Method Article

اختبار تعادلية تقليل التألق لفيروس التهاب الكبد E لقياس عيارات الأجسام المضادة المعادلة

DOI:

10.3791/69892

⸱

May 22nd, 2026

 ,  ,  ,  , 
1Virology Laboratory, Centre for Virus Research, Therapeutics and Vaccines, Translational Health Science and Technology Institute, 2Department of Gastroenterology, All India Institute of Medical Sciences, New Delhi

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لا يوجد اختبار قياسي لتحييد الفيروس لفيروس التهاب الكبد E (HEV)، وهو فيروس RNA إيجابي غير سيتوباثي. هنا، يوصف اختبار تعادلية تقليل التألق (FRNT) يعتمد على قياس كمية بروتين الكبسيد الفيروسي الموسوم بالفلورية لتقييم فعالية الأجسام المضادة المضادة لفيروس HEV.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يقيس اختبار تعادلية الفيروس إمكانية تعادلية الجسم المضاد أو مزيج من الأجسام المضادة ضد الفيروس المقابل. تعد هذه تقنية قيمة لتقييم فعالية مرشحي اللقاح والأجسام المضادة المعادلة التي تم تطويرها ضد الفيروس. اختبار تقليل اللويحات (PRNT) هو طريقة شائعة لتقييم عيار الأجسام المضادة المعادلة الخاصة بالفيروس. ومع ذلك، فإن PRNT غير ممكن في حالة الفيروسات غير السيتوباتية. فيروس التهاب الكبد E (HEV) هو فيروس RNA أحادي الحس إيجابي، وينتمي إلى عائلة Hepeviridae. وهو سبب رئيسي لالتهاب الكبد الفيروسي الحاد حول العالم. لا يظهر أي تأثير خلوي في زراعة الخلايا الثديية. يتوفر لقاح ضد فيروس الكلب التشابه في الصين. ومع ذلك، لا تتوفر اللقاحات أو الأجسام المضادة العلاجية ضد HEV في معظم أنحاء العالم. تعمل عدة مختبرات على مرشحات لقاح ضد فيروس الكهرومغناطيسي العالي (HEV). اختبار تحييد لقياس فعالية لقاحات HEV سيكون أداة مفيدة جدا للباحثين. هنا، نصف اختبار تعادلية تقليل الفلورة (FRNT) لتقدير مقياس تعادلية 50٪ (NT50) للأجسام المضادة المضادة HEV. تم استخدام HEV المحايد لمضاد HEV ORF2، أو HEV المحايد من IgG للأرانب، لإصابة خلايا Huh7، تلاها تلوين فلوري مناعي لبروتين ORF2 الفيروس. تم قياس الخلايا الفلورية الموجبة في تطبيق ImageJ، وقدر NT50 بحجم 2.1 × 103. يمكن تطبيق هذه الطريقة لتقدير NT50 للأجسام المضادة لفيروس HEV الموجودة في الفئران المحصنة، والأجسام المضادة المضادة HEV المنتجة في المختبرات.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

فيروس التهاب الكبد E (HEV) هو فيروس RNA أحادي السلسلة ذو الإحساس الإيجابي وينتمي إلى عائلة Hepeviridae 1,2. عادة ما يسبب التهاب الكبد الحاد المحدود ذاتيا، لكنه قد يسبب التهاب الكبد المزمنلدى الأشخاص الذين يعانون من ضعف المناعة. النساء الحوامل معرضات لخطر كبير للإصابة بفشل كبدي حاد، حيث يرتفع معدل الوفاة حتى 30٪5. أفادت منظمة الصحة العالمية (WHO) بحوالي 19.47 مليون حالة التهاب الكبد الحاد E (AHE) و3450 حالة وفاة ناجمة عن HEV حول العالم في عام 2021. ينتقل فيروس الكبد المهروبي في الدول النامية بشكل رئيسي عن طريق الطعام والماء الملوثين، بسبب سوء الصرف الصحي، بينما يرتبط العدوى المهنية المتقطعة في الدول المتقدمة باستهلاكاللحوم النيئة أو غير المطهوة جيدا. يصنف HEV إلى ثمانية أنماط جينية. النمط الجيني (g) 1- وG2- HEV يصيب البشر فقط. لدى g3- وG4-HEV مجموعة واسعة من المضيفين مثل البشر، والأرنب، والخنازير، والخنازير البرية، والغزلان. تصيب G5- وG6-HEV الخنازير البرية بينما تصيب G7- وG8-HEV الجمال. تم الإبلاغ عن حالة واحدة من انتقال فيروس G7-HEV إلى الإنسان في الشرق الأوسط من خلال استهلاك لحم الإبل والحليب 7,8. عدوى HEV شائعة بشكل رئيسي في البلدان ذات الدخل المنخفض إلى المتوسط. تم الإبلاغ عن عدة تفشيات عبر المياه في مناطق متوطنة في جنوب وجنوب شرق آسيا وأفريقيا والمكسيك، ناجمة بشكل رئيسي عن عدوى G1 وأقل تكرارا بسبب عدوى G2-HEV. غالبا ما تكون حالات العدوى المتقطعة المهنية في الدول المتقدمة في أوروبا وشرق آسيا ناجمة عن الفيروس G3-HEV 6,7.

