مقالة منهجية

نموذج تصلب الشرايين في الفئران ناتج عن كل من الربط الجزئي للسباط السباتي والتعبير الزائد عن PCSK9

548 مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/69862

⸱

فبراير 27, 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Vascular Surgery, Peking Union Medical College Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, 2State Key Laboratory of Complex, Severe, and Rare Diseases, Department of Pathophysiology, Institute of Basic Medical Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, 3Qinghai Cardio-Cerebrovascular Specialty Hospital, Qinghai High Altitude Medical Research Institute, 4Research Center of High Altitude Medicine

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

يحفز نموذج الفأر القابل للتكرار تصلب الشرايين السباتي من خلال الجمع بين فيروس PCSK9 المرتبط بالألدية (PCSK9-AAV) - النظام الغذائي عالي الدهون وفرط كوليسترول الدم المعبر عن الدهون وربط جزئي للسبايا السباتي الأيسر (PCL)، مما يعيد تكرار الفيزيولوجيا المرضية البشرية. يتيح ذلك تحفيز سريع لآفات تصلب الشرايين السباتي الشبيهة بالإنسان في فئران البرية دون تعديل جينومي، مما يوفر أداة موحدة لتسهيل أبحاث تصلب الشرايين السباتي.

الملخص

نقص نماذج تصلب الشرايين الخاصة بالسباتي السريعة والقابلة للتكرار في الفئران البرية يحد من الدراسات الانتقالية لبيولوجيا اللويحات والعلاجات. يصف هذا البروتوكول طريقة غير معدلة جينوميا وفعالة من حيث الوقت لتحفيز تصلب الشرايين السباتي القابل للتكرار في فئران C57BL/6 من خلال الجمع بين فرط تعبير PCSK9 المرتبط بالفيروس الملحدي (AAV)، ونظام غذائي عالي الدهون الشباهي الطبيعي، وربط جزئي للشريان السباتي (PCL). الهدف هو توفير سير عمل موحد يعيد إنتاج السمات المرضية الرئيسية لمرض السباتي البشري - فرط الدهون في الدم بالإضافة إلى اضطراب تدفق الدم - دون الحاجة إلى حيوانات معدلة وراثيا. تشمل الطرق جرعة PCSK9-AAV وإعطائها، التحضير المحيطي بالعملية، الربط الجراحي خطوة بخطوة للشريان السباتي الأيسر، الرعاية بعد العملية، النظام الغذائي، جمع الأنسجة، والتقييم النسيجي بما في ذلك Oil Red O وتلوين فيرهوف-فان جيسون. تشير النتائج إلى ارتفاع مستويات الكوليسترول الدوراني وبروتينات الدهون منخفضة الكثافة مقارنة بالقيم المرجعية. تتطور لويحات تصلب شرايين واضحة عند الشريان السباتي المربوط الأيسر، مع زيادة ملحوظة في تراكم الدهون وتكثيف كبير في وسط الشرايين الداخلية مقارنة بالشريان الضابط الأيمن غير المربوط. يحسن هذا البروتوكول الموحد قابلية التكرار وسهولة الوصول للباحثين الذين يدرسون تكون لويحات السباتين السباتي، وتطورها، واستراتيجيات التدخل، ويسهل المقارنات بين المختبرات للعلاجات التجريبية.

المقدمة

تظل أمراض القلب والأوعية الدموية (CVD) السبب الرئيسي للوفيات العالمية، حيث يعد تصلب الشرايين أساسا مرضيا شائعالها. 1. الشريان السباتي موقع حرج لظهور الآفات التصلب الشرايي؛ دراسة تصلب الشرايين السباتي أمر ضروري لفهم مسببات أمراض القلب والأوعية الدموية وتطوير استراتيجياتعلاجية 2. نماذج الحيوانات أدوات لا غنى عنها لأبحاث تصلب الشرايين في الجسم الحي ، ومع ذلك غالبا ما تعاني النماذج الحالية من حيث الراحة وقدرتها على إعادة تلخيص السمات الفسيولوجية المرضية البشرية.

