يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

المجهر الفريد لتحديد الجزيء الواحد لبروتينات الغشاء باستخدام وسم الجسم المضاد الواحد

1.2K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/69853

⸱

مارس 20, 2026

 ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry, University of Illinois Chicago, 2University of Illinois Cancer Center, 3Department of Biomedical Engineering, University of Illinois Chicago, 4Department of Biochemistry and Molecular Genetics, College of Medicine, University of Illinois Chicago

في هذه المقالة

ملخص

يصف هذا البروتوكول تصنيف الجسم المضاد الواحد (SAL) لحل التنظيم المكاني على نطاق نانوي لبروتينات الغشاء البلازما. من خلال الاستفادة من التفاعلات التراكمية بين الأجسام المضادة والحامضة على مستوى الجزيئات الفردية، يقوم SAL الغشائي (mSAL) برسم توزيعات الملحمة المحلية مع التقاط سلوك ارتباط الأجسام المضادة في البيئة الخلوية الأصلية.

الملخص

يحدد الغشاء البلازمي شكل الخلية ويعمل كواجهة تحكم التواصل بين الخلايا. تشكل البروتينات الغشائية فئة رئيسية من الأهداف العلاجية؛ لذلك، فإن التحليل الفائق لغشية الخلية عبر بروتيناته المكونة يحمل وعدا كبيرا في تطوير بيولوجيا الخلية وعلاجات الأجسام المضادة. في هذا الصدد، يمكن مجهر تحديد الموقع للجزيء الواحد (SMLM) من التصور على نطاق نانوي لمنظمات البروتينات على البنى البيولوجية. على الرغم من أهميته، فإن تطبيق SMLM على بروتينات البلازما الغشية يطرح تحديات فريدة. في هذا البروتوكول، نقدم نهجا فعالا باستخدام تصنيف الأجسام المضادة المفردة (SAL) بالتايم لابس يسمى SAL الغشائي (mSAL). نقدم تعليمات مفصلة خطوة بخطوة، بما في ذلك تحسين تركيز الأجسام المضادة، وكثافة طاقة الليزر، ومدة الفترات غير الإضاءة، وإعادة بناء الصورة، وتحليل التعنود المعتمد على الكثافة، لتحديد توزيع البروتينات النانوية للغشاء وشكل الغشية. نستخدم بروتين التتراسبانين CD81 كنموذج لبروتين الغشاء لإثبات قدرة mSAL على كل من الخلايا الثديية الملتصقة والمعلقة. بالإضافة إلى التحليل الفائق لغشاء الخلية وتوزيعات بروتينات الغشاء، تمكن تقنيتنا من دراسة الديناميكا الدوائية للأجسام المضادة العلاجية التي تتفاعل مع أهدافها في بيئة الغشاء الأصلية.

المقدمة

يحتوي غشاء البلازما على مجموعة متنوعة من البروتينات التي تنظم حركة الخلايا، والالتصاق، والحساس، والتواصل بين الخلايا. فهم توزيع بروتينات غشاء البلازما على المستوى النانوي أمر مهم، حيث غالبا ما تتحكم وظيفة البروتين ليس فقط بمستويات التعبير بل أيضا بتنظيمها المكاني على الغشاء 1,2. ومن الجدير بالذكر أن العديد من الأجسام المضادة العلاجية تستهدف بروتينات الغشاء 3,4، مما يجعل التحقيقات على المستوى النانوي ضرورية لفهم كيفية تأثير تفاعلات الأجسام المضادة على منظمة البروتينات الغشائية المحلية. ومع ذلك، لا تزال الخريطة الدقيقة لتوزيع البروتينات الغشائية، وتحديد جزيء واحد لكمية البروتين، والمراقبة اللحظية لتفاعلاتها الديناميكية مع شركاء الارتباط تحديا.

تستخدم تقنيات المجهر التموضعي لجزيء واحد (SMLM) المستخدمة على نطاق واسع، مثل المجهر البصري العشوائي المباشر (dSTORM)5,6 وتراكم النقاط المعتمدة على DNA للتصوير في الطبوغرافيا النانوية (DNA-PAINT)7، التلوين بالفلورية المناعية (IF) لوضع العلامات على العينة. حققوا دقة جانبية ~ 10 نانومتر وقدموا رؤى واسعة حول تنظيم الأهداف العلاجية للغشاء على المستوى النانوي، بما في ذلك مستقبل عامل النمو البشري 2 (HER2)8,9، CD2010، مستقبلات الخلايا التائية 11,12,13، رابطة الموت المبرمجة 114، مستقبلات خلايا B 15,16,17، وCD1917.18. على سبيل المثال،كشفت دراسات STORM باستخدام الجسم المضاد العلاجي ودي النسيلة تراستوزوماب للكشف المباشر عن HER2، وهو مستقبل رئيسي مرتبط بسرطان الثدي، عن حالات تجمع مميزة بين مرضى HER2 الإيجابيين8، بينما أظهرت أجسام مضادة علاجية مختلفة أنها تعدل تجمع HER29. وقد أوضح DNA-PAINT مع مجهر صفائح الضوء الشبكية الحالات الأوليغوميرية وملفات التفاعل ل CD20 في خلايا B مع الأجسام المضادة وحيدة النسيلة العلاجية ريتوكسيماب، أوفاتوماب، وأوبينوتوزوماب10. على الرغم من أن SMLM التقليدي يوفر رؤى قيمة حول تنظيم النانو، إلا أن إمكاناته الكاملة محدودة بأساليب التلوين التقليدية بالتلوين المتساوي (IF). تعتمد جودة صورة SMLM على صبغة IF، والذي بدوره يتحكم فيه خصوصية وألفة الجسم المضاد المميز. يستخدم SMLM التقليدي أجساما مضادة عالية الألفة تحقق عادة تلوين متكامل وجودة صورة متفوقة. ومع ذلك، تتفاعل معظم الأجسام المضادة العلاجية مع مستقبلات الغشاء في الخلايا الحية ذات الألفة المتوسطة لتقليلالآثار الجانبية غير المستهدفة. على سبيل المثال، تظهر متفاعلات خلايا T ثنائية الأنواع (TCEs) ألفة أقل مع CD3، مما يمنع استيعاب TCR 20,21,22. لا يمكن التقاط مثل هذه التفاعلات بدقة باستخدام تقنيات IF التقليدية.

لقد طورنا سابقا استراتيجية تستفيد مباشرة من تفاعلات الأجسام المضادة الجزيئية الواحدة مع الحوامت، وتسمى وسم الأجسام المضادة المفردة (SAL). يمكن SAL رسم خرائط عالية الكثافة لتفاعلات الأجسام المضادة مع الحواظم مع الحفاظ على توازنات الارتباط الطبيعية23. بينما أبلغنا سابقا عن بروتوكول للبروتينات الهيكلية الخلوية والميتوكوندرية24، لم يتم إثبات SAL على بروتينات الغشاء. في هذا البروتوكول، نقدم سير عمل خطوة بخطوة لتطبيق SAL على بروتينات الغشاء، كما تم إثباته من خلال وسم تيتراسبان CD81، وهو مرشح علاجي تم الإبلاغ عنه كهدفعلاجي 25,26,27,28، في كل من الخلايا المعلقة واللبقة. باستخدام الأجسام المضادة المضادة ل CD81 الموسومة بالفلورية لفحص التوزيع المكاني ل CD81 على خلايا U2OS وJurkat T، نظهر تطبيق دراسات SAL النانوية على بروتينات الغشاء. أطلقنا على هذه الاستراتيجية اسم SAL الغشائي (mSAL). أخيرا، نصف استراتيجية قائمة على التجميع لتقليل اكتشافات الجزيئات الفردية المعزولة خارج الخلية.

في جوهرها، يستخدم SAL تصنيف جزيء واحد بتقنية التايم لابس لالتقاط تفاعلات الأجسام المضادة الفردية مع الحامت، وينتج فك الالالتفاف اللاحق بمحرك واحد صورة فائقة الدقة تعتمد على SMLM. من خلال ضبط تركيز الأجسام المضادة واختيار فترة غير مضيئة مناسبة (NII) بين إطارات الصور المتتالية، يطابق SAL معدل ظهور الأجسام المضادة مع معدل اكتشاف جزيء واحد، مما يمكن من تحديد موقع جزيء واحد. يتطلب SAL NII أطول بسبب بطء الحركة المرتبط للأجسام المضادة، مما يطيل مدة التقاط الصورة (~3-17 ساعة). SAL هو الأنسب للتطبيقات التي تتطلب رسم خرائط دقيقة على نطاق نانوي للحواتيم وتقييم ديناميكيات تفاعل الأجسام المضادة الفردية مع الحوامت. على الرغم من انخفاض إنتاجه، يقدم SAL رؤية فريدة حول تنظيم الحواتم وتفاعل الأجسام المضادة في ظروف شبه فسيولوجية، مما يجعله ذا قيمة خاصة في توصيف الأجسام المضادة العلاجية في الموقع.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

يستخدم هذا البروتوكول خطوط خلايا جوركات E6.1 وU2OS المعتمدة ولا يشمل مواد بشرية أو حيوانية حية أولية.

