 3 × 1 دقيقة لإزالة وسط الزراعة المتبقي وأكمل جميع الغسولات خلال 10 دقائق.
  3. أضف 50 ميكرولتر من مخزن MAS 1x إلى بئر خلفية مخصص (بدون خلايا) لإنشاء مرجع بصري للحجم.
  4. يتم سحب العزل من الآبار التجريبية، مما يترك حوالي 50 ميكرولتر من المخزن المتبقي في كل بئر.
  5. حضن الصفيحة عند حرارة 37 درجة مئوية في حمام ماء، مع إبقاء اللوح فوق سطح الماء لمنع التبخر. حافظ على درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق (أقصى 20 دقيقة) قبل التحميل.
  6. قبل تحميل اللوحة مباشرة، أضف 450 ميكرولتر من 1x MAS buffer يحتوي على الركائز المناسبة لكل بئر للوصول إلى حجم نهائي 500 ميكرولتر.
  7. أدخل اللوحة في محلل التدفق خارج الخلية.

9. نهاية الاختبار وتحليل البيانات

  1. قم بإزالة لوحة الخلية وخرطوشة المستشعر من المحلل بعد الانتهاء من التشغيل.
  2. تطبيع قيم الضبط الضوئي في الحشد لكل بئر باستخدام قياس البروتين الكلي أو إجمالي عدد الخلايا. تقوم الخلايا التحليل باستخدام RIPA بقياس البروتين الكلي باستخدام اختبار برادفورد أو اختبار بروتين مطيافي ضوئي آخر.
  3. تطبيع قيم التعرف الضوئي على الحرارم باستخدام برنامج التحليل وتصدير البيانات حسب الحاجة.
  4. تطبيق معايير القبول التالية: تأكيد استقرار السجل الضوئي على الدرجة الأساسية (≤انحراف 15٪ عبر دورتين قياسيتين متتاليتين) وتأكيد ≥انخفاض بنسبة 60٪ في السجل الضوئي الضوئي بعد حقن روتينون، أوليغومايسين، أو أنتي ميسين A.
  5. استبعد الدفعات التي تفشل في هذه المعايير وأعد تحسين تركيز المنفاذ أو كثافة بذر الخلايا حسب الحاجة.

10. تصدير النتائج

  1. أدخل وحدة تخزين USB في الآلة.
  2. تصدير بيانات الاختبار.

