Method Article

المجهر الفريد لتحديد الجزيء الواحد لبروتينات الغشاء باستخدام وسم الجسم المضاد الواحد

DOI:

10.3791/69853

⸱

March 20th, 2026

 ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry, University of Illinois Chicago, 2University of Illinois Cancer Center, 3Department of Biomedical Engineering, University of Illinois Chicago, 4Department of Biochemistry and Molecular Genetics, College of Medicine, University of Illinois Chicago

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا البروتوكول تصنيف الجسم المضاد الواحد (SAL) لحل التنظيم المكاني على نطاق نانوي لبروتينات الغشاء البلازما. من خلال الاستفادة من التفاعلات التراكمية بين الأجسام المضادة والحامضة على مستوى الجزيئات الفردية، يقوم SAL الغشائي (mSAL) برسم توزيعات الملحمة المحلية مع التقاط سلوك ارتباط الأجسام المضادة في البيئة الخلوية الأصلية.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يحدد الغشاء البلازمي شكل الخلية ويعمل كواجهة تحكم التواصل بين الخلايا. تشكل البروتينات الغشائية فئة رئيسية من الأهداف العلاجية؛ لذلك، فإن التحليل الفائق لغشية الخلية عبر بروتيناته المكونة يحمل وعدا كبيرا في تطوير بيولوجيا الخلية وعلاجات الأجسام المضادة. في هذا الصدد، يمكن مجهر تحديد الموقع للجزيء الواحد (SMLM) من التصور على نطاق نانوي لمنظمات البروتينات على البنى البيولوجية. على الرغم من أهميته، فإن تطبيق SMLM على بروتينات البلازما الغشية يطرح تحديات فريدة. في هذا البروتوكول، نقدم نهجا فعالا باستخدام تصنيف الأجسام المضادة المفردة (SAL) بالتايم لابس يسمى SAL الغشائي (mSAL). نقدم تعليمات مفصلة خطوة بخطوة، بما في ذلك تحسين تركيز الأجسام المضادة، وكثافة طاقة الليزر، ومدة الفترات غير الإضاءة، وإعادة بناء الصورة، وتحليل التعنود المعتمد على الكثافة، لتحديد توزيع البروتينات النانوية للغشاء وشكل الغشية. نستخدم بروتين التتراسبانين CD81 كنموذج لبروتين الغشاء لإثبات قدرة mSAL على كل من الخلايا الثديية الملتصقة والمعلقة. بالإضافة إلى التحليل الفائق لغشاء الخلية وتوزيعات بروتينات الغشاء، تمكن تقنيتنا من دراسة الديناميكا الدوائية للأجسام المضادة العلاجية التي تتفاعل مع أهدافها في بيئة الغشاء الأصلية.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يحتوي غشاء البلازما على مجموعة متنوعة من البروتينات التي تنظم حركة الخلايا، والالتصاق، والحساس، والتواصل بين الخلايا. فهم توزيع بروتينات غشاء البلازما على المستوى النانوي أمر مهم، حيث غالبا ما تتحكم وظيفة البروتين ليس فقط بمستويات التعبير بل أيضا بتنظيمها المكاني على الغشاء 1,2. ومن الجدير بالذكر أن العديد من الأجسام المضادة العلاجية تستهدف بروتينات الغشاء 3,4، مما يجعل التحقيقات على المستوى النانوي ضرورية لفهم كيفية تأثير تفاعلات الأجسام المضادة على منظمة البروتينات الغشائية المحلية. ومع ذلك، لا تزال الخريطة الدقيقة ل....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يستخدم هذا البروتوكول خطوط خلايا جوركات E6.1 وU2OS المعتمدة ولا يشمل مواد بشرية أو حيوانية حية أولية.

1. بذر/هبوط الخلايا وثبيتها

ملاحظة: يتم إعداد العينة وفقا لبروتوكولات التلوين القياسية للفلورة المناعية (IF)، والتي تم تحسينها للحفاظ على التنظيم تحت الخلوي لبروتينات غشاء البلازما عبر أنواع الخلايا المختلفة. إذا كان هناك بروتوكول تلوين مناعي معتمد للهدف المعني، يمكن للمستخدمين اتباع هذا البروتوكول حتى الخطوة 1.2.14 لحجب العينات. يعتمد تصنيف الجسم المضاد الواحد (SAL) على الكشف التراكمي عن الأجسام المضادة الموسومة بالفلورية أثناء ارتباطها بمستضدها على مستوى الجزيء الواحد. تضاف الأجس....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمكن تقنية mSAL الموصوفة في هذا البروتوكول من تصور أحداث ارتباط الأجسام المضادة الفردية بأهدافها المقابلة في غشاء البلازما، مما ينتج خريطة فائقة الدقة لتوزيع بروتين الغشاء. يستخدم CD81 هنا كمثال تمثيلي، رغم أن النهج قابل للتكيف بسهولة مع بروتينات الغشاء الأخرى.

