يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة بحثية
* These authors contributed equally
تحدد هذه الدراسة توقيعا تأكسديا مرتبطا بالإجهاد التأكسدي 10-lncRNA في سرطان الخلايا الحرشفية الرئوي (LUSC) باستخدام بيانات من أطلس جينوم السرطان. على الرغم من أن التحقق أظهر أداء تنبؤيا سريريا محدودا، إلا أن التوقيع تميز أنماط البيئة الدقيقة المناعية، ودعمت اختبارات المختبر LINC01615 كمرشح مرتبط بالهجرة والغزو لمزيد من التحقيقات الميكانيكية.
يؤثر الحمض النووي الريبي غير المشفر طويل السلسلة (lncRNA) بشكل كبير على القيمة التنبؤية لسرطان الخلايا الحرشفية الرئوي (LUSC) وتسلل المناعة. هدفت هذه الدراسة إلى إظهار كيف تؤثر الحمض النووي الريبي الريبي المرتبط بالإجهاد التأكسدي على سرطان الخلايا الحرشفية في الرئة (SCC). جمعت مجموعة بيانات أطلس جينوم السرطان (TCGA) معلومات النسخ المكتوب والبيانات السريرية ذات الصلة ل LUSC. لبناء نموذج تنبؤي، تم تحديد 10 جينات مرتبطة بالتوقعات باستخدام سلسلة من تحليلات المعلوماتية الحيوية التي قارنت التعبير الشاذ لجين OS في الأورام والأنسجة السليمة، بالإضافة إلى ارتباطه بالسرطان. تم تصنيف المشاركين إلى مجموعات عالية ومنخفضة الخطورة بناء على متوسط درجة المخاطر المستمدة من توقيع الجينات العشرة. بينما أظهر نموذج المخاطر الرياضي أداء تنبؤيا مستقلا محدودا في مجموعة التحقق (AUC ~ 0.5)، كشفت التقييمات الوظيفية والمناعية عن اختلافات كبيرة في بيئة الورم الدقيقة (TME) عبر طبقات الخطر. على وجه التحديد، أظهر المرضى المعرضون لخطر العالي ملفات تسلل مناعية مميزة ودرجات مناعة متغيرة مقارنة بنظرائهم منخفضي الخطورة. لذلك، بدلا من أن يكون أداة تنبؤ سريرية مباشرة، يوفر توقيع lncRNA المرتبط بالإجهاد التأكسدي رؤى بيولوجية قيمة حول المشهد المناعي لسرطان الرحم التأكسدي ويبرز أهدافا علاجية محتملة لمزيد من التحقيقات الميكانيكية.
يظهر سرطان الرئة أعلى معدل حدوث ووفيات عالميا بين الأورام الخبيثة1. ضمن المتحورات النسيجة لسرطان الرئة غير صغير الخلايا (NSCLC)، يعد سرطان الخلايا الحرشفية الرئوية (LUSC) نوعا فرعيا سائدا، وغالبا ما يرتبط بنتائج سريرية غير مواتية ونقص في علاجات مستهدفة فعالة للغاية مقارنة بسرطان الغدةفي الرئة 2. بينما تشمل الأساليب العلاجية الأساسية التدخل الجراحي، العلاج الإشعاعي، والعلاج الكيميائي، غالبا ما يظهر المرضى المصابون ب LUSC المتقدم مقاومة علاجية3. وبالتالي، هناك حاجة ملحة لتحديد مؤشرات حيوية جزيئية قوية لتحسين الطبقات التنبؤية وتوجيه استراتيجيات علاجية استكشافية ل LUSC4.
يلعب الإجهاد التأكسدي بتراكم مرضي لأنواع الأكسجين التفاعلية (ROS)، دورا حاسما في بدء الورم ونموه وانتشاره. في غياب آليات إزالة ROS فعالة للكفاءة، تؤدي مستويات ROS المرتفعة إلى تلف الحمض النووي والسمية الجينية، مما يؤدي في النهاية إلى تغييرات جينومية مختلفة تساهم في تطور السرطان. ومن الجدير بالذكر أن الدراسات أظهرت باستمرار ارتفاعا في مستويات ROS والإجهاد التأكسدي تحديدا ضمن مسببات سرطان الرئة 5,6. وقد أبرزت الأبحاث الحديثة أيضا أن مجموعات من الجينات المرتبطة بالإجهاد التأكسدي قد تعمل كمؤشرات حيوية تنبؤية مستقبلية في الأورام الرئويةالخبيثة 7. ظهرت الحمض النووي الريبي غير المشفر طويل الأمد (lncRNAs) كمنظمات حيوية حاسمة لتعبير الجينات وتمثل مؤشرات حيوية واعدة في مختلف الأورام الخبيثة. بينما نجحت دراسةسابقة بارزة 7 في تأسيس نموذج تنبؤي لسرطان الغدة الريفية المرتبط بالإجهاد التأكسدي (LUAD)، لا تزال التوقعات المحددة والآثار المناعية لمثل هذه ال lncRNA في LUSC غير مستكشفة إلى حد كبير.
