Method Article

التشريح الدقيق بالليزر لنسيج كبد الفئران المثبت بالبارافورمالديهايد لتحليل الحمض النووي الريبي

DOI:

10.3791/69814

⸱

April 17th, 2026

 ,  ,  , 
1Biomedical Research Center, Southern Medical University, 2School of Traditional Chinese Medicine, Southern Medical University, 3School of Pharmaceutical Science, Southern Medical University, 4Leica Microsystems (Shanghai) Trading Co., Ltd., 5The Seventh Affiliated Hospital, Southern Medical University

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا البروتوكول طريقة لعزل الحمض النووي الريبي من المناطق النسيجية المحددة في نسيج كبد الفئران المدمج مع مركب القطع المثالي المثبت بدرجة حرارة القطع المثلى باستخدام التشريح الدقيق بالليزر، مما يتيح تحليل التعبير الجيني المستهدف في المراحل اللاحقة.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوفر التشريح الدقيق بالالتقاط بالليزر (LCM) وصولا مكانيا إلى مجموعات خلايا محددة داخل الأنسجة المعقدة من خلال التصوير الميداني والعزل. لتمكين التحليل النصي للمناطق المحددة نسيجيا في الأنسجة الثابتة، يتم تقديم بروتوكول LCM مفصل لاستخراج الحمض النووي الريبي من أقسام كبد الفئران المدمجة في مركب درجة حرارة القطع المثلى (OCT) المثبتة بالبارافورمالديهايد. يوضح البروتوكول تحديد وجمع عينات المقياس المجهري (حوالي 1000 خلية) من خلال سير عمل يشمل تثبيت الأنسجة، وجفاف السكروز، وتضمين الأشعة المقطعية المجردة، والتقطيع بالتجميد، وتلوين الهيماتوكسيلين، والالتقاط بالليزر للمناطق النسيجية المستهدفة. باستخدام هذه الطريقة، تم الحصول على RNA عالي النقاء (A260/A280: 1.9-2.1). كان رقم سلامة الحمض النووي الريبي (RIN) 6.7 ± 0.9، مما يعكس التجزئة المتوقعة المرتبطة بتثبيت PFA. ومع ذلك، أدت عملية PCR الكمية ل β-actin إلى نتائج Ct تتراوح بين 17-19، وأدى تسلسل الحمض النووي الريبي باستخدام إعداد مكتبة محسن للتجزئة إلى إنتاج قراءات عالية الجودة، حيث حقق >90٪ من القواعد عتبات Q20 وQ30، مما يؤكد أن الحمض النووي الريبي مناسب للتحليلات الحساسة في مرحلة ما بعد التيار. لذلك، يتيح هذا البروتوكول تحليل التعبير الجيني المستهدف والمحدد مكانيا من خلال توفير RNA بنقاء وسلامة محددة من مناطق نسيجية محددة في نسيج الكبد المثبت ب PFA.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعد الحصول الدقيق على ملفات التعبير الجيني المحلية أمرا بالغ الأهمية لفهم تباين الأنسجة في الصحة والأمراض. يوفر تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية (scRNA-seq) دقة خلوية عالية 1,2، لكنه يفقد السياق المكاني الأصلي وقد يغير ملفات النسخ أثناء تفكك الأنسجة 3,4. بالنسبة لأنواع الخلايا التي تفتقر إلى علامات محددة محددة علنا، يبقى الحصول على تجمعات نقية باستخدام الفرز القائم على التألق المناعي أو العزل المناعي المغناطيسي صعبا 5,6. تسمح تقنيات النسخ المكاني مثل Visium وGeoMx بالتقاط بيانات تعبير جيني عالية الإنتاجية في الموقع، لكن دقتها المكانية محدودة عند مستوى الخلية المفردة أو تحت الخلية 7,8. وعلى العكس، يمكن لتقنيات النسخ المكانية المعتمدة على التصوير أن تحقق دقة على مستوى النانومتر لكنها محدودة في معدل الكشف الجيني9. هذا يبرز فجوة مستمرة في التحليل القائم على الفرضيات لمناطق مورفولوجية محددة.

يسمح التشريح الدقيق بالالتقاط بالليزر (LCM) باختيار وعزل الخلايا الموجهة بالمجهر من مقاطع الأنسجة أو الزراعة الحية بناء على النمط الظاهري المرئي. يحافظ هذا النهج على البنية الخلوية والمعلومات المكانية10. تم تطبيق هذه التقنية على نطاق واسع في أبحاث أمراض الكبد في التحليلات اللاحقة. على سبيل المثال، تم استخدام ال LCM لجمع خلايا الظهارة الصفراوية من خزعات الكبد لتوضيح دورها المناعي التنظيمي في التهاب الصفراء الصفراويالأولي 11. بالإضافة إلى ذلك، تم استخدامه لعزل الأنسجة الإيجابية لإزيم γ جلوتاميل ترانسفيراز (GGT) من النماذج التجريبية لتأكيد التعبير الجيني Ggt1 الخاص بالموقع12. لكن هذه الدراسات ركزت بشكل كبير على الأنسجة المجمدة الطازجة، التي غالبا ما تفتقر إلى تعليقات سريرية أو متابعة طويلة الأمد. على النقيض من ذلك، توفر الأنسجة المثبتة كيميائيا مزايا للتشخيص النسيجيالمرضي 14. على الرغم من أن تسلسل الحمض النووي الريبي المعتمد على LCM (RNA-Seq) قد تم تطبيقه بنجاح على عينات الكبد المؤرشفة الكبيرة المثبتة بالفورمالين والمدمجة بالبارافين (FFPE)15. ومع ذلك، فإن بروتوكول تحليل الجينات القائم على LCM قوي مخصص خصيصا لعينات المقياس المجهري من أنسجة الكبد المدمجة في مركبات البارافورمالديهايد (PFA) ودرجة حرارة القطع المثلى (OCT).