1. بذر/هبوط الخلايا وثبيتها

ملاحظة: يتم إعداد العينة وفقا لبروتوكولات التلوين القياسية للفلورة المناعية (IF)، والتي تم تحسينها للحفاظ على التنظيم تحت الخلوي لبروتينات غشاء البلازما عبر أنواع الخلايا المختلفة. إذا كان هناك بروتوكول تلوين مناعي معتمد للهدف المعني، يمكن للمستخدمين اتباع هذا البروتوكول حتى الخطوة 1.2.14 لحجب العينات. يعتمد تصنيف الجسم المضاد الواحد (SAL) على الكشف التراكمي عن الأجسام المضادة الموسومة بالفلورية أثناء ارتباطها بمستضدها على مستوى الجزيء الواحد. تضاف الأجسام المضادة الموسومة بالفلورية المخففة في مخزن تصوير إلى العينات على مرحلة المجهر، ويحدث وضع العلامات الفلورية ديناميكيا مع تقدم التقاط الصورة. لا يتم وضع علامات فلورية خلال مرحلة تحضير العينة.

  1. جهز الخلايا الملتصقة، مثل خط خلايا U2OS، كما هو موضح في بروتوكول24 المنشور سابقا.
  2. تعليق الخلايا
    1. الحفاظ على خلايا جوركات التائية بكثافة 1 × 10إلى 1 × 10و6 خلايا/مل في 10 مل من وسط RPMI كامل (RPMI 1640 مع 10٪ (v/v) مصل أبقار جنيني، 100 U/mL بنسلين، و100 ميكروغرام/مل ستريبتومايسين) عند 37 درجة مئوية في حاضنة رطبة مدعمة ب 5٪CO2.
      ملاحظة: ال 10 مل الموصى بها من الوسائط الكاملة تنطبق على قوارير T25؛ يجب على المستخدمين تعديل الحجم وفقا لذلك عند استخدام أوعية زراعة مختلفة.
    2. جهز سطح الزجاج بإضافة 200 ميكرولتر من محلول بولي-إل-ليسين (PLL) بنسبة 0.01٪ إلى الآبار المخصصة للاستخدام في زجاج تغطية ب8 آبار. الحضانة طوال الليل عند 4 درجات مئوية أو لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية.
    3. عد الخلايا من الزراعة باستخدام جهاز قياس الدم، ثم انقل 3.5 ×10 خلايا 4 إلى أنبوب طرد مركزي دقيق بسعة 1.5 مل.
      ملاحظة: قد يحتاج عدد الخلايا إلى تعديل لتحقيق توزيع جيد للخلايا الفردية. يحقق نطاق البذور من 30,000 إلى 60,000 خلية جوركات T كثافة مثالية حيث تكون الخلايا المفردة منفصلة بوضوح عن بعضها البعض دون أن تكون متفرقة جدا. قد يحتاج عدد الخلايا إلى تعديل لنوع خلية جديد.
    4. الطرد المركزي عند 300 × جرام لمدة 3 دقائق للحصول على حبيبة خلية. تخلص من المادة الفائقة وأعد تعليق الحبيبات الخلوية في 200 ميكرولتر من محلول الملح الفوسفاتي المخزن لدولبيكو (DPBS) المسخن مسبقا (37 درجة مئوية). ستكون الحبيبة الناتجة مرئية كترسب أبيض صغير في أسفل أنبوب الطرد المركزي الدقيق.
      ملاحظة: التخلص من النفايات البيولوجية الخطرة وفقا لإرشادات المؤسسة وجميع اللوائح المحلية والولائية والفيدرالية المعمول بها.
    5. استنشق محلول PLL من زجاج الغطاء المحضر (الخطوة 1.2.2). إذا حدثت حضانة PLL طوال الليل عند 4 درجات مئوية، قم بتسخين زجاج الغطاء ذو 8 غرف إلى 37 درجة مئوية قبل شفط المحلول.
    6. أضف تعليق الخلية من الخطوة 1.2.4. على الحجرة المغطاة ب PLL. حضن في حاضنة رطبة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية مع إضافة 5٪ ثاني أكسيد الكربونلمدة 30 دقيقة للسماح للخلايا بالالتصاق بالسطح. اخلط تعليق الخلية جيدا قبل الطلاء والصق الماصة للأعلى والأسفل لتفكيك تجمعات الخلايا وضمان توزيعها بشكل متساو عبر البئر.
    7. افحص تركيب الخلية على سطح الزجاج باستخدام المجهر الضوئي. تحت تكبير 10x، ركز المجهر على أسفل زجاج الغلاف.
      ملاحظة: النقر بلطف على زجاج الغطاء المخصص للغرفة أثناء المراقبة تحت المجهر قد يساعد في تقييم ما إذا كانت الخلايا قد التصقت بالسطح أو لا تزال عائمة.
    8. جهز 200 ميكرولتر من محلول التثبيت (4٪ بارافورمالديهايد و0.1٪ جلوتارالديهيد في DPBS) وسخنه مسبقا إلى 37 درجة مئوية في حمام ماء.
      ملاحظة: مخزن التثبيت المرفق محسن ل CD81 وهو مناسب بشكل عام للحفاظ على بروتينات الغشاء. بالنسبة لأهداف بروتين الغشاء الجديدة، قد تحتاج إلى تعديل تركيبة المخزن لتحقيق حفظ مثالي. يشجع المستخدمون على الرجوع إلى الأدبيات حول ظروف تثبيت مصممة خصيصا لأهداف جديدة.
      تحذير: بارافورمالديهايد سام ومسرطن. الجلوتارالديهايد سام ومسبب للتآكل. ارتد معدات الحماية الشخصية المناسبة (PPE) عند التعامل مع هذا الواشف. في حال ملامسة الجلد، اغسل المنطقة المصابة فورا جيدا بالصابون والماء. تخلص من المادة وفقا لإرشادات مؤسسة المستخدم وجميع اللوائح المحلية والولائية والفيدرالية المعمول بها.
    9. استنشق DPBS من كل عينة جيدة (من الخطوة 1.2.6) باستخدام ميكروبايبت.
      ملاحظة: من الضروري تنفيذ جميع خطوات تبادل المحلول ببطء لتجنب إزاحة الخلايا من زجاج الغلاف. تخلص من النفايات البيولوجية الخطرة وفقا لإرشادات مؤسسة المستخدم وجميع اللوائح المحلية والولائية والفيدرالية المعمول بها.
    10. أضف 200 ميكرولتر من محلول تثبيت مسبق التسخين بدرجة حرارة 37 درجة مئوية إلى زاوية البئر وحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
      تحذير: بارافورمالديهايد سام ومسرطن. الجلوتارالديهايد سام ومسبب للتآكل. ارتد معدات الحماية الشخصية المناسبة عند التعامل مع هذه المواد الكيميائية. في حال ملامسة الجلد، اغسل المنطقة المصابة فورا جيدا بالصابون والماء. تخلص من المادة وفقا لإرشادات مؤسسة المستخدم وجميع اللوائح المحلية والولائية والفيدرالية المعمول بها.
    11. اغسل الخلايا الثابتة ثلاث مرات باستخدام 500 ميكرولتر من DPBS. تجاوز هذه الخطوة إذا كنت تتابع الخطوة 1.2.12.
    12. اختياري: أزل محلول التثبيت ببطء وأضف 200 ميكرولتر من بوروهيدريد الصوديوم 0.1٪ الجاهز حديثا في DPBS، ثم حضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 7 دقائق. تجاوز هذه الخطوة وتابع إلى الخطوة 1.2.14 إذا لم تستخدم تقليل بوروهيدريد الصوديوم.
      ملاحظة: يساعد الاختزال باستخدام بوروهيدريد الصوديوم في تبريد التألق الذاتي الناتج عن الجلوتارالديهايد ويعادل الألدهيدات غير المتفاعلة. إطلاق غاز الهيدروجين نتيجة تفاعل بوروهيدريد الصوديوم مع المحلول المائي سيظهر في إطلاق فقاعات. إذا لم يلاحظ إطلاق غاز الهيدروجين، استخدم محلول جديد من بوروهيدريد الصوديوم.
      تحذير: بوروهيدرات الصوديوم سامة ومسببة للتآكل. ارتد معدات الحماية الشخصية المناسبة عند التعامل مع هذا الواشف. في حال ملامسة الجلد، اغسل المنطقة المصابة فورا جيدا بالصابون والماء. تخلص من المادة وفقا لإرشادات مؤسسة المستخدم وجميع اللوائح المحلية والولائية والفيدرالية المعمول بها.
    13. استنشق محلول بوروهيدريد الصوديوم من كل بئر، ثم اغسله ثلاث مرات ب 500 ميكرولتر من DPBS.
    14. جهز 200 ميكرولتر من محلول العزل وأضفه إلى البئر. حضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. لا تستخدم كاشف نفاذية (مثل TritonX-100، سابونين)، لأنه قد يزيل بروتينات الغشاء. بروتوكول SAL الغشائي (mSAL) المعروض هنا ل CD81 لم يتضمن خطوة حجب (حجب العلاج).
      ملاحظة: يوصى باستخدام محلول حاجب يحتوي على 5٪ (بدون ضبط) ألبومين مصل البقري (BSA) في DPBS لعلاج mSAL مع الأهداف الجديدة. عند استخدام الأجسام المضادة الثانوية، يستخدم المصل المقابل للحجب. على سبيل المثال، مصل الماعز بنسبة 10٪ (v/v) في DPBS عند استخدام جسم مضاد ثانوي من الماعز. إذا كان هناك وصفة مخزن حجب معتمدة وبروتوكول للهدف، يمكن للمستخدمين اتباع هذا البروتوكول. يمكن اختيار أن يتم تعويض العزل الحاجز بأجسام مضادة للتحكم في النظائر أو الأجسام المضادة المشتقة من المصل لتقليل الارتباط خارج الهدف للأجسام المضادة23،24. يجب تضمين كاشف نفاذية في المخزن الحاجز فقط إذا استهدف الجسم المضاد حافتا داخل الخلية لبروتين الغشاء.
    15. بالنسبة ل mSAL مع الأجسام المضادة الأولية المتقاربة بالصبغة، تابع مباشرة الخطوة 1.2.20.
    16. جهز 150 ميكرولتر من محلول تلوين الأجسام المضادة الأولي (الأجسام المضادة بالتركيز المطلوب مخفف في مخزن الانسداد). تجاوز هذه الخطوة بالنسبة ل mSAL مع الأجسام المضادة الأولية المتقاربة بالصبغة.
      ملاحظة: للاطلاع على صبغة الأجسام المضادة الأولية، يرجى الرجوع إلى ورقة بيانات البائع لمعرفة الحالات الموصى بها. إذا لم يتم توفير معلومات تركيز، ابدأ ب 4 ميكروغرام/مل (27 نانومتر) لIgGكامل الطول 23,24.
    17. استبدل الحاجز العائلي بمحلول الأجسام المضادة الأساسي. حضن في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين أو عند 4 درجات مئوية طوال الليل في غرفة رطبة. تجاوز هذه الخطوة بالنسبة ل mSAL مع الأجسام المضادة الأولية المتقاربة بالصبغة.
    18. اغسل العينة مرتين باستخدام 400 ميكرولتر من DPBS. أضف 200 ميكرولتر من حاجز العزل إلى البئر.
    19. اختياري: استبدل مخزن العزل ب 200 ميكرولتر من المخزن بعد التثبيت (4٪ بارافورمالديهايد) وحضن لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
      ملاحظة: يساعد التثبيت اللاحق في الحفاظ على حجب العينات لSAL 23,24. ومع ذلك، يجب استبعاد هذه الخطوة إذا قللت من إمكانية الوصول إلى الحوامت. لتقييم تأثير ما بعد التثبيت على التعرف على الحواتم بواسطة الأجسام المضادة، وإجراء صبغة فلورية مناعية قياسية مع وبدون تثبيت لاحق، وقارن جودة التلوين.
    20. اختياري: اغسل العينة مرتين باستخدام DPBS.
    21. أضف 200 ميكرولتر من DPBS إلى كل بئر وغط الحجرة بطبقة شفافة لمنع التبخر. يمكن تخزين العينات عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد. إذا قمت بإجراء mSAL مباشرة بعد الخطوة 1.2.14، أو 1.2.19 بدون تثبيت لاحق، احتفظ بالعينة في مخزن الحجب وانتقل مباشرة إلى الخطوة 2.2.
      ملاحظة: الحفاظ على العينة في DPBS مع مكمل بأزيد الصوديوم 5 ملليمول سيمنع نمو البكتيريا أثناء التخزين.
      تحذير: أزيد الصوديوم سام بشكل حاد وقد يكون قاتلا إذا تم تناوله. ارتد معدات الحماية الشخصية المناسبة عند التعامل مع هذا الواشف. في حال ملامسة الجلد، اغسل المنطقة المصابة فورا جيدا بالصابون والماء. تخلص من المادة وفقا لإرشادات مؤسسة المستخدم وجميع اللوائح المحلية والولائية والفيدرالية المعمول بها.