في هذا البحث، حلل المؤلفون مجموعات بيانات TCGA بشكل منهجي لبناء توقيع lncRNA جديد مرتبط بالإجهاد التأكسدي مصمم خصيصا ل LUSC. علاوة على ذلك، وعلى عكس التحليلات الحيوية المعلوماتية البحتة، تتضمن هذه الدراسة التحقق من صحة التجارب المختبرية لتأكيد الدور الوظيفي البيولوجي للرنا الريبية الرئيسية المحددة (مثل Linc01615). بدلا من الادعاء بالتطبيق السريري الفوري في قرارات التشخيص والعلاج، يسعى هذا البحث بشكل أساسي إلى استكشاف الآليات المحتملة للإجهاد التأكسدي في LUSC وارتباطه بالبيئة الدقيقة المناعية للورم. تهدف هذه النتائج إلى تقديم رؤى بيولوجية قيمة وتسليط الضوء على الأهداف العلاجية المحتملة للتحقيقات الميكانيكية المستقبلية.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
جمع البيانات والمعالجة المسبقة
تم الحصول على جميع البيانات التي تم تحليلها في هذه الدراسة من قاعدة بيانات TCGA المتاحة للجمهور المدرجة في جدول المواد. التزمت هذه الدراسة بدقة بسياسة مشاركة بيانات الجينوم التابعة للمعاهد الوطنية للصحة (NIH) وإرشادات النشر التي قدمتها TCGA. نظرا لأن مجموعات البيانات تتكون من بيانات سريرية ومتعددة الأوميكس غير محددة الهوية ومتاحة للجمهور، فقد تم استثناء هذه الدراسة من موافقة مجلس مراجعة المؤسسات (IRB). تم تنزيل بيانات النسخ المكتوب والمعلومات السريرية المقابلة ل LUSC من قاعدة بيانات أطلس جينوم السرطان (TCGA). في البداية، كانت المجموعة تتألف من 551 عينة (502 ورم و49 عينة طبيعية). لضمان متانة هذا النموذج التنبؤي، تم استبعاد المرضى الذين يفتقرون إلى بيانات البقاء الكاملة الكاملة أو حالة البقاء أو الخصائص السريرية الأساسية من تحليل البقاء في المرحلة النهائية. وبعد هذه العملية الصارمة في التصفية، تم إنشاء مجموعة تحليلية نهائية مكونة من 470 مريضا من LUSC. تم تقسيم هؤلاء المرضى البالغ عددهم 470 بشكل عشوائي إلى مجموعة تدريب (n = 235) ومجموعة اختبار (n = 235) لبناء نموذج المخاطر والتحقق منها. تم جمع ما مجموعه 792 جينا مرتبطا بالإجهاد التأكسدي عبر قاعدة بيانات GeneCards، المدرجة في جدول المواد، باستخدام معيار إدراج بدرجة الصلة ≥ 7. تم استخدام حزمة ليما (الإصدار 3.66.0) لفحص جينات الإجهاد التأكسدي المعبر عنها بشكل تفاضلي. تم إنتاج قطع البراكين باستخدام حزمة ggplot2 (الإصدار 4.0.2). بين مجموعة التدريب ومجموعة الاختبار، لم يكن هناك تفاوت ملحوظ في الخصائص السريرية (p > 0.05). تم استخدام مجموعة التدريب في بناء النماذج، ومجموعة الاختبار للتحقق الداخلي.