لتلبية هذه الحاجة غير الملباة، تم تحسين بروتوكول شامل باستخدام عمليات تجميد مثبتة ب PFA ومدمجة في OCT. يعالج هذا البروتوكول حدود سير عمل FFPE (مثل المعالجة الممتدة والمواد الكيميائية القاسية) لتطبيقات LCM-RNA الحساسة16. على النقيض من ذلك، فإن عملية التثبيت والتضمين للعينات المثبتة في PFA والمدمجة في OCT أبسط وأكثر مرونة نسبيا، مما يتيح التحضير السريع لمقاطع عالية الجودة تحافظ على سلامة الحمض النووي الريبي وشكل الأنسجة. علاوة على ذلك، يتم تنفيذ هذا البروتوكول باستخدام نظام LCM قائم على الليزر فوق البنفسجي (UV). مقارنة بأنظمة الأشعة تحت الحمراء، يوفر UV-LCM دقة قطع أدق ويتيح جمع عينات مباشرة وغير تلامسية، مما يقلل التلوث ويجعله مناسبا لعزل المناطق الدقيقة من هياكل الأنسجةالمعقدة 17,18. لذلك، تكمن القيمة التشغيلية لهذا البروتوكول في قدرته على التقاط مناطق ميكروسكوبية (~1000 خلية) من أقسام الكبد المثبتة ب PFA مع الحفاظ على الشكل الشكلي. ينتج RNA مناسب لتحليل التعبير الجيني المستهدف، مما يسمح بارتباط مباشر بين الخصائص النسيجية المرضية والملفات التصويرية المحلية.

هنا، نصف بروتوكولا للتشريح الدقيق للأنسجة على المقياس الدقيق (~1000 خلية) من أقسام كبد الفأر المثبتة ب PFA ومدمجة في OCT، يتبعه استخراج الحمض النووي الريبي والتحليل التالي عبر PCR وتسلسل RNA بالنسخ العكسي الكمي. يمكن إتمام هذه الإجراءات خلال خمسة أيام.

لتوجيه القراء في تقييم تطبيق هذا البروتوكول، يتم تلخيص النطاق الرئيسي والقيود أدناه. هذا البروتوكول محسن خصيصا لأخذ عينات موجهة بالشكل القائم على الفرضيات من مناطق نسيجية محددة من أنسجة مثبتة ب PFA ومدمجة في OCT، مع تطبيق أساسي في كبد الفئران. وهو مناسب للباحثين الذين يحتاجون إلى ربط بيانات النسخ الفضائية المحلولة مع ميزات نسيجية مرضية دقيقة محفوظة في عينات ثابتة. يكون سير العمل ذا قيمة خاصة عند العمل مع الأنسجة الثابتة المؤرشفة أو المشروحة سريريا حيث لا تتوفر عينات مجمدة حديثا. ومع ذلك، فإن هذا البروتوكول ليس مثاليا للدراسات التي تتطلب RNA عالي السلامة وغير متجزأ (مثل رقم سلامة RNA (RIN) > 8)، حيث أن التجزئة الجوهرية الناتجة عن التثبيت الكيميائي تحد من استخدامه في التطبيقات التي تعتمد على النسخ الكاملة الطول.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تنفيذ جميع إجراءات التعامل مع الحيوانات ورعايتها وفقا للإرشادات الأخلاقية وتمت الموافقة عليها من قبل لجنة أخلاقيات الحيوان في جامعة ساوثرن الطبية. استخدمت الطريقة الموصوفة فئران ذكور بالغة من نوع C57BL/6J وتم الحفاظ عليها على نظام غذائي عالي الدهون والسكر ونقص الكولين لنمذجة التهاب الكبد الدهني المرتبط بالاستقلاب (MASH). قبل جمع أنسجة الكبد، كانت الحيوانات تقتل عن طريق قطع الرأس.

1. تحضير عينة مثبتة ب PFA

  1. ثبت عينات أنسجة الكبد الطازجة (فصوص فردية، بسماكة 5 مم أو أقل) في 30 مل من مادة PFA باردة 4٪ (طازجة المحضرة) عند 4 درجات مئوية لمدة 24 ساعة.
    ملاحظة: ينصح بحقن الكبد بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS، 1×، يتكون عادة من 137 ملليمولار NaCl، 2.7 ملليمولار KCl، 10 ملليمولار Na₂HPO₄، و1.8 ملليمولار KH₂PO₄، ورقم الهيدروجينة 7.4) بتركيز 1× لمدة 5 دقائق، يليه تثبيت التروية بنسبة 4٪ PFA لمدة 5 دقائق. بدلا من ذلك، يمكن أيضا تثبيت الأنسجة في محلول فورمالين بنسبة 10٪.
    تحذير: مثبت PFA سام. يجب جمع جميع نفايات PFA في حاوية نفايات كيميائية محددة ومعلمة بشكل صحيح وفقا للوائح المؤسسية والمحلية.
  2. اغسل عينات الأنسجة المثبتة 3× مرات لمدة 5 دقائق باستخدام محلول PBS 1× خالي من RNase.
  3. ضع نسيج الكبد الثابت في أنبوب بسعة 50 مل مملوء ب 50 مل من السكروز بنسبة 30٪ (معد حديثا في 1× PBS المعقم). حافظ على العينات عند 4 درجات مئوية لمدة 10-12 ساعة.
  4. قم بإزالة عينات الأنسجة من محلول السكروز. قم بقص العينات للحصول على كتل سهلة التعامل (حوالي 5 مم × 3 مم × 5 مم)، ثم تضمين العينات في مبرد تجميد (7 مم × 7 مم × 5 مم) يحتوي على مركب OCT.
    ملاحظة: عدل اتجاه الأنسجة باستخدام الملقط إذا لزم الأمر.
  5. أضف مركب OCT على الأعلى لتغطية عينات الأنسجة بالكامل، ثم ضع كتلة الأنسجة المدمجة في OCT فورا على النيتروجين السائل أو الثلج الجاف لتجميد مركب OCT بسرعة وتكوين كتلة صلبة. هذا التجميد السريع ضروري للحصول على عمليات تجميد عالية الجودة.
    تحذير: ارتد قفازات مقاومة للتجميد لحماية اليدين عند التعامل مع المواد المبردة.
  6. ضع الكتل المدمجة في OCT عند -80 درجة مئوية حتى التقسيم.

