مقالة منهجية

تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية لتحديد مقاطع القولون العقدية والعقدية من مرضى مرض هيرشسبرونغ

114 مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/69825

⸱

مايو 22, 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Gastrointestinal Surgery, The Second Affiliated Hospital of Zunyi Medical University

في هذه المقالة

ملخص

يصف هذا البروتوكول سير عمل تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية لتحليل تسلل الخلايا المناعية والفروق في النسخ الخاصة بنوع الخلية بين مقاطع القولون العقدية والعقدية في مرض هيرشسبرونغ.

الملخص

مرض هيرشسبرونغ (HSCR) هو اضطراب خلقي في حركة الأمعاء يتميز بغياب الخلايا العصبية المعوية في الأمعاء البعيدة. مقارنة بتسلسل الحمض النووي الريبي الضخم، يتيح تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية (scRNA-seq) تحليل تعبير الجين على مستوى الخلية الواحدة، مما يحل التباين الخلوي الذي يتم إخفاؤه في التحليلات المتوسطة حسب السكان. تم إنشاء سير عمل موحد لتسلسل scRNA-seq لتوصيف المشهد النسخي للأجزاء العقدية والعقدية من مرضى HSCR. تم جمع أنسجة القولون، وتم إجراء تلوين بالهيماتوكسيلين والإيوزين لتحديد المناطق العقدية والعقدية. تم تفكيك الأنسجة إنزيميا وميكانيكيا إلى تعليقات خلية واحدة، تلتها الترشيح، وتقييم القابلية للبقاء، وبناء مكتبات النسخ الأحادية الخلية. تم تسلسل المكتبات التي اجتازت مراقبة الجودة، وتمت معالجة البيانات الخام لقياس الخلايا وتصفية الجودة لإزالة الخلايا منخفضة الجودة والعيوب التقنية. بعد التطبيع وتقليل الأبعاد، تم تجميع الخلايا وتوضيحها بناء على جينات العلامة المثبتة. قارنت التحليلات اللاحقة تركيب نوع الخلايا بين الأنسجة العقدية والأغانغليونية وحددت جينات معبرة بشكل مختلف ضمن مجموعات رئيسية من الخلايا المناعية. تكشف النتائج عن اختلافات كبيرة في البيئة الدقيقة المناعية بين الأجزاء العقدية والجنغليونية في HSCR.

المقدمة

يعد مرض هيرشسبرونغ (HSCR) واحدا من أكثر اضطرابات حركة الأمعاء الخلقية شيوعا، حيث يبلغ معدل حدوث حوالي 1 من كل 5,000 ولادة حية حول العالم1. ينشأ المرض من فشل خلايا القمم العصبية المعوية (ENCCs) في الهجرة إلى الأمعاء البعيدة خلال الأسابيع الجنينية 5–12، مما يؤدي إلى غياب العقد المعوية في الأجزاء المتأثرة2. وبالتالي، يظهر الجزء العقدي انقباضا مستمرا في التشنج وضعف في حركة التبيض، مما يؤدي إلى توسع الأمعاء القريب. سريريا، يظهر ذلك على شكل انسداد وظيفي، يسبب الإمساك، وتورم البطن، والقيء، وقد يكون مهددا للحياة في الحالات الشديدة. يظل الاستئصال الجراحي للجزء العقدي هو العلاج الأساسي لمرض HSCR؛ ومع ذلك، يعاني جزء كبير من المرضى من مضاعفات ما بعد العملية، بما في ذلك الإمساك، والتهاب الأمعاء، وتلوث البراز، مما يؤثر بشكل كبير على جودة الحياة3. بالإضافة إلى ذلك، قد تحدث متلازمة الأمعاء القصيرة (SBS) بعد استئصال أمعاء واسع، مما يؤدي إلى ضعف امتصاص العناصر الغذائية وزيادة التحديات في الإدارة السريرية. لذلك، يبقى توضيح الآليات الأساسية ل HSCR وتحديد أهداف علاجية جديدة احتياجات سريرية حاسمة.