بناء والتحقق من نموذج المخاطر
لتحديد الحمض النووي الريبي الريبي اللينسي المرتبطة بالإجهاد التأكسدي، تم إجراء تحليل بيرسون للتعبير المشترك. قام المؤلفون بتقييم العلاقة بين ملفات التعبير للجينات المرتبطة بالإجهاد التأكسدي المعبر عنها بشكل تفاضلي وجميع الحمض النووي الريبي اللوبي المشروح ضمن مجموعة بيانات TCGA-LUSC. تم تعيين معايير الارتباط لاختيار lncRNA المعبر عنها عند معامل الارتباط |R| > 0.4 وقيمة p < 0.001. استنادا إلى هذه العتبات، تم استخلاص ما مجموعه 6,088 من LNCRNA المرشح المرتبط بالإجهاد التأكسدي. لاحقا، تم تقييم هذه ال 6,088 من ال lncRNA المرشحين من خلال انحدار LASSO وطرق تحليلية تكميلية لبناء نموذج المخاطر التنبؤية. باستخدام البيانات المعالجة، تم تصنيف المشاركين في المرضى إلى طبقات عالية ومنخفضة الخطورة.
العوامل المستقلة ومنحنيات ROC
تم استخدام نماذج الانحدار أحادية المتغير ومتعددة المتغيرات لكوكس لتحديد المتغيرات التنبؤية المستقلة. تحديدا، للتحكم في معدل الخطأ حسب العائلة خلال تحليلات الانحدار أحادية المتغير لكوكس (n = 236 اختبارا)، تم تطبيق تصحيح بونفيروني، حيث تم تحديد عتبة الدلالة المعدلة بدقة عند p < 0.00021 (محسوبة ك0.05 / 236).
تحليل البقاء وتحليل المكونات الرئيسية
تم استخدام حزمة البقاء (الإصدارات 3.8-6) لحساب معدلات البقاء الكلية (OS)، واستخدم تحليل المكونات الرئيسية (PCA) لتقييم متانة نموذج المخاطر.
الرسم النوموغرامي
تم تقييم مؤشر الملاءمة باستخدام حزمة rms في R لتقييم موثوقية الرسم النوموغرامي. تم تقييم ورؤية عبء الطفرات الورمية (TMB) باستخدام حزمة مافوتالز (الإصدار 2.22.0). تم استخدام خوارزميات، بما في ذلك ssGSEA، لاكتشاف تسرب المناعة. بالإضافة إلى ذلك، تم استخدام حزمة ggpubr (الإصدار 0.6.3) لمقارنة نقاط التحقق المناعية بين الفئات المخاطرة. تم استخدام خوارزمية ESTIMATE لتوصيف البيئة الدقيقة للورم (TME).
التحليل الدالي
تم استخدام حزمة clusterProfiler (الإصدار 4.14.6) في R لتحليل الإثراء. لاستكشاف المسارات الوظيفية بشكل أعمق، تم إجراء تحليل GSEA. باستخدام Cytoscape، تم إنشاء شبكة تعبيرات مشتركة للملاحظة.
الطرق التجريبية
ظروف وتركيب زراعة الخلايا
تم زراعة سلسلة سرطان الخلايا الحرشفية للرئة البشرية NCI-H520 (RRID: CVCL_1566؛ مدرجة في جدول المواد) في وسط RPMI-1640 مع 10٪ (v/v) مصل بقري جنيني و1٪ بنسلين-ستريبتومايسين. تم زرع خلايا الطور اللوغاري في ألواح زراعة مكونة من 6 آبار. عند الالتزام الناجح، تم توزيع الخلايا عشوائيا إلى ثلاث مجموعات تجريبية مميزة: مجموعة ضابطة فارغة تحت ظروف الزراعة القياسية، مجموعة ضابطة سلبية (si-NC) تم نقلها بواسطة siRNA غير مستهدف، ومجموعة تجريبية للضرب (si-LINC01615) تم نقلها ب siRNA خاص LINC01615.
النقل الخلوي
تم إذابة كواشف si-LINC01615 وsi-NC على الجليد. لتحضير مركب النقل، تم توصيل 95 ميكرولتر من وسط RPMI-1640 الخالي من المصل إلى أنابيب طرد مركزي معقمة، تلاها إضافة تتابع ل 3 ميكروغرام من siRNA و5 ميكرولتر من كاشف النقل Lipo3000. تم تطبيق نفس الإجراء لكل من مجموعتيsi LINC01615 وsiNC. تم خلط المحاليل بلطف وحضنها في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق لتسهيل تكوين المعقد، مما أدى إلى حجم إجمالي يقارب 200 ميكرولتر لكل أنبوب. لاحقا، تم توزيع هذا الخليط بشكل موحد في آبار الزراعة المخصصة التي تحتوي على 800 ميكرولتر من الوسط القاعدي RPMI-1640. بعد فترة حضانة استمرت 6 ساعات عند 37 درجة مئوية، تم استنشاق وسط النقل بعناية واستبداله بوسط زراعة كامل طازج.