مقارنة بتصلب الشرايين في مواقع شرايين أخرى (مثل الشريان الأبهري، الشريان الفخذي)، فإن تكوين تصلب الشرايين السباتي يتأثر بشكل أكبر بديناميكا الدم. يتعرض الشريان السباتي لإجهاد قص مرتفع (10-15 دين/سم²، داينز لكل سنتيمتر مربع)، وهو الثاني بعد الشريان التاجي (6-45 دين/سم²)3. خصوصا عند انقسام السباتي، يحدث تدفق الدوامات، والذي يتميز بإجهاد قصي مضطرب ومتذبذب. هذا البيئة الدموية غير الطبيعية تحفز تنشيط مستمر للالتهابات لخلايا البطانة المحلية، وتتميز بزيادة في التعبير عن جزيئات الالتصاق والكيموكينات التي تسهل تجنيد الخلايا الأحادية وبدء تصلب الشرايين3. بالإضافة إلى ذلك، غالبا ما تظهر الآفات التصلب الشراييية عالية الخطورة لدى الإنسان درجة تضيق تتجاوز 70٪، والتي تعرف بأنها نسبة الانخفاض في قطر الضوء الناتج عن اللويحة4. لذا، فإن النماذج الحيوانية القادرة على تحفيز تضيق تصلب شرايين شديد مهمة.

نموذج الربط السباتي الجزئي (PCL) هو نموذج تصلب الشرايين الناتج عن اضطراب مستمر في تدفق الدم، ويتميز بوقت النمذجة القصير والآفات الشديدة5. البروتين الأبوليبوبروتين E (ApoE) هو بروتين رئيسي يشارك في استقلاب وتطهير الكوليسترول المتداول وبروتينات الدهون الغنية بالدهون الثلاثية الجليسريد، ويلعب دورا حيويا في الحفاظ على توازن الدهون في البلازما. ومع ذلك، فإن نموذج PCL التقليدي الذي يستخدم فئران ApoE-knockout (ApoE⁻/⁻) صعب ومكلف في إنشاء5. عندما يكون هناك حاجة لإخراج جين مستهدف، يكون القضاء على الجين المزدوج ضروريا (لكل من الجين المستهدف وجين ApoE)، مما يزيد من تعقيد عملية النمذجة. على النقيض من ذلك، عندما تستخدم فئران النوع البري C57BL/6 فقط لعلاج PCL، يفتقر النموذج إلى فرط كوليسترول الدم، وهو عامل خطر أساسي لتصلب الشرايين البشرية، ونادرا ما يشكل آفات تصلب شرايين غنية بالدهونبارزة 6,7. نماذج أخرى، مثل ApoE⁻/⁻ أو LDLR-knockout (LDLR⁻/⁻) التي تغذى على نظام غذائي عالي الدهون (HFD)، تستخدم على نطاق واسع في أبحاث تصلب الشرايين لدراسة تصلب الشرايين الأبهرية. ومع ذلك، تفشل هذه النماذج في دمج تأثير اضطراب تدفق الدم ولا يمكنها تكوين تصلب شرايين شديد في فترة قصيرة. أظهرت دراسات سابقة أنه بعد 3 أشهر من تغذية HFD، فإن فئران ApoE⁻/⁻ أو LDLR⁻/⁻ لا تطور سوى لويحات تصلب شرايين خفيفة في منطقة الشريان الأبهر أو الشريان العضدي والسيفالي، بينما لا تتكون آفات واضحة في الشرايين السباتي 8,9.

يعتبر بروبروتين كونفرتاز سبتيليزين/كيكسين النوع 9 (PCSK9) منظما رئيسيا لاستقلاب الكوليسترول منخفض الكثافة (LDL-C): فهو يعزز تحلل مستقبلات LDL، مما يزيد من مستويات LDL-C في المصل10. يتيح فيروس الأدينوكرمون المؤتلف الذي يعبر عن PCSK9 (PCSK9-AAV) من فرط كوليسترول الدم القابل للتحكم في الجرعة في فئران WT دون الحاجة إلى تعديلات جينية11. الجمع بين فرط الكوليسترول الناتج عن PCSK9-AAV، وHFD (الذي يزيد من تفاقم اضطرابات الأيض الدهنية)، وPCL (الذي يسبب اضطرابا ديناميكيا دمويا موضعيا) يسمح ببناء نموذج حيواني يدمج عاملين رئيسيين لخطر تصلب الشرايين البشري: فرط الكوليسترول واضطراب التدفق.