في السنوات الأخيرة، تم تطبيق تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية (scRNA-seq) على نطاق واسع لدراسة الآليات الجزيئية المرتبطة بالمرض. على عكس تسلسل الحمض النووي الريبي التقليدي، يتيح scRNA-seq تحليل التعبير الجيني بدقة خلية واحدة، مما يسمح بتحديد التباين الخلوي والمجموعات الفرعية النادرة التي تخفي في التحليلاتالجماعية 4. وبالتالي، برز scRNA-seq كأداة قوية لتحليل التغاير الخلوي والتواصل بين الخلايا، مما دفع الأبحاث في علم الأحياء والطب5. كشف هذا النهج عن آليات مرضية جديدة وأهداف علاجية في الأمراض المعقدة، بما في ذلك مرض الزهايمر6، التهاب المفاصل الروماتويدي7، سرطان الرئة8، والسكري من النوع2 9.

في هذه الدراسة، تم تطبيق scRNA-seq لتوصيف المشهد النسخي لخلايا المناعة وأنماط التسلل في أنسجة القولون العقدية والعقدية من مرضى HSCR. تضمن سير العمل ثلاث خطوات رئيسية: إعداد وتقييم جودة التعليقات أحادية الخلية، وبناء مكتبات RNA-seq أحادية الخلية بطول 3 أقدام (3′)، والتحليل المعلوماتي الحيوي في مرحلة لاحقة. تم حفظ عينات الأنسجة في محلول مخصص لحفظ خلية واحدة مباشرة بعد الاستئصال، وتم تفكيكها إنزيميا إلى تعليقات خلية واحدة خلال 48 ساعة. تجاوزت قدرة الخلايا على قيد الحياة 80٪، وتم تعديل التركيز النهائي للخلية إلى 700–1,500 خلية/ميكرولتر قبل التحضير في المكتبة. تمت مقارنة تسرب الخلايا المناعية بين الأجزاء العقدية والعقدية، وتم تحديد مجموعات فرعية من الخلايا المناعية التي أظهرت فروقا واضحة في النسخ النسجي. تحدد هذه التحليلات التغيرات في الخلايا المناعية المرتبطة بأمراض القولون في HSCR.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تمت الموافقة على هذه الدراسة من قبل لجنة الأخلاقيات المؤسسية في المستشفى التابع لجامعة زوني الطبية (رقم الموافقة: KYLL-2024-030). تتوافق الدراسة مع إعلان هلسنكي. تم الحصول على موافقة مستنيرة (شفوية وكتابية) من جميع المشاركين وأوصيائهم. يعرض الجدول 1 المعلومات عن مرضى HSCR.

جمع أنسجة القولون، بما في ذلك الأجزاء العقدية والعقدية، من مرضى HSCR الذين تم تشخيصهم وخضعهم لجراحة في قسم جراحة الأطفال في المستشفى التابع لجامعة زوني الطبية. تشمل الأجزاء العقدية والعقدية العقدية من اثنين من مرضى HSCR الذكور. المعلومات السريرية التفصيلية موضحة في الجدول 1. جميع المواد الكيميائية والمواد الكيميائية والمعدات والبرمجيات مدرجة في جدول المواد.

