حدد تسلسل النسخ الكيميائي الممرض في المركز في اللويحات المصحوبة بالتصلب

ملخص

تهدف هذه الدراسة إلى تحليل الآليات الأساسية للعوامل الالتهابية المرتبطة باللويحات التصلب الشرايين (AP) باستخدام تسلسل الحمض النووي الريبي. حددت النتائج جينات مركز الالتهاب الرئيسية CCL3 وCCL4 وCXCL1 في AP. قد تؤدي هذه الكيموكينات إلى تحفيز تصلب الشرايين من خلال تعزيز تراكم بلعم M0 مع كبح الخلايا المناعية الواقية، مما يكشف عن أهداف علاجية محتملة.

الملخص

اللويحات التصلب الشرايين (AP) هي نوع من أمراض تكاثر الأنسجة الليفية الالتهابية بعد إصابة خلايا البطانة وخلايا العضلات الملساء في جدار الشريان، مما قد يؤدي إلى درجات مختلفة من انسداد تدفق الدم القلبي والأوعية الدموية الدماغية. ومع ذلك، فإن الأساليب العلاجية الفعالة التي تستهدف الالتهاب فشلت إلى حد كبير حتى الآن، مما يشير إلى أن هناك حاجة إلى رؤى إضافية. هدفت هذه الدراسة إلى تحليل التغيرات الترانسكريبتومية المرتبطة بالعوامل الالتهابية في AP باستخدام تسلسل الحمض النووي الريبي (RNA-seq). تم إجراء تسلسل RNA على عينات من مرضى AP (n = 11) وأفراد ضابطة (n = 3). تم تحديد الجينات المعبر عنها بشكل تفاضلي (DEGs) باستخدام Metascape، تلاها تحليل إثراء مسار KEGG باستخدام حزمة clusterProfiler في برنامج R، وتحليل تسرب المناعة باستخدام CIBERSORT، وشبكة تفاعل البروتين والبروتين (PPI) باستخدام قاعدة بيانات STRING. تم تحديد جينات المركز داخل شبكة PPI باستخدام إضافة CytoHubba. تم تحديد ما مجموعه 3713 جين DEG في مجموعة AP، بما في ذلك 2097 جينا مرفوعا و1616 جينا منخفضا. أظهرت النتائج أن DEGs كانت غنية بشكل رئيسي بالمسارات المناعية والالتهابية. تم اعتبار ثلاثة عوامل مرتبطة بالالتهاب: CCL3، CCL4، وCXCL1 كجينات مركزية رئيسية في العملية المرضية لداء AP. كشف تحليل التسلل المناعي عن بيئة دقيقة مميزة في AP، تميزت بزيادة كبيرة في بلاعم M0 إلى جانب انخفاض في خلايا CD8⁺ التائية، وخلايا NK المنشطة، وخلايا البدينة الراحة. في الختام، تصف هذه النتائج الإجرائية التعبير التفاضلي ل CCL3 وCCL4 وCXCL1 وارتباطها بتركيب خلايا مناعية متغير في AP، مما يبرز الكيموكينات الثلاثة كمرشحين محتملين لمزيد من التحقيقات الميكانيكية.

المقدمة

كان مرض القلب والأوعية الدموية تهديدا خطيرا لصحة الإنسان حول العالم.¹. مع تصاعد اتجاه شيخوخة السكان العالمي، يزداد معدل الإصابة بأمراض القلب والأوعية الدموية^{أيضا 2}. من بينها، تعد اللويحات التصلب الشرايين (AP) واحدة من الأسباب الرئيسية لمرض القلب والأوعية الدموية³. AP هو مرض التهابي مزمن، يتميز بتراكم الدهون تدريجيا في داخل الشرايين وتكوين اللويحات⁴. يعد AP الأساس الشائع للأحداث القلبية الوعائية والأوعية الدموية الدماغية، ويشمل بشكل رئيسي الشرايين الكبيرة والمتوسطة الحجم، مما يؤدي إلى نقص التروية والإصابات، وهو عامل رئيسي يسبب أمراض القلب والأوعية الدموية الدماغية^{والوفاة}. نظرا لعدم ظهور الأعراض الواضحة في المراحل المبكرة، عادة ما يكون مرض الفصيلة الزائدة متقدما عند تشخيصه، مما يؤدي إلى معدل وفيات مرتفع⁶. يركز علاج الاكتئاب الخارجي على عوامل الخطر التي يمتلكها، بما في ذلك العوامل القابلة للتعديل مثل قلة النشاط البدني، السلوك الخامل، التدخين، مشاكل الصحة النفسية⁷، والسمنة والسكري من النوع الثاني بسبب النظام الغذائي عالي الدهون، بالإضافة إلى عوامل غير قابلة للتعديل مثل الجينات، العمر، والجنس⁸. وجدت الدراسات الحديثة أن متلازمة الأيض، والهوموسيستينيميا، وفرط يورية الدم، ومقاومة البنكرياس هي عوامل خطر مهمة لحدوث وتطور تصلب الشرايين ^9,10.