2. اكتساب الصور

ملاحظة: إجراء التصوير لكل من الخلايا الملتصقة والخلايا المعلقة مشابه ويتم باستخدام مجهر التألق الداخلي الكلي (TIRF). ومع ذلك، يجب تحسين ظروف التصوير لكل نوع من الخلايا.

  1. اترك العينات المخزنة (عند 4 درجات مئوية) تصل إلى درجة حرارة الغرفة قبل التصوير لمنع التكثف على الزجاج. تجاوز هذه الخطوة إذا كنت تنتقل مباشرة إلى التصوير بعد تحضير العينة.
  2. الطاقة على نظام المجهر: المجهر، كاميرا sCMOS، وحدة الليزر، والكمبيوتر الذي يحتوي على برنامج التقاط الصور. اسمح لنظام المجهر بالاستقرار لمدة 5-10 دقائق بعد التشغيل للسماح لمكونات النظام بالوصول إلى درجات حرارة التشغيل وتقليل الانجراف الحراري.
    ملاحظة: يمكن إجراء mSAL باستخدام أي إعداد مجهر TIRF وبرامج متوافقة. شغل النظام حسب تعليمات الأداة.
  3. ضع زيت الغمر على هدف TIRF (مثل 100x/1.49) وركب زجاج الغطاء المحجوز على مرحلة المجهر.
    ملاحظة: إذا كان الهدف مزودا بطوق تصحيح، تأكد من ضبطه على سمك زجاج الغطاء الصحيح عند 23 درجة مئوية. كان سمك زجاج الغطاء المستخدم في هذه الدراسة بين 0.13-0.17 مم.
  4. إذا كان السلاح مجهزا، شغل نظام التركيز المثالي (PFS)، ثم ارفع الهدف بحذر إلى زجاج الغطاء وجعل العينة في بؤرة التركيز.
  5. جهز كولويدات الذهب كعلامات ائتمانية (تخفيف بنسبة 1:2 في مياه فائقة النقي). قم بسونيكيد الكولويدات الذهبية قبل التخفيف لمدة 3 دقائق لتوزيع التجمعات.
  6. استنشق بلطف مخزن التخزين (DPBS أو مخزن الحجب) من بئر العينة وأضف 200 ميكرولتر من محلول الغلود الذهبي إلى العينة. حضن المحلول لمدة دقيقة واحدة وأخرج المحلول.
  7. استخدم إضاءة الحقل الساطع للتحقق من ترسيب كمية كافية من الكولويدات الذهبية قبل شفط المحلول. تتكون الكثافة المثالية من 5 إلى 10 كرويدات ذهبية ضمن المنطقة المحددة للاهتمام.
    ملاحظة: بدلا من ذلك، يمكن استخدام الكرات الفلورية (انظر جدول المواد) بتخفيف بنسبة 1:1,000 في DPBS.
  8. اغسل مرة واحدة ب 500 ميكرولتر من الماء فائق النقي لإزالة الكوليدات الذهبية الزائدة، ثم أضف 200 ميكرولتر من DPBS.
  9. في برنامج التصوير، قم بإنشاء التكوين البصري للفلوروفور (لمسبار الأجسام المضادة)، بما في ذلك الديكروي المناسب، وطول موجة الإثارة بالليزر، وكثافة الطاقة، ووقت دمج الكاميرا، ومرشح الانبعاث، وتركيب بكسل الكاميرا (إذا كان ذلك مناسبا). يوصى بحجم بكسل بين 150-160 نانومتر لتحقيق الدقة المثلى.
  10. أنشئ تكوين بصري لخطوة التبييض الضوئي. يوصى بقوة ليزر 380 واط/سم2 أو أكثر مع زمن دمج الكاميرا 1 ثانية.
    ملاحظة: التبييض الضوئي أثناء الاكتساب يساعد في تقليل التداخل بين أحداث ارتباط الأجسام المضادة الفلورية الفردية. يمكن توجيه الضوء المجمع عبر مرشح انبعاث بطول موجي غير مطابق لتجنب تشبع الكاميرا.
  11. اضبط زاوية الليزر لتحديد إضاءة TIRF. باستخدام إضاءة الحقل المضيء، حدد خلية لمتلازمة متعددة الاستخدامات. تأكد من رؤية ما لا يقل عن 5 كولويدات ذهبية داخل عائد الاستثمار لتصحيح انحراف المرحلة أثناء إعادة بناء الصورة. أكد التألق الذاتي من الكولويدات الذهبية عند كثافة طاقة الليزر التصويرية.
  12. حدد معلمات التصوير: الفترة غير المضيئة (NII)، عدد الإطارات، وتكرار خطوة التبييض الضوئي (إذا لزم الأمر) في برنامج التقاط الصورة. بالنسبة لفحص mSAL ل CD81 على U2OS وخلايا جوركات T مع الأجسام المضادة ل CD81، كانت الإعدادات المثلى NII بقيمة 5 ثوان، و2000 إطار إجمالي، وخطوة تبييض ضوئي كل إطار خامس.
    ملاحظة: يجب تحسين هذه المعايير لكل بروتين مهم، والأجسام المضادة المستخدمة في mSAL، ونوع الخلية. راجع الخطوة 3 لمزيد من التفاصيل حول التحسين. قد يختلف العدد الأمثل للأطر بين الجسم المضاد المستهدف وكذلك نوع الخلية. بالنسبة للأنظمة المستهدفة الجديدة، يوصى بالتقاط 2,000-3,000 إطار كنقطة انطلاق. تمدد NII مدة اكتساب الصور. على سبيل المثال، الاستحواذ على mSAL بقيمة 3,000 إطار مع NII 20 ثانية ينتج عنه ~17 ساعة من وقت الاستحواذ.
  13. جهز المخزن التصويري عن طريق تخفيف الجسم المضاد CD81 إلى تركيز 1 ميكروغرام/مل في 200 ميكرولتر بنسبة 5٪ BSA (مع الفتحة) في DPBS. بالنسبة لmSAL من CD81، كان التركيز النهائي للأجسام المضادة 0.5 نانوميل لخلايا جوركات التائية و2 نانوميل لخلايا U2OS.
    ملاحظة: تركيز الأجسام المضادة يعتمد على وفرة الركيزة المحلية ومدى ألفة الجسم المضاد. من الضروري تحسين تركيزات الأجسام المضادة لكل هدف بروتيني، ولكل جسم مضاد يستخدم في التصوير، ولكل نوع من الخلية. راجع الخطوة 3.1 لمزيد من التفاصيل حول التحسين.
  14. أضف المخزن التصويري المحضر إلى البئر وابدأ عملية الاقتناء.