1. تلوين الهيماتوكسيلين والإيوزين

  1. جمع الأنسجة وتثبيتها
    1. ثبت عينات الأنسجة المعوية في محلول تثبيت بارافورمالديهايد بنسبة 4٪ لمدة لا تقل عن 24 ساعة.
      تحذير: البارافورمالديهايد سام ويطلق أبخرة الفورمالديهايد. قم بجميع الإجراءات باستخدام غطاء بخار كيميائي واستخدم معدات الحماية الشخصية المناسبة.
    2. قم بقص الأنسجة إلى حوالي 5 × 5 × 2 مم3 باستخدام المشرط. ضع المناديل في أشرطة الكاسيت المدمجة واشطفها تحت ماء الصنبور الجاري لمدة 24 ساعة.
      ملاحظة: قم بإزالة حواف الأنسجة وحضر كتل ذات سطح مسطح واحد على الأقل. إذا كان غير متساو، ضع منديل بين أوراق الترشيح بعد الشطف.
  2. تجفيف الإيثانول بدرجات
    1. اغمر الأنسجة بشكل متسلسل في محاليل الإيثانول: 70٪ إيثانول طوال الليل، 80٪ إيثانول لمدة 3 ساعات، 90٪ إيثانول لمدة ساعتين، 95٪ إيثانول I لمدة ساعتين، 95٪ إيثانول II لمدة ساعة واحدة، 100٪ إيثانول I لمدة ساعة، و100٪ إيثانول II لمدة 30 دقيقة.
      ملاحظة: قم بتخفيف الإيثانول (≥99.7٪) بالماء فائق النقاء إلى التركيزات المشار إليها.
      تحذير: قم بالتعامل مع الإيثانول في غطاء بخار كيميائي.
    2. أزل سلة الجفاف وصرف المضخة جيدا بين الخطوات.
  3. التنظيف
    1. نقل الأنسجة إلى الزيلين لمدة 30 ثانية لتحقيق الشفافية.
  4. تسرب وتضمين البارافين
    1. إذابة شمع البرافين عند درجة حرارة 60 درجة مئوية قبل يوم واحد. ضع الشمع الطازج في ثلاث دورات تجميد وإذابة لإزالة الفقاعات. قم بتصفية البارافين المذاب عبر ورق الترشيح بعد الدورة الثالثة.
    2. تغلغل الأنسجة في شمع البارافين النقي (شمع البارافين I) لمدة ساعة واحدة.
    3. تغلغل الأنسجة في خليط البارافين (شمع البارافين II؛ شمع البارافين النقي: شمع النحل = 8:1) لمدة ساعتين.
      ملاحظة: قم بإذابة شمع العسل تماما وتصفيتها قبل الاستخدام.
    4. صب شمع البرافين II في قوالب الغرس. ضع كتل الأنسجة بشكل منتصب ومسطح، وأدخل الملصقات، واترك نفسها لتتصلب.
  5. التقسيم
    1. قم بتقليم كتل البارافين للحصول على أسطح ناعمة دون قطع الأنسجة.
    2. ثبت الكتل على ميكروتوم. عدل الاتجاه وأزل البارافين الزائد. قطع مقاطع تسلسلية بسماكة 4 ميكرومتر. أقسام الطفو على حمام ماء بدرجة حرارة 50 درجة مئوية وانتقل إلى شرائح زجاجية.
    3. الشرائح الجافة في فرن بدرجة حرارة 60 درجة مئوية لإزالة الرطوبة المتبقية.
      ملاحظة: الأقسام الجافة لمدة 12–48 ساعة.
  6. إزالة البارافرافينية
    1. قم بإجراء الحضانة المتسلسلة: زيلين I (15 دقيقة)، زيلين II (15 دقيقة)، 100٪ إيثانول I (5 دقائق)، 100٪ إيثانول II (5 دقائق)، 90٪ إيثانول (5 دقائق)، 80٪ إيثانول (5 دقائق)، 70٪ إيثانول (5 دقائق)، وماء مقطر (5 دقائق).
  7. صبغ الهيماتوكسيلين
    1. صبغ أجزاء بالهيماتوكسيلين لمدة 50 ثانية.
    2. اشطف الماء تحت ماء الصنبور الجاري لمدة 10 دقائق.
  8. صبغة الإيوزين
    1. صبغ أجزاء بالإيوسين لمدة 40 ثانية.
  9. الجفاف
    1. اغمر الأقسام بشكل متسلسل في 95٪ إيثانول I (30 ثانية)، 95٪ إيثانول II (30 ثانية)، 100٪ إيثانول I (30 ثانية)، و100٪ إيثانول II (30 ثانية).
  10. التنظيف
    1. انقل الأقسام إلى زيلين I لمدة 10 دقائق وزيلين II لمدة 10 دقائق.
  11. التركيب والمراقبة
    1. أضف وسط تركيب. غط بغطاء زجاجي وأزل فقاعات الهواء.
    2. دع وسط التثبيت يتصلب. افحص الأقسام تحت المجهر الضوئي.

2. تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية

  1. تحضير نظام التعليق أحادي الخلية
    1. قم بتقطيع أنسجة الأمعاء إلى قطع بحجم ~1 مم3 باستخدام المقص.
    2. حضن شظايا الأنسجة في وسط النسر المعدل (DMEM) من دولبيكو الذي يحتوي على 1 ملغ/مل من كولاجناز II و0.1 ملغ/مل DNase I عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة مع تحريك خفيف على منصة هزاز (60 دورة في الدقيقة).
    3. إنهاء الهضم بإضافة كمية متساوية من DMEM البارد الذي يحتوي على 10٪ مصل البقري الجنيني (FBS).
    4. قم بترشيح نظام التعليق عبر مصفاة خلية بحجم 70 ميكرومتر. الطرد المركزي عند 300 × جرام لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    5. تخلص من المادة الفائقة واحتفظ بحبيبة الخلية. اغسله مرة واحدة بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) يحتوي على 0.04٪ ألبومين مصل البقري (BSA).
    6. قم بتفكيك تجمعات الخلايا عن طريق استخدام الماصات اللطيف للحصول على تعليق خلية واحدة.
    7. قم بترشيح نظام التعليق عبر مصفاة خلايا بحجم 40 ميكرومتر.
    8. الطرد المركزي عند 300 × جرام لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. تخلص من السوبرناتين واجمع الحبيبات.
    9. أعد تعليق الخلايا في DMEM التي تحتوي على 10٪ FBS و1٪ بنسلين-ستربتوميسين (P/S).
    10. حدد بقاء الخلية وكثافتها باستخدام استبعاد الأزرق التريباني. استخدم عينات ذات صلاحية >80٪ واضبط التركيز إلى 700–1,500 خلية/ميكرولتر.
      ملاحظة: امزج تعليق الخلايا مع تريبان بلو (بنسبة 1:1) وعد الخلايا الصالحة باستخدام جهاز قياس الدم الخلوي.
  2. تحضير المكتبة
    1. تحميل حوالي 15,000 خلية في كل جولة لتحضير المكتبة.
      ملاحظة: في قطرات الحمض النووي المغناطيسي الهلامية (GEM)، يتهجين mRNA إلى أوليجونكليوتيدات متعددة (dT) على حبيبات الجل.
    2. قم بعمل النسخ العكسي وتضخيم cDNA باستخدام PCR (95 °C لمدة 10 دقائق؛ 40 دورة من 95 °م لمدة 15 ثانية، 60 °م لمدة 35 ثانية، 72 °م لمدة 25 ثانية؛ التمديد النهائي عند 72 °م لمدة 25 ثانية). استخدم cDNA المضخم لبناء مكتبة scRNA-seq بزاوية 3′.
      ملاحظة: يضاف بروز CCC أثناء تخليق cDNA ويتزاوج مع تسلسل أوليجوننيوكليوتيدات التبديل في القالب (TSO).
    3. كسر المستحلبات واسترجع cDNA من الأحجار الكريمة.
  3. مراقبة الجودة والتسلسل المكتبي
    1. قم بقياس تعبير الجينات وتقييم توزيع حجم الشظايا.
    2. قم بإجراء قياس دقيق باستخدام جهاز qPCR الفلوري.
      ملاحظة: تأكد من تركيز المكتبة ≥10 نانومتر.
    3. مكتبات التسلسل باستخدام أداة التسلسل.
      ملاحظة: بنية القراءة: قراءة 1 (26 نقطة حمل)، قراءة 2 (91 نقطة أساس للقراءة)، مؤشر i7 (8 نقاط أساس للقراءة)؛ عمق الهدف ~50,000 قراءة لكل خلية.
  4. مراقبة جودة البيانات
    1. محاذاة القراءات الخام إلى قاعدة بيانات المراجع. قم بإجراء عد UMI وإنشاء مصفوفة خلية بجين.
    2. استيراد النتائج بصيغة AnnData (البيانات المشروحة) للتحليل اللاحق.
    3. قم بتصفية QC بناء على UMIs، وعدد الجينات، وقراءات الميتوكوندريا.
      ملاحظة: إزالة الدوبلتات (سكروبليت)؛ استبعد الخلايا التي تحتوي على <200 أو >5,000 جين، أي total_counts >40,000، أو mt_ratio >20٪.
  5. تقليل الأبعاد والتعليق
    1. يعد معدل التعريف الجزيئي الفريد (UMI) إلى 10,000 لكل خلية.
    2. تحديد الجينات المتغيرة للغاية.
    3. إجراء تحليل المكونات الرئيسية (PCA).
    4. قم بإنشاء رسم بياني لأقرب جار k.
    5. قم بتنفيذ تضمين UMAP.
    6. الخلايا العنقودية باستخدام خوارزمية لايدن في Scanpy (الإصدار 1.9.3).
      ملاحظة: استخدم sc.pp.neighbors و sc.tl.leiden (الدقة = 0.5).
    7. قم بتوضيح أنواع الخلايا باستخدام أداة مصممة للتوضيح الآلي والدقيق لأنواع الخلايا في بيانات تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية (scRNA-seq).
  6. التحليل التفاضلي
    1. إجراء تحليل تعبير جيني تفاضلي في R (v4.2.2) باستخدام Seurat (v4.3.0).
      ملاحظة: استخدم دالة FindMarkers مع اختبار مجموع الرتب Wilcoxon.
    2. قم بإجراء تحليل إثراء GO باستخدام clusterProfiler (الإصدار 4.8.1) باستخدام enrichGO.
      ملاحظة: تشمل فئات CC، MF، وBP.
    3. قم بإجراء تحليل إثراء مسار KEGG باستخدام clusterProfiler (الإصدار 4.8.1) مع enrichKEGG10.