اختبار شفاء الجروح (اختبار الخدوش)
في اختبار شفاء الجروح، تم زرع خلايا NCI-H520 اللوغاريتمية (RRID: CVCL_1566) في صفائح زراعة بستة آبار بكثافة 5.6 × 10إلى 5 خلايا/بئر. عند الوصول إلى 95–100٪ من التقاء الجسم، تم إنشاء جرح خطي صناعيا عن طريق خدش طبقة الخلية الأحادية عموديا عبر مركز البئر باستخدام رأس ماصة معقم بسعة 200 ميكرولتر. تم غسل الآبار لاحقا ثلاث مرات باستخدام PBS لإزالة الخلايا المنفصلة والحطام الخلوي، ثم حضنتها في وسط RPMI-1640 خال من المصل. تم التقاط صور لمناطق الجرحى المتطابقة عند الساعة 0 و24 و48 ساعة باستخدام مجهر مقلوب. تم قياس مساحة الشفاء من الجرح بقياس مسافة الفجوة باستخدام ImageJ (RRID: SCR_003070؛ مدرج في جدول المواد)، وتم حساب معدل الهجرة بالنسبة لمنطقة الجرح الأولية عند 0 ساعة.
اختبارات الهجرة والغزو عبر البئر
تم تقييم قدرات الهجرة والغزو الخلوي باستخدام غرف ترانسويل بسعة 24 بئر مزودة بإدخالات غشاء بولي كربونات بحجم مسام 8.0 ميكرومتر المدرجة في جدول المواد. في اختبار الغزو، تم طلاء غرف القمم مسبقا ب 50 ميكرولتر من مادة الماتريجيل (مخفف بنسبة 1:8 في وسط خال من المصل؛ مدرج في جدول المواد) وحضنة عند 37 درجة مئوية لمدة ساعتين للبلمرة، بينما استخدم اختبار الهجرة إدخالات غير مطلية. بعد نقل الخلايا وفترة تجويع المصل لمدة 24 ساعة، تم جمع خلايا NCI-H520، وأعيد تعليقها في وسط RPMI-1640 الخالي من المصل، وزرعها في الحجرات القمية بكثافة 1.8 × 105 خلايا/بئر في 200 ميكرولتر. تم ملء الغرف القاعدية ب 600 ميكرولتر من متوسط RPMI-1640 مع 10٪ FBS كجاذب كيميائي. بعد حضانة استمرت 48 ساعة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية مع 5٪ CO، تمت إزالة الإدخال وغسلها ثلاث مرات باستخدام PBS. تم مسح الخلايا المتبقية على السطح القمي للغشاء بلطف باستخدام مسحة قطنية مبللة. الخلايا التي هاجرت أو غزت السطح الجانبي القاعدي كانت ثابتة ب 4٪ بارافورمالديهايد لمدة 20 دقيقة وصبغت بمحلول جيمسا المدرج في جدول المواد لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. تم تصور الخلايا المنهجيرة والغزوة وتعدادها عبر ثلاثة حقول بصرية مختارة عشوائيا في كل إدخال باستخدام مجهر مقلوب بتكبير 40x.