استنادا إلى التقدم البحثي السابق12، يؤسس هذا البروتوكول طريقة موحدة لتحفيز تصلب الشرايين السباتي في فئران C57BL/6. مقارنة ببروتوكولات النماذج الحالية، يقدم ثلاث مزايا رئيسية: (1) الصلة الفيزيولوجية المرضية: يعيد في الوقت نفسه فرط كوليسترول الدم واضطراب التدفق، مما يؤدي إلى آفات السباية تظهر سمات مشابهة لتصلب الشرايين البشري في المرحلة المتوسطة إلى المتأخرة؛ (2) قابلية التكرار: يقلل التحليل التفصيلي لجرعة AAV، والإجراءات الجراحية، والتحكم الغذائي من التفاوت بين المختبرات؛ (3) التوقيت الصحيح: مدة النمذجة الإجمالية هي 5 أسابيع، مما يقلل بشكل كبير من الوقت المطلوب لإنشاء النموذج.

هذا البروتوكول مناسب للباحثين الذين يدرسون بيولوجيا جدار الأوعية الدموية، ويقيمون فعالية الأدوية المضادة لتصلب الشرايين، ويستكشفون التفاعل بين ديناميكا الدم وأيض الدهون في تصلب الشرايين. ومن الجدير بالذكر أن هذا البروتوكول هو نموذج يركز على السباتي، ولا يمكنه تكرار جميع جوانب عوامل الخطر البشرية الجهازية لتصلب الشرايين، بما في ذلك على سبيل المثال لا الحصر، التدخين، السكري، ارتفاع ضغط الدم، والسمنة. فيما يلي دليل خطوة بخطوة لتأسيس النماذج وتقييم الآفات.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تمت الموافقة على جميع الإجراءات من قبل لجنة أخلاقيات الحيوان في لجنة أخلاقيات تجارب الحيوانات في كلية بكين الطبية المتحدة (ACUC-A02-2024-006) وتتوافق مع دليل العناية واستخدام الحيوانات المختبرية.

1. تحضير الحيوانات التجريبية

  1. اشتر فئران ذكر C57BL/6 بعمر 6-8 أسابيع (وزن الجسم: 22-25 جم).
  2. فئران المنزل في بيئة خالية من مسببات الأمراض (SPF) تحت ظروف محكمة التنظيم: درجة الحرارة (23 ± 1°C)، الرطوبة (50 ± 5٪)، ودورة ضوء/ظلام لمدة 12 ساعة (الإضاءة: 07:00-19:00).
  3. قبل التجربة، قدم للفئران نظاما غذائيا قياسيا للطعام (نسبة طاقة دهونية 10٪) وماء معقم، مع إمكانية الوصول المجاني إلى الطعام والماء، لمدة أسبوع واحد من التكيف.

2. تحضير وإعطاء PCSK9 -AAV

تحذير: عامل AAV كخطر للسلامة البيولوجية ونفذ جميع الإجراءات وفقا لمستوى السلامة البيولوجية المؤسسي المناسب (عادة BSL-2). ارتد قفازات مزدوجة، واقي للعين، وملابس واقية. تجنب تكوين الهباء الجوي أثناء التعامل. قم بتطهير المواد الملوثة ب AAV بالمطهرات المناسبة (مثل 10٪ مبيض) واتبع بروتوكولات المسؤولية والاستجابة للحوادث المحددة بوضوح. يجب تعطيل جميع النفايات الملوثة بالفيروس عن طريق الغمر في مطهرات تحتوي على الكلور.

  1. اشتر PCSK9-AAV المؤتلف (rAAV8-HCRApoE/hAAT-D377Y-mPCSK9).
  2. تحقق من عيار AAV بواسطة PCR الكمي في الوقت الحقيقي يستهدف محفز CMV: كان العيار النهائي 6.10×10¹³ vg/mL (جينومات ناقلة لكل مليليتر). خزن AAV عند -80°C وتجنب تكرار دورات التجمد والذوبان (≤3 دورات تجمد-ذوبان).
  3. قم بإذابة أنبوب الطرد المركزي على الجليد لمدة 15-20 دقيقة، ثم قلب أنبوب الطرد المركزي بلطف 3-5 مرات للخلط (تجنب الدوامة).
  4. تخفيف PCSK9-AAV باستخدام محلول ملحي معقم مع فوسفات (PBS) إلى تركيز نهائي 2×10¹¹ vg/200 ميكرولتر لكل فأر.
  5. الحقن عبر حقن وريد الذيل (i.v.): ثبت الفأر باستخدام حامل حقن ذيل الفأر الذي يرى الأوردة وحقن 200 ميكرولتر من الحقن المخفف ببطء باستخدام حقنة الأنسولين (معدل الحقن: 10 ميكرولتر/ثانية). نقطة الحقن هي أسبوع قبل الرعب الصليبي الخلفي (الشكل 1A).