تشمل النظريات المتعلقة بمسببات المرض لداء الأكسجين بشكل رئيسي نظريات تسرب الدهون، والالتهاب، واستجابة الإجهاد التأكسدي، والعدوى، والتفاعل بين العوامل الجينية والبيئية^11,12. من بينها، يعتبر الالتهاب والإجهاد التأكسدي العامل الأساسي للمرض العصبي الزائد ويتشاركان في جميع العمليات من الظهور إلى التطور والتدهور ل AP¹³. التلف المفاجئ في بلاك AP غير المستقر، وتنشيط الصفائح الدموية والجلطة هي أسباب مهمة لاحتشاء عضلة القلب والسكتة الدماغية النزفية¹⁴. من خلال البحث المستمر، تبين أن AP يحتوي ليس فقط على الدهون بل أيضا على العديد من الخلايا الالتهابية¹⁵. التدخين، ارتفاع ضغط الدم، اضطرابات الدهون، فرط الإنسولينيميا، ارتفاع سكر الدم، ارتفاع حمض اليوريك وغيرها من المحفزات الضارة تحفز خلايا الدم البيضاء وخلايا البطانة على إطلاق جزيئات التصاق قابلة للذوبان وأنواع مختلفة من السيتوكينات بشكل مستمر، مما يعزز التصاق الخلايا الأحادية بخلايا البطانة الوعائية. تؤدي الكيموكينات المتراكمة أيضا إلى هجرة الخلايا الأحادية إلى الفضاء تحت البطانة وتمايزها إلى بلاعميات، التي تقوم بعد ذلك ببلعمة البكلماتية المؤكسدة والغنية بالكوليسترول (LDL) داخل الأنسجة، مما يتحول إلى خلايا رغوية وتبدأ تكوين خطوط دهنية¹⁶. الضرر المرضي المبكر لAS، وهو خطوط الدهون، يتكون بشكل رئيسي من البلاعم والخلايا اللمفاوية التائية، وهي آفة التهابية نموذجية¹⁷. لذلك، تشارك خلايا التهابية مختلفة ومنتجاتها في بدء وتقدم AP¹⁸. ومع ذلك، فإن المشهد الالتهابي لمرض AP معقد ويشمل عوامل متعددة معروفة وربما غير معروفة. قد تفشل الأساليب التقليدية التي تعتمد على الجينات المرشحة في استيعاب هذا الطيف الكامل من الدوافع الالتهابية.

لمعالجة هذا القيد، استخدمنا تسلسل الحمض النووي الريبي (RNA-seq)، وهو طريقة نقل غير متحيزة عالية الإنتاجية. هذا النهج مناسب بشكل خاص للدراسات التي تولد الفرضيات حيث لا تكون المحركات الجزيئية الرئيسية محددة مسبقا. على عكس الطرق القائمة على الجينات المرشحة أو المصفوفات الدقيقة، يقدم RNA-seq نطاقا ديناميكيا أوسع، وحساسية أعلى، وقدرة على اكتشاف نسخ جديدة دون تصميم مسبار مسبق^19,20. هذه الميزات تجعله مناسبا بشكل خاص لاكتشاف الإشارات المرتبطة بالالتهاب في AP، حيث يبقى الأساس الجزيئي غير محدد بشكل كامل.

في هذه الدراسة، تم إجراء تحليل RNA-seq لتحليل الآليات الأساسية للعوامل الالتهابية المرتبطة ب AP. تم استخدام أدوات المعلوماتية الحيوية التي تستخدم خوارزميات مختلفة لفحص سلسلة من DEGs. لاحقا، تم إجراء تحليل الإثراء (WGCNA، مسار KEGG، mcode، GSEA، تحليل جيني المحور)، وتحليل شبكات تفاعل البروتين والبروتين (PPI). تساهم نتائج هذه الدراسة في فهم أفضل للآلية المرضية الجزيئية الكامنة وراء AP المدفوع بالالتهاب، وتلعب دورا مهما في البحث عن مؤشرات حيوية جديدة.

البروتوكول

تمت الموافقة على هذه الدراسة من قبل لجنة الأخلاقيات في مستشفى شعب لياوتشنغ (رقم الموافقة: 2023014) والتزمت بمبادئ إعلان هلسنكي. تم الحصول على موافقة مستنيرة من جميع المشاركين. تم توقيع نماذج الموافقة المستنيرة من قبل جميع المرضى أو عائلاتهم.