11. معالجة البيانات

  1. حلل البيانات باستخدام برنامج الأداة.
  2. تصدير البيانات المعالجة بصيغ متوافقة مع برامج التحليل المفضلة لمزيد من التحليل والتصور.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تحسين تركيز الأديتونين لنفاذ خلايا C BE(2) في اختبار الاقتران
في بداية هذا البروتوكول، قمنا بتوحيد تركيز الأديتونين الأمثل المطلوب لنفاذ الخلايا الفعال دون التأثير على التنفس الميتوكوندري. في هذا البروتوكول، اختبرنا تركيزات بداية 5 ميكرومولار و10 ميكرومولار وأجرينا اختبار اقتران. يقوم هذا الاختبار بتقييم درجة الترابط بين ETC وآلات OXPHOS، مما يسمح لنا بالتمييز بين التنفس المدفوع ب ETC وOXPHOS. تم استخدام روتينون لتثبيط المركب I، بينما كان السوكسينات هو المانح للإلكترو...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تقدم هذه الدراسة بروتوكولا سريعا وفعالا من حيث التكلفة لتقييم تعديل OXPHOS بواسطة الليغاند العضلي في خلايا الورم العصبي المزروعة. من خلال استخدام ديجتونين المنتقي الانتقائي لنفاذ غشاء البلازما، مع أزواج محددة من الركيزة والمثبطات، مكنا من توصيل ركائز أيضية مستهدفة مثل السوكسينات مباشرة إلى الميتوكوندريا في الموقع. يتغلب هذا النهج على قيود أغشية الخلايا السليمة، التي عادة ما تقيد الوصول إلى الوسيطات الرئيسية لدورة TCA. ومن المهم أن البروتوكول يحافظ على البنية الخلوية والتفاعلات ا...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المؤلفون لا يفرضون أي تضارب مصالح.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعترف المؤلفون بأبحاث مستشفى سانت بونيفاس، جامعة مانيتوبا، وينيبيغ، كندا؛ وجامعة نوفا ساوث إيسترن (NSU)، فورت لودرديل، فلوريدا، الولايات المتحدة الأمريكية، لتوفير التمويل ودعم البنية التحتية. كما يشكر المؤلفون شركة Alzo Biosciences في سان دييغو، كاليفورنيا وCapillus في ميامي، فلوريدا، الولايات المتحدة الأمريكية على الدعم التمويلي.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
كلوريد الأستيل كولينميليبورسيغماA6625منشط موسكاريني
ADPMP Biomedicals, IncICN19014901مستقبل الإلكترونات، ركيزة لتخليق ATP.
أنتيميسين أAAJ63522MAثيرمو ساينتفيكيثبط مركب الميتوكوندريا III
الأتروبينميليبورسيغما1044990الخصم المسكاريني
خلايا Be2Cمجموعة ثقافة الأنواع الأمريكيةCRL-2268خلية من الخلايا العصبية التي تم عزلها من دماغ مريض ذكر مصاب بالورم العصبي تعبر عن مستقبل عضلي
ديجيتونينميليبورسيغماD141منظف خفيف، منفذ غشاء.
دي-مانيتولالكيمياويات العلمية الحراريةAA3334236كحول سكري غير قابل للأيض، يستخدم لتثبيت الأسموزي وحماية الغشاء
EGTAميليبورسيغماE0396تخلب الكالسيوم، يمنع تنشيط البروتيازات المعتمدة على الكالسيوم وإنزيمات أخرى قد تحلل بروتينات الميتوكوندريا.
BSA الخالي من الأحماض الدهنيةميليبورسيغما126575يمنع تأثيرات الأحماض الدهنية غير المنضبطة، ويثبت الميتوكوندريا
FCCPشركة كايمان للكيماوياتNC0904863بروتونوفور وفصل الفسفرة التأكسدية في الميتوكوندريا
هيبسميليبورسيغما391340تخزين الرقم الهيدروجيني، التوافق مع وظيفة الميتوكوندريا
إل-أسكوربيتتي سي آي أمريكاA053925Gدورة TCA، ركيزة OXPHOS
كلوريد المغنيسيومميليبورسيغماM8266لتوازن الأيونيات، دعم النشاط الإنزيمي
N1,N1,N1,N1,N1-تترامثيل-1,4-فينيلين ديامين (TMPD)متبرع الإلكترون إلى السيتوكروم c، تقييم وظيفة IV المعقدة بتجاوز المعقدين I و II، يتيح TMPD/الأسكوربات القياس المباشر لاستهلاك الأكسجين المعتمد على المعقد IV
أوليغوميسينميليبورسيغما1404-19-9يثبط تخليق ATP الميتوكوندري، المركب V
بيرينزيبين ثنائي الهيدروكلوريدميليبورسيغماP7412منشط متحيز موسكاريني
حمض بيروفيكالكيمياويات العلمية الحراريةAC132155000ركيزة دورة TCA
روتينونيميليبورسيغما557368يثبط المركب الميتوكوندري I
ألواح زراعة الخلايا من Seahorse XF24 V7 PSأجيلينت102340-100صفائح زراعة الخلايا الدقيقة
محلل Seahorse XFe24أجيلينتS7801BRتقيس محللات Agilent Seahorse XFe24 معدل استهلاك الأكسجين (OCR) ومعدل التحمض خارج الخلايا (ECAR) للخلايا الحية في شكل صفيحة مكونة من 24 بئرا.
حمض السكسينيكفيشر كيميكالAC158742500دورة TCA، ركيزة OXPHOS
مخزن معايرة خرطوشة مستشعر XFe24أجيلينت102340100pH لمخزن PBS 7.2
خراطيش مستشعرات XFe24أجيلينت102340-100مستشعر لقياس السجل الضوئي الضوئي (OCR) وقياس ECAR