3. التحضير قبل العملية لربط السباتي الجزئي

تحذير: تريبروموإيثانول هو مادة كيميائية خاضعة للرقابة مع خطر الجرعة الزائدة. قم بالإعطاء بدقة حسب وزن الجسم، وتجنب الحقن المتكررة، وسجل وقت وحجم الجرعة بدقة. تخزين الجهة في حاوية مغلقة وتأكد من أن التحضير والاستخدام يتم بواسطة أفراد مدربين فقط. في حالات الاشتباه في تناول جرعة زائدة، ابدأ إدارة الطوارئ ووثق الحادث.

  1. تخدير الفئران عن طريق الحقن داخل الصفاق (i.p.) من ترايبروموإيثانول (2.5٪ أفرتين، 0.18 مل/10 جم) حتى يفقد منعكس التقويم (حوالي 2-3 دقائق). ثم انقل الفأرة إلى وسادة تسخين (37 ± 0.5°C). تحقق من تأثير التخدير عن طريق قرص أصابع القدم.
    ملاحظة: التخدير ضروري لنجاح الجراحة. لتقليل مخاطر التخدير، يجب تجنب الحقن المتعددة بالتخدير. قبل بدء الجراحة، يجب تحديد جرعة التخدير بناء على المدة الجراحية المتوقعة. بالإضافة إلى ذلك، يوصى بأن تكون مدة الجراحة لكل فأر <30 دقيقة لتقليل المخاطر المرتبطة بالإجراءات الطويلة.
  2. أثناء الجراحة، تحقق من معدل تنفس الفأر (الطبيعي: 40-60 نفسا/دقيقة) وردة فعل الأخمص عن طريق قرص وسادة الكف الخلفية بلطف بالملقط كل 5 دقائق.
  3. ضع كريم إزالة الشعر جيدا على جلد الفأر الأمامي في عنق الرحم. بعد دقيقتين إلى ثلاث دقائق، أزل الشعر الأمامي العنقي باستخدام عشاش قطنية ونظف الشعر المتبقي بالمحلول الملحي العادي. عقم الجلد المكشوف ب 5٪ بوفيدون-يودين ثلاث مرات.
  4. إجراء الجراحة في خزانة السلامة البيولوجية في غرفة فئران معقمة. قم بتعقيم مساحة الجراحة بضوء فوق بنفسجي للحفاظ على تعقيم الجسم قدر الإمكان وقم بتعقيم جميع الأجهزة المعدنية.
    ملاحظة: البيئة المعقمة والتعقيم الشامل ضروريان لضمان بقاء الفأر بعد العملية واستقراره الفسيولوجي.

4. الربط الجزئي للسباتي السباتي - إجراء جراحي

  1. قم بعمل شق في منتصف المنتصف (حوالي 1.0-1.5 سم) في عنق الفأر باستخدام مقص جراحي معقم؛ يفصل الأنسجة تحت الجلد وعضلة القصية الترقاء مع ملقط غير حاد لكشف الشريان السباتي المشترك الأيسر (LCCA).
    ملاحظة: يجب ترطيب منطقة العملية باستمرار بمحلول ملحي دافئ عادي لمنع حدوث صدمات إضافية ناجمة عن جفاف الأوعية الدموية/الأنسجة.
  2. افصل بشكل مباشر العصب المبهم عن العصب المبهم (الموجود بجوار الشريان) لتجنب تلف العصب المبهم (الذي قد يسبب اكتئاب التنفس).
  3. قم بتقشير الأعلى على طول LCCA لكشف الشريان السباتي الداخلي (ICA)، الشريان السباتي الخارجي (ECA)، الشريان القذالي (OA)، والشريان العلوي للغدة الدرقية (STA) (الشكل 1B).
  4. استخدم غرز حريرية معقمة بحجم 6-0 لربط الشريان السباتي الخارجي الأيسر فوق العضلة العصبية. ثم استخدم غرزة حرير معقمة أخرى بحجم 6-0 لربط جذور ال ICA والفتحات الدهوية في نفس الوقت.
    ملاحظة: تجنب ربط الأعصاب والأنسجة المحيطة الأخرى. حجب تماما تدفق التحويلة في ECA/ICA/OA مع الحفاظ على درجة معينة من التدفق التراجعي في LCCA. يجب تقييم تأثير الربط من خلال مراقبة حالة النزيف/تدفق الدم والنبض الشرياني البعيد.
  5. افحص وجود نزيف في موقع الجراحة. إذا حدث نزيف، اضغط بلطف باستخدام عشاش قطنية معقمة لمدة 30-60 ثانية للحصول على الرطوبة الدموية. قم بخياطة الجلد باستخدام لاصق الأنسجة أو خياطة جراحية.
    ملاحظة: تجنب تسرب اللاصق الزائد إلى الأنسجة تحت الجلد.