3. التخلص من النفايات

  1. اجمع النفايات التي تحتوي على بارافورمالديهايد وزيلين بشكل منفصل.
  2. قم بتحييد المحاليل الحمضية عند الاقتضاء أو التخلص منها كنفايات خطرة.
  3. اتبع لوائح الصحة والسلامة البيئية المؤسسية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

كشفت صبغات الهيماتوكسيلين والإيوسين (HE) (الشكل 1) عن اختلافات نسيجية واضحة بين الأجزاء العقدية والأغانغليونية. مقارنة بالأجزاء العقدية، أظهرت المقاطع العقدية زيادة في تقشير المخاط، وانخفاضا ملحوظا في خلايا الكأس والعصبونات تحت المخاطية، وحدود ضبابية بين الطبقات المخاطية والعضلية. في مجموعة فرعية من الأقسام، كان حفظ الأنسجة غير مثالي، مع انفصال جزئي للظهارة واضطراب في بنية الأنسجة، مما حد من التقييم النسيجي في هذه المناطق.

بعد ترش...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

تم تطبيق تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية على السمات النسخية الملف النفسي لأنسجة القولون التي تم استئصالها جراحيا (الأجزاء العقدية والعقدية) من مرضى أمراض هيرشسبرغ 4,5. تم إيلاء اهتمام خاص لاستراتيجية تفكك الأنسجة، حيث تؤثر معايير التفكك على استعادة الخلية، وتمثيل نوع الخلية، وسلامة الحمض النووي الريبي. تم تحسين ظروف الهضم الإنزيمية لتحقيق توازن كاف بين تفكك الأنسجة والحفاظ على بقاء الخلايا وجودة النسخ النصي. نظرا لمصفوفة ا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