2. التقميد البريد لالتقاط الليزر الميكروديكسيفريز

  1. تعرض شرائح غشاء البولي إيثيلين نفثالات (PEN) لأشعة فوق البنفسجية لمدة 30 دقيقة، ثم غط الشرائح ب 0.1 ملغ/مل من بولي-إل-ليسين، ثم تجفيفها بالهواء. ثم أغلق حواف شريحة غشاء PEN بوسط تثبيت محايد.
    ملاحظة: يمكن أن يؤدي التعرض للأشعة فوق البنفسجية ومعالجة البولي-إل-ليسين لشرائح غشاء PEN إلى تحسين التصاق عينات الأنسجة بشرائح غشاء PEN. إغلاق المحيط بوسط تثبيت محايد يمنع تسرب الماء أو تكوين الفقاعات تحت الغشاء، وهو أمر حاسم للحفاظ على كفاءة LCM (LCM).
    تحذير: احم البشرة والعينين من ضوء الأشعة فوق البنفسجية. ارتد نظارات واقية واقية للأشعة فوق البنفسجية أو واقي وجه (مصنف للحماية من الأشعة فوق البنفسجية)، بالإضافة إلى معطف مختبر وقفازات نيتريل وأكمام طويلة لتغطية الجلد المكشوف.
  2. امسح جميع الأسطح المتاحة من جهاز التجميد وجميع الأدوات باستخدام عامل تنظيف RNase، ونظف الفرشاة بنسبة 75٪ إيثانول.
    تحذير: التخلص من مناديل ومحليلات الإيثانول المستخدمة وفقا لبروتوكولات الصحة والسلامة البيئية المحلية في المؤسسات.
  3. اسمح للجهاز بالوصول والاستقرار عند −20 درجة مئوية.
  4. استرجاع عينات الكبد من درجة حرارة -80 درجة مئوية وضعها في التجميد لمدة لا تقل عن 15 دقيقة.
  5. ضع طبقة رقيقة (2-3 مم) من مركب OCT على سطح مرحلة العينة. ضع مرحلة العينة على رف تجميد سريع (أو في غرفة التجميد) لتثبيت طبقة OCT مسبقا.
  6. ضع كمية صغيرة من OCT على طبقة OCT المتصلبة مسبقا في مرحلة العينة. استرجع كتلة الأنسجة المتوازنة (من الخطوة 2.4) وضعها فورا أفقيا على هذا التصوير المقطعي الدماغي، وثبتها في مكانها لمدة 10-15 ثانية للسماح بالتجميد الجزئي والالتصاق. بعد تثبيتها، قم بتركيب مرحلة العينة (مع كتلة الأنسجة المرفقة) على رأس عينة الكريوستات.
  7. أدخل الشفرة بعناية بين ألواح التثبيت والألواح الخلفية من جانب واحد من جهاز التبريد، ثم ثبت ذراع التثبيت.
  8. اضبط ضبط سماكة المبرد إلى 10 ميكرومتر.
    ملاحظة: قم بضبط سمك الشريحة حسب الحاجة للنسيج، لكن حافظ على السماكة بين 5-15 ميكرومتر19.
  9. قم بقطع وتركيب الأقسام مباشرة على شرائح غشاء PEN المعالجة مسبقا داخل غرفة التجميد التي تحافظ على درجة حرارة -20 درجة مئوية.
    ملاحظة: يمكن لكل شريحة غشاء PEN أن تستوعب 6-8 أقسام أنسجة. يوصى بإكمال عملية التقسيم بالكامل خلال ساعة واحدة. يقلل تقليل وقت التقسيم من تعرض الأنسجة للظروف المحيطة، مما يقلل من مخاطر تحلل الحمض النووي الريبي، وجفاف الأنسجة، والتشويهات الشكلية التي تعد ضرورية للحفاظ على جودة الحمض النووي الريبي وسلامة الأنسجة في التحليل المنخفض المنخفض والتحليل اللاحق.