5. رعاية ما بعد ربط السبايا الجزئي والتدخل في النظام الغذائي عالي الدهون

  1. أعط 0.5 مل من محلول ملحي دافئ طبيعي عبر الحقن داخل الصفاق لاستبدال السوائل بعد العملية.
  2. تخفيف الألم عن طريق حقن الميلوكسيكام تحت الجلد (0.1 ملغ/كغ) مباشرة بعد الجراحة و12 ساعة بعد العملية.
  3. ضع الفأر في قفص تعافي ساخن (37°C) حتى يستعيد رد فعل الاستقامة (حوالي 15-30 دقيقة). راقب الفأر بحثا عن السلوكيات غير الطبيعية (مثل الخمول، ضيق التنفس) خلال 24 ساعة من العملية.
  4. قدم المضادات الحيوية لمنع العدوى بعد الجراحة كما ينصح الأطباء البيطريون، مثل مياه الشرب التي تحتوي على مضادات حيوية لمدة 7 أيام بعد الجراحة.
  5. أطعم ب HFD على الطريقة الغربية (بنسبة طاقة دهنية 40٪ ومحتوى كوليسترول 1.25٪) حتى تقييم الآفة (بعد 4 أسابيع من العملية).
    ملاحظة: خزن جهاز HFD عند 4°C لمنع أكسدة الدهون واستخدمه خلال أسبوعين من فتحه. استبدل جهاز HFD كل يومين لضمان نضارة الفئران ومراقبة كمية الطعام التي يتناولها الفئران يوميا (كمية الطعام المعتادة: حوالي 4-5 جرام لكل فأر يوميا). تزامن تغذية HFD مع فرط الكوليسترول الناتج عن PCSK9-AAV يعظم ترسيب الدهون في الشريان السباتي؛ تأخير بدء HFD سيقلل من شدة الآفات.

6. جمع العينات ومعالجتها

تحذير: يطلق بارافورمالديهايد أبخرة سامة. يجب أن يتم التحضير والاستخدام والإزالة باستخدام غطاء بخار كيميائي مع ارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة (قفازات، نظارات أمان، ومعطف مختبر). التخلص من النفايات باستخدام إجراءات تحييد وجمع النفايات الكيميائية المعتمدة. يجب تحييد المثبتات وجمعها مركزيا وفقا لبروتوكولات التخلص المؤسسية من النفايات السائلة.

ملاحظة: تم الحصول على عينات تصلب الشريان السباتي البشرية في هذه الدراسة من مرضى يعانون من تضيق الشريان السباتي وخضعوا لاستئصال بطن الشريان السباتي. تتوافق هذه الدراسة مع إعلان هلسنكي وقد تمت الموافقة عليها من قبل مجلس مراجعة الأخلاقيات المؤسسية في مستشفى كلية بكين الطبية المتحدة (PUMCH) (رقم JS-2966). قدم جميع المشاركين في الدراسة موافقة مكتوبة مستنيرة.