التحليل الإحصائي
تم إجراء جميع التحليلات الإحصائية وتصور البيانات باستخدام برنامج R (الإصدار 4.1.2؛ RRID: SCR_001905; مدرج في جدول المواد). تم تفصيل أرقام النسخ المحددة لجميع حزم R المستخدمة في هذه الدراسة بشكل صريح في أقسام المنهجية الخاصة بها. كانت القيمة ذات الدلالة تعرف تقليديا بأنها p < 0.05 ما لم يتم الإبلاغ عن خلاف ذلك. عندما أجريت مقارنات متعددة (مثل الانحدارات المتعددة أحادية المتغير)، تم تطبيق طريقة بونفيروني بشكل صارم للحفاظ على معدل الخطأ حسب العائلة (FWER)، مع تفصيل العتبة المعدلة بدقة (مثل p < 0.00021) في القسم الفرعي المنهجي المعني. تم التعبير عن البيانات الكمية في المختبر كمتوسط ± انحراف معياري وتم تحليلها باستخدام اختبار t الخاص بالطلاب أو تحليل التحليل المعاد أحادي الاتجاه حسب الحاجة.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
تحديد الجينات المعبر عنها بشكل تفاضلي للإجهاد التأكسدي
يتم عرض سير العمل في الشكل 1. الخصائص السريرية للمجموعة التحليلية النهائية التي تضم 470 مريضا من LUSC مفصلة في الجدول 1. استنادا إلى الحد المحدد لدرجة الصلة ≥ 7، استرجع المؤلفون ما مجموعه 792 جينا مرتبطا بالإجهاد التأكسدي من قاعدة بيانات GeneCards (الملف التكميلي 1). بين عينات LUSC الطبيعية وعينات LUSC، أظهر 178 جين إجهاد تأكس...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
سرطان الخلايا الحرشفية الرئوية (LUSC) هو نوع فرعي نسيجي سائد وعدواني للغاية من سرطان الرئة غير صغير الخلية، وغالبا ما يتميز بمعدلات بقاء قاتمة ومقاومة للطرق العلاجية التقليدية 8,9. تشير الأدلة الناشئة إلى أن الإجهاد التأكسدي هو المحرك المحوري في نشوء وتطور الأورام الخبيثة المختلفة. يؤثر التراكم المرضي لأنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) وخلل تنظيم أنظمة الدفاع الخلوي المضادة للأكسدة مثل محور الإشارة KEAP1/NRF2 بشكل ...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
يعلن المؤلفون عدم وجود مصالح متنافسة. لم تستخدم أي أدوات للذكاء الاصطناعي أو تقنيات مدعومة بالذكاء الاصطناعي أثناء إعداد المخطوطات؛ تم توليد ومراجعة وموافقة جميع المحتوى العلمي، والتحليلات، والبيانات الخام، والاستنتاجات بشكل مستقل من قبل المؤلفين.
وقد دعمت هذه المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (المنحة رقم 8200430). نشكر بصدق المساهمين والمؤسسات المعنية، بما في ذلك جامعة هونان للطب الصيني التقليدي ومستشفى أكاديمية هونان للطب الصيني التقليدي، على مواردهم ودعمهم. كما نعبر عن امتناننا لجميع الباحثين والمشاركين الذين ساهموا في هذه الدراسة.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 4% Paraformaldehyde | Beyotime | P0099 | يستخدم لتثبيت الخلايا |
| Cytoscape | Cytoscape Consortium | https://cytoscape.org/ | يستخدم لإنشاء شبكة التعبير المشترك |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10099-141 | التركيز النهائي 10% (v/v) |
| قاعدة بيانات GeneCards | قاعدة بيانات الجينات البشرية GeneCards | https://www.genecards.org/ | غربلة الجينات المرتبطة بالإجهاد التأكسدي |
| Giemsa Stain | Sigma-Aldrich | GS500 | يستخدم لتلطيخ الخلايا المهاجرة/الغازية |
| ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ | يستخدم لقياس فجوة الجروح |
| Lipo3000 Transfection Reagent | GLPBIO | GK20006 | يستخدم لنقل siRNA |
| Matrigel | Corning | 356234 | مخفف بنسبة 1:8 في وسط خالٍ من المصل |
| NCI-H520 سرطان الخلية الحرشفية الرئة البشري | ATCC | HTB-182 | يستخدم في اختبارات التحقق في المختبر |
| PBS (محلول فوسفات متوازن) | Gibco | 10010-023 | يستخدم لغسل الخلايا |
| البنسلين-ستربتومايسين (1%) | Gibco | 15140-122 | مكمل مضاد حيوي لثقافة الخلايا |
| برنامج R (الإصدار 4.1.2) | R Foundation | https://www.r-project.org/ | التحليل الإحصائي والتصور |
| RPMI-1640 Medium | Gibco | 11875-093 | وسط ثقافة الخلايا |
| The Cancer Genome Atlas (TCGA) | Genomic Data Commons | https://portal.gdc.cancer.gov/ | مصدر النسخ السريري وبياناته |
| Transwell Chambers (8.0 μm) | Corning | 3422 | يستخدم في اختبارات الهجرة والغزو |