3. تحسين معلمات التصوير

ملاحظة: معلمات تصوير mSAL تتأثر بتعبير البروتين، وتنظيمه المحلي، واختيار الجسم المضاد المستخدم للتصوير. الهدف من تحسين معلمات التصوير هو تحديد تركيز الأجسام المضادة والمؤشر الوطني للجزء الذي ينتج أحداثا جزيئية واحدة محلية مع الحفاظ على كثافات عالية بما يكفي لتعظيم أخذ عينات الحوامت.

  1. تركيز الأجسام المضادة
    1. تخفيف الجسم المضاد إلى 0.5 نانومول لخلايا جوركات و2 نانوميل لخلايا U2OS في 200 ميكرولتر من 5٪ (مع ضج) BSA في DPBS وأضف محلول الأجسام المضادة إلى البئر. للحصول على وسم الأجسام المضادة الواحدة الأمثل، استخدم تركيز الأجسام المضادة عند أو بالقرب من ثابت تفكك التوازن (Kd); إذا كان Kd غير معروف، ينصح بدءا من 1 نانومتر.
    2. استخدم وظيفة العرض المباشر في برنامج التصوير المهيأ ل mSAL لمراقبة ارتباط الأجسام المضادة.
    3. ضبط زاوية TIRF ومعلمات التصوير لتحقيق نسبة إشارة إلى ضوضاء (SNR) ≥ 3.
      ملاحظة: زاوية TIRF المثلى تحسن نسبة التشويش الضوئي من خلال الحد من الفلورية خارج التركيز الناتجة عن انتشار الأجسام المضادة في مخزن التصوير. يمكن استخدام كثافة طاقة ليزر تتراوح بين 100-200 واط/سم2 وزمن دمج للكاميرا 50 مللي ثانية في البداية. إذا كان معدل الضوضاء منخفضا، قم بزيادة قوة الليزر و/أو وقت دمج الكاميرا تدريجيا وراقب التغيرات في معدل الضوضاء حتى تصل إلى القيمة المثلى.
    4. قم بتكوين معلمات التصوير في برنامج اكتساب الصور للحصول على اقتناص لا يقل عن 10 إطارات مع مؤشر NII بقيمة 5 ثوان (انظر الخطوة 2.12).
      ملاحظة: يوصى ب 5 ثانية NII كنقطة انطلاق. يجب إجراء فحص NII لتحديد أفضل NII لنظام جديد مستهدف للأجسام المضادة (الخطوة 3.2).
    5. ابدأ عملية الاستحواذ. تقييم ندرة التوطين المفرد للجزيء الواحد في الفيلم المسجل.
      ملاحظة: تم وصف خطوات مفصلة للحصول على كثافة التوطين في منشور سابق24. وجد أن كثافة تحديد موقع جزيء واحد بين 0.02 و0.15 أحداث/ميكرومتر2 هي الأمثل لاختبار mSAL.
    6. إذا لوحظت عدة أحداث ارتباط أجسام مضادة متداخلة فور إضافة حاجز التصوير أو تراكمت مواقع جزيء واحد مع تقدم التسجيل، أوقف عملية الاستحواذ. قلل تركيز الأجسام المضادة بمقدار مرتين وكرر عملية الاقتناء على عينة جديدة. كرر هذه العملية لتقليل تركيز الأجسام المضادة بمقدار مرتين وإعادة تقييم عدد الأحداث لكل وحدة مساحة حتى يتم تحقيق كثافة حدث التموضع الجزيء الواحد المرغوبة.
      ملاحظة: تظهر الأحداث المتداخلة على شكل عدة نقاط كبيرة تصبح أكثر سطوعا أو أكبر عند ارتباط جسم مضاد جديد ضمن حد الحيود للجسم المضاد الأول.
    7. إذا كانت كثافة الحدث قليلة، زد تركيز الأجسام المضادة في مخزن التصوير بمقدار مرتين وكرر عملية الاقتناء على عينة جديدة. كرر هذه العملية بزيادة تركيز الأجسام المضادة بمقدار مرتين وإعادة تقييم عدد أحداث الارتباط لكل وحدة مساحة حتى يتم تحقيق كثافة حدث التمركز الجزيء الواحد المطلوب.
      ملاحظة: ينصح باستخدام عينة جديدة لكل تجربة تحسين تركيز لتجنب التداخل المحتمل من الأجسام المضادة المرتبطة مسبقا في تقييمات كثافة التمركز اللاحقة.
  2. تحسين NII
    1. قم بتكوين معلمات التصوير في برنامج اكتساب الصورة للحصول على اقتتاز 50 إطارا (انظر الخطوة 2.12). اضبط مؤشر NII على 0 (بدون تأخير).
    2. جهز مخزن التصوير إلى تركيز الأجسام المضادة المحسن من الخطوة 3.1 وأضفه إلى بئر العينة. ابدأ عملية الاستحواذ.
    3. كرر الخطوات 3.2.1-3.2.2، مع تعديل NII إلى 1، 3، 5، 10، أو 20 ثانية. قم بكل عملية اقتناء على عينة جديدة.
    4. قيم كثافة وتنوع التوطين الجزيءي الواحد للفيلم المسجل (انظر الخطوات 3.1.5-3.1.7). يتم تحديد أدنى NII ذات كثافة حدثية جزيئية واحدة المثلى على أنها NII المثلى.
      ملاحظة: قد يحتاج تركيز الأجسام المضادة إلى تحسين أكثر لتحقيق كثافة تحديد موقع جزيء واحد مثالية للNII المقابل. راجع الخطوة 3.1. تظهر التقارير السابقة أن NII الأطول (10-20 ثانية) كانت أكثر انتقائية تجاه أحداث الارتباط ذات الكثافة الأعلى، لكن تمديد NII لما بعد 20 ثانية لم يؤد إلى تحسين إضافي23,24. إذا حدثت أحداث ارتباط متداخلة مكانيا مع تقدم التقاط الصورة، قم بإدخال خطوة تبييض ضوئي على فواصل كافية لإزالة الفلورة من الأجسام المضادة المرتبطة. على سبيل المثال، إذا ظهرت أحداث متداخلة بحلول الإطار الخامس، فطبق التبييض الضوئي كل إطار خامس. يتم وصف ظهور الأحداث المتداخلة مكانيا في مذكرة الخطوة 3.1.6.