  1. بعد 4 أسابيع من العملية، تخدر الفئران عن طريق حقن التريبروموإيثانول داخل الصفاق.
  2. إجراء عملية فتح الصدر الثنائية على فئران مخدرة وثقب القلب لجمع عينات دم لفحوصات دهون الدم. بعد ذلك، قم بحقن البطين الأيسر بكمية 20 مل من متلازمة زبدة الفول الباردة جدا لطرد الدم المتبقي من الأوعية الدموية بسرعة 3-6 مل/دقيقة. لاحظ تغيرات لون الأنسجة كمؤشر بصري على إتمام التروية.
    ملاحظة: إذا سمحت الأخلاقيات أو اللوائح المؤسسية، يمكن استخدام طرق بديلة إذا تم توضيحها بوضوح وتنفيذ وفقا لمتطلبات لجنة رعاية واستخدام الحيوانات المؤسسية المحلية (IACUC). يجب حرق جثث الحيوانات من قبل فريق الطب البيطري المؤسسي أو المقاولين المصرح لهم وفقا للوائح النفايات البيولوجية أو معالجتها عبر إجراءات التخلص من المخاطر البيولوجية المعتمدة.
  3. قم بتشريح وحصاد الشرايين السباتية مع القلب، وعزل الشريان السباتي الثنائي تحت المجهر، وتثبيته في 4٪ بارافورمالديهايد (PFA) عند 4°C لمدة 24 ساعة.
  4. انقل الشريان السباتي الثابت إلى محلول سكروز بنسبة 30٪ (مذاب في PBS) وحضن عند 4°C لمدة 24 ساعة (حتى تغوص الأنسجة). قم بتثبيت الشريان في مركب درجة حرارة القطع المثلى (OCT) وخزنها عند -80°م.
  5. استخدم جهاز تجميد لقطع مقاطع عرضية بسماكة 5 ميكرومتر من الشريان السباتي الأيسر المشترك (موقع المقطع: 1 مم قريب من موقع الربط؛ درجة حرارة القطع: -20°م ~-22°م، الضبط الدقيق بناء على محتوى النسيج السائق). باستخدام فرشاة ناعمة مبردة مسبقا، انقل القسم بلطف إلى لوحة مقاومة الدوران في جهاز التبريد لضمان استبعادها. أمسك شريحة مغلفة بولي-إل-ليسين بزاوية شبه عمودية واجعله ببطء مع القسم.
    ملاحظة: خطوة التروية ضرورية لإزالة الدم المتبقي؛ وإلا، فسوف يتداخل مع تلطيخ الآفات. تثبيت كامل للشريان خلال 30 دقيقة بعد القتل الرحيم للحفاظ على شكل الأنسجة.

7. تقييم الآفات التصلب الشرايين 1 - صبغة زيتية باللون الأحمر O

  1. جفف الأقسام في الهواء عند درجة حرارة الغرفة (20-25 درجة مئوية) لمدة 30 دقيقة؛ انقع في 60٪ إيزوبروبانول لمدة دقيقة واحدة، ثم حضنه في محلول زيت أحمر (مخفف بنسبة 3:2 مع 60٪ إيزوبروبانول) في درجة حرارة الغرفة (20-25 درجة مئوية) لمدة 10 دقائق.
  2. قم بالتميز بغمر الشريحة بالكامل في 60٪ إيزوبروبانول في درجة حرارة الغرفة لمدة ~5-10 ثوان مع تحريك لطيف لإزالة الصبغة غير المرتبطة؛ صبغ بالهيماتوكسيلين لمدة 30 ثانية؛ اشطف بماء الصنبور لمدة 5 ثوان (لتزوين نوى الخلية).
  3. التقاط صور الأقسام باستخدام ماسح الشرائح أو المجهر البصري بتكبير 5x و10x و20x؛ حلل كمية مساحة ترسيب الدهون باستخدام برنامج ImageJ (الإصدار 1.54p) - احسب نسبة مساحة O-موجبة للزيت الأحمر نسبة إلى المساحة الداخلية الكلية.
  4. الصورة J إجراءات القياس
    1. افتح الصورة؛ اختر أداة الاختيار الحر لتحديد منطقة الوسائط المباشرة يدويا. انتقل إلى أدوات التحليل > > مدير العائد على الاستثمار واضغط على إضافة.
    2. اذهب إلى الصورة > اضبط عتبة الألوان >؛ اضبط معايير اللون والسطوع لتتناسب مع مناطق O الموجبة باللون الأحمر الزيتي. انقر على التحديد، ثم أضف إلى مدير العائد على الاستثمار.
    3. اختر كل من عائد الاستثمار في الوسائط المباشرة والعائد على الاستثمار، ثم انقر على O للحصول على منطقة Oil Red O-positive ضمن منطقة الوسائط الداخلية.
    4. انقر على إضافة وقياس لحساب مناطق الوسائط الداخلية ومناطق الصفر الإيجابي الحمراء الزيتية.
    5. صيغة الحساب:
      زيت أحمر منطقة O (٪) = (زيت أحمر O_positive_area / intimal_media_area) × 100