وقد دعم هذا العمل مشروع قويتشو للعلوم والتكنولوجيا (مؤسسة التعاون بين العلوم والتكنولوجيا - ZK - [2024] العام 344) (إلى X.F. يانغ) وعقد مشروع العلوم والتكنولوجيا في زوني (التعاون العلمي والتكنولوجي) (تعاون زوني للعلوم والتكنولوجيا HZ (2023) رقم) (إلى ي. كو).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
شمع النحلشركة سينوفارم للكاشف الكيميائي المحدودة.8012-89-3  https://www.reagent.com.cn/ProductSearch/8012-89-3
شمع النحلشركة سينوفارم للكاشف الكيميائي المحدودة.8012-89-3  https://www.reagent.com.cn/ProductSearch/8012-89-3
مصل البقر الألبومينثيرموفيشر30066575  https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/30066575؟ SID=srch-srp-30066575
مصل البقر الألبومينثيرموفيشر30066575  https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/30066575؟ SID=srch-srp-30066575
سيلتايبيستلا يوجدNAhttp://celltypist.org/tutorials/onlineguide
سيلتايبيستلا يوجدNAhttp://celltypist.org/tutorials/onlineguide
حزمة ملف الكلسترالموصل الحيويv4.8.1https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/clusterProfiler.html
حزمة ملف الكلسترالموصل الحيويv4.8.1https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/clusterProfiler.html
كولاجناز IIثيرموفيشر17101015  https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/17101015؟ SID=srch-srp-17101015
كولاجناز IIثيرموفيشر17101015  https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/17101015؟ SID=srch-srp-17101015
زجاج الغطاءسيتوتست80340-0130  https://cn.citotest.com/pd40971476.html
زجاج الغطاءسيتوتست80340-0130  https://cn.citotest.com/pd40971476.html
شفرة ميكروتوم ذات الاستخدام الواحدريشةS-35  https://www.feather.co.jp/en/m_Products/pathology01.html
شفرة ميكروتوم ذات الاستخدام الواحدريشةS-35  https://www.feather.co.jp/en/m_Products/pathology01.html
DNase Iثيرموفيشر18047019  https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/18047019؟ SID=srch-srp-18047019
DNase Iثيرموفيشر18047019  https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/18047019؟ SID=srch-srp-18047019
فرن التجفيفبوروكDHG-9140A  http://www.shboruike.com/sys-pd/84.html
فرن التجفيفبوروكDHG-9140A  http://www.shboruike.com/sys-pd/84.html
دولبيكو' إس معدلف إيجل ميديومثيرموفيشر12491015  https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/12491015
دولبيكو' إس معدلف إيجل ميديومثيرموفيشر12491015  https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/12491015
كحول الإيثيلشركة سينوفارم للكاشف الكيميائي المحدودة.10009218  https://www.reagent.com.cn/ProductSearch/10009218
كحول الإيثيلشركة سينوفارم للكاشف الكيميائي المحدودة.10009218  https://www.reagent.com.cn/ProductSearch/10009218
مصل الأبقار الجنينيثيرموفيشرA5669801https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/A5669801
مصل الأبقار الجنينيثيرموفيشرA5669801https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/A5669801
مجموعة تلوين الهيماتوكسيلين والإيوزينبيوتايمC0105S  https://m.beyotime.com/mobilegoods.do?method=code&؛ code=C0105S
مجموعة تلوين الهيماتوكسيلين والإيوزينبيوتايمC0105S  https://m.beyotime.com/mobilegoods.do?method=code&؛ code=C0105S
حمض الهيدروكلوريكشركة سينوفارم للكاشف الكيميائي المحدودة.10011028  https://www.reagent.com.cn/ProductSearch/10011028
حمض الهيدروكلوريكشركة سينوفارم للكاشف الكيميائي المحدودة.10011028  https://www.reagent.com.cn/ProductSearch/10011028