4. تحليل البيانات

ملاحظة: يستخدم إعادة بناء الصور mSAL برنامج NIH المجاني، Fiji29، مع إضافة ThunderSTORM30 . تم استخدام نسخة فيجي v1.54r وThunderSTORM الإصدار 1.3 في هذا البروتوكول. تم وصف تحليل الصور التفصيلي في بروتوكول سابق رقم 24. في هذا القسم، نستعرض سير عمل التحليل المستخدم تحديدا في mSAL. استخدم التحليل المعروض في هذا البروتوكول كاميرا Prime95B sCMOS (الرقم التسلسلي A18B203004) بفوتوإلكترونات لكل A/D بقيمة 0.98، ومستوى قاعدة الكاميرا 100. تم ضبط حجم بكسل التصوير على 147 نانومتر.

  1. حدد المعلمات الخاصة بإعادة البناء في نافذة تحليل التشغيل. المعلمات المستخدمة لإعادة بناء صور CD81 mSAL موضحة أدناه. يجب استخدام دالة المعاينة لتقييم أحداث الارتباط الجزيء الواحد المكتشفة في الإطار المختار قبل إجراء التحليل الكامل.
    تصفية الصور:
    المرشح: مرشح المويجات (B-spline)
    ترتيب B-Spline: 2
    مقياس B-Spline: 4
    تحديد الموقع التقريبي للجزيئات:
    الطريقة: الحد الأقصى المحلي
    عتبة الشدة القصوى: std(موجة F1)
    الاتصال: 8 أحياء
    تحديد موقع جزيئات تحت بكسل:
    الطريقة: PSF: غاوسية متكاملة
    نصف قطر التركيب [px]: 2
    طريقة التركيب: أقصى احتمال
    السيغما الابتدائي [px]: 0.75
    تحليل ملاءمة متعدد الباعث: غير محدد
    تصور النتائج:
    الطريقة: الغاوسية التطبيع
    التكبير: 7.3
    تكرار التحديث [الإطارات]: 50
    عدم اليقين الجانبي: 20
    ملاحظة: تستخدم معلمات الترشيح المسبق لتعزيز اكتشاف الباعث الواحد عبر الخلفية. تعمل كنقاط انطلاق ولكن يجب تحسينها لكل مجموعة بيانات. تستخدم معلمات التمركز التقريبي وطريقة الكشف لأحداث الارتباط بجزيء واحد. استخدام أقصى شدة محلية مع اتصال 8 أحياء أظهر أنه يوفر أداء موثوقا31. تم اختيار الطريقة الغاوسية المتكاملة مع ملاءمة الاحتمالية القصوى لأنها مستخدمة على نطاق واسع وتوفر تقريبا موثوقا لدالة الانتشار النقطي (PSF) في تطبيقات التصوير الجزيء الواحد 32,33,34,35. طريقة التصور المستخدمة في هذا البروتوكول هي الغاوسية المطبعة. يمكن للمستخدمين اختيار طريقة التصور التي تناسب بياناتهم بشكل أفضل. تم ضبط التكبير ليعطي حجم بكسل معاد بناؤه 20 نانومتر، وهو مناسب لدقة تحديد المواقع المتوقعة التي يمكن تحقيقها باستخدام وسم الأجسام المضادة، حيث يكون خطأ الربط في حدود ~10 نانومتر. تم حساب عامل التكبير البالغ 7.3 عن طريق قسمة حجم البكسل المحدود بالحيود على حجم البكسل المعاد بناؤه المطلوب (147 نانومتر / 20 نانومتر = 7.3). يحدد تردد التحديث عدد مرات تحديث الصورة المعاد بناؤها أثناء المعالجة، لكنه لا يؤثر على النتيجة النهائية. يتم ضبط عدم اليقين الجانبي على 20 (ولكن ليس مجبرا عليه) بحيث تتضمن إعادة البناء عدم اليقين المحسوبة للتوطين. لمزيد من التفاصيل حول الخيارات المتاحة، يرجى الرجوع إلى دليل مستخدم ThunderSTORMرقم 30 أو انقر على علامة الاستفهام بجانب حقل الإدخال.
  2. ابدأ تحليل ThunderSTORM بسيغما ابتدائي 1.6 بكسل ونصف قطر تركيب 3. قم بتحسين المعايير حسب الحاجة. لم يستخدم تركيب متعدد الإصدارات، حيث تم الحفاظ على كثافات الأحداث غير متداخلة في الصور المحدودة الحيود.
  3. اضغط على موافق لتشغيل إعادة البناء. بمجرد الانتهاء، ستفتح نافذة النتائج تلقائيا.
  4. استخدم دالة مخطط الرسم المخطط للعثور على قمة السيغما. حول هذه القيمة (nm) إلى بكسل عن طريق قسمتها على حجم بكسل البيانات الخام، ثم أعد تشغيل تحليل ThunderSTORM باستخدام القيمة الجديدة للسيغما الابتدائية ونصف قطر التركيب المعين على عدد صحيح قريب من 3x سيغما ابتدائية30.
  5. حدد تصحيح الانجراف باستخدام العلامة الختاميةالمحددة 24.
  6. قم بإعادة بناء الصورة على كامل مجال الرؤية وتطبيق تصحيح الانجراف المحسوب.
  7. للمعالجة اللاحقة للصورة، انقر على تبويب التصفية في نافذة النتائج. تطبيق الفلاتر لإزالة الأحداث غير الموضعية بشكل جيد. في النتائج المعروضة ل CD81، تمت إزالة الأحداث التي يزيد فيها سيغما عن 200 نانومتر وعدم اليقين أكبر من 20 نانومتر. استخدم دالة مخطط مخطط مخطط لفحص توزيع السيغما وتحديد القطع المناسب.
    ملاحظة: عادة ما تنشأ التمركزات الموحدة ذات القيم الكبيرة في الجزيء الواحد من الفلوروفورات الخافتة ذات عدد فوتون منخفض أو من تداخل الباعثات. كما تمت إزالة التوطين الذي يزيد عن عدم اليقين 20 نانومتر، حيث يشير احتمال عدم اليقين الذي يتجاوز حجم البكسل النهائي إلى دقة توطين ضعيفة. للحصول على إرشادات إضافية حول معايير التصفية، يرجى الرجوع إلى دليل مستخدمي ThunderSTORMرقم 30.
  8. احفظ جدول النتائج مع بيانات تحديد الموقع بجزيء واحد للتحليلات التالية عن طريق اختيار التصدير. سيكون الملف المصدر بصيغة .csv ويسمى mSAL.csv في هذا البروتوكول. احفظ الصورة الغاوسية المطبعة الناتجة.

5. تحليل التجمعات

ملاحظة: أثناء استكشاف الحوات، تتفاعل الأجسام المضادة مع أهدافها المقصودة (تفاعلات محددة) وكذلك مع الجزيئات خارج الهدف (تفاعلات غير محددة). نظرا لأن mSAL يعتمد على الكشف التراكمي عن أحداث ارتباط الأجسام المضادة بالمستضدات الفردية، فإن بعض التفاعلات غير المحددة تساهم حتما في إعادة بناء الصورة. تظهر تفاعلات الأجسام المضادة مع الحواظم بصمات حركية مميزة يمكنها، من حيث المبدأ، التمييز بين الارتباط الخاص وغير النوعي، حيث يتم التمييز بين الأحداث المحددة وغير المحددة بكثافة التفاعل المحلية، بدلا من خلال السكن بين جزيء واحد في36. هنا، يتم وصف تجميع مكاني قائم على الكثافة لتطبيقات الضوضاء (DBSCAN)37 لإزالة الأحداث منخفضة الكثافة، مع الاحتفاظ بالأحداث عالية الكثافة التي من المرجح أن تعكس ارتباط الأجسام المضادة المحددة. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن يوفر التجميع القائم على الكثافة رؤى كمية حول التنظيم المكاني على نطاق النانو، خصوصا تلك المعروفة بتنظيمها الطبيعي في عناصر، مثل CD81 في مجالات دقيقة غنية بالرباعي السبانين 38,39,40,41,42. تم إجراء تحليل DBSCAN المقدم باستخدام MATLAB 2025a. للمستخدمين الذين لا يملكون الوصول إلى MATLAB، ينصح بإجراء تحليلات DBSCAN مماثلة باستخدام بدائل مفتوحة المصدر مثل بايثون أو R43، 44، 45. يمكن الحصول على الشيفرة المستخدمة في هذا البروتوكول من: https://github.com/nrams12/DBSCAN_SAL_Clusterer/tree/main.

