$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
أجريت جميع التجارب على الحيوانات وفقا للإرشادات الدولية لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية وامتثلت لتوصيات منظمة التعاون الاقتصادي والتنمية. تمت الموافقة على بروتوكول الدراسة من قبل لجنة العناية بالحيوانات واستخدامها (IACUC) في جامعة بهاء الدين زكريا في ملتان. (رقم الموافقة: 3 /UREC/2025). تم بذل كل الجهود لتقليل معاناة الحيوانات وتقليل عدد الحيوانات المستخدمة.
1. تحضير مستخلص الميثانول الكامل T. mantaly (TMWM)
- اجمع السيقان والجذور والأوراق الطازجة من T. mantaly، وتحقق من صحة المادة النباتية، ووضع عينة قسيمة في معشبة معترف بها.
ملاحظة: تم جمع المواد النباتية المستخدمة في هذه الدراسة من مشتل البنجاب، طريق ماتيتال، ملتان، في 12 نوفمبر 2023. الإحداثيات الجغرافية لموقع المجموعة هي 30.2236° شمالا، 71.4755° شرقا. تم توثيق النبتة تصنيفيا من قبل عالم التصنيف البروفيسور دكتور. ظفر الله ظفر، أستاذ علم النبات بجامعة بهاء الدين زكرية، ملتان، وتم إيداع عينة قسيمة (www.theplantlist.org/tpl1.1/record/kew-2434420) في معشبة جامعة بهاء الدين زكريا في ملتان. تم جمع النبات من موطنه الطبيعي في ظروف بيئية مناسبة، وتم توثيق موقع الجمع بصور فوتوغرافية.
- غسل المادة النباتية بماء الصنبور ثم الماء المقطر لإزالة الملوثات، ثم جفف في الظل عند 25–30 درجة مئوية لمدة 7–10 أيام حتى يصل الوزن إلى ثبات.
- طحن المادة المجففة حتى تصبح مسحوقا خشنا ووزن 500 جرام باستخدام ميزان تحليلي. انقل المسحوق إلى وعاء زجاجي نظيف وأضف 2.5 لتر من الميثانول.
- انقع الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة 72 ساعة مع هز متقطع كل 6–8 ساعات. فلتر عبر ورق فلتر واتمان رقم 1.
- ركز المفلتر تحت ضغط منخفض باستخدام مبخر دوار عند 39 درجة مئوية، ثم خزن المستخلص المجفف في حاويات محكمة الإغلاق في درجة حرارة الغرفة حتى الاستخدام.
تحذير: الميثانول سام وقابل للاشتعال. قم بالتعامل داخل غطاء البخار أثناء ارتداء قفازات ونظارات واقية. التخلص من نفايات المذيبات وفقا لإرشادات السلامة الكيميائية المؤسسية.
ملاحظة: يمكن تخزين المستخلص المجفف في حاويات محكمة الإغلاق على درجة حرارة الغرفة لعدة أسابيع قبل إجراء المزيد من التحليل.
2. تقدير المحتوى الفينولي الكلي (طريقة فولين–تشوكالتيو)
- تحضير محلول حمض غاليك (100 ميكروغرام/مل) عن طريق إذابة 10 ملغ من حمض الجاليك في 100 مل من الميثانول وتحضير تخفيفات متسلسلة تتراوح بين 1–10 ميكروغرام/مل.
- قم بإذابة مستخلص 10 ملغ في 10 مل من الميثانول للحصول على محلول بقوة 1 ملغ/مل. نقل 0.5 مل من كل معيار أو عينة إلى أنابيب اختبار.
- أضف 2.5 مل من مادة فولين–تشوكالتيو مخففة بنسبة 1:1 مع الماء، ثم أضف 2.0 مل من محلول كربونات الصوديوم بنسبة 7.5٪. اخلط واحتضن عند 25 ± 2 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
- قس الامتصاص عند 765 نانومتر مقابل كاشف فارغ وحساب إجمالي المحتوى الفينولي كمكافئ لحمض الجاليك لكل جروم مستخلص من الملغيوم.
3. تقدير إجمالي محتوى الفلافونويدات (طريقة كلوريد الألمنيوم)
- تحضير محلول مخزون روتين (1000 ميكروغرام/مل) عن طريق إذابة الروتين في الميثانول، ثم تحضير تخفيفات متسلسلة في نطاق 10–80 ميكروغرام/مل.