شريحة المجهرسيتوتست80302-3111  https://cn.citotest.com/pd530614548.html
شريحة المجهرسيتوتست80302-3111  https://cn.citotest.com/pd530614548.html
وسيط التثبيتبيوتايمC0173-100 مل  https://m.beyotime.com/mobilegoods.do?method=code&؛ code=C0173-100ml
وسيط التثبيتبيوتايمC0173-100 مل  https://m.beyotime.com/mobilegoods.do?method=code&؛ code=C0173-100ml
المجهر البصرينيكونإكليبس SI  https://www.microscope.healthcare.nikon.com/ja_JP/products/upright-microscopes/eclipse-si
المجهر البصرينيكونإكليبس SI  https://www.microscope.healthcare.nikon.com/ja_JP/products/upright-microscopes/eclipse-si
شمع البارافين  شركة سينوفارم للكاشف الكيميائي المحدودة.8002-74-2  https://www.reagent.com.cn/ProductSearch/8002-74-2
شمع البارافين  شركة سينوفارم للكاشف الكيميائي المحدودة.8002-74-2  https://www.reagent.com.cn/ProductSearch/8002-74-2
Paraformaldehyde Fix SolutionبيوتايمP0099-3L  https://m.beyotime.com/mobilegoods.do?method=code&؛ code=P0099-3L
Paraformaldehyde Fix SolutionبيوتايمP0099-3L  https://m.beyotime.com/mobilegoods.do?method=code&؛ code=P0099-3L
البنسلين – ستريبتوميسينثيرموفيشر15140122  https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/15140122؟ SID=srch-srp-15140122
البنسلين – ستريبتوميسينثيرموفيشر15140122  https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/15140122؟ SID=srch-srp-15140122
محلول ملحي مخزن بالفوسفاتثيرموفيشر10010023  https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/10010023
محلول ملحي مخزن بالفوسفاتثيرموفيشر10010023  https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/10010023
ورق المرشح النوعيسولاربيولوجياYA0166https://www.solarbio.com
ورق المرشح النوعيسولاربيولوجياYA0166https://www.solarbio.com
حزمة برامج Rمؤسسة R للحوسبة الإحصائيةv4.2.2https://www.r-project.org/
حزمة برامج Rمؤسسة R للحوسبة الإحصائيةv4.2.2https://www.r-project.org/
الميكروتوم الدوارلايكالايكا RM2125 RTShttps://www.leicabiosystems.com/en-jp/histology-equipment/microtomes/histocore-biocut/
الميكروتوم الدوارلايكالايكا RM2125 RTShttps://www.leicabiosystems.com/en-jp/histology-equipment/microtomes/histocore-biocut/
سكانبيتطوير المجتمعv1.9.3https://scanpy.readthedocs.io/en/latest/?utm_source=chatgpt.com
سكانبيتطوير المجتمعv1.9.3https://scanpy.readthedocs.io/en/latest/?utm_source=chatgpt.com
سوراكرانv4.3.0https://cran.r-project.org/web/packages/Seurat/index.html
سوراكرانv4.3.0https://cran.r-project.org/web/packages/Seurat/index.html
جهاز تجفيف الأنسجةشركة ووهان جونجي للإلكترونيات المحدودةJT-12H  http://www.whjjbl.com/front/page/126495/product_id/46166.html
جهاز تجفيف الأنسجةشركة ووهان جونجي للإلكترونيات المحدودةJT-12H  http://www.whjjbl.com/front/page/126495/product_id/46166.html
آلة تضمين الأنسجةشركة ووهان جونجي للإلكترونيات المحدودةJB-L8  http://www.whjjbl.com/front/page/126495/product_id/46064.html
آلة تضمين الأنسجةشركة ووهان جونجي للإلكترونيات المحدودةJB-L8  http://www.whjjbl.com/front/page/126495/product_id/46064.html
تريبان بلو  سولاربيولوجياC0040https://www.solarbio.com/haveRegion?id=48&all=0&key=%20Trypan%20Blue
تريبان بلو  سولاربيولوجياC0040https://www.solarbio.com/haveRegion?id=48&all=0&key=%20Trypan%20Blue
زيلينشركة سينوفارم للكاشف الكيميائي المحدودة.10023418  https://www.reagent.com.cn/ProductSearch/10023418
زيلينشركة سينوفارم للكاشف الكيميائي المحدودة.10023418  https://www.reagent.com.cn/ProductSearch/10023418