المرضى والعينات

حللت هذه الدراسة بأثر رجعي 11 مريضا يعانون من تضيق الشريان السباتي الشديد الذين خضعوا لاستئصال الشريان السباتي في قسم جراحة الأعصاب الوعائية بمستشفى لياوتشنغ الشعبي، مقاطعة شاندونغ، الصين، من يناير 2023 إلى ديسمبر 2023. تم تسجيل هؤلاء المرضى كمجموعة AP. تم تشخيص تضيق الشريان السباتي بناء على بيانات تصوير مثل CTA أو تصوير الأوعية الدموية الدماغية. كانت معايير الإدراج لمجموعة AP هي: (1) العمر بين 50 و80 سنة؛ (2) أكد تصوير الأوعية الدموية المحوسوب مع تصوير الأوعية الدموية/الطرح الرقمي تضيق الشريان السباتي الداخلي داخل الجمجمة ≥70٪؛ (3) درجة مقياس رانكين المعدل قبل البداية ≤ 1؛ (4) الموافقة المستنيرة التي تم الحصول عليها من المريض أو من ممثله القانوني. كانت معايير الاستبعاد هي: (1) الأمراض الالتهابية أو المناعية؛ (2) وجود اضطرابات نفسية؛ (3) وجود أورام خبيثة؛ (4) الحمل، الرضاعة، أو إمكانية الإنجاب. المطابقة العمرية تم اختيار المرضى الذين تعرضوا لإصابات دماغية رضحية شديدة وخضعوا للتبرع بالأعضاء في نفس المستشفى خلال نفس الفترة كمجموعة ضابطة (NA؛ التحكم العادي، n = 3). تم مطابقة المشاركين في المجموعتين من حيث العمر والجنس ومؤشر كتلة الجسم لإزالة العوامل المربكة. معايير الإدراج لمجموعة الضابط كانت: (1) العمر بين 50 و80 سنة؛ (2) عدم وجود تاريخ لمرض الشريان التاجي، أو تضيق الشريان السباتي، أو أمراض الأوعية الدموية الجهازية الأخرى؛ (3) الموافقة المستنيرة التي تم الحصول عليها من الممثل القانوني للمريض. تم جمع عينات من الشريان السباتي الداخلي واللويحات من مجموعة AP أثناء استئصال بطن الشريان السباتي، بينما تم جمع عينات من مجموعة التحكم بعد التبرع بالأعضاء. تم تخزين الأنسجة الوعائية واللويحية في خزانات نيتروجين سائل للاختبارات لاحقا. تظهر الخصائص الأساسية لمرضى AP في الجدول 1.

تحضير العينة

تم استخراج الحمض النووي الريبي الكلي باستخدام كاشف ترايزول وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. تم تقييم تركيز ونقاء الحمض النووي الريبي باستخدام مقياس طيف ND-2000 من نوع Nanodrop عند 260 نانومتر و280 نانومتر (نسبة A260/A280 بين 1.8 و2.0). تم تقييم سلامة الحمض النووي الريبي باستخدام الرحلان الكهربائي من جل أغاروز بنسبة 2٪ عند 100 فولت لمدة 30 دقيقة. تم الحصول على قيم سلامة الحمض النووي الريبي (RINs) باستخدام محلل بيولوجي Agilent 2100 (تم استخدام عينات تحتوي على RIN ≥ 7.0 للتحليل اللاحق). تم إجراء جميع إجراءات معالجة العينات واستخراج الحمض النووي الريبي في درجة حرارة الغرفة ما لم يذكر خلاف ذلك. تم التخلص من مادة النفايات ترايزول وفقا لإرشادات النفايات الكيميائية الخطرة المؤسسية.

تسلسل الحمض النووي الريبي

بعد معالجة DNase I للRNA الكلي ب mRNA، تم إثراء mRNA باستخدام خرزات مغناطيسية من Oligo D (T) ثم تجزأ إلى قطع قصيرة عند 94 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. عملت شظايا mRNA الناتجة كقالب، مع أوليغونيوكليوتيد عشوائي كبادئ. تم تصنيع cDNA للسلسلة الأولى عبر نظام النسخ العكسي M-MuLV عند درجة حرارة 42 درجة مئوية لمدة 50 دقيقة، تلاه تحلل خيوط RNA بواسطة RNase H. تم إجراء تخليق السلسلة الثانية باستخدام dNTPs داخل نظام بوليميراز الحمض النووي I. تم تنقية cDNA مزدوج الخيط، وإصلاح الأطراف، وتم تدييله بامتداد "A" لتسهيل ربط المحول. تم استخدام خرز AMPure XP لاختيار شظايا cDNA بحجم 250-300 وحدة حرارية، والتي تم تضخيمها بعد ذلك عبر PCR. بعد ذلك، تم تنقية المنتجات المضخمة لتوليد المكتبة النهائية. تم إجراء تسلسل المكتبة على منصة Illumina HiSeq مع طول قراءة مزدوج في النهاية يبلغ 150 بت في اللعبة. بالنسبة لمراقبة جودة البيانات (QC)، تم تصفية البيانات الخام التي تحتوي على تسلسلات محولات أو قواعد منخفضة الجودة باستخدام سكريبتات داخلية. نظرا لأخطاء التسلسل التي قد تنشأ من الأداة، تم تقييم جودة البيانات من خلال تحليل توزيع معدلات الأخطاء في التسلسل (حيث اعتبر معدل الخطأ < 1٪ مقبولا). بالإضافة إلى ذلك، تم تحديد توزيع محتوى النسخة الخضراء. تم إجراء جميع إجراءات التسلسل عند درجة حرارة البيئة ما لم يذكر خلاف ذلك. تم التخلص من المواد الكيميائية الخطرة (مثل مخازن DNase I) وفقا لإرشادات السلامة البيولوجية المؤسسية.