3. صبغ الهيماتوكسيلين لالتقاط الليزر الميكروديسيكل

  1. قم بإذابة الشرائح في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 20 دقيقة قبل الاستخدام.
  2. اغسل الشرائح ب PBS 1× PBS بدون RNase (3 مرات، 10 ثوان لكل منها).
  3. اغمر شرائح الأنسجة في محلول الهيماتوكسيلين المصفاة من ماير (المكون من 1.0 جم/لتر هيماتوكسيلين، 0.2 جرام/لتر يودات الصوديوم، 50 جرام/لتر كبريتات الأمونيوم دوديكايهيدرات، 50 جرام/لتر كلورال هيدرات، و1.0 جرام/لتر حمض الستريك) لمدة 5-10 ثوان.
    ملاحظة: مرر محلول الهيماتوكسيلين العامل عبر غشية فلتر حقنة بحجم 0.22 ميكرومتر قبل التلوين.
  4. اغسل السلايدات بماء خال من RNase (3 مرات، 10 ثوان لكل مرة) لإزالة محلول الهيماتوكسيلين المتبقي.
  5. قيم جودة التلوين تحت المجهر.
    ملاحظة: يجب أن تظهر النوى المصبوغة بشكل مثالي بلون أزرق بنفسجي واضح على خلفية صافية. يؤدي نقص التلوين إلى ظهور نوى باهتة، بينما يؤدي التلوين الزائد إلى إخفاء تفاصيل الخلايا. فقط الشرائح التي تستوفي هذه المعايير المثلى يجب أن تنتقل إلى الخطوة التالية.
  6. جفف الشرائح باستخدام ورق ماص ثم جفف الهواء تماما (10-15 دقيقة).
    ملاحظة: تأكد من أن الشرائح جافة بالكامل قبل البدء في LCM. ثم تضع الشرائح في أنابيب الطرد المركزي بسعة 50 مل وتخزنها مؤقتا على الثلج حتى يتم إجراء عملية الطرد المركزي المنخفض.

4. التشريح الدقيق بالالتقاط بالليزر

ملاحظة: يجب الحفاظ على مدة تجربة LCM لكل شريحة بين 30 دقيقة وساعة واحدة. يوصى بإكمال تجربة ال LCM كاملة خلال 4 ساعات. يتم تعيين هذا الحد لتقليل تحلل الحمض النووي الريبي عند RT ولمنع تبخر مخزن الجمع في غطاء الأنبوب، وهو أمر حاسم لاسترجاع العينات بكفاءة. عمليا، يمكن حصاد العائد المستهدف لحوالي 1000 خلية من مناطق محددة شكليا بشكل موثوق خلال 4 ساعات.

  1. امسح أسطح طاولة المختبر باستخدام عامل إزالة التلوث RNase.
  2. شغل وحدة التحكم ودع المجهر يكمل عملية التهيئة الخاصة به.
  3. قم بتدوير المفتاح باتجاه عقارب الساعة من وضع الإيقاف إلى وضع التشغيل لبدء نظام الليزر.
    ملاحظة: يحتاج نظام الليزر إلى حوالي 10 دقائق للتسخين.
  4. شغل الكمبيوتر وافتح برنامج LCM، ثم انتظر حتى تكتمل عملية التهيئة.
  5. أدخل أنبوب PCR معقم بسعة 0.2 مل (أنبوب تجميع) في جهاز التجميع.
  6. أضف 10 ميكرولتر من محلول هضم البروتيناز K (انظر جدول المواد) إلى غطاء أنبوب PCR.
    ملاحظة: سيتم رفع الحجم الكلي لمخزن هضم البروتيناز K إلى 150 ميكرولتر في خطوة تالية (انظر الخطوة 5.4.1) كجزء من إجراء التحلل الكامل.
  7. حمل جهاز الجمع في حامل عينات المجهر.
  8. داخل نافذة تغيير جهاز جامع ، اختر أولا زر الانتقال إلى نقطة المرجع . بعد ذلك، قم بضبط تركيز الكاميرا لضمان رؤية واضحة لنقطة المرجع. إذا لزم الأمر، استخدم الأسهم في النافذة لمركز نقطة المرجع في مجال الرؤية.
  9. حمل قسم نسيج في حامل العينة، مع التأكد من أن قسم النسيج موجه للوجه للأسفل، والملصق على اليمين.
