$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
يتم تلخيص سير العمل التجريبي لتقييم فعالية اللقاحات الميكروبية في تعزيز تحمل إجهاد الماء في خس رومين (Lactuca sativa L. var. Paspartu) في الشكل 1. دمج البروتوكول المراقبة المستمرة لأنظمة الري الدقيقة مع جمع بيانات فسيولوجية وحرارية بشكل دوري. تم استخدام منتجين ميكروبيين مميزين: (1) اتحاد الميكروبات، وهو اتحاد معقد يضم 67 سلالة يتكون من PGPR، والفطريات الأكتينوية، والفطريات المفيدة، مصمم ليعمل كحاجز فسيولوجي من خلال استعمار الجذور وإفراز إكسوبوليسكاريد (EPS)؛ و(II) Trichoderma harzianum، وهو ملقح أحادي السلالة من Trichoderma harzianum يهدف إلى تحفيز المقاومة الجهازية وتعديل بنية الجذور. المواد الكيميائية والمعدات والبرامج المستخدمة مدرجة في جدول المواد.
1. التطعيم الميكروبي
تم تنفيذ نظام تلقيح موحد لكلا المعالجتين الميكروبيات، يتكون من ستة تطبيقات مغطاة بالتربة تستهدف الريزوسفير باستخدام ميكروبايبتات عالية الدقة لمحاكاة الجرعات على مستوى ميداني. حدثت المرحلة الأولى خلال مرحلة الشتلة بعد 5 و15 يوما من الزراعة (DAS). عند 30 DAS، تم نقل الشتلات إلى صواني تجويف أكبر، مع إجراء المرحلة الثانية من التطعيم بعد يوم واحد من الزراعة (DAT)، تلتها تطبيقات متتالية عند 7 و15 و20 DAT.
بالنسبة لاتحاد الميكروبات، تم تعديل الجرعات وفقا لفينولوجيا النبات: تم تطبيق أول تطبيقين عند 500 جم/هكتار (3 مل/نبتة)، تلتها جرعة عالية التركيز 2 كجم/هكتار عند الزراعة، واختتمت بثلاث جرعات صيانة بمقدار 300 جم/هكتار. وبالمثل، تم تطبيق T. harzianum بمعدل 1 لتر/هاكتار خلال المرحلتين الأوليين، و3 لتر/هكتار عند الزراعة، و1 لتر/هكتار في الثلاث التطبيقات الأخيرة. تم تصميم هذا النهج التدريجي لضمان استعمار جذور قوي والحفاظ على دور المجموعة الميكروبية كحاجز فسيولوجي طوال فترات النمو الحرجة وفترات تحفيز الإجهاد.
2. تحضير المحاصيل
تم إنبات بذور الخس الروماني المعتمد (Lactuca sativa L. var. Paspartu) في صواني بوليسترين بسعة 311 تجويف (11 مل لكل تجويف) باستخدام ركيزة محترفة من الطحالب على عمق 1 سم. تم إجراء الإنبات في غرفة مناخية حيوية مضبوطة تحافظ عليها عند نطاق درجات حرارة يتراوح بين 15 °م إلى 22 °م ورطوبة نسبية بين 60٪–70٪. عند الوصول إلى 90٪ من الإنبات (حوالي 3–5 أيام من الزراعة)، تم نقل الشتلات إلى صواني أكبر بسعة 55 مل لتكوين كرات جذرية للسماح بتطور الجذور دون قيود (الشكل 2 والشكل 3). تم تنظيم التجربة بتصميم عشوائي بالكامل (CRD)، مع 9 وحدات تجريبية (صواني)، و20 شتلة لكل صينية. تم هيكلة هذا التركيب لاستيعاب ترتيب عوامل من 3 × 3 (3 معالجات ميكروبية × 3 أنظمة ري). تم تقديم خصائص فيزيائية-كيميائية مفصلة للركيزة وبرمجة غرفة مناخية حيويةمحددة 14في الشكل 3، الجدول التكميلي 1، الجدول التكميلي 2، والجدول التكميلي 3.