عتبات مراقبة الجودة وحل المشكلات

تم استخدام عينات تحتوي على RIN ≥ 7.0 ومكتبات بحجم شظايا 250–300 بيت. كان هناك ما لا يقل عن 14 مليون قراءة خام لكل عينة مع Q30 ≥ 98٪ مطلوب. تم حل انخفاض إنتاجية المكتبة بزيادة دورات PCR إلى 18، لكن تم تفضيل 15 دورة للحفاظ على معدلات التكرار أقل من 15٪.

فحص أجهزة DEG

قمنا بتقييم توزيع مستويات التعبير الجيني عبر عينات مختلفة. تم استخدام الارتباط بين العينات لمستويات التعبير الجيني للتحقق من موثوقية التجارب وملاءمة اختيار العينة. تم تطبيق تحليل المكونات الرئيسية (PCA) لتقييم الفروق بين المجموعات وقابلية التكرار داخل المجموعة. تم تحديد مستويات DEG باستخدام قاعدة بيانات Metascape الإلكترونية (http://metascape.org/gp/index.html#/main/step1). تم تعريف DEGs بأنها تلك التي تحتوي على |log₂(تغيير الطية) | > 1 وقيمة p < 0.05، والتي اعتبرت ذات دلالة إحصائية. تم إجراء جميع التحليلات المعلوماتية الحيوية باستخدام المعلمات الافتراضية ما لم يذكر خلاف ذلك. كنقطة تحقق وسيطة لإمكانية تكرار الإنتاج، تم إنشاء مخططات PCA لتأكيد أن العينات تجمعت حسب المجموعة وليس حسب الدفعة.

موسوعة كيوتو للجينات والجينومات (KEGG) لتحليل الإثراء

تحليل كيغ (http://www.genome.jp/) هو نهج منهجي لتقييم وظيفة الجينات لاكتشاف المسارات التنظيمية البيولوجية. حصلت هذه الورقة أولا على التعريف الرسمي لجين تحويل الرمز للجين التفاضلي من org.Hs.eg (الإصدار 3.12.0). تم إجراء تحليل مسار KEGG باستخدام حزمة clusterProfiler في برنامج R (الإصدار 4.2.0). تم اعتبار الدرجة الأولى < 0.05 ذات دلالة إحصائية. كانت النتيجة الوسيطة هي توليد قائمة مرتبة من المسارات المثرية مع أعداد جينية مقابلة وقيم p معدلة.

تحليل شبكات PPI

لبناء شبكة PPI وجين مفتاح الشاشة، تم استخدام قاعدة بيانات STRING (الإصدار 11.0، https://string-db.org/). فقط التفاعلات التي تتجاوز درجة مركبة 0.9 تم الاحتفاظ بها كذات دلالة إحصائية. تم تصور وتحليل الشبكة باستخدام Cytoscape (الإصدار 3.10.1)، وهو أداة معلوماتية حيوية مفتوحة المصدر مصممة لاستكشاف شبكات التفاعل الجزيئي. تم تحديد جينات المركز داخل شبكة PPI باستخدام إضافة CytoHubba (الإصدار 0.1).

جين المحور

تم اختيار أفضل 20 جينا رئيسيا بواسطة CytoHubba Plugin. الأحمر يشير إلى مستويات عالية من الجين. تحليل المعلوماتية الحيوية لجينات المركز بواسطة قاعدة بيانات ميتسكيب الإلكترونية (الإصدار 3.5، http://metascape.org/gp/index) لتحليل 20 جينا مركزيا سابقا. تم تحديد إثراء الجينات في الفئات الأنطولوجية التالية: WGCNA، PCA، mcode، GSEA. جميع الجينات في الجينوم تعمل كخلفية إثرائية. تم فحص العناصر التي تحتوي على ص. < 0.05، الحد الأدنى للعدد 3، وعامل الإثراء > 1.5.

طريقة التحليل الإحصائي

تم استخدام برنامج إحصائي SPSS 25.0 لتحليل البيانات. تم التعبير عن بيانات العد كتكرار أو نسبة مئوية، وتم اختبار المقارنة بين المجموعات بواسطة اختبار كاي تربيع. كانت بيانات القياس متوافقة مع متوسط الانحراف المعياري ± التوزيع الطبيعي، واستخدم اختبار T للمقارنة بين المجموعات. تم اعتبار الرقم 0.05 < نقطة إهمال.

النتائج

تحليل بيانات RNA-seq للجينات التفاضلية في اللويحات المصحوبة بالشرايين

تم استخدام عينات تحتوي على RIN ≥ 7.0 فقط في تحضير المكتبة. جميع العينات ال 14 (11 AP، 3 في الضابطة) اجتازت هذا العتبة. تم ترتيب جميع العينات في دفعة واحدة؛ لذلك، لم يكن هناك حاجة لتعديل تأثير الدفعات. تم توليد متوسط 16.8 مليون قراءة خام لكل عينة؛ بعد التصفية ذات الجودة، تم الاحتفاظ ب 16.5 مليون قراءة نظيفة (98٪)، منها 91٪ منها تم رسمها بشكل فريد على الجينوم المرجعي البشري (HG38). أظهر تحليل DEGs وجود 2097 جينا مرتفعا و1616 جينا منخفضا (|log2FC| >1, P <0.05) لدى مرضى لديهم لويحات تصلب الشرايين مقارنة بالضابطين الأصحاء (الشكل 1A). تم عرض خريطة الحرارة لأفضل 20 جين معبر عنه تفاضلي في الشكل 1B. كشف تسلسل RNAseq بتقنية النقل عن ارتباطات عينة (الشكل 1C). تم تحليل العلاقة بين وحدات الجينات المعبر عنها المشتركة والأنماط الظاهرية بواسطة WGCNA (الشكل 1D). أظهر تحليل تحليل PCA وجود فرق كبير بين مجموعة NA ومجموعة AP (P.< 0.05) (الشكل 1E).