- انقل 0.5 مل من محلول القياس أو محلول الاستخلاص إلى أنابيب الاختبار وأضف 1.5 مل من الميثانول، 0.1 مل من محلول كلوريد الألمنيوم 10٪ (AlCl₃)، 0.1 مل من محلول أسيتات البوتاسيوم 1 مل، و2.8 مل من الماء المقطر.
- حضن عند درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة وقس الامتصاص عند 415 نانومتر. تظهر النتائج كأنها مكافئ مغليغ روتين لكل جم مستخلص9.
4. تحليل الكروماتوغرافيا الغازية–مطيافية الكتلة (GC–MS)
- قم بإذابة مستخلص 10 ملغ في ميثانول بدرجة HPLC بسعة 1 مل وتصفية عبر فلتر حقنة بحجم 0.22 ميكرومتر إلى قارورة GC.
- إجراء التحليل باستخدام مدفع Agilent 7890B GC مقترن ب 5977A MS مزود بعمود شعري HP-5MS (30 م × 0.25 مم × 0.25 ميكرومتر). استخدم الهيليوم كغاز حامل عند 1.0 مل/دقيقة مع درجة حرارة الحقن عند 250 درجة مئوية.
- حافظ على درجة حرارة مصدر الأيونات عند 230 درجة مئوية ودرجة حرارة رباعي الأقطاب عند 150 درجة مئوية. برمج الفرن من 60 درجة مئوية (لمدة دقيقتين للانتظار) إلى 180 درجة مئوية عند 10 درجة مئوية في الدقيقة ثم إلى 280 درجة مئوية عند 5 درجات مئوية في الدقيقة مع التوقف النهائي لمدة 10 دقائق.
- حقن 1 ميكرولتر من المستخلص المصفاة في وضع تقسيم (10:1) وتسجيل كروماتوغرامات على نطاق m/z من 40–600. شغل مذيب فارغ قبل حقن العينة.
- تحديد المركبات من خلال مقارنة الأطياف مع مكتبة الطيف الكتلي في NIST وتأكيد الهويات باستخدام زمن الاحتفاظ وتطبيع منطقة الذروة.
5. النشاط المضاد للالتهابات (وذمة الكف الناتجة عن الكاراجينان)
- استخدم فئران ويستار ألبينو صحية تزن بين 180–220 جرام وتتأقلم مع الجو لمدة 7 أيام. الحيوانات تصوم طوال الليل قبل التجربة مع وصول مجاني للماء.
- قسم الحيوانات عشوائيا إلى خمس مجموعات (n = 5 لكل مجموعة). إعطاء محلول ملحي عادي للضوابط؛ إعطاء 100 و200 و300 ملغ/كغ عن طريق الفم لمجموعات العلاج؛ وإعطاء ديكلوفيناك الصوديوم (40 ملغ/كغ، تحت الجلد) للمجموعة القياسية.
- بعد ساعة واحدة، حقن 0.1 مل من الكاراجينان الطازج بنسبة 1٪ في المنطقة تحت الأخمصية من الكف الخلفي الأيمن.
- قس سمك الأرجل عند 0، 1، 2، 3، و4 ساعات باستخدام كاليبر فيرنييه رقمي وحساب الزيادة بالنسبة للخط الأساسي.
- حدد نسبة تثبيط الوذمة مقارنة بمجموعة الضابطة10.
تحذير: قد يسبب مسحوق الكاراجينان التهيج. تجنب الاستنشاق وملامسة الجلد والتخلص من النفايات البيولوجية وفقا لإجراءات السلامة البيولوجية المؤسسية.
6. النشاط المسكن (اختبار غمر الذيل)
- استخدم فئران ويستار الألبينو المتأقلمة التي تم الحفاظ عليها تحت دورة ضوء/ظلام لمدة 12 ساعة مع وصول مجاني للطعام والماء.
- قسم الحيوانات إلى خمس مجموعات (n = 5). يعطى الماء المقطر للمجموعة الضابطة، ويستخلص عن طريق الفم بجرعات 100 و200 و300 ملغ/كجم لمجموعات المعالجة، ويعطى الباراسيتامول (20 ملغ/كغ) للمجموعة القياسية.
- حافظ على حمام الماء عند 55 ± 1 درجة مئوية. اغمر 1–2 سم من الذيل البعيد وسجل زمن انسحاب القاعدة باستخدام زمن قطع 15 ثانية.