8. تقييم الآفات التصلب 2 - صبغة فان جيسون لفيرهويف

  1. استرجاع المقاطع المجمدة المركبة المدمجة في OCT على الشرائح.
  2. اغمر في الماء المقطر بدرجة حرارة الغرفة (20-25 درجة مئوية) لمدة 10-15 دقيقة مع تحريك خفيف (2-3 مرات) لإذابة مركب OCT تماما.
  3. تخلص من الماء المحتوي على مركب OCT، ثم اشطف الأقسام بالماء المقطر الطازج لمدة دقيقتين للتخلص من بقايا مركب OCT.
  4. حضن الأقسام في صبغة فيرهوف (التي تحتوي على الهيماتوكسيلين واليود وكلوريد الحديد) في درجة حرارة الغرفة (20-25 درجة مئوية) لمدة 15 دقيقة، مع هز رف الانزلاق بلطف 2-3 مرات أثناء الحضانة لضمان تلوين متساو.
  5. اشطف الأقسام بسرعة بالماء المقطر مرتين، 10 ثوان في كل مرة.
  6. التمايز في محلول كلوريد الحديدي بنسبة 2٪ لمدة 30-60 ثانية؛ راقب تحت المجهر حتى تظهر الألياف المرنة زرقاء سوداء والخلفية رمادية. اشطف بالماء المقطر مرتين، دقيقة واحدة في كل مرة.
  7. عالج الأقسام بمحلول ثيوسلفات الصوديوم 5٪ لمدة دقيقة إلى دقيقتين لإزالة اليود المتبقي.
  8. اشطف بالماء المقطر لمدة دقيقتين، ثم ضع صبغة مضادة بصبغة فان جيسون (حمض الفوخسين + حمض البيكريك) لمدة 5 دقائق لتلوين ألياف الكولاجين باللون الأحمر الزاهي.
  9. جفف بالتتابع ب 95٪ إيثانول (مرتين، دقيقة واحدة لكل مرة) و100٪ إيثانول (مرتين، دقيقة لكل مرة)؛ أرفع المحلول في الزيلين لمدة 5 دقائق؛ تم تمرير الأجزاء بغطاء باستخدام وسط تركيب من الراتنج الصناعي.
  10. التقاط صور القسم؛ استخدم برنامج تحليل الصور الرقمية لقياس سمك الوسائط الداخلية أو السماكة الداخلية لللويحات في أربعة اتجاهات (الأمامية، الخلفية، اليسار، اليمنى) باستخدام أداة قياس الطول، ثم احسب القيمة المتوسطة.
    1. افتح الشريحة، قم بالتكبير على مقطع الوعاء المستهدف، ثم اضغط على أداة القياس.
    2. انقر على داخل الفتحة الداخلية والحواف الخارجية للجزء الداخلي/الوسط في الاتجاهين الأمامي والخلفي واليسار واليمنى بالتسلسل، وسجل القيم الأربع للسمكة.
    3. احسب القيمة المتوسطة وسجل القياسات.
      القيمة المتوسطة = (أمامي + خلفي + يسار + يمين) ÷ 4

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

أظهرت نتائج صبغة Oil Red O أن الشرايين المربوطة أظهرت تكونا شديدا للويحات تصلب الشرايين، ونوى دهنية واضحة، ومناطق نخرية. كانت نسبة المناطق الدهنية أعلى بشكل ملحوظ في الشريان السباتي الأيسر مقارنة ب ضابط الشريان السباتي الأيمن (p < 0.001) (الشكل 2A). أظهر تلوين VVG تلفقا أو اختفاء الألياف المرنة في الفتحة، بالإضافة إلى زيادة كبيرة في سمك البلاك الإنتيما. تم زيادة كل من سماكة الوسط الداخلي (IMT) وسماكة الداخل (IT) بشكل ملحوظ في الشريان السباتي الأيسر مقارنة با...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يصف هذا البروتوكول طريقة موحدة لإنشاء نموذج تصلب الشرايين السباتية في فئران C57BL/6 من خلال دمج فرط الكوليسترول الناتج عن PCSK9-AAV، والنظام الغذائي عالي الدهون (HFD)، والربط الجزئي للشريان السباتي المشترك (PCL).