تحليل إثراء KEGG للجينات التفاضلية

تم إجراء تحليل إثراء مسار KEGG باستخدام حزمة clusterProfiler في برنامج R (الإصدار 4.2.0) بشكل منفصل على الجينات المعبر عنها بشكل تفاضلي مرتفعة ومنخفضة في مجموعة المرض (الشكل 2A,B). أظهرت النتائج أن هذه الجينات كانت غنية بشكل كبير في المسارات المتعلقة بالمناعة والالتهاب مثل سلالة الخلايا المكونة للدم، التهاب المفاصل الروماتويدي، الالتصاق البؤري، إشارات الإنتجرين، ومسار إشارات الكيموكين.

تحليل GSEA

أظهر تحليل GSEA أن الجينات الأساسية في المجموعة التجريبية كانت غنية بشكل رئيسي في الأعلى، مما يظهر اتجاه تصاعدي (الشكل 3A). كانت الجينات الأساسية في مجموعة التحكم غنية بشكل رئيسي في الأسفل، مما يظهر اتجاها تنازليا (الشكل 3B). باختصار، تم رفع تنظيم الجينات الالتهابية في المجموعة التجريبية (ASA) وانخفاض تنظيمها في مجموعة الضابطة (NA).

تحليل شبكات PPI

في شبكة PPI التي تحلل باستخدام قاعدة بيانات STRING (الإصدار 11.0)، تميل العقد التي تشترك في نفس معرف العنقود إلى أن تكون متقاربة عن بعضها البعض. كما هو موضح في الشكل 4A، كشف هذا التجميع أن الجينات المقابلة تشارك بشكل أساسي في تنظيم تنشيط الخلية، والاستجابة الالتهابية، وتنشيط الخلية. عرض الشكل 4B نفس الشبكة الملونة بقيم p، حيث تظهر العناقيد التي تحتوي على المزيد من الجينات قيم p ذات دلالة أكبر.

تحديد جينات المركز وتحليل تسرب الخلايا المناعية

تم اختيار DEGs لتحليل mcode ونتائج التحليل التي تتعلق بشكل رئيسي بمستقبلات الأستيل كولين (الشكل 5 والجدول 2). حدد تحليل جينات Hub باستخدام إضافة CytoHubba في Cytoscape أفضل 20 جينا مركزيا، معظمها مرتبط بالمناعة والالتهاب (الشكل 6A، اللوحة اليسرى). تكونت أفضل 10 جينات محور من CXCR4، CCL4، CCL3، CCL20، CXCL1، CCL5، CXCL8، CD4، CCR2، وCCR5 (الشكل 6A، اللوحة اليمنى). كشف تقاطع جينات المحور مع جينات الالتهاب في لوحة ال 92 من ال olink عن 5 جينات شائعة تشمل CXCL1، CCL20، TNF، CCL3، وCCL4 (الشكل 6B). كشف تحليل CIBERSORT عن اختلافات كبيرة في تسلل الخلايا المناعية بين مجموعة المرض والمجموعة الضابطة الأصحاء. مقارنة بمجموعة الضابطة، أظهرت مجموعة المرض نسبة أعلى بشكل ملحوظ من البلاعم M0 (p < 0.05) (الشكل 6C). وعلى العكس، كانت نسب خلايا ال CD8 التائية، وخلايا NK المنشطة، ومعظم الخلايا الراحة، أقل بشكل ملحوظ في مجموعة المرض (ص. < 0.05 للجميع) (الشكل 6C).

التحليل الوظيفي لجينات المحور

قمنا بتحليل الوظيفة البيولوجية لجين Hub باستخدام قاعدة بيانات ميتاسكيب كاشفين أن هذه الجينات مرتبطة بشكل رئيسي بمسار الإشارات الذي تتوسطه السيتوكينات والإشارات التي تعبر عن الكالسيوم (الشكل 7A والجدول 3). ثم تم استخدام توقيعات نوع الخلايا لإثراء العوامل التنظيمية النسخية لجين المحور، مما أظهر أن جينات المحور مرتبطة بشكل رئيسي بخلايا شبيهة ب c11 شبيه بالخلايا الشبيهة ب Gao في الأمعاء الغليظة 24W C11، وأنابيب الدماغ الوسطى المطورة للقلب، وأنواع الدماغ المتوسط البشرية HMGL (الشكل 7B). أظهر تحليل إثراء الأمراض في قاعدة بيانات DisGeNET أن جينات المركز مرتبطة بآفات جلدية، وعدوى فيروس إبشتاين-بار، والتهاب الدماغ بالقراد (الشكل 7C). أظهر تحليل خصائص أنسجة قاعدة بيانات PaGenBase أن جينات المحور كانت غنية بشكل رئيسي في الطحال والدم والرئة (الشكل 7D). بالإضافة إلى ذلك، كشف تحليل قاعدة بيانات TRRUST عن أن RELA و NFKB1 هما العوامل الرئيسية للنسخ التي تنظم جينات المركز (الشكل 7E).