تثبيت خلايا جوركات T بمسافة كافية بين الخلايا يضمن وصول الأجسام المضادة وسطح الزجاج إلى الحومة الغشائية لتستقر العائلات (الشكل 1A). بالإضافة إلى ذلك، يمكن لتقنيات التوصيل ب.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يلعب تنظيم بروتينات الغشاء البلازما دورا حيويا في تنظيم وظيفة الخلية. تقنيات المجهر الفلوري التقليدية محدودة بحد الحيود للضوء، مما يخفي تنظيمها على نطاق النانو. تتغلب SMLM على هذا القيد من خلال تحقيق دقة مكانية تتراوح بين 10-20 نانومتر47، مما يمكن من توصيف مجموعاتهم النانوية 10,48,49. تنشأ تشوهات التجمع في SMLM من تكرار اكتشافات نفس الفلوروفور50، م.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

جميع المؤلفين يعلنون أنه لا يوجد لديهم تضارب مصالح للكشف عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد تم دعم البحث المبلغ عنها في هذا المنشور من قبل المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة التابع للمعاهد الوطنية للصحة تحت الجائزة رقم R35GM146786 وكلية الفنون والعلوم الحرة بجامعة إلينوي في شيكاغو. المحتوى هو مسؤولية المؤلفين وحدها ولا يعكس بالضرورة الآراء الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
الجسم المضاد أليكسا فلور 488 مضاد CD81ثيرمو فيشر العلميMA5-44132الأجسام المضادة للتصوير
الطرد المركزي على سطح الطاولةإبندورف5424
مصل البقر الألبومينميليبورسيغماA7906-100G
زجاج تغطية بغرفة، 8-بئرسيلفيسC8-1-N
وسائط DMEMثيرمو فيشر العلمي11960069
محلول الفوسفات المحلول الملحي المخزن من دولبيكوثيرمو فيشر العلمي14190-144
مصل الأبقار الجنينيميليبورسيغماF0926-500ML
غلوتارالدهيد، 10٪علوم المجهر الإلكتروني16120
كولويدات ذهبية، 100 نانومترتيد بيلا15711&الخلاص؛ 20علامة الائتمان
زيت الغمر  مختبرات كارجيل16245
المجهر المقلوب  مجهزة بوحدة TIRFنيكون إنسترومنتسإكليبس Ti2-Eالمجهر
خط خلية جوركات E6.1ميليبورسيغما88042803-1VLخلايا التعليق
إطلاق الليزر، 6 خطوطأوكسيوسL6CC-CS8-1511ليزر الإثارة
ليبوفيكتامين 2000ثيرمو فيشر العلمي11668019كاشف النقل
أنبوب الطرد المركزي الدقيق، 1.5 ملمتر VWR89000-028
برنامج التصوير المجهرينيكون إنسترومنتسأبحاث عناصر الاستخبارات الوطنية الوطنيةبرنامج التقاط الصور
الهدف: 100x/1.49 CFI APO TIRF نيكون إنسترومنتسMRD01991هدف المجهر
بارافورمالديهايد، 16٪علوم المجهر الإلكتروني15710
البنسلين-ستريبتوميسينثيرمو فيشر العلمي15140-122المضادات الحيوية
محلول بولي-إل-ليزين، 0.01٪ ميليبورسيغماP4707-50ML
كاميرا برايم 95B sCMOSحلول تيليداين فيجن01-برايم-95B-آر-م-16-سيالكاميرا
وسائط RPMI 1640ثيرمو فيشر العلمي11875-093وسائط لخلايا التعليق
أزيد الصوديومثيرمو فيشر العلمي19038-1000
بوروهيدريد الصوديومميليبورسيغما213462-25G
قوارير الزراعة T25ثيرمو فيشر العلمي169900
كرات تتراسبيك الدقيقةعلامة الائتمان
طبق زراعة الأنسجة، 100 مم كورنينغ353003
خط خلايا U2OSATCCHTB-96الخلايا الملتصقة

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zulueta Diaz, Y., de las, M., Arnspang, E. C. Super-resolution microscopy to study membrane nanodomains and transport mechanisms in the plasma membrane. Front Mol Biosci. 11, 1455153(2024).
  2. Levental, I., Lyman, E. Regulatio....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Single Molecule LocalizationMembrane ProteinsSingle Antibody LabelingPlasma MembraneSuper Resolution MicroscopyCD81 ProteinDensity Based ClusteringAntibody BindingDrift CorrectionTherapeutic Antibodies

Related Articles