مقارنة بالنموذج التقليدي مثل ApoE -/- أو LDLR-/- أو نماذج PCL باستخدام فأر WT5، يقدم هذا النموذج مزايا فريدة في أبحاث تصلب الشرايين. أولا، يتم إعطاء PCSK9-AAV للفئران ويتم إطعامها ب HFD لتحفيز فرط الكوليسترول،...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

حصل هذا العمل على تمويل من المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (82470516، 8227022021)، وصندوق البحوث الخاص للجامعات المركزية، وكلية بكين الطبية المتحدة (3332025111)، وتمويل الأبحاث السريرية الوطنية للمستشفيات رفيعة المستوى (2025-PUMCH-A-181، 2025-PUMCH-D-001)، ومؤسسة العلوم الطبيعية في مقاطعة سيتشوان (2024NSFC0715).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
غرزة نايلون معقمة 6-0جينهوان الطبيF602NA
فئران C57BL/6مركز شنغهاي للكائنات النموذجية، المحدودة (SMOC)SM-001NA
تشاو ديتسيرة شيتونغلا. XT93GNA
Cryostat Leica CM1950NA
كريم إزالة الشعرفيتRB Health LLCNA
النظام الغذائي عالي الدهونسيرة شيتونغXT108cNA
أكتوبرساكورا4582NA
محلول أويل ريد أوservicebio G1017-100 ملNA
المجهر البصريلايكاDM4BNA
بارافورمالديهايد Servicebio G1101-500 ملNA
PCSK9-AAVWZBioscience AV208001-AV8NA
شرائح مغلفة بولي-إل-ليسينسيغماP0425NA
ماسح الشرائح3DHISTECHالمسح البانوروراميNA
السلفاميثوكسازولسيليكS1915 NA
لاصق الأنسجة3M فيتبوند1469SBNA
حامل حقن ذيل الفأر بتصور الأوردة  جينان ييان للعلوم والخدمات شركة تطوير التكنولوجيا المحدودةYLS-Q9GNA

المراجع

  1. Vaduganathan, M., Mensah, G. A., Turco, J. V., Fuster, V., Roth, G. A. The global burden of cardiovascular diseases and risk: A compass for future health. J Am Coll Cardiol. 80 (25), 2361-2371 (2022).
  2. Saba, L., et al. Carotid artery atherosclerosis: Mechanisms of instability and clinical implications. Eur Heart J. 46 (10), 904-921 (2025).
  3. Soehnlein, O., Lutgens, E., Döring, Y. Distinct inflammatory pathways shape atherosclerosis in different vascular beds. Eur Heart J. 46 (33), 3261-3272 (2025).
  4. Aburahma, A. F., et al. Society for vascular surgery clinical practice guidelines for management of extracranial cerebrovascular disease. J Vasc Surg. 75 (1s), 4s-22s (2022).
  5. Nam, D., et al. A model of disturbed flow-induced atherosclerosis in mouse carotid artery by partial ligation and a simple method of RNA isolation from carotid endothelium. J Vis Exp. (40), e1861(2010).
  6. Nam, D., et al. Partial carotid ligation is a model of acutely induced disturbed flow, leading to rapid endothelial dysfunction and atherosclerosis. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 297 (4), H1535-H1543 (2009).
  7. Ni, C. W., et al. Discovery of novel mechanosensitive genes in vivo using mouse carotid artery endothelium exposed to disturbed flow. Blood. 116 (15), e66-e73 (2010).
  8. Nakashima, Y., Plump, A. S., Raines, E. W., Breslow, J. L., Ross, R. Apoe-deficient mice develop lesions of all phases of atherosclerosis throughout the arterial tree. Arterioscler Thromb. 14 (1), 133-140 (1994).
  9. Ma, Y., et al. Hyperlipidemia and atherosclerotic lesion development in ldlr-deficient mice on a long-term high-fat diet. PLoS One. 7 (4), e35835(2012).
  10. Maxwell, K. N., Fisher, E. A., Breslow, J. L. Overexpression of pcsk9 accelerates the degradation of the ldlr in a post-endoplasmic reticulum compartment. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (6), 2069-2074 (2005).
  11. Keeter, W. C., Carter, N. M., Nadler, J. L., Galkina, E. V. The aav-pcsk9 murine model of atherosclerosis and metabolic dysfunction. Eur Heart J Open. 2 (3), oeac028(2022).
  12. Kumar, S., Kang, D. W., Rezvan, A., Jo, H. Accelerated atherosclerosis development in c57bl6 mice by overexpressing aav-mediated pcsk9 and partial carotid ligation. Lab Invest. 97 (8), 935-945 (2017).
  13. Gogulamudi, V. R., Durrant, J. R., Adeyemo, A. O., Ho, H. M., Walker, A. E., Lesniewski, L. A. Advancing age increases the size and severity of spontaneous atheromas in mouse models of atherosclerosis. Geroscience. 45 (3), 1913-1931 (2023).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

PCSK9 C57BL 6 Oil Red O Verhoeff Van Gieson

مقالات ذات صلة