المراجع

  1. Montalva, L., et al. Hirschsprung disease. Nat Rev Dis Primers. 9 (1), 54 (2023).
  2. Morera, C., Nurko, S. Hirschsprung's disease management. Aliment Pharmacol Ther. 60 Suppl 1, S66-S76 (2024).
  3. Kyrklund, K., et al. ERNICA guidelines for the management of rectosigmoid Hirschsprung's disease. Orphanet J Rare Dis. 15 (1), 164 (2020).
  4. Jovic, D., et al. Single-cell RNA sequencing technologies and applications: a brief overview. Clin Transl Med. 12 (3), e694 (2022).
  5. Cheng, C., Chen, W., Jin, H., Chen, X. A review of single-cell RNA-seq annotation, integration, and cell-cell communication. Cells. 12 (15), 1970 (2023).
  6. Mathys, H., et al. Single-cell multiregion dissection of Alzheimer's disease. Nature. 632 (8026), 858-868 (2024).
  7. Wu, X., et al. Single-cell sequencing of immune cells from anticitrullinated peptide antibody positive and negative rheumatoid arthritis. Nat Commun. 12 (1), 4977 (2021).
  8. Maynard, A., et al. Therapy-induced evolution of human lung cancer revealed by single-cell RNA sequencing. Cell. 182 (5), 1232-1251.e22 (2020).
  9. Lee, H., et al. Immunological link between periodontitis and type 2 diabetes deciphered by single-cell RNA analysis. Clin Transl Med. 13 (12), e1503 (2023).
  10. Kanehisa, M., Goto, S. KEGG: Kyoto encyclopedia of genes and genomes. Nucleic Acids Res. 28 (1), 27-30 (2000).
  11. Su, K. Y., Watanabe, A., Yeh, C. H., Kelsoe, G., Kuraoka, M. Efficient culture of human naive and memory B cells for use as APCs. J Immunol. 197 (10), 4163-4176 (2016).
  12. Cancro, M. P., Tomayko, M. M. Memory B cells and plasma cells: the differentiative continuum of humoral immunity. Immunol Rev. 303 (1), 72-82 (2021).
  13. Weisel, N. M., et al. Surface phenotypes of naive and memory B cells in mouse and human tissues. Nat Immunol. 23 (1), 135-145 (2022).
  14. Phelps, A., et al. Production and use of antigen tetramers to study antigen-specific B cells. Nat Protoc. 19 (3), 727-751 (2024).
  15. Wu, X. Z., et al. Activated naive B cells promote development of malignant pleural effusion by differential regulation of Th1 and Th17 response. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 315 (3), L443-L455 (2018).
  16. Chien, C. H., Chiang, B. L. Regulatory T cells induced by B cells: a novel subpopulation of regulatory T cells. J Biomed Sci. 24 (1), 86 (2017).
  17. Tan, Z., et al. Comprehensive analysis of scRNA-seq and bulk RNA-seq reveals dynamic changes in the tumor immune microenvironment of bladder cancer and establishes a prognostic model. J Transl Med. 21 (1), 223 (2023).
  18. Ding, Q., et al. Integrated analysis of single-cell RNA-seq, bulk RNA-seq, Mendelian randomization, and eQTL reveals T cell-related nomogram model and subtype classification in rheumatoid arthritis. Front Immunol. 15, 1399856 (2024).
  19. Guo, S., et al. Integrated analysis of single-cell RNA-seq and bulk RNA-seq unravels T cell-related prognostic risk model and tumor immune microenvironment modulation in triple-negative breast cancer. Comput Biol Med. 161, 107066 (2023).
  20. Zhang, C., et al. Comprehensive analyses of brain cell communications based on multiple scRNA-seq and snRNA-seq datasets for revealing novel mechanisms in neurodegenerative diseases. CNS Neurosci Ther. 29 (10), 2775-2786 (2023).
  21. Zhang, Y., et al. Single-cell RNA sequencing in cancer research. J Exp Clin Cancer Res. 40 (1), 81 (2021).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة