مقالة منهجية

التوحيد البيولوجي للبناء الحيوي المعتمد على ASC البشري لتركيبات الأنسجة الكبيرة القابلة للتكرار

DOI:

10.3791/69839

⸱

يونيو 5, 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Eukaryotic Cell Biology (Labio), National Institute of Metrology, Quality and Technology (INMETRO), 2Post-graduation Program of Translational Biomedicine (Biotrans), UNIGRANRIO, 3Post-graduation Program in Biotechnology, National Institute of Metrology, Quality and Technology (INMETRO), 4Post-graduation Program in Science and Technology of Polymers, Laboratory of Catalysis for Polymerization, Recycling and Biodegradable Polymers (LCPRB), Institute of Macromolecules, Federal University of Rio de Janeiro, 5Post-graduation Program in Metrology and Technology, National Institute of Metrology, Quality and Technology (INMETRO), 6Campus of Duque de Caxias, Federal University of Rio de Janeiro

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تقدم هذه الدراسة سير عمل للتصنيع الحيوي القابل لإعادة الإنتاج باستخدام كرويدات الخلايا الجذعية المشتقة من الدهون وسقالات GelMA المطبوعة ثلاثية الأبعاد. يظهر التحكم المكاني، وقدرة الدمج، ومقاييس مراقبة الجودة، مما ينتج عنه تراكيب أنسجة كبيرة قابلة للزراعة مع تطبيقات محتملة في الطب التجديدي.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يشكل غياب البروتوكولات الموحدة عبر المختبرات عائقا كبيرا أمام قابلية المقارنة بين نتائج التجارب ونقل تقنيات التصنيع الحيوي بكفاءة. لا يعزز التوحيد البيولوجي الصارم قابلية التكرار فحسب، بل يسهل أيضا التوافق مع الأطر التنظيمية الوطنية والدولية، التي تعتبر ضرورية للترجمة السريرية لاستراتيجيات هندسة الأنسجة. تقدم هذه الدراسة سير عمل موحد للتصنيع الحيوي يشمل زراعة أحادية الطبقة من hADSCs، وتكوين الكرويد، والطباعة ثلاثية الأبعاد لسقالات الجيلاتين ميثاكريلويل (GelMA)، والتجميع الحيوي الكروي. تم دمج مقاييس مراقبة الجودة لضمان قابلية التكرار. تم تصميم السقالة المطبوعة ثلاثية الأبعاد من GelMA بمسامين مركزيين، كل منهما قادر على استيعاب مئات الكرويدات. تم تأكيد دقة الطباعة من خلال مقارنة أبعاد السقالة مع نموذج CAD، مع انحرافات طفيفة غير ذات دلالة. شكلت hADSCs كرويدات متجانسة خلال 24 ساعة في قوالب الأغاروز الدقيقة. عند بذرها في مسام السقالات، خضعت الكرويدات للاندماج المستمر على مدى 72 ساعة، مكونة تراكيب كبيرة تؤكد بواسطة التصوير الكونفوكلي. ضمنت تصميم السقالات ودقة الطباعة الدعم الهيكلي، بينما أتاح التجانس الكروي التكوين المتوقع للهيكل. أدى اندماج الكرويدات داخل مسام السقالة إلى تكوين أنسجة مناسبة للزراعة، سواء مع أو بدون السقالة، مما يبرز مرونة هذا النهج الحيوي. تؤكد النتائج الدور المحوري للتوحيد القياسي البيولوجي في تطوير منهجيات قابلة للتكرار لبناء التركيب الحيوي للأنسجة الحية، مع تداعيات واعدة على التطبيقات السريرية المستقبلية في الطب التجديدي.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التجميع الحيوي والطباعة الحيوية هما نهجان تكميلان في التصنيع الحيوي في هندسة الأنسجة يركزان على بناء أنسجة وأعضاء معقدة على المستوى الكبير باستخدام تقنيات آلية 1,2,3,4.

تم دمج الكرويدات في التصنيع الحيوي كعناصر أساسية لنهج التجميع الحيوي5. تعتبر الكرويدات نسيج دقيق تعيد إنتاج التفاعلات بين الخلايا والبيئة الدقيقة للأنسجة المحيطة في الجسم الحي. من بين مصادر الخلايا المستخدمة في تكوين الكروي، تبرز الخلايا الجذعية المشتقة من الدهون (ADSCs) بسهولة عزلها، والحفاظ على الزراعة طويلة الأمد، وإمكانات التمايز 6,7,8.

نظرا لقدرتها الذاتية على تكوين تجمعات أكبر، يمكن للكرويدات توليد تراكيب أنسجة أكثر تعقيدا عند تعرضها لطرق التجميع الحيوي. تعزز هذه التنظيمات المدفوعة بالاندماج الإمكانات التجديدية والتمايز لسفيرويدات الخلايا الجذعية 9,10.

يمكن دعم أو حتى توجيه التجميع الحيوي للكروي بواسطة المواد الحيوية11، مما يجعل هذه الاستراتيجية مناسبة للتصنيع الحيوي القابل للتوسع والآلي12,13.

يمكن تصنيف استراتيجيات التصنيع الحيوي الحالية بشكل واسع إلى طرق تجميع كروية خالية من السقالات وأنظمة الطباعة الحيوية المدمجة بالهيدروجيل 2,5,14. تعتمد الطرق الخالية من السقالات حصريا على التجميع الذاتي للخلايا والاندماج بين الكروي، مستفيدة من التفاعلات الداخلية بين الخلايا والخلية. ومع ذلك، وبسبب عدم حدوث ذلك دون توجيه معماري خارجي أو حصر هندسي، تظهر هذه الأساليب تحكما مكانيا أقل وأقل قابلية للتنبؤ الهيكلي 5,15. على النقيض من ذلك، تقوم طرق التغليف المعتمدة على الهيدروجيل بتضمين الخلايا داخل المصفوفات الضخمة لتوفير دعم هيكلي وبنية محددة مسبقا16,17، والتي قد تقيد جزئيا الاتصال المباشر بين الخلايا والخلية خلال مراحل الاندماج المبكرة وتؤثر على ديناميكيات هجرة الخلايا18. في هذا الإطار، تقدم المواد الحيوية القابلة للطباعة مثل الجيلاتين ميثاكريلويل (GelMA) زخارف التصاق الخلايا وقد تعمل كهياكل لتسهيل التجميع الكروي الحيوي19. يفترض أن سقالة GelMA المطبوعة ثلاثية الأبعاد توفر حجزا هندسيا وإرشادا مكانيا للكرويدات، مما يعزز تكوين الأنسجة المتحكم بها من خلال الاندماج في تراكيب أكبر ومحددة هيكليا. يهدف هذا النهج إلى تحسين التحكم المكاني وقابلية التكرار الهيكلي أثناء التجميع الحيوي للكروي من خلال دمج التنظيم الموجه بالسقالات مع اندماج الكروي ضمن بنية هيدروجيل محددة. ومع ذلك، يركز سير العمل الحالي على توحيد العمليات ومعايير التصنيع الحيوي الهيكلي ولا يتناول نضج الأنسجة طويل الأمد، أو التمايز الوظيفي، أو الإنتاج الآلي واسع النطاق.

التوحيد البيولوجي ضروري ليس فقط لضمان قابلية التكرار والتوسع، بل أيضا للحفاظ على السلامة الوظيفية للأنسجة المصنوعة حيويا19,20. وبالتالي، فإن التحكم الدقيق في المعايير الهندسية والهيكلية أمر بالغ الأهمية، حيث تؤثر هذه العوامل مباشرة على الأداء البيولوجي، بما في ذلك وظيفة الأنسجة ونضجالأنسجة 5,21. يتم تقديم سير عمل للتصنيع الحيوي الموحد والقابل للتكرار، يشمل الخطوات الرئيسية التالية: (1) زراعة أحادية الطبقة من ASC؛ (2) تكوين الكروي ASC؛ (3) الطباعة ثلاثية الأبعاد لسقالة GelMA؛ و(4) التجميع الحيوي للكرويدات (الشكل 1). ضمن هذا السير العملي، تم وضع مقاييس مراقبة جودة موضوعية، بما في ذلك توحيد الكروي والكروية، ودقة الطباعة، وسلامة شكل السقالات.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المواد المستخدمة والمواد المستخدمة مدرجة في جدول المواد.

1. تحضير قوالب الأغاروز الدقيقة وتصنيع السقالات المطبوعة ثلاثية الأبعاد من GelMA

  1. إنتاج مولد الأغاروز الدقيقي بنسبة 2٪ في محلول كلوريد الصوديوم (NaCl) بنسبة 0.9٪ (انظر الشكل 2A)
    ملاحظة: يجب التعامل مع جميع النفايات الكيميائية والتخلص منها وفقا للوائح السلامة الكيميائية المؤسسية وإرشادات النفايات الخطرة.
    1. حضر محلول NaCl بنسبة 0.9٪ في ماء فائق النقاء واستخدم المعقم لمدة 30 دقيقة عند درجة حرارة 121 درجة مئوية. حافظ عليه تحت ظروف معقمة حتى الاستخدام.
    2. قم بتخفيف 1 جرام من الأجاروز فائق النقاء المعقم في محلول 50 مل من محلول NaCl بنسبة 0.9٪. قم بتجانس وإزالة البلمرة من الأغاروز في ميكروويف بفواصل زمنية 10 ثوان لمدة 3–5 دورات، حتى يذوب بالكامل.
    3. في خزانة أمان بيولوجية، ضع قالب سيليكون متوفر تجاريا يحتوي على 81 تجويف دائري على شاش معقم.
    4. ضع 600 ميكرولتر من الأغاروز بعناية في مركز قالب السيليكون ودعه يستريح لمدة 40 دقيقة لضمان البلمرة الكاملة.
    5. قم بإزالة القالب الدقيق للأجاروز المبلمرة بالكامل وانقله إلى بئر من صفيحة ميكروتيتر ب 12 بئر.
    6. ضبط موقع القالب الدقيق للأجاروز وتثبيته في قاع البئر عن طريق ملئه ب 600 ميكرولتر من الأغاروز.
    7. قم بحضانة القالب الصغير مسبقا عن طريق الحضانة باستخدام مولد إيجل المتوسط منخفض الجلوكوز من دولبيكو (DMEM، 2 مل/بئر) لمدة 15 دقيقة. كرر هذا الإجراء مرتين، وفي الحضانة الثالثة، استبدل بوسط الزراعة ثلاثي الأبعاد (ثلاثي الأبعاد)، المكون من DMEM مع حمض الأسكوربيك (50 ميكروغرام/مل)، ألبومين المصل البشري (1.25 ميكروغرام/مل)، البنسلين-ستربتوميسين (PS، 1×، من محلول مخزوني 100×)، ومكمل ITS (1×، من محلول مخزوني 100×).
      ملاحظة: يختلف وسط الزراعة ثلاثية الأبعاد عن وسط توسع الطبقة الأحادية بغياب مصل البقر الجنيني (FBS) ووجود مكملات محددة تعزز التفاعل بين الخلايا والدعم للمصفوفة خارج الخلية، مما يفضل التجميع الذاتي الصحيح للكروي واستقراره. إذا تم إنتاج العفن وطلاء الخلايا في أيام مختلفة، يمكن إيقاف الإجراء بعد الحضانة الثانية من DMEM، ويجب تخزين العفن في ظروف معقمة في حاضنة رطبة عند 37 درجة مئوية لمدة تصل إلى 5 أيام. يجب إجراء الحضانة الثالثة باستخدام وسط زراعة ثلاثي الأبعاد فقط في يوم التقديم. قبل زرع الخلايا، قم بإزالة الوسط بالكامل من البئر والعفن الدقيق.
  2. تحضير هيدروجيل الجيلاتين ميثاكريلويل (GelMA)
    ملاحظة: يجب إجراء العملية بالكامل في الظلام، لأن المواد الحساسة للضوء. في هذه الدراسة، تم استخدام GelMA (قوة الجل 300 جرام بلوم، درجة الاستبدال 60٪) والمبادر الضوئي ليثيوم فينيل-2,4,6-تريميثيل بينزويل فوسفينات (LAP). لتحضير 10 مل من محلول GelMA بنسبة 10٪ مع طاقة وفولت يحتوي على 0.5٪ مع LAP:
    1. قم بإذابة 50 ملغ من مسحوق LAP في 1 مل من DMEM، وامزجه بلطف مع الماصة حتى يتم الحصول على محلول شفاف ومتجانس.
    2. انقل محلول LAP إلى أنبوب طرد مركزي يحتوي على 9 مل من DMEM وامزجه جيدا.
    3. في خزانة الأمان البيولوجي، قم بتعقيم المحلول الناتج عن طريق الترشيح عبر فلتر بحجم 0.22 ميكرومتر.
    4. أضف 1 جرام من GelMA إلى المحلول وقم بالتجانس باستخدام التحريك المغناطيسي عند 50 درجة مئوية لمدة تقارب 3 ساعات، أو حتى يتم الحصول على محلول شفاف ومتجانس. ارفع القارورة أمام الضوء لضمان خلو المحلول من الجزيئات المرئية والعكارة.
    5. تحميل الهيدروجيل الناتج في حقنة بسعة 10 مل للطباعة لاحقا أو، إذا لم يستخدم فورا، خزنها عند 2–8 درجات مئوية، محمية من الضوء، حتى الاستخدام.
      ملاحظة: تم استخدام محاليل GelMA وLAP بعد حوالي 24 ساعة من التحضير. لا ينصح بتخزين هذا المحلول لفترة طويلة. يجب تخزين كل من مسطحات GelMA وLAP عند 2–8 درجات مئوية، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. يصنف مبادر الفوتونيشيا LAP كغير خطير وفقا لمعايير مثل ABNT NBR 14725 واللائحة (EC) رقم 1272/2008. ومع ذلك، توصي الشركة المصنعة باستخدام معدات الحماية الشخصية لمنع تهيج الجهاز التنفسي والجلد والعين. يوصى باستخدام نظارات السلامة التي تم اختبارها واعتمادها وفقا للمعايير الحكومية ذات الصلة، مثل NIOSH (المعهد الوطني للسلامة والصحة المهنية - الولايات المتحدة) أو EN 166 (الاتحاد الأوروبي)، بالإضافة إلى قفازات مطاطية من النيتريل بسماكة لا تقل عن 0.11 مم. الحماية التنفسية مطلوبة فقط عند توليد الغبار. تستند توصيات الشركة المصنعة بشأن حماية الجهاز التنفسي باستخدام الفلتر إلى معايير مثل DIN EN 143 وDIN EN 14387 ومعايير تكميلية أخرى تتعلق بنظام الحماية التنفسية المستخدم. توصي الشركة المصنعة باستخدام فلتر من نوع P1.
  3. تصميم النماذج ثلاثية الأبعاد، والتقطيع، وتوليد ملف G-code
    ملاحظة: تم تصميم نموذج السقالة ثلاثية الأبعاد باستخدام برنامج التصميم ثلاثي الأبعاد بمساعدة الحاسوب (CAD) عبر الإنترنت يدعى Tinkercad. لهذا البروتوكول، تم إنشاء سقالة أسطوانية بقطر 15 مم، وسماكة قاع 1 مم، ومسامين دائريين، كل منهما بقطر 5.50 مم وعمق 2 مم.
    1. بمجرد اكتمال تصميم النموذج ثلاثي الأبعاد، يتم تصديره كملف *.stl (الملف الإضافي 1).
    2. افتح برنامج Repetier-Host V2.3.2، الذي سيستخدم لتقطيع النموذج المصمم.
    3. في تبويب "المقطع"، اختر خيار التقطيع المطلوب. في هذه الدراسة، تم استخدام محرك CuraEngine .
    4. قم بتكوين ملف المعلمات المناسب. في هذا العمل، السرعة 10 مم/ث؛ ارتفاع الطبقة 0.2 مم؛ نمط الحشو: شبكة؛ تم استخدام قطر الفوهة 0.41 مم.
    5. قم بتحميل ملف *.stl الخاص بالنموذج ثلاثي الأبعاد ليتم طباعته.
    6. في تبويب "Slicer"، اختر التكوين الذي تم إنشاؤه سابقا.
    7. انقر على "Slice with CuraEngine". سيتم بعد ذلك عرض النموذج ثلاثي الأبعاد المقطع في واجهة البرمجيات.
    8. انقر على "حفظ في الملف" لحفظ ملف G-code في الموقع المطلوب.
  4. الطباعة ثلاثية الأبعاد لسقالات الهيدروجيل الجيلاتين ميثاكريلويل (GelMA) للتجميع الحيوي للكرويدات
    ملاحظة: يجب إجراء الطباعة ثلاثية الأبعاد في ظروف معقمة. لذلك، قبل بدء عملية الطباعة، تأكد من أن خزانة السلامة البيولوجية التي تحتوي على الطابعة مفعلة وأن تدفق الهواء يعمل بشكل صحيح. تأكد من أن ارتفاع زجاج حماية الخزانة بنفس ارتفاع علامة حساس المعدات.
    1. قم بإزالة أقفال الأمان من الطابعة الحيوية.
    2. قم بإزالة اللوحة الزجاجية من سرير الطباعة عن طريق تحرير المشابك المعدنية.
    3. قم بتثبيت دليل أكريليك الشكل المناسب لدعم تثبيت لوحة الزراعة على منصة الطباعة، باستخدام المشابك المعدنية.
    4. وصل الطابعة بمصدر الطاقة. لاحظ أن هذا الجهاز يدعم جهدا مزدوجا (110/220 فولت).
    5. وصل كابل USB الخاص بالطابعة بالكمبيوتر.
    6. اضغط زر التشغيل/الإيقاف لتشغيل الطابعة.
    7. Open Repetier-Host برمجيات V2.3.2، والتي ستستخدم لعرض النموذج ثلاثي الأبعاد والطباعة.
    8. انقر على خيار "الاتصال" في واجهة البرنامج.
    9. باستخدام التحكم اليدوي البرمجي، اختر البثق (1 أو 2) وأرسل رأس الطباعة إلى الموقع الرئيسي (X = 0، Y = 0، Z = 0).
    10. ضبط البثق المختار لتركيب الحقنة بشكل صحيح باستخدام أداة التحكم اليدوي المناسبة في Repetier.
    11. أدخل الحقنة بعناية في البثق، وهو محمل بالفعل بالهيدروجيل ومثبت على فوهة بثق (في هذه الدراسة، استخدمنا فوهة بولي بروبيلين مخروطية بقطر داخلي 0.41 مم).
    12. ضع لوحة الزراعة في دليل الأكريليك المثبت على سرير الطباعة.
    13. ضبط موضع Z Home (Z = 0) باستخدام برغي Z endstop الموجود على الجانب الأيسر من الطابعة الحيوية. أي تحديد المسافة المطلوبة بين فوهة البثق وسطح الطباعة. من الناحية المثالية، يجب أن تلمس الفوهة الركيزة بخفة، والتي كانت في هذه الدراسة هي صفيحة الزرعة.
    14. أعد رأس الطباعة إلى موضع الهومين.
    15. قم بتحميل ملف G-code الذي تم إنشاؤه سابقا.
    16. باستخدام أداة التحكم اليدوية المناسبة في البرنامج، قم بإخراج بعض الهيدروجيل من الحقنة لضمان تدفق المادة عبر الفوهة.
    17. ابدأ عملية الطباعة.
    18. بعد الطباعة، قم بإجراء الربط الضوئي المتقاطع للسقالة الناتجة باستخدام نظام الأشعة فوق البنفسجية في طابعة البيوبرينتر ثلاثية الأبعاد، المزود بمصباحين LED على ارتفاع 395-400 نانومتر. عرض السقالة لأشعة فوق البنفسجية لمدة 5 دقائق (شدة الضوء 20 مللي واط/سم 2).
    19. استخدم نفس محلول الأجاروز 2٪ المنزوع البلمرة المستخدم في تصنيع القوالب الدقيقة لتثبيت السقالات المطبوعة ثلاثية الأبعاد على آبار صفيحة زراعة مكونة من 12 بئرا. تثبيت السقالات في قاع الآبار ضروري لتوفير استقرار أكبر ولمنع الإزاحة أثناء الزراعة الكروية وخلال فترة الزراعة.
      ملاحظة: عند تنفيذ الخطوة 4.16، تحقق مما إذا كان الهيدروجيل يشكل خيطا مستمرا أثناء البثق. عادة، يتم تحميل محلول الجيلاتين في الحقنة وهو لا يزال في الحالة السائلة (حوالي 37 درجة مئوية). خلال دقائق قليلة عند درجة حرارة الغرفة (22–25 درجة مئوية)، تبدأ هذه المادة الحيوية في الانتقال إلى قوام يشبه الهلام. يجب ألا يتساقط الخام أثناء البثق، لأن ذلك سيؤثر سلبا على جودة الطباعة. تشير التكون المستمر للخيوط أثناء البثق إلى أن الهيدروجيل قد وصل إلى قوام مثالي للطباعة. محلول GelMA وLAP المخفف في DMEM يظهر لونا برتقاليا قليلا. بعد الربط الضوئي الناتج عن الأشعة فوق البنفسجية، يلاحظ تغير اللون بشكل شائع، حيث تصبح المادة بيضاء أو شفافة، كما هو موضح في الشكل 3D,E. عند تشغيل نظام الأشعة فوق البنفسجية، فإن نظارات السلامة ضرورية لضمان حماية كافية للعين ضد الأشعة فوق البنفسجية.
  5. تحليل دقة الطباعة
    ملاحظة: تحليل دقة الطباعة ثلاثية الأبعاد لسقالات GelMA يأخذ في الاعتبار المعايير التالية: قطر السقالة، قطر المسام، وسماكة السقالات. تم استخدام برنامج ImageJ الإصدار 1.54 لإجراء القياسات.
    1. أولا، التقط صورا للسقالات التي يشاهدها المجهر المجسم. استخدم مسطرة أو كايبر كمرجع.
    2. قبل تحليل الصور، قم بمعايرة وضبط المقياس في ImageJ لإجراء القياسات.
    3. استخدم أداة الخط المستقيم لإجراء القياسات.
    4. نظرا لأن أشكال السقالة والمسام دائرية، استخدم المتوسط الحسابي للسقالة وأقطار المسامات للتحليل الإحصائي.
    5. لتحليل دقة الطباعة، قارن القياسات التي حصل عليها ImageJ من السقالات المطبوعة مع القيم المحددة في النموذج ثلاثي الأبعاد الذي يولده Tinkercad.
      ملاحظة: يتم مقارنة سمك السقالة المطبوعة المقاس بمجموع عمق المسام وقيم سمك القاع المعروضة في تينكركاد.
    6. قم بإجراء تحليل إحصائي للبيانات المكتسبة. في هذه الحالة، لمقارنة قيم السقالة المقاسة مع القيم المتوقعة، يمكن استخدام اختبار مان-ويتني U (غير معلمي). يستخدم اختبار شابيرو-ويلك لتقييم الطبيعية. تعتبر الفروق ذات دلالة إحصائية عندما يكون p < 0.05.

2. تحضير الهيدروك الهوائية وتكوين الكرويدات

ملاحظة: تم زراعة الخلايا الجذعية الميزنكيمية المشتقة من الدهون (hADSCs) المتوفرة تجاريا في وسط نمو خاص بالخلايا وتم تمريرها عند التقاء بنسبة 80٪–90٪ وفقا لتوصيات الشركة المصنعة. تم استخدام الخلايا حتى الفقرة 7 لهذا البروتوكول. يجب أن يتم تطهير أو تعقيم جميع النفايات البيولوجية بشكل صحيح قبل التخلص منها والتعامل معها وفقا لإرشادات السلامة البيولوجية المؤسسية. لرؤية الكونفوكال لاحقا، يجب وسم الطبقة الأحادية بصبغة فلورية قبل تكوين الكرويدات وحضانها كما توصي الشركة المصنعة. يمكن بدء تكوين الكروي بعد 30 دقيقة من وضع العلامات.

  1. تريبسينية طبقة أحادية ASC
    1. في خزانة السلامة البيولوجية، افتح قارورة الزراعة وانقل محتوياتها إلى حاوية نفايات.
    2. اغسل الطبقة الأحادية مرتين بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) × وتخلص من المحلول.
    3. أضف 0.125٪ محلول تريبسين/EDTA يكفي لتغطية الطبقة الأحادية. أغلق القارورة وحضن في حاضنة رطبة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة تصل إلى 5 دقائق.
    4. قم بتعطيل التربسين/EDTA بإضافة كمية متساوية من DMEM مع 10٪ مصل البقري الجيني (FBS).
    5. اجمع تعليق الخلية باستخدام ماصة مصلية أو انقله إلى أنابيب الطرد المركزي. الطرد المركزي عند 400 × جرام لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (20–25 درجة مئوية).
    6. تخلص من السوبرناتانت بعناية.
    7. أعد تعليق حبيبات الخلية في DMEM وقم بالتجانس. خذ أليكوت لتقييم عد الخلايا وإمكانية البقاء.
  2. ثقافة الكروية (انظر الشكل 2B)
    1. افصل العدد المناسب من الخلايا التي سيتم تغطيتها لكل قالب في أنبوب طرد مركزي بسعة 15 مل. بالنسبة لعفن hADSCs، يجب أن يحصل كل قالب أغاروز يحتوي على 81 تجويف على 1 × 106 خلايا—يتكون كروي واحد في كل بئر دقيق، وينتج 81 كرويا لكل ميكرومولد.
    2. أضف 1× PBS وجهاز طرد مركزي بدرجة حرارة 500 × جرام لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. تخلص من السوبرناتانت وأضف 1× PBS. كرر هذه الخطوة مرتين.
    3. بعد الطرد المركزي الثالث، تخلص بعناية من المادة الفوقية وجفف فتحة الأنبوب بشاش معقم قبل إعادته إلى وضعه الرأسي.
    4. أعد تعليق حبيبات الخلية في 120 ميكرولتر من وسط زراعة ثلاثي الأبعاد لزراعة الكروية ثم التجانس. اضبط حجم التعليق إلى 200 ميكرولتر مع إضافة وسط زراعة ثلاثي الأبعاد إذا لزم الأمر.
      ملاحظة: كل قالب يحتوي على 81 عملية استئصال له سعة 200 ميكرولتر.
    5. استنشق 200 ميكرولتر وطبقها في وسط القالب بعناية، لتجنب تكون الفقاعات.
      ملاحظة: يمكن أتمتة هذه الخطوة باستخدام نظام توصيل روبوتي، كما تم وصفه سابقا22.
    6. اترك اللوحة في خزانة السلامة البيولوجية لمدة 5 دقائق للسماح للخلايا بالاستقرار في عمليات الاستئصال.
    7. ضع الطبق في حاضنة رطبة لمدة 40 دقيقة.
    8. بعد هذه الفترة، أضف بعناية 2 مل من المتوسط ثلاثي الأبعاد إلى كل بئر. أعد اللوح إلى الحاضنة المرطبة عند 37 درجة مئوية.
  3. قياس الكرويدات والتحليل الإحصائي
    1. التقط صورا للكرويدات الموضوعة على طول القطريين لقالب الأغاروز الدقيق، مكونة نمط "X"، باستخدام مجهر بصري مقلوب مزود بكاميرا رقمية وهدف بحجم 10×. استخدم شريط مقياس 100 ميكرومتر لمعايرة مقياس الصورة قبل قياس الأقطار.
    2. لتحديد الأقطار الرئيسية والصغرى للكرويدات، استخدم أداة "الخط" في البرنامج وقم بإجراء قياسين عموديين لكل كروي مصور، مع زاوية تقريبية تبلغ 90° بينهما.
    3. احسب متوسط قطر كل كروي كمتوسط حسابي للقطرين العموديين المقاسين سابقا. احسب الكروية كنسبة الأكبر إلى أصغر قطر لكل كرويد، مع القيم الأقرب إلى 1 تشير إلى تجانس أكبر وشكل كروي أكثر.
    4. إجراء تحليلات إحصائية باستخدام القيم التي تم الحصول عليها من القطر والكروية.

3. زرع الكرويدات على سقالات GelMA لاندماج الكرويدات وتجميع الكرويدات البيولوجية

  1. بعد 24 ساعة من تكوين الكروي، اجمعها من قوالب الأغاروز الصغيرة باستخدام ماصة ذات رؤوس عريضة ونقلها إلى أنابيب دقيقة بحجم 2 مل.
  2. عندما تستقر الكرويدات في قاع الأنابيب الدقيقة، تخلص من السوبرناتانت.
  3. أعد تعليق الكرويدات في 50 ميكرولتر من المتوسط ثلاثي الأبعاد.
  4. باستخدام ماصة ذات أطراف عريضة التجويف، اجمع الكرويدات وغرسها بلطف في مسام سقالة GelMA.
    ملاحظة: في مسام دعم GelMA بقطر حوالي 5.50 مم وعمقها 2 مم، تزرع حوالي 480 إلى 640 كرويا (تتوافق مع 6–8 قوالب أجاروز دقيقة، كل منها يولد 81 كرويا بأقطار تتراوح بين 200 إلى 400 ميكرومتر) في 50 ميكرولتر. استند هذا التقدير إلى حجم المسام ومتوسط قطر الكرويد، حيث تم القياس بواسطة عدد القوالب الدقيقة الكاملة المنقولة بدلا من العد الكروي الفردي، مما يضمن تقديرا عمليا وقابلا للتكرار لكثافة الكروي داخل المسام.
  5. بعد ترسيب الكرويدات في مسام دعم GelMA، انتظر 20–40 دقيقة للسماح للكرويدات بالاستقرار. أضف 1 مل من الوسط ثلاثي الأبعاد إلى كل بئر.
  6. بعد 24 ساعة، أضف 1 مل من الوسط ثلاثي الأبعاد إلى كل بئر.
  7. مراقبة اندماج الكرويدات داخل مسام سقالات GelMA باستخدام المجهر التباين الطوري والمجهر المجسم. التقط الصور كل 24 ساعة، من اليوم 0 (مباشرة بعد التلقيح) إلى اليوم الثالث (72 ساعة).
  8. تثبيت التركيب البيولوجي في بارافورمالديهيد بنسبة 4٪ بعد 72 ساعة للرؤية بالمجهر الكونفوكلي. تعامل مع البارافورمالديهايد في غطاء بخار كيميائي معتمد باستخدام معدات الحماية الشخصية المناسبة (معطف المختبر، القفازات، وحماية العين) بسبب خصائصه السامة والمهيجة، والتخلص من النفايات وفقا لإرشادات السلامة الكيميائية المؤسسية. لمراقبة الكونفوكات، يجب وضع وسم مسبقا للخلايا في الطبقة الأحادية بصبغة فلورية قبل تكوين الكروي.
    ملاحظة: إذا كان من الضروري إزالة التركيب من مسام GelMA للتحليل أو التطبيق الحي ، استرجعه بعناية باستخدام ملقط دقيق أو ثقب خزعة بالحجم المناسب.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الخلايا الجذعية المشتقة من الدهون البشرية (hASCs) التي زرعت في طبقة أحادية (الشكل 2C) تم تحفيزها بنجاح لتكوين كرويدات خلال 24 ساعة من البذر في قوالب أغاروز الصغيرة (الشكل 2D). أظهرت الكرويدات الناتجة شكلا مضغوطا ومحددا جيدا. كشف التحليل المورفومتري عن متوسط قطر 239.8 ميكرومتر ± 87.0 ميكرومتر عند 24 ساعة (الشكل 2E) وقيمة كروية قريبة من 1 (0.947 ± 0.123) (الشكل 2F)، مما ي...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تسلط النتائج المعروضة في هذه الدراسة الضوء على الدمج الناجح لمقاييس مراقبة الجودة في سير عمل موحد للتصنيع الحيوي لضمان قابلية التكرار. يوفر استخدام السقالات المطبوعة ثلاثية الأبعاد المستندة إلى تصاميم محددة مسبقا دعما هيكليا للتجميع الحيوي للكروي19,23. كإثبات للمفهوم، تم تصميم سقالة صلبة ذات منطقتين مركزيتين مساميتين، تم تعديلها لدعم تحميل كروي عالي الكثافة وتجميع بيولوجي موجه.

كنقطة تفتيش أولى لمراقبة...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المؤلفون لا يذكرون أي تضارب مصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

BioRender.com (https://BioRender.com/x1lxn0y) للرسومات في الأشكال.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
1x Phosphate-Buffered Saline (PBS)Prepared in the laboratory-
593iCAN 3D Bioprinter, Model 593 iCan2X Printhead593iCAN--
AgaroseSigma-Aldrich16500-500-
Ascorbic Acid Sigma-Aldrich A4544-100MG-
Carl Zeiss Microscopy GmbH Primovert Zeiss-415510-1101-000
Celldiscover Zeiss-LSM 900 with Airyscan 2
CelltrackerInvitrogen C7025-
CentrifugeEppendorf -5702
Class II Biological Safety CabinetStreamline-Model SC2-4E3
CO2 incubator for cell cultureThermo Fisher Scientific-Series 8000 WJ 
Conical polypropylene nozzle 0.41 mm593iCAN--
Dulbecco’s Modified Eagle Medium Low Glucose Sigma-Aldrich D2902-10L-
EDTASigma-Aldrich E9884-
Fetal Bovine Serum (FBS)Gibco 12657-029-
Gelatin methacryloyl gel strength 300 g Bloom, degree of substitution 60%Sigma-Aldrich900622Lot/Batch number: MKCS2673. Documentation for each batch, including the Safety Data Sheet (SDS) and the Certificate of Analysis (CoA), can be obtained from the manufacturer’s website.
GraphPad Prism 6.0 softwareGraphPad Inc--
Hot plate magnetic stirrerIKAZ671797Model C-MAG HS7
Human serum albumin 100 mg/mlFUJIFILM Irvine Scientific9988-
ITS (Insulin-transferrin-sodium selenite) supplement 100x Sigma-AldrichI3146-5ML-
Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP)Sigma-Aldrich900889
Luxoeo 4Z Stereozoom Microscope Labomed--
MicroTissues® 3D Petri Dish® micro-mold spheroidsSigma-AldrichZ764019-
Penicillin-streptomycin 100xSigma-Aldrich15140122-
Poietics™ human adipose derived stem cells (ADSC)Lonza PT-5006
Sodium Chloride (NaCl)Sigma-Aldrich71382-500G-
Trypsin/EDTAGibco 27250018-

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Spagnuolo, F. D., Kronemberger, G. S., Storey, K. J., Kelly, D. J. The maturation state and density of human cartilage microtissues influence their fusion and development into scaled-up grafts. Acta Biomater. 194, 109-121 (2025).
  2. Baptista, L. S., et al. Bioprinting using organ building blocks spheroids organoids and assembloids. Tissue Eng Part A. 30 (13–14), 377-386 (2024).
  3. Shojaei Barjuei, E., et al. Precision improvement of robotic bioprinting via vision-based tool path compensation. Sci Rep. 14 (1), 17764 (2024).
  4. Li, H., Zhou, H., Xu, C., Wei, Y., Tang, X. 3D bioprinting and scaffold-free strategies for fabrication of multicellular tissues or organoids. Int J Bioprinting. 9 (1), 135 (2023).
  5. Mironov, V. R., et al. Organ printing tissue spheroids as building blocks. Biomaterials. 30 (11), 2164-2174 (2009).
  6. Côrtes, I., et al. Mimicking lipolytic adipogenic and secretory capacities of human subcutaneous adipose tissue using spheroids. Front Cell Dev Biol. 11, 1219218 (2023).
  7. Shi, Y., et al. Advances in culture of adipose-derived stromal stem cells. Front Endocrinol (Lausanne). 15, 1343255 (2024).
  8. Suchanecka, M., et al. Adipose-derived stem cells in regenerative medicine. Biomed Pharmacother. 186, 118036 (2025).
  9. Kim, E. M., et al. Fabrication of core shell spheroids for engineering vascularized tissues. Acta Biomater. 100, 158-172 (2019).
  10. Kronemberger, G. S., et al. Hypertrophic cartilage induction influences building block capacity of ASC spheroids. Artif Organs. 45 (11), 1208-1218 (2021).
  11. Caprio, N. D., Burdick, J. A. Engineered biomaterials guiding spheroid formation and function. Acta Biomater. 165, 4-18 (2023).
  12. Kopinski-Grünwald, O., et al. Scaffolded spheroids for cartilage tissue engineering. Acta Biomater. 174, 163-176 (2024).
  13. Mekhileri, N. V., et al. Automated 3D bioassembly of microtissues. Biofabrication. 10 (2), 024103 (2018).
  14. Groll, J., et al. Biofabrication reappraising the definition. Biofabrication. 8 (1), 013001 (2016).
  15. Jakab, K., et al. Tissue engineering by self-assembly of cells. Tissue Eng Part A. 14 (3), 413-421 (2008).
  16. Murphy, S. V., Atala, A. 3D bioprinting of tissues and organs. Nat Biotechnol. 32 (8), 773-785 (2014).
  17. Ozbolat, I. T., Hospodiuk, M. Advances in extrusion-based bioprinting. Biomaterials. 76, 321-343 (2016).
  18. Zhuang, P., Chiang, Y. H., Fernanda, M. S., He, M. Spheroids as building blocks in tumor microenvironment models. Int J Bioprinting. 7 (3), 444 (2021).
  19. Levato, R., et al. From shape to function in bioprinting. Adv Mater. 32 (12), 1906423 (2020).
  20. Moroni, L., et al. Biofabrication terminology and technology. Trends Biotechnol. 36 (4), 384-402 (2018).
  21. Sun, W., et al. The 2022 biofabrication roadmap. Biofabrication. 15 (1), 012001 (2023).
  22. Kronemberger, G. S., et al. Automated production of ASC spheroids for bioprinting. J Vis Exp. (181), e63430 (2022).
  23. Daly, A. C., Prendergast, M. E., Hughes, A. J., Burdick, J. A. Bioprinting for the biologist. Cell. 184 (1), 18-32 (2021).
  24. Arguchinskaya, N. V., et al. Properties and printability of GelMA hydrogels. Int J Mol Sci. 24 (3), 2121 (2023).
  25. Compaired, P. M., García-Gareta, E., Pérez, M. &. #. 1. 9. 3. ;. Workflow for bioprinting optimization. Int J Bioprinting. 11 (3), 397-415 (2025).
  26. Gaglio, C. G., et al. GelMA synthesis and comparison for bioprinting. Front Bioeng Biotechnol. 12, 1383010 (2024).
  27. Gillespie, G. J., et al. Influence of printing parameters and cell density on bioink outcomes. Tissue Eng Part A. 26 (23–24), 1349-1358 (2020).
  28. Maggiotto, F., et al. Perfusable vascularized cancer niche via 3D bioprinting. Front Bioeng Biotechnol. 13, 1484738 (2025).
  29. Shie, M. Y., et al. Effects of GelMA concentration on properties and fibroblast behavior. Polymers (Basel). 12 (9), 1930 (2020).
  30. Chimene, D., Lennox, K. K., Kaunas, R. R., Gaharwar, A. K. Advanced bioinks for 3D printing. Adv Mater. 32 (12), 1902026 (2020).
  31. Pepelanova, I., Kruppa, K., Scheper, T., Lavrentieva, A. GelMA hydrogels for tissue engineering. Polymers (Basel). 10 (11), 1134 (2018).
  32. Heinrich, M. A., et al. 3D bioprinting from bench to translation. Adv Mater. 31 (23), 1805510 (2019).
  33. Kronemberger, G. S., Chattahy, K., Spagnuolo, F. D., Karam, A. S., Kelly, D. J. Bioassembly of fibrocartilage microtissues for meniscal grafts. Adv Healthcare Mater. 14 (32), e02208 (2025).
  34. Matai, I., Kaur, G., Seyedsalehi, A., McClinton, A., Laurencin, C. T. Progress in 3D bioprinting for regenerative engineering. Biomaterials. 226, 119536 (2020).
  35. Decarli, M. C., et al. Bioprinting stem cell spheroids for cartilage engineering. Adv Healthcare Mater. 12 (7), 2203021 (2023).
  36. Zhang, Z., Liu, Y., Tao, X., Du, P., Enkhbat, M., et al. Engineering cell microenvironments with spheroids and hydrogels. Polymers (Basel). 15 (9), 1925 (2023).
  37. Zuliani, C. C., da Cunha, J. B., Correa, R. F., Pinto, J. u. n. i. o. r. . E. A., d’Ávila, M. A., et al. Injectable hydrogel for delivery of MSC spheroids in cartilage regeneration. Artif Cells Nanomed Biotechnol. 53 (1), 453-467 (2025).
  38. Unagolla, J. M., Jayasuriya, A. C. Hydrogel-based 3D bioprinting review. Appl Mater Today. 17, 100479 (2019).
  39. Kim, M. H., Singh, Y. P., Celik, N., Yeo, M., Rizk, E., et al. High-throughput bioprinting of spheroids. Nat Commun. 15 (1), 10083 (2024).
  40. Daly, A. C., Davidson, M. D., Burdick, J. A. Spheroid fusion within self-healing hydrogels. Nat Commun. 12 (1), 753 (2021).
  41. Prabhakaran, V., Melchels, F. P. W., Murray, L. M., Paxton, J. Z. Engineering bone tissues via spheroid fusion. Front Endocrinol (Lausanne). 14, 1308604 (2023).
  42. Gabriella, , et al. Probing multicellular tissue fusion of cocultured spheroids. Adv Sci (Weinh). 8 (21), e2103320 (2021).
  43. Kim, S., Kim, E. M., Yamamoto, M., Park, H., Shin, H. Engineering multicellular spheroids. Adv Healthcare Mater. 9 (12), 2000608 (2020).
  44. Zhang, J., Yun, S., Du, Y., Zannettino, A., Zhang, H. Hydrogel-based preparation of cell aggregates. Appl Mater Today. 20, 100747 (2020).
  45. Khajehmohammadi, M., Azizi Tafti, R., Nikukar, H. Effect of porosity on bioprinted scaffolds. J Biomed Mater Res A. 111 (2), 245-260 (2023).
  46. Kim, M., et al. Enhanced nutrient transport in engineered cartilage constructs. Acta Biomater. 58, 1-11 (2017).
  47. Chariyev-Prinz, F., et al. MSC response to hydrostatic pressure in chondrogenesis supportive environments. J Biomech. 154, 111590 (2023).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Human Adipose Stem CellsBiofabrication WorkflowTissue EngineeringSpheroid FormationGelMA Scaffold3D PrintingSpheroid BioassemblyScaffold DesignRegenerative Medicine

مقالات ذات صلة