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Yin, Y., Shen, H. Common methods in mitochondrial research (review). Int J Mol Med. 50 (4), 148(2022).
  2. Walsh, M. A., Musci, R. V., Jacobs, R. A., Hamilton, K. L. A practical perspective on how to develop, implement, execute, and reproduce high-resolution respirometry experiments: the physiologist's guide to an Oroboros O2k. FASEB J. 37 (12), e23280(2023).
  3. Severinghaus, J. W., Astrup, P. B. History of blood gas analysis. IV. Leland Clark's oxygen electrode. J Clin Monit. 2 (2), 125-139 (1986).
  4. Gnaiger, E. Mitochondrial pathways and respiratory control. Drug-induced mitochondrial dysfunction. , 325-352 (2008).
  5. Chance, B., Williams, G. R. A simple and rapid assay of oxidative phosphorylation. Nature. 175 (4469), 1120-1121 (1955).
  6. Gu, X., Ma, Y., Liu, Y., Wan, Q. Measurement of mitochondrial respiration in adherent cells by Seahorse XF96 cell mito stress test. STAR Protoc. 2 (1), 100245(2021).
  7. Rogers, G. W., et al. High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. PLoS One. 6 (7), e21746(2011).
  8. Subczynski, W. K., Pasenkiewicz-Gierula, M., Widomska, J., Mainali, L., Raguz, M. High cholesterol/low cholesterol: effects in biological membranes: a review. Cell Biochem Biophys. 75 (3-4), 369-385 (2017).
  9. Pesta, D., Gnaiger, E. High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle. Methods Mol Biol. 810, 25-58 (2012).
  10. Fan, H. Y., Heerklotz, H. Digitonin does not flip across cholesterol-poor membranes. J Colloid Interface Sci. 504, 283-293 (2017).
  11. Sabbir, M. G. Cholinergic receptor muscarinic 1 co-localized with mitochondria in cultured dorsal root ganglion neurons, and its deletion disrupted mitochondrial ultrastructure in peripheral neurons: implications in Alzheimer's disease. J Alzheimers Dis. 98 (1), 247-264 (2024).
  12. Sabbir, M. G., Swanson, M., Speth, R. C., Albensi, B. C. Hippocampal versus cortical deletion of cholinergic receptor muscarinic 1 in mice differentially affects post-translational modifications and supramolecular assembly of respiratory chain-associated proteins, mitochondrial ultrastructure, and respiration: implications in Alzheimer's disease. Front Cell Dev Biol. 11, 1100854(2023).
  13. Sabbir, M. G., Swanson, M., Albensi, B. C. Loss of cholinergic receptor muscarinic 1 impairs cortical mitochondrial structure and function: implications in Alzheimer's disease. Front Cell Dev Biol. 11, 1158604(2023).
  14. Sabbir, M. G., Fernyhough, P. Muscarinic receptor antagonists activate ERK-CREB signaling to augment neurite outgrowth of adult sensory neurons. Neuropharmacology. 143, 268-281 (2018).
  15. Sabbir, M. G., Taylor, C. G., Zahradka, P. CAMKK2 regulates mitochondrial function by controlling succinate dehydrogenase expression, post-translational modification, megacomplex assembly, and activity in a cell-type-specific manner. Cell Commun Signal. 19 (1), 98(2021).
  16. Sabbir, M. G., Calcutt, N. A., Fernyhough, P. Muscarinic acetylcholine type 1 receptor activity constrains neurite outgrowth by inhibiting microtubule polymerization and mitochondrial trafficking in adult sensory neurons. Front Neurosci. 12, 402(2018).
  17. Facino, R. M., Carini, M., Stefani, R., Aldini, G., Saibene, L. Anti-elastase and anti-hyaluronidase activities of saponins and sapogenins from Hedera helix, Aesculus hippocastanum, and Ruscus aculeatus: factors contributing to their efficacy in the treatment of venous insufficiency. Arch Pharm (Weinheim). 328 (10), 720-724 (1995).
  18. Dervishi, M., et al. Sterols govern membrane susceptibility to saponin-induced lysis. bioRxiv. , (2025).
  19. Mhada, M., Metougui, M. L., El Hazzam, K., El Kacimi, K., Yasri, A. Variations of saponins, minerals and total phenolic compounds due to processing and cooking of quinoa (Chenopodium quinoa Willd.) seeds. Foods. 9 (5), 660(2020).
  20. Fasciani, I., et al. The C-terminus of the prototypical M2 muscarinic receptor localizes to the mitochondria and regulates cell respiration under stress conditions. PLoS Biol. 22 (4), e3002582(2024).
  21. Skok, M. Mitochondrial nicotinic acetylcholine receptors: mechanisms of functioning and biological significance. Int J Biochem Cell Biol. 143, 106138(2022).
  22. Felmlee, M. A., Jones, R. S., Rodriguez-Cruz, V., Follman, K. E., Morris, M. E. Monocarboxylate transporters (SLC16): function, regulation, and role in health and disease. Pharmacol Rev. 72 (2), 466-485 (2020).
  23. Wohlrab, C., Phillips, E., Dachs, G. U. Vitamin C transporters in cancer: current understanding and gaps in knowledge. Front Oncol. 7, 74(2017).
  24. Rovini, A. Tubulin-VDAC interaction: molecular basis for mitochondrial dysfunction in chemotherapy-induced peripheral neuropathy. Front Physiol. 10, 671(2019).
  25. Heuck, A. P., Moe, P. C., Johnson, B. B. The cholesterol-dependent cytolysin family of gram-positive bacterial toxins. Subcell Biochem. 51, 551-577 (2010).
  26. Murase, K. Cytolysin A (ClyA): a bacterial virulence factor with potential applications in nanopore technology, vaccine development, and tumor therapy. Toxins (Basel). 14 (2), 107(2022).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Oxidative PhosphorylationCholinergic LigandsDigitonin PermeabilizationBE 2 C CellsNeuroblastoma CellsExtracellular Flux AnalyzerMitochondrial RespirationComplex II RespirationPlasma Membrane PermeabilizationElectron Transport Chain

Related Articles