  10. اختر العدسة الموضوعية 10×، حدد وحدد المناطق ذات الاهتمام التي تظهر خصائص مرضية محددة، مثل التعقيم الحويفي الميكروي (الذي يتميز بوجود خلايا كبد بها العديد من الفجوات السيتوبلازمية الصغيرة والشفافة ونوى مركزية). ثم انتقل إلى قائمة الليزر واضغط على زر المعايرة . أكد الرسالة المعروضة على الشاشة باختيار نعم وتابع المعايرة.
    ملاحظة: عدسة 10× الموضوعية ليست حصرية للتشريح الدقيق؛ يمكن اختيار عدسات تكبير أخرى (مثل 20×) بناء على وضوح العينة والدقة المطلوبة.
  11. في لوحة التحكم بالليزر، اضبط معايير القطع إلى: قوة الليزر = 50، الفتحة (قطر شعاع الليزر) = 5، والسرعة = 9.
    ملاحظة: القيم المذكورة أعلاه تستخدم كمرجع لنظام UV-LCM مع عينات الأنسجة المستخدمة في هذا البروتوكول. يجب على مستخدمي أنظمة UV-LCM الأخرى أن يأخذوا هذه النقاط كنقطة انطلاق وربما يحتاجون إلى تعديل الإعدادات تجريبيا. قد تختلف الإعدادات المثلى حسب نوع الأنسجة، وسمك المقطع، وأنظمة النسيج الخفيف الأخرى.
  12. ارسم دائرة حول المنطقة المستهدفة باستخدام شريط الأدوات الرسومية. اختر الشكل الواحد، ثم اضغط على زر بدء القطع لإجراء LCM، ثم ضع جهاز الجمع لجمع الأنسجة المفصولة.
    ملاحظة: يشير الانفصال الناجح بفصل المنطقة المختارة، غالبا مع وجود فجوة واضحة أو حركة شظية. للاتساق، اجمع من عدد محدد مسبقا من المناطق ذات الحجم المماثل لكل عينة. إذا لم تنفصل المنطقة المستهدفة تلقائيا، اضغط على زر التحريك والقطع لقطع العينة يدويا باستخدام الفأرة. للحصول على تقدير أكثر دقة لعدد الخلية، يمكن لبرنامج LCM تسجيل مساحة القطع الكلية تلقائيا. يمكن تقسيم هذه القيمة على متوسط مساحة المقطع العرضي للخلية المستهدفة لتقريب العدد الكلي للخلايا الملتقطة.
    تحذير: أثناء عملية التصوير المنخفض المنخفض، لا تحدق مباشرة في شعاع الليزر لتجنب التعرض لإشعاع الليزر.
  13. اختياريا، يمكنك التقاط صورة قبل وبعد لموقع التشريح عن طريق اختيار أمر حفظ الصورة باسم في قائمة الملف . في مربع الحوار، اختر موقعا واسم ملف، واحفظ بصيغة مفضلة (مثل .tif).
  14. عند جمع العدد المطلوب من الخلايا، اضغط على زر الإلغاء لإزالة المجمع من المرحلة. قبل إغلاق أنبوب PCR، تحقق من أن حجم مخزن هضم البروتيناز K في الغطاء لا يزال عند 10 ميكرولتر؛ إعادة تعبئة المخزن إذا حدث التبخر أثناء التصوير المنخفض (انظر الخطوة 4.6).
    ملاحظة: يضمن إضافة 10 ميكرولتر من المخزن أن سطح الغطاء مبلل بالكامل، مما يسهل النقل الفعال لحبيبات الأنسجة المفككة دقيقة أثناء الطرد المركزي في الخطوة 4.16.
  15. قم بتدوير أنابيب الجمع بشكل جيد.
  16. قم بتدوير أنابيب الجمع لفترة وجيزة وتخزين أنابيب العينة عند -80 درجة مئوية حتى استخراج RNA.
    ملاحظة: كرر الخطوات من 4.5 إلى 4.16 للعينة التالية. يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا حتى استخراج الحمض النووي الريبي.

5. استخراج الحمض النووي الريبي الكلي من عينات مفككة دقيقة

  1. امسح أسطح طاولة المختبر باستخدام عامل إزالة التلوث RNase.
  2. انقل عينات LCM من الفريزر بدرجة حرارة -80 درجة مئوية إلى حمام ثلج. إذا رغبت، قم بتجميع دفعات مختلفة من نفس العينات الملتقطة.
  3. حضن أنابيب العينات المفصلة بشكل دقيق مقلوبة عند 42 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
    ملاحظة: هذا الانعكاس يضمن إطلاق أي نسيج متبقي ملتصق بالغطاء بعد الطرد المركزي القصير (الخطوة 4.16) إلى حاجز الهضم. يضمن ذلك نقل العينات إلى المخزن المؤقت قبل ضبط الحجم والطرد المركزي عالي السرعة في الخطوة 5.4.1.
  4. عزل الحمض النووي الريبي الكلي من عينات LCM باستخدام مجموعة استخراج RNA قياسية مصممة للأنسجة الثابتة (انظر جدول المواد).
    1. اضبط الحجم في كل أنبوب عينة إلى 150 ميكرولتر نهائي باستخدام مخزن هضم البروتيناز K (انظر جدول المواد). قم بتدوير الأنابيب عند 11,000 × جرام (دقيقة واحدة)، ثم نقل العينات إلى أنبوب معقم بسعة 1.5 مل.
    2. أضف 10 ميكرولتر من البروتيناز K (20 ملغ/مل) لكل أنبوب، ثم اخلط العينات بلطف عبر تكرار التوصيل. ينتج عن ذلك حجم نهائي يبلغ 160 ميكرولتر وتركيز نهائي من بروتيناز K يقارب 1.25 ملغ/مل في تفاعل الهضم لكل عينة.
    3. قم بحضانة عينات من خطوتين: أولا عند 56 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة، تليها 15 دقيقة عند 80 درجة مئوية. خلال كل حضانة، قم بتدوير الأنابيب لفترة وجيزة كل 5 دقائق.
      ملاحظة: للحصول على سير عمل مثالي، استخدم حمامين مائيين مسخنين مسبقا. إذا كنت تستخدم حماما واحدا، توقف بعد الحضانة عند 56 درجة مئوية: احتفظ بالعينات على RT بينما يسخن الحمام إلى 80 درجة مئوية، ثم تابع.
    4. ضع العينات لمدة 3 دقائق على الثلج، تليها الطرد المركزي عند 20,000 × جرام (15 دقيقة).
    5. قم بسحب المادة الشفافة إلى أنبوب جديد بسعة 1.5 مل، مع الحرص على تجنب الحبيبات.
    6. أضف 16 ميكرولتر من مخزن حضانة DNase و10 ميكرولتر من إنزيم DNase I (2.73 وحدة/ميكرولتر، انظر جدول المواد) إلى كل عينة. ثم اخلط المحتويات جيدا عن طريق عكس الأنابيب بلطف. ينتج عن ذلك حجم نهائي يبلغ 186 ميكرولتر وتركيز نهائي من DNase I يقارب 0.15 وحدة/ميكرولتر في تفاعل الهضم لكل عينة.
    7. قم بدوران سريع لجمع السائل المتبقي من جدران الأنبوب.
    8. حضن أنابيب العينات عند RT لمدة 15 دقيقة.
    9. انقل 320 ميكرولتر من محلول الغسيل عالي الملح (انظر جدول المواد) إلى كل عينة وامزج العينات جيدا. ينتج عن ذلك حجم نهائي يبلغ 506 ميكرولتر لكل عينة.
    10. انقل 720 ميكرولتر من الإيثانول المطلق إلى كل أنبوب، وامزج العينات عن طريق التوصيل بالماصات (دون طرد مركزي)، ثم تابع فورا. ينتج عن ذلك حجم نهائي يبلغ 1,226 ميكرولتر لكل عينة.
      تحذير: الإيثانول المطلق قابل للاشتعال بشدة. جمع نفايات الإيثانول في حاوية مخصصة لنفايات المذيب العضوي غير الهالوجيني للتخلص السليم.
    11. نقل 700 ميكرولتر من خليط العينة إلى عمود تنقية (موضوع في أنبوب تجميع بسعة 2 مل، انظر جدول المواد). أغلق الغطاء برفق، واستخدم الطرد المركزي عند 8,000 × جرام (15 ثانية).
    12. تخلص من تدفق أنبوب التجميع. احتفظ بعمود التنقية.
    13. كرر الخطوات من 5.4.11 إلى 5.4.12.
    14. أضف 500 ميكرولتر من مخزن الغسيل القائم على الإيثانول (انظر جدول المواد) إلى كل أنبوب عينة. أغلق الأغطية بلطف، واستخدم الطرد المركزي عند 8,000 × جرام (15 ثانية). ثم تخلص من تدفق أنبوب الجمع.
    15. كرر الخطوة 5.4.14 بالكامل، مع تعديل وحيد بزيادة وقت الطرد المركزي إلى دقيقتين عند 8,000 × جرام.
    16. انقل كل عمود تنقية إلى أنبوب جديد بسعة 2.0 مل. قم بتشغيل الطرد المركزي عند 14,000 × جرام (5 دقائق) مع فتح الغطاء، ثم تخلص من الأنبوب والسائل المتبقي.
    17. انقل كل عمود تنقية إلى أنبوب جديد بسعة 1.5 مل. قم بإخراج 16 ميكرولتر من الماء الخالي من RNase على الغشاء، ثم أغلق الغطاء وجهاز الطرد المركزي عند 14,000 × جرام (5 دقائق) لتسهيل إخراج الحمض النووي الريبي الكلي.
      ملاحظة: احتفظ بجميع عينات الحمض النووي الريبي المائلة على الثلج في الخطوات 5.5 و5.6 لمنع التحلل.
  5. قم بقياس عينات الحمض النووي الريبي وتحقق من نقائها (نسبة260/280 ) باستخدام القياس الطيفي الضوئي.
    ملاحظة: يعد قياس التركيز والنقاء (نسبة260/A280 ) في هذه الخطوة، إلى جانب تقييم السلامة في الخطوة 5.6، نقطة التحقق الكمية الحاسمة لنجاح استعادة RNA. من المتوقع حدوث خروج واضح من الحمض النووي الريبي.
  6. قم بإجراء الرحلان الكهربائي بجل الأجاروز بتركيز هلام 1٪ وتحديد رقم سلامة الحمض النووي الريبي (RIN) باستخدام نظام تحليل حيوي لتقييم جودة الحمض النووي الريبي.
  7. تخزين عينات RNA عند -80 درجة مئوية حتى يتم إجراء qRT-PCR أو RNA-Seq.