  1. تشغيل الكود
    1. حمل ملف MATLAB من رابط GitHub أعلاه.
    2. ابدأ MATLAB وافتح الكود. في الخطوط 37 و38، حدد الحد الأدنى لعدد النقاط (minPTS) وإبسيلون لمعاملات التجميع. تم استخدام المعايير التالية:
      خلايا جوركات التائية:
      minPTS: 7
      إبسيلون: 60
      خلايا U2OS:
      minPTS: 7
      إبسلون: 80
      ملاحظة: راجع الخطوة 5.2 لمزيد من التفاصيل حول تحسين هذه المعاملات.
    3. قم بتعيين مسار الملف في برنامج MATLAB إلى المجلد الذي يحتوي على ملف mSAL.csv المعاد بناؤه.
    4. شغل الكود بالنقر على تشغيل. سيطلب الكود من المستخدم اختيار ملف. اختر ملف mSAL.csv واضغط على فتح.
    5. يتم حفظ البيانات المجمعة تلقائيا في المجلد المسمى MATLAB Data في مسار الملف المعين داخل الكود. افتح هذا الملف في ThunderSTORM بالنقر على الإضافات > ThunderSTORM > استيراد/تصدير > استيراد.
    6. احتفظ بصورة المجهر الموضعية لجزيء واحد الناتجة.
  2. تحسين مدخلات التجميع
    ملاحظة: المعاملتان المخصصتان للإدخال في خوارزمية DBSCAN هما minPTS وEPSILON. يحدد إبسيلون نصف القطر حول نقطة لتحديد جوارها، بينما يحدد minPTS الحد الأدنى من النقاط داخل ذلك الحي المطلوب لتشكيل منطقة كثيفة. النقاط التي تحقق هذا الشرط للكثافة تصنف كنقاط نواة، وتضاف أحيارها بشكل تكراري إلى العنقود. النقاط التي لا تستوفي متطلبات الكثافة ولكن تقع ضمن جوار نقطة مركزية تسمى نقاط حدودية، بينما تعتبر جميع النقاط المتبقية نقاط ضوضاء.
    1. قم بتشغيل التحليل باستخدام المدخلات الموضحة أعلاه (الخطوة 5.1.2) كنقطة بداية. اختر قيمة minPTS تكون أعلى من عدد مواقع الضوضاء ولكن أقل من عدد التموضعات على الخلية. بعد اختيار minPTS، قم بضبط إبسيلون بحيث يمكن التقاط هذا العدد من التموضعيات ضمن نصف قطر الجوار لمناطق الخلايا التمثيلية.
      ملاحظة: يمكن تعديل minPTS وEPSILON بشكل مستقل عن بعضهما البعض. نهج عملي لاختيار هذه المعايير هو أولا فحص مخطط التشتت لنقاط الضوضاء خارج الخلية ومقارنتها بعدد المواقع التي لوحظت داخل مناطق متشابهة الحجم على الخلية.
    2. قيم النافذة المسماة الشكل 2 التي تعرض البيانات المجمعة. إذا احتفظت البيانات بعناقيد على الخلية تحتوي على النمط الظاهري المتوقع مع تقليل التمركز خارج الخلية، فإن مدخلات التجميع تكون كافية.
      ملاحظة: يجب أن تحتفظ البيانات المجمعة ببنية البيانات التي تم الحصول عليها باستخدام mSAL. إذا بدت المجموعات صغيرة، وموضعية فقط في المناطق ذات الكثافة العالية جدا في البيانات الأصلية، واستبعدت عددا كبيرا من أحداث الربط التي تتوافق مع النمط المتوقع، فقد تكون معلمات التجميع مقيدة جدا. إذا لم يتم تقليل الارتباط غير المحدد خارج الخلية بشكل كاف مع العناقيد الكبيرة، فقد تكون معايير التجميع شاملة جدا.
    3. إذا كانت معلمات التجميع مقيدة جدا، قلل minPTS وزد الإبسيلون ليشمل المزيد من النقاط في البيانات المجمعة. إذا كانت معايير التجميع شاملة جدا، زد minPTS وقلل الإبسيلون.
    4. بعد ضبط minPTS و epsilon، أعد تشغيل الكود. كرر الخطوات 5.2.2-5.2.3 حتى يتم تحقيق التجميع الأمثل.

6. التحقق من ارتباط الأجسام المضادة بالهدف

ملاحظة: بالنسبة لبروتينات الغشاء التي لا تملك مورفولوجيا محددة جيدا، قد يكون التحقق من دقة الهياكل المحلولة أمرا صعبا. للتحقق من خصوصية الأجسام المضادة، قد يعبر المستخدمون عن اندماج بروتين فلوري (FP) للبروتين المستهدف. كفحص أولي، يمكن إجراء تلوين فلوري مناعي تقليدي على الخلايا التي تعبر عن اندماج FP. للحصول على تحقق أكثر دقة عند تقييم الأجسام المضادة الجديدة، يمكن إجراء mSAL على الخلايا التي تعبر عن FP للتأكد من أن أحداث الارتباط الموضعي تتوافق مع الهدف الموسوم بالفلورية. هنا، يوصف بروتوكول لتحويل خلايا U2OS باستخدام CD81-mStayGold كمثال، مما يتيح تأكيد أن توطين CD81 mSAL يتوافق مع CD81 الموسوم ب FP على سطح الخلية. يمكن للمستخدمين استبدال أي بروتين فلوري مناسب، بشرط ألا يتداخل انبعاثه مع قناة التألق للجسم المضاد الذي يتم التحقق منه.

  1. تنزلق خلايا U2OS البذرية في غرفة ب 8 آبار وتنمو حتى ~70٪ من التلاصق. الحفاظ على الخلايا في 200 ميكرولتر من وسط النمو الكامل (DMEM مع 10٪ (v/v) مصل البقر الجنيني، 100 U/mL بنسلين، و100 ميكروغرام/مل ستريبتومايسين).
  2. اجمع 100 نانوغرام من تركيب الحمض النووي المشفر للبروتين مع مسجل فلوري يحتوي على 5 ميكرولتر من ليبوفيكتامين 2000. الدوامة لمدة 30 ثانية وحضانة لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: استخدمت هذه الدراسة مادة CD81 ملتصقة ب mStayGold. تم استخدام تقنيات الاستنساخ الجزيئية القياسية في توليد بلازميدات الحمض النووي، رغم أن هذه التقنيات غير موصوفة في هذا البروتوكول. نسب الحمض النووي (DNA): الليبوفكتامين المقدمة محسنة للخلايا التي تم زرعها في شرائح حجرة 8 آبار، وقد تحتاج إلى تعديل وفقا لتعليمات الشركة المصنعة لصيغ عينات أخرى.
  3. أضف 5 ميكرولتر من محلول DNA/ليبوفكتامين إلى الخلايا. حضن شريحة الحجرة لمدة 4 ساعات عند 37 درجة مئوية، مع إضافة 5٪ ثاني أكسيد الكربونفي بيئة رطبة.
  4. استبدل الوسائط بوسائط نمو كاملة مدفأة مسبقا. حضانه لمدة > 8 ساعات عند 37 درجة مئوية مع إضافة 5٪ من ثاني أكسيد الكربونفي بيئة رطبة للسماح بمستويات واضحة من تعبير البروتين.
  5. تقييم مستويات التعبير الفلوري في الخلايا باستخدام مجهر فلوري أو جهاز تصوير. يوصى بكفاءة النقل بنسبة ≥ 30٪. إذا كانت مستويات التعبير الفلوري غير مثالية، قم بتحسين نسبة الحمض النووي إلى ليبووفيكتامين وفقا لإرشادات الشركة المصنعة.
    ملاحظة: يجب استخدام الخلايا المعبرة بشكل مؤقت للتحقق من صحة الأجسام المضادة خلال 24-48 ساعة بعد النقل.
  6. لإصلاح الخلايا، يرجى اتباع الخطوات 1.2.8-1.2.13.
  7. تخزين العينات الثابتة في 200 ميكرولتر من DPBS مع 5 ملليمولار أزيد الصوديوم حتى تكون جاهزة للتصوير. يمكن تخزين العينات عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد.
    تحذير: أزيد الصوديوم سام بشكل حاد وقد يكون قاتلا إذا تم تناوله. ارتد معدات الحماية الشخصية المناسبة عند التعامل مع هذا الواشف. في حال ملامسة الجلد، اغسل المنطقة المصابة فورا جيدا بالصابون والماء. تخلص من المادة وفقا لإرشادات مؤسسة المستخدم وجميع اللوائح المحلية والولائية والفيدرالية المعمول بها.
  8. اتبع الخطوات 2.1-2.12 لإعداد المجهر وتركيب العينة. تحديد الخلية التي تعبر عن البروتين المعني باستخدام إشارة التألق.
  9. للمرجعية، التقط صورة TIRF للخلية. إذا تم استخدام بروتين فلوري في نفس قناة التصوير مع الجسم المضاد mSAL، قم بإجراء التبييض الضوئي للبروتين الفلوري. لتبييض البروتين، استخدم أقصى طاقة ليزر لمدة > 10 دقائق حتى لا يتم رصد أي إشارة.
  10. أضف المخزن التصويري المحضر إلى البئر وابدأ في التصوير. يجب إكمال التحليل كما هو موضح سابقا (الخطوة 4).
  11. افتح كل من الصورة المعاد بناؤها وصورة TIRF للبروتين الفلوري الذي تم الحصول عليه قبل اكتساب mSAL. تقييم مواقع ارتباط الأجسام المضادة mSAL من خلال مقارنة مظهر ومواقع البروتين المعبر عنه الموضح في صورة TIRF محدودة الحيود، مع صورة mSAL.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

تمكن تقنية mSAL الموصوفة في هذا البروتوكول من تصور أحداث ارتباط الأجسام المضادة الفردية بأهدافها المقابلة في غشاء البلازما، مما ينتج خريطة فائقة الدقة لتوزيع بروتين الغشاء. يستخدم CD81 هنا كمثال تمثيلي، رغم أن النهج قابل للتكيف بسهولة مع بروتينات الغشاء الأخرى.

تثبيت خلايا جوركات T بمسافة كافية بين الخلايا يضمن وصول الأجسام المضادة وسطح الزجاج إلى الحومة الغشائية لتستقر العائلات (الشكل 1A). بالإضافة إلى ذلك، يمكن لتقنيات التوصيل ب...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يلعب تنظيم بروتينات الغشاء البلازما دورا حيويا في تنظيم وظيفة الخلية. تقنيات المجهر الفلوري التقليدية محدودة بحد الحيود للضوء، مما يخفي تنظيمها على نطاق النانو. تتغلب SMLM على هذا القيد من خلال تحقيق دقة مكانية تتراوح بين 10-20 نانومتر47، مما يمكن من توصيف مجموعاتهم النانوية 10,48,49. تنشأ تشوهات التجمع في SMLM من تكرار اكتشافات نفس الفلوروفور50، م...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

جميع المؤلفين يعلنون أنه لا يوجد لديهم تضارب مصالح للكشف عنه.

شكر وتقدير

وقد تم دعم البحث المبلغ عنها في هذا المنشور من قبل المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة التابع للمعاهد الوطنية للصحة تحت الجائزة رقم R35GM146786 وكلية الفنون والعلوم الحرة بجامعة إلينوي في شيكاغو. المحتوى هو مسؤولية المؤلفين وحدها ولا يعكس بالضرورة الآراء الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
الجسم المضاد أليكسا فلور 488 مضاد CD81ثيرمو فيشر العلميMA5-44132الأجسام المضادة للتصوير
الطرد المركزي على سطح الطاولةإبندورف5424
مصل البقر الألبومينميليبورسيغماA7906-100G
زجاج تغطية بغرفة، 8-بئرسيلفيسC8-1-N
وسائط DMEMثيرمو فيشر العلمي11960069
محلول الفوسفات المحلول الملحي المخزن من دولبيكوثيرمو فيشر العلمي14190-144
مصل الأبقار الجنينيميليبورسيغماF0926-500ML
غلوتارالدهيد، 10٪علوم المجهر الإلكتروني16120
كولويدات ذهبية، 100 نانومترتيد بيلا15711&الخلاص؛ 20علامة الائتمان
زيت الغمر  مختبرات كارجيل16245
المجهر المقلوب  مجهزة بوحدة TIRFنيكون إنسترومنتسإكليبس Ti2-Eالمجهر
خط خلية جوركات E6.1ميليبورسيغما88042803-1VLخلايا التعليق
إطلاق الليزر، 6 خطوطأوكسيوسL6CC-CS8-1511ليزر الإثارة
ليبوفيكتامين 2000ثيرمو فيشر العلمي11668019كاشف النقل
أنبوب الطرد المركزي الدقيق، 1.5 ملمتر VWR89000-028
برنامج التصوير المجهرينيكون إنسترومنتسأبحاث عناصر الاستخبارات الوطنية الوطنيةبرنامج التقاط الصور
الهدف: 100x/1.49 CFI APO TIRF نيكون إنسترومنتسMRD01991هدف المجهر
بارافورمالديهايد، 16٪علوم المجهر الإلكتروني15710
البنسلين-ستريبتوميسينثيرمو فيشر العلمي15140-122المضادات الحيوية
محلول بولي-إل-ليزين، 0.01٪ ميليبورسيغماP4707-50ML
كاميرا برايم 95B sCMOSحلول تيليداين فيجن01-برايم-95B-آر-م-16-سيالكاميرا
وسائط RPMI 1640ثيرمو فيشر العلمي11875-093وسائط لخلايا التعليق
أزيد الصوديومثيرمو فيشر العلمي19038-1000
بوروهيدريد الصوديومميليبورسيغما213462-25G
قوارير الزراعة T25ثيرمو فيشر العلمي169900
كرات تتراسبيك الدقيقةعلامة الائتمان
طبق زراعة الأنسجة، 100 مم كورنينغ353003
خط خلايا U2OSATCCHTB-96الخلايا الملتصقة