توفر البيانات:

يتم توفير مصفوفة العد المعالجة كملفات إضافية (الملف التكميلي 1 والملف التكميلي 2). جميع البيانات الأخرى معروضة بالكامل في المقال. تتوفر بيانات التسلسل الخام من المؤلف المقابل عند الطلب المعقول.

الشكل 1: تحليل DEGs. (أ) لويحات صحية ولويحات تصلب الشرايين، خريطة بركانية جينية تفاضلية، تم تنظيمها بشكل أعلى 2097، و1616 (|log2FC| > 1، P.< 0.05). (ب) خريطة الحرارة لأفضل 20 جينا معبر عنه بشكل تفاضلي في التنظيم والتنظيم المنخفض. (ج) تحليل الارتباط بالعينة. (د)تم تحليل الارتباط بين وحدات الجينات المعبر عنها المشتركة والأنماط الظاهرية بواسطة WGCNA. (ه) تحليل تحليل PCA (كانت مجموعة NA مختلفة بشكل ملحوظ عن مجموعة AP). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 2: تحليل KEGG. تم إجراء تحليل إثراء مسار KEGG بشكل منفصل على الجينات المعبر عنها بشكل تفاضلي في مجموعة المرض (A) والمخفضة (B). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 3: تحليل GSEA. (أ) أظهر تحليل GSEA أن الجينات الأساسية في المجموعة التجريبية كانت غنية بشكل رئيسي في الأعلى، مما يظهر اتجاه تصاعدي. (ب) في مجموعة الضابطة، تم إثراء الجينات الأساسية بشكل رئيسي في الأسفل وأظهرت اتجاها تنازليا. في الختام، تم رفع تنظيم الجينات الالتهابية في المجموعة التجريبية (AP) وانخفاض التنظيم في مجموعة الضابطة (NA). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 4: مخطط شبكة PPI. (أ) ملون حسب معرف العنقود، حيث تكون العقد التي تشترك في نفس معرف العنقود عادة قريبة من بعضها البعض. (ب) التلوين بقيم P، حيث تحتوي العناصر على عدد أكبر من الجينات لها قيم P ذات دلالة أكبر. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 5: تحليل mcode لنماذج DEGs. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 6: تحليل جينات المحور. (أ) أفضل 20 جين محور (اللوحة اليسرى) وأفضل 10 جينات محور (اللوحة اليمنى) تم الحصول عليها بطريقة حساب الدرجات عبر إضافة CytoHubba في Cytoscape، والتي ترتبط بشكل رئيسي بالمناعة والالتهاب. (ب) تقاطع جينات المحور وجينات الالتهاب في لوحة اللينك 92 حدد 5 جينات تقاطع. (C)تم استخدام خوارزمية CIBERSORT لمقارنة وفرة التسلل ل 22 مجموعة فرعية من الخلايا المناعية بين مجموعات AP وNA. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 7: تحليل المعلوماتية الحيوية لجينات المحور. (أ) التعليق الوظيفي لجينات المحور باستخدام قاعدة بيانات ميتاسكايب. (ب) تحليل إثراء منظمات النسخ المرتبطة بجينات المحور بناء على توقيعات نوع الخلية. (ج) تحليل إثراء الأمراض لجينات المركز الذي يجرى باستخدام قاعدة بيانات DisGeNET. (د) أنماط التعبير الخاصة بالأنسجة لجينات المحور تم تحديدها عبر قاعدة بيانات PaGenBase. (ه) شبكة التنظيم النسخي لجينات المحور التي تم تحليلها باستخدام قاعدة بيانات TRRUST. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

MCODE	انطلق	الوصف	السجل10(P)
MCODE_1	R-HSA-629597	مستقبلات النيكوتين الأستيل كولين عالية النفاذية للكالسيوم	-10.7
MCODE_1	R-HSA-622323	مستقبلات الأستيل كولين النيكوتين قبل المشبكية	-10.3
MCODE_1	R-HSA-629594	مستقبلات النيكوتين النيكوتين الأستيل كولين عالية النفاذية للكالسيوم	-10.3
MCODE_2	R-HSA-1296346	قنوات البوتاسيوم في مجال المسام المتتالي	-10.3
MCODE_2	انطلق:0030322	تثبيت جهد الغشاء	-9.8
MCODE_2	R-HSA-5576886	المرحلة 4 - جهد الغشاء الراكن	-9.7

الجدول 1: الخصائص الأساسية لمرضى AP

MCODE	انطلق	الوصف	السجل10(P)
MCODE_1	انطلق:0030322	مستقبلات النيكوتين الأستيل كولين عالية النفاذية للكالسيوم	-19.9
MCODE_1	R-HSA-5576886	مستقبلات الأستيل كولين النيكوتين قبل المشبكية	-19.6
MCODE_1	R-HSA-1296346	مستقبلات النيكوتين النيكوتين الأستيل كولين عالية النفاذية للكالسيوم	-16.7

الجدول 2: تحليل إثراء MCODE لمستويات DEG.

MCODE	انطلق	الوصف	السجل10(P)
MCODE_1	R-HSA-629597	مستقبلات النيكوتين الأستيل كولين عالية النفاذية للكالسيوم	-10.7
MCODE_1	R-HSA-622323	مستقبلات الأستيل كولين النيكوتين قبل المشبكية	-10.3
MCODE_1	R-HSA-629594	مستقبلات النيكوتين النيكوتين الأستيل كولين عالية النفاذية للكالسيوم	-10.3
MCODE_2	R-HSA-1296346	قنوات البوتاسيوم في مجال المسام المتتالي	-10.3
MCODE_2	انطلق:0030322	تثبيت جهد الغشاء	-9.8
MCODE_2	R-HSA-5576886	المرحلة 4 - جهد الغشاء الراكن	-9.7

الجدول 3: تحليل إثراء MCODE لجين المحور.

الملف التكميلي 1: التحكم (n=3) تعبير الجينات.يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الملف التكميلي 2: المرضى (n=10) جين الجدول الأساسي.يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

المناقشة

مع التعمق المستمر في الأبحاث حول الحمض الزائد، يتم اكتشاف سيتوكينات جديدة باستمرار في الحمض الزائد، وأصبح الالتهاب عاملا مهما في نشأة وتطور AS^21,22. قد يؤدي تنشيط الألبومين إلى قطع الاتصال بين الخلايا البطانية ومصفوفة الأوعية الدموية الداخلية ويعزز انقسام الخلايا البطانية من الداخل الوعائي. إصابة الأوعية الدموية الحينية الناتجة^{عن 23,24}. الالتهاب يحفز التعديل التأكسدي ل LDL-C، ويؤدي التعديل LDL-C بدوره إلى العملية الالتهابية داخل الداخل للشريان، مما يسرع من تكوين AP²⁵. يمكن أن تنفجر اللويحات غير المستقرة في النهاية وتسبب ACS تحت^{استخدام أسباب} داخلية وخارجية. أثناء تمزق اللويحات، تفرز البلعميات وخلايا العضلات الملساء الوعائية (VSMC) والخلايا اللمفاوية عوامل التهابية مثل إنترلوكين-1 (IL-1)، IL-6، عامل الالتصاق بين الأوعية-1، وعامل الالتصاق بين الخلايا-1. في الوقت نفسه، يزداد تعبير إنتكرين الكريات البيضاء (CD11b/CD18)، وهو مستقبل على الخلايا الأحادية والحبيبات،^{بمقدار 27,28}. ومع ذلك، لا يزال الآلية الجزيئية للالتهاب التي تؤدي إلى تكوين AP بحاجة إلى مزيد من الاستكشاف.

حدوث وتطور الالتهاب العاطفي البديل ناتج عن الالتهاب هو مسار معقد من العوامل المتعددة، وتغير متعدد الجينات، ومرض متعدد المراحل، ويرتبط بشكل وثيق بالتعبير غير الطبيعي للعديد من الجينات. في هذه الدراسة، كشف تحليل RNA-Seq وتحليل المعلوماتية الحيوية أنه بين الأنسجة الضابطة السليمة والتحليل الزائد، أظهر مخطط البراكين ل DEGs 2097 جينا مرتفعا و1616 جينا منخفضا. أظهر تحليل إثراء KEGG الإضافي ل DEGs أن DEGs كانت مثربة بشكل رئيسي في المسارات المناعية والالتهابية. حدد تحليل جينات المركز أفضل 10 جينات محور تتكون من CXCR4، CCL4، CCL3، CCL20، CXCL1، CCL5، CXCL8، CD4، CCR2، وCCR5. كشف تقاطع جينات المحور مع جينات اللوح الالتهابي Olink 92 عن 5 جينات شائعة تشمل CXCL1، CCL20، TNF، CCL3، وCCL4. تشير هذه النتائج إلى أن العوامل المرتبطة بالالتهاب مثل CCL3 وCCL4 وCXCL1 قد تلعب دورا حاسما في العملية المرضية لداء الالتهاب العاطفي. كشف تحليل تسرب المناعة عن بيئة دقيقة مميزة تتميز بزيادة كبيرة في بلاعم M0 إلى جانب انخفاض في خلايا CD8⁺ التائية، وخلايا NK المنشطة، والخلايا البدينة الراحة.