6. تحليل الحمض النووي الريبي

ملاحظة: تم وصف qRT-PCR في الخطوتين 6.1 و6.2، وRNA-Seq في الخطوة 6.3.

  1. جهز خليط تفاعل النسخ العكسي وأضف 50 نانوغرام من إجمالي RNA لكل تفاعل على الثلج. تابع التفاعل العكسي باستخدام جهاز تدوير حراري وفقا للتعليمات المقدمة (انظر جدول المواد).
  2. على الثلج، حضر خليط PCR الكمي الرئيسي لمادة β-أكتين وفقا لتعليمات الشركة المصنعة (انظر جدول المواد لتسلسلات البرايمر). قم بتضخيم PCR في الوقت الحقيقي على نظام PCR كمي باستخدام بروتوكول الدورة الموصى به من الشركة المصنعة مع 10 نانوغرام من cDNA لكل تفاعل.
  3. باستخدام مجموعة خيالية منخفضة الإدخال (انظر جدول المواد)، قم ببناء مكتبات RNA-Seq من 50 نانوغرام من إجمالي RNA. حدد حجم المكتبة وتركيزها باستخدام نظام تحليل حيوي (انظر جدول المواد) ثم قم بتنفيذ تسلسل مزدوج على منصة عالية الإنتاجية (انظر جدول المواد).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتضمن سير العمل التجريبي، الذي يشمل تثبيت PFA، وجفاف السكروز بنسبة 30٪، ودمج OCT والتقسيم بالبريد، وتلوين الهيماتوكسيلين، وتحديد وجمع المنطقة المستهدفة بدقة (~1,000 خلية) بواسطة LCM، وتحليل الخلية، وعزل RNA، ومقاييس مراقبة جودة RNA، وتطبيقين تحليليين رئيسيين، موضح في الشكل 1. يظهر قسم الكبد المصبوغ بالهيماتوكسيلين على شريحة PEN تحت المجهر قبل (الشكل 2A) وبعد (الشكل 2B) التقاط نسيج الكبد على نطاق دقي...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تكمن قوة النسيج الربائي المنخفض في التقاطه الدقيق والموقع لخلايا أو مناطق أنسجة مختارة، مما يسهل دراسة مناطق محددة داخل نسيج غير متجانس. لكن إنتاجية العينة المنخفضة، والعملية التي تستغرق وقتا طويلا، وتكلفتها العالية، والحاجة إلى معدات متخصصة تحد من التطبيق الواسع لهذه التقنية في المختبرات23. في هذه الدراسة، تم تأسيس بروتوكول LCM-RNA لتجاوز القيود التاريخية الرئيسية. نفذ هذا البروتوكول خطوة تلوين سريعة بالهيماتوكسيلين (~10 ثوان)، ومن خلال استخدام تضمين PFA...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المؤلفون لا يفرضون أي تضارب مصالح.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد دعم هذا العمل جزئيا بمنح من المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (82070589)، ومؤسسة قوانغدونغ للعلوم الطبيعية (2022A1515010218)، ومشروع خطة قوانغتشو للعلوم والتكنولوجيا (206077078001) للبروفيسور يان وانغ. نحن ممتنون لمركز البحوث الطبية الحيوية في جامعة ساوثرن الطبية على الدعم الفني والوصول إلى نظام التشريح الدقيق بالليزر.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
<قوي>مادي
أنابيب ذات جدران رقيقة بحجم 0.2 ملأكسجينPCR-02-Cأنابيب لجمع ال LCM
أنبوب طرد مركزي بحجم 1.5 ملأكسجين339653
4٪ بارافورمالديهيدليجينDF0135
أنبوب طرد مركزي بسعة 50 ملثيرموفيشر ساينتيفيك339653
DEPC (ثنائي إيثيل بيروكربونات)سيغماD-5758
مجموعة الهضم DNase Iتشياغن73504مكون من مجموعة RNeasy FFPE يتضمن محلول DNase I المخزن ومخزن تعزيز DNase
الإيثانول (100٪)ثيرمو فيشر العلميBP2818منقى لعلم الأحياء الجزيئي
مخزن الغسيل القائم على الإيثانولتشياغن73504RPE المخزن (مكون من مجموعة RNeasy FFPE)
مخزن الغسيل عالي الملحتشياغن73504RBC المخزن (مكون من مجموعة RNeasy FFPE)
شفرات الميكروتوم منخفضة الملفلايكا بيوسيستمز819
ماير' s هيماتوكسيلينليجينDH0001
مركب OCTساكورا4583
شريحة مغلفة بغشاء PENلايكا11505188
محلول ملحي مخزن بالفوسفاتليجينCC0010DNase/RNase الخالي من DNase
بولي-إل-ليسينماكلينP875131S
مخزن هضم البروتيناز Kتشياغن73504Buffer PKD (مكون من مجموعة RNeasy FFPE)
عمود التنقيةتشياغن73504عمود الدوران RNeasy MinElute (مكون من مجموعة RNeasy FFPE)
مزيج PCR الكمي الرئيسينبذة تاكاراRR820ATB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)
مجموعة النسخ العكسيتشياغن205411مجموعة النسخ العكسي كوانتي نوفا
مجموعة استخراج الحمض النووي الريبيتشياغن73504مجموعة RNeasy FFPE
مجموعة تسلسل الحمض النووي الريبي (مدخل منخفض، متقطع)نبذة تاكارا634412مجموعة RNA-seq الكلية مع SMARTer - مدخل بيكو للثدييات v2
عامل إزالة التلوث RNaseسولاربيولوجياSR0040التنظيف
سكروزماكلينS818049
<قوي>الحيوانات والنظام الغذائي
الفأرة: C57BL/6Jمركز الحيوانات المختبرية في مقاطعة قوانغدونغ03
<قوي>حمية خاصة ونظام غذائي ماء شرب< قوي>
نظام غذائي عالي الدهون وقليل من الكولين (النظام الغذائي الأساسي)شركة تروفيك للأعلاف الحيوانية عالية التقنية المحدودة.TP36310Mالمغذيات الكبرى: بروتين، 14 كيلو كالية؛ الكربوهيدرات، 26 كيلو سائلة؛ دهن، 60 كيلو سعرة حرارية)
مياه الشرب المكملة بالسكرماكلينغير متوفر (محضر داخليا)تمت إضافة خليط من D-جلوكوز (Macklin, Cat# F87500) وD-فركتوز (Macklin, Cat# S818049) إلى مياه الشرب المعقم بتركيز نهائي 42 جرام/لتر، بنسبة جلوكوز إلى فركتوز 55:45 (بميض/أبيض)
<سترونغ>برايمر الفئران
β-actin (للأمام: AGAGGGAAATCGTGCGTGAC)تسلسل BGIمخصصتنقية HPLC
β-actin (العكس: CAATAGTGATGACCTGGCCGT)تسلسل BGIمخصصتنقية HPLC
<قوي>معدات
الميكروتوم الكريوستاتلايكا بيوسيستمزCM3050 S
نظام المحلل الحيويأجيلينتG2939BA
منصة تسلسل عالية الإنتاجيةإلومينا؛ إنك.نظام NovaSeq 6000
نظام التقطيع الدقيق بالليزرلايكا مايكروسيستمزلايكا LMD6500
نظام PCR الكميأنظمة حيوية تطبيقيةنظام كوانتستوديو 5 لمستقبل PCR
مقياس الطيف الفوتونيثيرموفيشر ساينتيفيكNP80نانودروب
دورة حراريةبيورادT100
<قوي>برمجيات
Adobe Illustrator CC 2019 (الإصدار 23.0.2)أدوبيhttps://www.adobe.com/products/illustrator.html
جراف باد بريزم (الإصدار 8.3.0)برنامج جراف بادhttps://www.graphpad.com