تم توزيع الصواني التجريبية باستخدام تخطيط عشوائي بالكامل داخل غرفة المناخ الحيوية لإزالة تأثيرات الحواف وضمان تعرض موحد. تم برمجة الحجرة لمحاكاة ظروف الحقل الديناميكية، باستخدام نظام درجات حرارة عالية لمحاكاة الإجهاد الحراري في المجال المفتوح. خلال المرحلة النباتية، تم الحفاظ على المعايير البيئية ضمن نطاق رطوبة نسبي متغير، وفترة ضوئية مدتها 9 ساعات توفرها إضاءة LED عالية الشدة (مضبوطة فوق 50٪ من السعة القصوى لضمان إشعاع نشط تمثيليا ضوئيا كافيا)15. بعد مرحلة التأسيس، تم تعديل البرنامج البيئي ليعكس المتطلبات المتزايدة لمعالجات نقص المياه، كما هو موضح في التحولات الجوية التدريجية15 (الشكل 4 والشكل 5). يتم تفصيل نقاط الضبط النهارية/الليلية المحددة لدرجة الحرارة والرطوبة وشدة الضوء في الجدول التكميلي 1 والجدول التكميلي 2 لتبسيط البروتوكول الرئيسي.
تم تصميم استراتيجية التسميد لتلبية المتطلبات الفينولوجية الخاصة بخس الروماين، مع الحفاظ على تدفق متوازن من العناصر الغذائية طوال الدورة الخضرية. خلال مرحلة الشتلة (12 إلى 24 DAS)، تم تزويد المغذيات عبر تطبيقات مستهدفة لنترات البوتاسيوم (KNO3)، وفوسفات أحادي البوتاسيوم (KH2PO4)، ونترات الكالسيوم (Ca(NO3)2). لتعزيز التثبيت المبكر، تم إضافة محفز حيوي تجاري خلال أول24 يوما و16.
من 26 DAS وحتى التقييم النهائي عند 76 DAS، انتقل برنامج الإخصاب إلى نظام صيانة حيث يتم التخلص من المنبه الحيوي لعزل التأثيرات المحددة للملقحات الميكروبية. تم معايرة جميع التطبيقات للحفاظ على التوصيل الكهربائي الأمثل (EC) ودرجة الحموضة داخل الريزوسفير (rhizsphere). الجدول الزمني الكامل لتركيزات المعادن وأجزاء الجرعاتالمحددة 16مفصل في الجدول التكميلي 3.
3. العلاج بالكائنات الدقيقة
لتقييم فعالية التدخلات البيولوجية ضد الإجهاد المائي، تم إنشاء ثلاث علاجات مميزة: (1) اتحاد الميكروبات، وهو اتحاد ميكروبي عالي التنوع يضم 67 سلالة مفيدة، بما في ذلك البكتيريا النشطة لنمو النبات (PGPR)، والفطريات الأكتينوميسيتات، والفطريات؛ (II) T. harzianum، تركيبة متخصصة بسلالة واحدة من Trichoderma harzianum؛ و(3) جهاز تحكم غير ملقح. تم اختيار هذه العلاجات بناء على إمكاناتها في تحمل الجهاز المحفز (IST)، وذلك بشكل أساسي من خلال آليات مثل تعديل بنية الجذور، وإنتاج ACC-دياميناز، وإفراز إكسوبوليسكاريد (EPS).
اتبع التطعيم نهجا استراتيجيا مرحليا. تم التطبيق الأولي (3 مل لكل نبات) عبر ميكروبايبت عالية الدقة مباشرة في الجذور في المرحلة الثانية من الورقة الحقيقية لضمان استعمار الجذور مبكرا. تم معايرة التطبيقات اللاحقة إلى مكافئات على مقياس الحقل (محاكاة كثافة 75,000 نبات/هكتار). بالنسبة ل T. harzianum، تم تطبيق تركيز 2 لتر/هكتار، بينما تم إعطاء اتحاد الميكروبات بمعدل 1 كجم/هكتار. تم إذابة هذه التركيبات في مياه الري وتطبيقها كل 15 يوما للحفاظ على استقرار مجموعة ميكروبية كحاجز فسيولوجي طوال الدورة الخضرية17.
4. علاجات الري المختلفة
لتقييم المرونة الفسيولوجية والزراعية ل L. sativa تحت ظروف هيدرائية مختلفة، تم تنفيذ ثلاثة أنظمة ري تعتمد على استبدال التبخر والنتح المحصول (ETc). تم معايرة محتوى الماء الحجمي مقابل سعة الحقل (FC) للركيزة لضمان تحفيز إجهاد دقيق. تم تعريف الأنظمة كما يلي: (1) التحكم/الري الجيد (CC-100٪ ETc)، حيث يتم تجديد التبخر والتنفس الكامل؛ (II) عجز ماء متوسط (75٪ ETc)، مصمم لتحفيز القيود الهيدروليكية الوسيطة؛ و(ثالثا) العجز المائي الشديد (50٪ من إجمالي المياه)، بهدف توليد إجهاد مائي حرج. تم إجراء الري يوميا بعد التقاط صور حرارية باستخدام ماصات متدرجة لضمان تعويض دقيق لحجم المياه المفقودة من خلال التبخر والنتح18.