- كرر القياسات بعد 30، 60، 90، و120 دقيقة بعد العلاج، مع التأكد من أن نفس الجزء من الذيل يغمر في كل مرة.
- احسب نسبة زيادة الكمون وعبر عن النتائج كمتوسط ± SD.
7. النشاط المضاد للحرارة
- استخدم فئران متأقلمة وسجل درجة حرارة المستقيم الطبيعية باستخدام مقياس حرارة رقمي مزلق.
- حضر تعليق خميرة 20٪ في ماء مقطر وحقنه تحت الجلد بقوة 10 مل/كجم في الظهر لتحفيز الحمى الزائدة.
- بعد 18 ساعة، قس درجة حرارة المستقيم مرة أخرى واستبعد الحيوانات التي لا تظهر زيادة لا تقل عن 0.5 درجة مئوية.
- قسم الفئران المحمومة عشوائيا إلى خمس مجموعات (n = 5 لكل مجموعة). أعطى محلول ملحي طبيعي للمجموعة الضابطة، واستخلاص النبات عن طريق الفم بجرعات 100، 200، و300 ملغ/كغ لمجموعات المعالجة، والباراسيتامول (150 ملغ/كغ) للمجموعة القياسية.
- قس درجة حرارة المستقيم عند 0 و1 و2 و3 ساعات بعد العلاج وحساب الانخفاض بالنسبة لخط الأساس11.
تحذير: تعليق الخميرة من قبل التخمير هو مواد بيولوجية ويجب التعامل معها باستخدام احتياطات السلامة البيولوجية القياسية. التخلص من المواد المعلقة غير المستخدمة والمواد الملوثة كنفايات بيولوجية.
ملاحظة: بعد حقن الخميرة، يمكن إعادة الحيوانات إلى الأقفاص والحفاظ عليها تحت ظروف قياسية حتى قياس درجة الحرارة.
8. دراسات السمية الحادة
- أجر الدراسة وفقا لإرشادات منظمة التعاون الاقتصادي والتنمية (OECD) رقم 423 باستخدام فئران ويستار المهمقة السليمة من كلا الجنسين ووزنها بين 180 و220 جرام.
- الحيوانات تصوم طوال الليل قبل الجرعة وقسمها عشوائيا إلى مجموعات (n = 5 لكل مجموعة).
- إعطاء جرعة فموية واحدة من 5 جرام/كجم من المستخلص للحيوانات المعالجة والماء المقطر (1 مل/كجم) للحيوانات الضابطة.
- راقب الحيوانات بشكل متواصل خلال أول 4 ساعات بعد الجرعة، بشكل دوري خلال أول 24 ساعة، ويويا لمدة 14 يوما.
ملاحظة: تشمل معايير الملاحظة تغيرات في حالة الجلد والفرو، والعينين والأغشية المخاطية، ونمط التنفس، وإفراز اللعاب، والرعشة، والتشنجات، والنشاط الحركي، والاستجابات السلوكية العامة.
- سجل العلامات السريرية للسمية، والوفيات، ووزن الجسم في اليوم 0، واليوم، واليوم 14.
- تقييم السلامة بناء على معدل البقاء والتغيرات السلوكية أو الجسدية الملحوظة12.
ملاحظة: يشمل تقييم السلوك مراقبة الوضعية، والمشي، ومستوى النشاط، وسلوك العناية، والاستجابة للمحفزات الخارجية، وعلامات الخمول أو فرط النشاط.
9. التحليل الإحصائي
- تجميع جميع البيانات التجريبية والتعبير عن النتائج كمتوسط ± انحراف معياري مع n = 5 حيوانات لكل مجموعة.
- أدخل البيانات في برنامج GraphPad Prism بصيغة عمود.
- تقييم طبيعية البيانات باستخدام اختبار شابيرو-ويلك قبل تطبيق التحليل المقارن.
- قم بإجراء تحليل إحصائي باستخدام برنامج GraphPad Prism باختيار: تحليل → مقارنات متعددة ANOVA → Tukey أحادية الاتجاه.
- إجراء تحليل أحادي الاتجاه للتباين يليه اختبار المقارنة المتعددة بعد الحدث لتوكي لتحديد الدلالة الإحصائية بين المجموعات.
- اعتبر الفروق ذات الدلالة الإحصائية عند p < 0.05.