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Shapiro, E., Biezuner, T., Linnarsson, S. Single-cell sequencing-based technologies will revolutionize whole-organism science. Nat Rev Genet. 14 (9), 618-630 (2013).
  2. Halpern, K. B., et al. Single-cell spatial reconstruction reveals global division of labour in the mammalian liver. Nature. 543 (7647), 352-356 (2017).
  3. Aizarani, N., et al. A human liver cell atlas reveals heterogeneity and epithelial progenitors. Nature. 572 (7768), 199-204 (2019).
  4. Van Den Brink, S. C., et al. Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations. Nat Methods. 14 (10), 935-936 (2017).
  5. Baron, C. S., et al. Cell Type Purification by Single-Cell Transcriptome-Trained Sorting. Cell. 179 (2), 527-542.e19 (2019).
  6. Gross, A., et al. Technologies for Single-Cell Isolation. Int J Mol Sci. 16 (8), 16897-16919 (2015).
  7. Dries, R., et al. Advances in spatial transcriptomic data analysis. Genome Res. 31 (10), 1706-1718 (2021).
  8. Chen, A., et al. Spatiotemporal transcriptomic atlas of mouse organogenesis using DNA nanoball-patterned arrays. Cell. 185 (10), 1777-1792.e21 (2022).
  9. Ståhl, P. L., et al. Visualization and analysis of gene expression in tissue sections by spatial transcriptomics. Science. 353 (6294), 78-82 (2016).
  10. Espina, V., et al. Laser-capture microdissection. Nat Protoc. 1 (2), 586-603 (2006).
  11. Baba, N., et al. Gene expression profiling in biliary epithelial cells of primary biliary cirrhosis using laser capture microdissection and cDNA microarray. Transl Res. 148 (3), 103-113 (2006).
  12. Mena, J. E. T., et al. Laser capture microdissection after γ-glutamyl transferase histochemistry: An optimization for gene expression analysis. Anal Biochem. 447, 126-132 (2014).
  13. Liu, Y., et al. Next-generation RNA Sequencing of Archival Formalin-fixed Paraffin-embedded Urothelial Bladder Cancer. Eur Urol. 66 (6), 982-986 (2014).
  14. Ludyga, N., et al. Nucleic acids from long-term preserved FFPE tissues are suitable for downstream analyses. Virchows Arch. 460 (2), 131-140 (2012).
  15. Mägel, L., Bartels, S., Lehmann, U. Next-Generation Sequencing Analysis of Laser-Microdissected Formalin-Fixed and Paraffin-Embedded (FFPE) Tissue Specimens. Methods Mol Biol. 1723, 111-118 (2018).
  16. Von Ahlfen, S., Missel, A., Bendrat, K., Schlumpberger, M. Determinants of RNA Quality from FFPE Samples. PLoS One. 2 (12), e1261(2007).
  17. Böhm, M., Wieland, I., Schütze, K., Rübben, H. Microbeam MOMeNT: non-contact laser microdissection of membrane-mounted native tissue. Am J Pathol. 151 (1), 63-67 (1997).
  18. Schütze, K., et al. Cut out or poke in--the key to the world of single genes: laser micromanipulation as a valuable tool on the look-out for the origin of disease. Genet Anal. 14 (1), 1-8 (1997).
  19. Datta, S., et al. Laser capture microdissection: Big data from small samples. Histol Histopathol. 30 (11), 1255-1269 (2015).
  20. Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. J Vis Exp. (45), e2565(2010).
  21. Ge, S. J., Gan, W. Q., Karlinsey, K., Zhou, B. Y., Pachter, J. S. Immuno-laser capture microdissection of perfusion-fixed mouse brain tissue coupled to RNA-seq. J Neurosci Methods. 423, 110548(2025).
  22. Takahashi, K., Beltran, W. A., Sudharsan, R. An optimized workflow for transcriptomic analysis from archival paraformaldehyde-fixed retinal tissues collected by laser capture microdissection. Exp Eye Res. 246, 109989(2024).
  23. Mahalingam, M. Laser Capture Microdissection: Insights into Methods and Applications. Methods Mol Biol. 1723, 1-17 (2018).
  24. Kim, S. O., Kim, J., Okajima, T., Cho, N. J. Mechanical properties of paraformaldehyde-treated individual cells investigated by atomic force microscopy and scanning ion conductance microscopy. Nano Converg. 4 (1), (2017).
  25. Erickson, H. S., et al. Quantitative RT-PCR gene expression analysis of laser microdissected tissue samples. Nat Protoc. 4 (6), 902-922 (2009).
  26. Pan, D. Y., et al. Laser Capture Microdissection-Based RNA Microsequencing Reveals Optic Nerve Crush-Related Early mRNA Alterations in Retinal Ganglion Cell Layer. Transl Vis Sci Technol. 9 (11), 30(2020).
  27. Civita, P., et al. Laser Capture Microdissection and RNA-Seq Analysis: High Sensitivity Approaches to Explain Histopathological Heterogeneity in Human Glioblastoma FFPE Archived Tissues. Front Oncol. 9, 482(2019).
  28. Phan, H. V., et al. High-throughput RNA sequencing of paraformaldehyde-fixed single cells. Nat Commun. 12 (1), 5636(2021).
  29. Thomsen, E. R., et al. Fixed single-cell transcriptomic characterization of human radial glial diversity. Nat Methods. 13 (1), 87-93 (2016).
  30. Lin, X. J., et al. A comparative analysis of RNA sequencing methods with ribosome RNA depletion for degraded and low-input total RNA from formalin-fixed and paraffin-embedded samples. Bmc Genomics. 20 (1), 831(2019).
  31. Luzzi, V., Mahadevappa, M., Raja, R., Warrington, J. A., Watson, M. A. Accurate and reproducible gene expression profiles from laser capture microdissection, transcript amplification, and high density oligonucleotide microarray analysis. J Mol Diagn. 5 (1), 9-14 (2003).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Laser Capture MicrodissectionParaformaldehyde Fixed TissueMouse Liver TissueRNA ExtractionCryosectioningHematoxylin StainingOCT EmbeddingRNA SequencingHepatocyte ProfilingReal Time PCR

Related Articles