5. تسجيل البيانات والصور
لتقييم التوزيع الحراري للمحطات وحالة المياه، تم التقاط صور حرارية بالأشعة تحت الحمراء يوميا من الاثنين إلى الجمعة طوال فترة التجارب. أجريت جميع التسجيلات الفوتوغرافية بين الساعة 12:00 ظهرا و2:00 ظهرا لتوحيد القياسات خلال فترة النتح الأقصى وشدة الشمس. من الضروري التقاط هذه الصور مباشرة قبل العلاجات اليومية للري لتسجيل الإجهاد المائي التراكمي الذي تعرضت له النباتات خلال دورة ال 24 ساعة السابقة. لالتقاط الصور، تم توصيل كاميرا الأشعة تحت الحمراء الحرارية بجهاز متنقل وحافظت على اتجاه عمودي بالنسبة لظهر نباتات الخس على مسافة ثابتة تتراوح بين 60–70 سم. تم تكوين البرنامج بلوحة حرارية متعددة الألوان حيث يتم تمثيل تدرجات الحرارة من الأدنى إلى الأعلى: بدءا من البنفسجي (الأبرد)، ثم الانتقال إلى الأزرق الملكي، الفيروزي، الأخضر (المنتصف)، الأصفر، البرتقالي، وأخيرا الأحمر (الأكثر سخة). داخل واجهة البرمجيات، تم اختيار منطقة الصينية المحددة التي تحتوي على مظلة النبات يدويا لالتقاط البيانات الحرارية. يعمل هذا المقياس اللوني كمؤشر فسيولوجي: النباتات المرطبة جيدا تظهر درجات حرارة مظلة أبرد (بنفسجي/أزرق) بسبب النتح النشط، بينما تظهر النباتات المجففة درجات حرارة أعلى في المظلة (برتقالي/أحمر) بسبب إغلاق الثغور وانخفاض التبريد التبخري. لاحقا، تمت معالجة هذه الصور عالية الدقة باستخدام دالة القياس ثلاثية النقاط على مناطق محددة ذات اهتمام (ROI) لاستخراج قيم دقيقة لدرجة حرارة المظلة (Tc) لحساب مؤشر إجهاد مياه المحاصيل (CWSI).

إذا كان CWSI هو:
0، إذا المحصول ليس تحت ضغط مائي
1 إذا يكون المحصول تحت ضغط مائي شديد
حيث:
TC هي درجة حرارة مظلة المحصول، تقاس بالتصوير بالأشعة تحت الحمراء. TW هي درجة حرارة المظلة تحت ظروف الإجهاد غير المائي. Td هي درجة حرارة المظلة تحت ظروف الإجهاد المائي القصوى19.
تظهر مؤشرات نمو النبات وتطوره والحالة الفسيولوجية، مثل الارتفاع، وعدد الأوراق، ودرجة حرارة الأوراق، التي تم تقييمها باستخدام التصوير الحراري بالأشعة تحت الحمراء، في الجدول التكميلي 4 إلى جانب متغيرات الدراسة والتعريفات المفاهيمية والتشغيلية المستخدمة في التجربة. سمح دمج هذه المتغيرات بتقييم شامل لتأثير العلاجات التجريبية على الأداء الفسيولوجي وتطور كل نبات.
6. تحليل البيانات
تم تحليل البيانات الفسيولوجية والشكلية باستخدام تحليل أنوفي أحادي الاتجاه لكل نظام ري لتحديد تأثير المعالجات الميكروبية المختلفة. تم تنفيذ جميع الإجراءات الإحصائية باستخدام برامج إحصائية. قبل إجراء التحليل الاستنتاجي، تم التحقق من المتطلبات الأساسية للإحصاء البارامتري لضمان موثوقية النتائج. تم تأكيد طبيعة البقايا باستخدام اختبار أندرسون-دارلينج (p > 0.100)، مما يشير إلى الطبيعية. بالإضافة إلى ذلك، تم التحقق من تجانس التباين باستخدام اختبار ليفين (p = 0.989)، مؤكدا وجود تجانس عالي بين المجموعات. وبما أن كلا الافتراضين تم تحقيقهما، فقد استخدم اختبار توكي HSD (الفرق القابل قدر بصدق) بعد الاختبار لتحديد الفروق المعنوية (p < 0.05) بين متوسطات العلاج. تم تعريف المصنع الفردي كوحدة تجريبية لجميع التقييمات الإحصائية.