تمثل بلاعم M0 تجمعا غير ملتزم يمكنه بسهولة استيعاب LDL المؤكسد والتمايز إلى خلايا رغوية، وهو حدث بارز في بداية تكوين الشرايين²⁹. تشير النسبة المرتفعة من بلاعم M0 التي لوحظت في مجموعة المرض إلى تراكم لهذه الخلايا التمهيدية داخل البيئة الدقيقة للبلاك. يعمل CCL4، الذي ينتج أساسا عن البلاعم المنشطة وخلايا الت، كمحفز مستمر يحافظ على تنشيط البلاعم عبر مسار إشارة NFκB، ويعزز التعبير عن جزيئات الالتصاق، ويحفز مصفوفة البروتيناز الميدالوسي-2 و-9، مما يسهل انتقال البلاعم M0 إلى حالة مؤيدة للأثروجينية ويعرض استقرار اللويحات^{بشكل مباشر 30}. قد تعكس نسبة الخلايا التائية منخفضة CD8⁺ قمع مجموعات خلايا T الحامية للشرايين بواسطة CCL3. أظهر كوميساروف وآخرون أن هجرة الخلايا التائية إلى اللويحات المصحوبة بشريان تحدث بشكل رئيسي عبر المحور 31 في CCR5-CCL3^. علاوة على ذلك^{، اكتشف} دورينغ وآخرون مسارا غير قانوني حيث يرسل CCL17 إشارات عبر CCR8 لتحفيز تعبير CCL3، مما يثبط تمايز الخلايا التائية التنظيمية؛ أدى الاستئصال الجيني ل CCL3 في خلايا T CD4⁺ إلى زيادة أعداد FoxP3⁺ Treg وقلل من تصلب الشرايين، في حين أدى إعطاء CCL3 إلى تفاقم المرض وكبح تمايز Treg. من المرجح أن يقلل هذا التحول من خلايا T التنظيمية لشرايين CD8⁺ الواقية من الشرايين بينما يعزز الخلايا التائية الفعالة الممرضة، مما يؤدي إلى انخفاض صافي في نسبة خلايا CD8⁺ T التي لوحظت في تحليلنا. من المرجح أن تعكس الانخفاض في خلايا NK المنشطة وخلايا البدينة الراكمة تغيرات في حالة التنشيط بدلا من فقدان كامل لهذه التجمعات. أفاد بوناكوسي وآخرون ³³ أن لويحات السباتي السباتي المسببة لأعراض تظهر زيادة في تسرب خلايا NK وإنتاج IFN-γ، مما يربط مباشرة تنشيط خلايا NK بعدم استقرار اللويحات السريري. بالنسبة لخلايا البدينة^{، أظهر} Wezel وآخرون أن الكيموكينات التي تطلق من الخلايا البدينة النشطة، وخاصة CXCL1، تحفز تجنيد العدلات عبر محور CXCL1/CXCR2، مما يزيد من استجابة الالتهاب المستمرة ويعزز تقدم البلاك وعدم استقراره. لذا، فإن انخفاض نسبة الخلايا البدينة المنشطة وخلايا البدينة الراحة، من المرجح أن يعكس تنشيطها أو فقدان الحبيبات أو استنزافها داخل بيئة اللويحات الالتهابية، وليس استنزافا رقميا حقيقيا.

هناك عدة قيود لهذه الدراسة. أولا، تعتمد هذه الدراسة فقط على تسلسل النسخ النصي وتقتصر على حجم العينة الصغير. بعيدا عن حجم العينة المحدود، يجب ملاحظة عدة قيود تقنية لبروتوكول RNA-seq. يخفي تسلسل الحمض النووي الريبي الضخم التغاير الخلوي؛ هناك حاجة إلى أساليب خلية واحدة لحل تعبيرات CCL3 وCCL4 وCXCL1 الخاصة بنوع الخلية. فك الالتفاف المناعي الحاسوبي (CIBERSORT) يوفر تقديرات فقط، وليس قياسات مباشرة. وفرة الحمض النووي الريبي لا ترتبط دائما بمستويات البروتين؛ التحقق المتعامد مطلوب. يجب أن تعالج الدراسات المستقبلية هذه القيود باستخدام علم النسخ الأحادي الخلية، والمجموعات الأكبر والمستقلة، والتحقق من صحة البروتينات المتعامدة.

في الختام، أكدت النتائج الحالية الدور المهم للعوامل الالتهابية في العملية الفسيولوجية المرضية للانفصال العاطفي. علاوة على ذلك، حددنا جينات المركز CCL3 وCCL4 وCXCL1، التي قد تشكل شبكة كيميائية منسقة تدفع تصلب الشرايين من خلال تعزيز تراكم الخلايا البلعمية M0، وقمع المجموعات الفرعية الحامية من خلايا T الحامية، وتغيير حالات تنشيط خلايا NK وخلايا البدينة. بشكل عام، تبرز هذه النتائج الكيموكينات الثلاثة كمنظمات حاسمة لبيئة الميكرو المناعي للبلاك وأهداف علاجية محتملة.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
تريزول	إنفيتروجين	15596026CN	استخراج الحمض النووي الريبي
مطياف نانودروب ND-2000	ثيرمو فيشر العلمي	ND2000	اكتشاف تركيز الحمض النووي الريبي
المحلل الحيوي Agilent 2100	أجيلينت	G2939BA	مراقبة جودة الحمض النووي الريبي
إلومينا هاي سيك TM 2000	إلومينا	هاي سيك 2000	تسلسل النسخ النصي
خرز أوليغو D (T) المغناطيسي	مختبرات نيو إنجلاند البيولوجية	S1550S	إثراء الحمض النووي الريبي