المراجع

  1. Zulueta Diaz, Y., de las, M., Arnspang, E. C. Super-resolution microscopy to study membrane nanodomains and transport mechanisms in the plasma membrane. Front Mol Biosci. 11, 1455153(2024).
  2. Levental, I., Lyman, E. Regulation of membrane protein structure and function by their paralipidomes. Nat Rev Mol Cell Biol. 24 (2), 107(2022).
  3. Stephens, A. D., Wilkinson, T. Discovery of Therapeutic Antibodies Targeting Complex Multi-Spanning Membrane Proteins. Biodrugs. 38 (6), 769(2024).
  4. Chan, A. C., Martyn, G. D., Carter, P. J. Fifty years of monoclonals: the past, present and future of antibody therapeutics. Nat Rev Immunol. 25, 745-765 (2025).
  5. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat Methods. 3 (10), 793-796 (2006).
  6. Heilemann, M., et al. Subdiffraction-resolution fluorescence imaging with conventional fluorescent probes. Angew Chem Int Ed Engl. 47 (33), 6172-6176 (2008).
  7. Jungmann, R., et al. Multiplexed 3D cellular super-resolution imaging with DNA-PAINT and Exchange-PAINT. Nat Methods. 11 (3), 313-318 (2014).
  8. Tobin, S. J., et al. Single molecule localization microscopy coupled with touch preparation for the quantification of trastuzumab-bound HER2. Sci Rep. 8 (1), 15154(2018).
  9. Wakefield, D. L., et al. Using quantitative single molecule localization microscopy to optimize multivalent HER2-targeting ligands. Front Med. 10, 1064242(2023).
  10. Ghosh, A., et al. Decoding the molecular interplay of CD20 and therapeutic antibodies with fast volumetric nanoscopy. Science. 387 (6730), eadq4510(2025).
  11. Lillemeier, B. F., et al. TCR and Lat are expressed on separate protein islands on T cell membranes and concatenate during activation. Nat Immunol. 11 (1), 90-96 (2010).
  12. Hu, Y. S., Cang, H., Lillemeier, B. F. Superresolution imaging reveals nanometer- and micrometer-scale spatial distributions of T-cell receptors in lymph nodes. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (26), 7201-7206 (2016).
  13. Rossboth, B., et al. TCRs are randomly distributed on the plasma membrane of resting antigen-experienced T cells. Nat Immunol. 19 (8), 821-827 (2018).
  14. Civita, S., et al. Nanoscale engagement of programmed death ligand 1 (PD-L1) in membrane lipid raft domains of cancer cells. FEBS J. 292 (22), 5979-5997 (2025).
  15. Lee, J., Sengupta, P., Brzostowski, J., Lippincott-Schwartz, J., Pierce, S. K. The nanoscale spatial organization of B-cell receptors on immunoglobulin M- and G-expressing human B-cells. Mol Biol Cell. 28 (4), 511(2017).
  16. Ferapontov, A., et al. Antigen footprint governs activation of the B cell receptor. Nat Commun. 14 (1), 976(2023).
  17. Mattila, P. K., et al. The actin and tetraspanin networks organize receptor nanoclusters to regulate B cell receptor-mediated signaling. Immunity. 38 (3), 461-474 (2013).
  18. Nerreter, T., et al. Super-resolution microscopy reveals ultra-low CD19 expression on myeloma cells that triggers elimination by CD19 CAR-T. Nat Commun. 10 (1), 3137(2019).
  19. Slaga, D., et al. Avidity-based binding to HER2 results in selective killing of HER2-overexpressing cells by anti-HER2/CD3. Sci Transl Med. 10 (463), eaat5775(2018).
  20. Haber, L., et al. Generation of T-cell-redirecting bispecific antibodies with differentiated profiles of cytokine release and biodistribution by CD3 affinity tuning. Sci Rep. 11 (1), 14397(2021).
  21. Abdelmotaleb, O., Schneider, A., Gassner, C., Märsch, S., Klein, C. The impact of CD3 affinity-attenuation on T cell engaging bispecific antibodies: is it really that simple. Expert Opin Drug Discov. 20 (8), 943-949 (2025).
  22. Dang, K., et al. Attenuating CD3 affinity in a PSMAxCD3 bispecific antibody enables killing of prostate tumor cells with reduced cytokine release. J Immunother Cancer. 9 (6), e002488(2021).
  23. Gunasekara, H., et al. Superresolution Imaging with Single-Antibody Labeling. Bioconjugate Chem. 34 (5), 825-833 (2023).
  24. Perera, T., Gunasekara, H., Hu, Y. S. Single-Molecule Localization Microscopy Using Time-Lapse Imaging of Single-Antibody Labeling. Curr Protoc. 3 (10), e908(2023).
  25. Küppers, R. CD81 as target for B cell lymphomas. J Exp Med. 216 (7), 1469-1470 (2019).
  26. Vences-Catalán, F., et al. CD81 is a novel immunotherapeutic target for B cell lymphoma. J Exp Med. 216 (7), 1497-1508 (2019).
  27. Vences-Catalán, F., et al. Targeting the tetraspanin CD81 reduces cancer invasion and metastasis. Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (24), e2018961118(2021).
  28. Bailly, C., Thuru, X. Targeting of Tetraspanin CD81 with Monoclonal Antibodies and Small Molecules to Combat Cancers and Viral Diseases. Cancers. 15 (7), 2186(2023).
  29. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  30. Ovesný, M., Křížek, P., Borkovec, J., Svindrych, Z., Hagen, G. M. ThunderSTORM: a comprehensive ImageJ plug-in for PALM and STORM data analysis and super-resolution imaging. Bioinformatics. 30 (16), 2389-2390 (2014).
  31. Ovesný, M., Křížek, P., Borkovec, J., Svindrych, Z., Hagen, G. M. Image analysis for single-molecule localization microscopy. In: Super-Resolution Imaging in Biomedicine. , 79-94 (2016).
  32. Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. Precise nanometer localization analysis for individual fluorescent probes. Biophys J. 82 (5), 2775-2783 (2002).
  33. Stallinga, S., Rieger, B. Accuracy of the Gaussian point spread function model in 2D localization microscopy. Opt Express. 18 (24), 24461-24476 (2010).
  34. Huang, F., Schwartz, S. L., Byars, J. M., Lidke, K. A. Simultaneous multiple-emitter fitting for single molecule super-resolution imaging. Biomed Opt Express. 2 (5), 1377-1393 (2011).
  35. Smith, C. S., Joseph, N., Rieger, B., Lidke, K. A. Fast, single-molecule localization that achieves theoretically minimum uncertainty. Nat Methods. 7 (5), 373-375 (2010).
  36. Chatterjee, T., et al. Direct Kinetic Fingerprinting and Digital Counting of Single Protein Molecules. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (37), 22815-22822 (2020).
  37. A density-based algorithm for discovering clusters in large spatial databases with noise. Ester, M., Kriegel, H. P., Sander, J., Xu, X. Int Conf Knowledge Disc Data Mining, 240, 226-231 (1996).
  38. Termini, C. M., Gillette, J. M. Tetraspanins Function as Regulators of Cellular Signaling. Front Cell Dev Biol. 5, 242379(2017).
  39. Levy, S., Shoham, T. Protein-protein interactions in the tetraspanin web. Physiology. 20, 218-224 (2005).
  40. Rubinstein, E., et al. CD9, CD63, CD81, and CD82 are components of a surface tetraspan network connected to HLA-DR and VLA integrins. Eur J Immunol. 26 (11), 2657-2665 (1996).
  41. Schmidt, S. C., Massenberg, A., Homsi, Y., Sons, D., Lang, T. Microscopic clusters feature the composition of biochemical tetraspanin-assemblies and constitute building-blocks of tetraspanin enriched domains. Sci Rep. 14 (1), 2093(2024).
  42. Zuidscherwoude, M., et al. The tetraspanin web revisited by super-resolution microscopy. Sci Rep. 5, 12201(2015).
  43. Comparative performance analysis of K-means and DBSCAN clustering algorithms on various platforms. Shahriar, N., Akib Al Faisal, S. M., Pinjor, M. M., Sharif Zobayer Rafi, M. A., Rahman Sarkar, A. Proceedings of the 22nd International Conference on Computer and Information Technology (ICCIT), , 1-6 (2019).
  44. Hahsler, M., Piekenbrock, M., Doran, D. dbscan: Fast Density-Based Clustering with R. J Stat Softw. 91 (1), 1-30 (2019).
  45. Pedregosa, F., et al. Machine Learning with PyTorch and Scikit-Learn: Develop machine learning and deep learning models with Python. J Mach Learn Res. 12, 2825-2830 (2011).
  46. Buchwalow, I., Samoilova, V., Boecker, W., Tiemann, M. Non-specific binding of antibodies in immunohistochemistry: fallacies and facts. Sci Rep. 1, 28(2011).
  47. Bond, C., Santiago-Ruiz, A. N., Tang, Q., Lakadamyali, M. Technological advances in super-resolution microscopy to study cellular processes. Mol Cell. 82 (2), 315-332 (2022).
  48. Garcia-Parajo, M. F., Cambi, A., Torreno-Pina, J. A., Thompson, N., Jacobson, K. Nanoclustering as a dominant feature of plasma membrane organization. J Cell Sci. 127 (23), 4995-5005 (2014).
  49. Tan, H. L., Bungert-Plümke, S., Kortzak, D., Fahlke, C., Stölting, G. Determination of oligomeric states of proteins via dual-color colocalization with single molecule localization microscopy. eLife. 11, e76631(2022).
  50. Annibale, P., Vanni, S., Scarselli, M., Rothlisberger, U., Radenovic, A. Identification of clustering artifacts in photoactivated localization microscopy. Nat Methods. 8 (7), 527-528 (2011).
  51. Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging. Nat Methods. 8 (12), 1027-1036 (2011).
  52. Shivanandan, A., Deschout, H., Scarselli, M., Radenovic, A. Challenges in quantitative single molecule localization microscopy. FEBS Lett. 588 (19), 3595-3602 (2014).
  53. Endesfelder, U., Heilemann, M. Art and artifacts in single-molecule localization microscopy: beyond attractive images. Nat Methods. 11 (3), 235-238 (2014).
  54. Lambert, T. J., Waters, J. C. Navigating challenges in the application of superresolution microscopy. J Cell Biol. 216 (1), 53-63 (2017).
  55. Annibale, P., Vanni, S., Scarselli, M., Rothlisberger, U., Radenovic, A. Quantitative photo activated localization microscopy: unraveling the effects of photoblinking. PloS One. 6 (7), e22678(2011).
  56. Jungmann, R., et al. Quantitative super-resolution imaging with qPAINT. Nat Methods. 13 (5), 439-442 (2016).
  57. Unterauer, E. M., Jungmann, R. Quantitative Imaging With DNA-PAINT for Applications in Synaptic Neuroscience. Front Synaptic Neurosci. 13, 798267(2021).
  58. Stein, J., Stehr, F., Jungmann, R., Schwille, P. Calibration-free counting of low molecular copy numbers in single DNA-PAINT localization clusters. Biophys Rep. 1 (2), 100032(2021).
  59. Youn, Y., et al. Quantitative DNA-PAINT imaging of AMPA receptors in live neurons. Cell Rep Methods. 3 (2), 100408(2023).
  60. Yin, H., Flynn, A. D. Drugging Membrane Protein Interactions. Annu Rev Biomed Eng. 18, 51-76 (2016).
  61. Jin, S., et al. Emerging new therapeutic antibody derivatives for cancer treatment. Signal Transduct Target Ther. 7 (1), 39(2022).
  62. To'a Salazar, G., Huang, Z., Zhang, N., Zhang, X. -G., An, Z. Antibody therapies targeting complex membrane proteins. Engineering. 7 (11), 1541-1551 (2021).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

الغشاء البلازميمجهرية فائقة الدقةبروتين CD81التجميع العنقودي القائم على الكثافةارتباط الأجسام المضادةتصحيح الانزياحالأجسام المضادة العلاجية
المجهر الفريد لتحديد الجزيء الواحد لبروتينات الغشاء باستخدام وسم الجسم المضاد الواحد
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.