جينوم HEV هو RNA بحجم 7.2 كيلو بت زائد السلاسل يحتوي على غطاء مكون من 7 ميثيلجوانين في نهاية 5′، وثلاثة إطارات قراءة مفتوحة (ORFs) تليها نهاية 3's متعددة الأدينيل. يشفر ORF1 البروتين متعدد البروتين غير الهيكلي، ويتكون من سبعة مجالات مميزة: ميثيل ترانسفيراز (Met)، مجال Y، بروتياز سيستين شبيه باباين (PCP)، مجال V، المجال الكبير (مجال X)، هيليكاز (Hel)، وإزياز RNA بوليميراز معتمد على RNA (RdRp). يشفر ORF2 بروتين الكابسيد، المسؤول عن تجميع الكابسيد الفيروس. يشفر ORF3 بروتينا فوسفوبروتين يعمل كفيروبورين ويساعد في خروج الفيروسات9. يوجد إطار قراءة مفتوح إضافي، ORF4، في g1-HEV، والذي يترجم عبر آلية مستقلة عن الغطاء، باستخدام عنصر داخلي يشبه موقع الدخول في الريبوسوم يقع داخل ORF1. يتم تعزيز تعبير ORF4 بواسطة مركبات تسبب الإجهاد في الشبكة الإندوبلازمية. تم اقتراح ORF4 لتعزيز تجميع مركب تكرار g1-HEV10.

على الرغم من أن HEV لا يتكاثر بكفاءة في المختبر، إلا أن بعض سلالات الفيروس، التي تم عزلها من مرضى التهاب الكبد E، تم الانتشار بنجاح في الخلايا الكبدية، وخط خلايا الرئة، وخط خلايا القولونالظهارية 11. ومع ذلك، من الصعب نشر الفيروس بقوة في الخلايا المزروعة. تم استخدام نسخة معدية من cDNA من g1-HEV (سلالة Sar55) في الدراسات المختبرية، لكن لم يتم حتى الآن تحقيق إنتاج وانتشار فعال لسلالات g1-HEV في الخلايا المزروعة. بعض سلالات g3 وg4-HEV تنمو بشكل أفضل في الخلايا المزروعة12. ومع ذلك، فإن الفيروس المنقى الناتج عن الخلايا التي تم نقلها باستخدام الحمض النووي الريبي الجينومي HEV المكتوب في المختبرات والمغلق ب-p6 غير كاف لإجراء اختبارات متعددة. بالإضافة إلى ذلك، جميع جزيئات HEV الناتجة عن زراعة الخلايا تكون شبه مغلفة، مما يؤثر على قابليتها للعدوى. على النقيض من ذلك، فإن HEV الموجود في الطعام والماء الملوثين غير مغلف، وهو شديد العدوى. HEV الموجود في براز المرضى غير مغلف، وهو المصدر الشائع للعدوى الطبيعية. لذلك، يضمن استخدام HEV المنقى من فضلات المريض فعالية العدوى في نظام زراعة الخلايا الثديية. أظهرت دراساتنا السابقة موثوقية الفيروس g1-HEV المنقى بالبراز في قياس تكاثر الفيروس في خلايا ورم الكبد البشري (Huh7). يحتفظ الفيروس المنقى المخزن في -80 درجة مئوية بقدرة العدوى لعدة سنوات، وقد استخدم في عدة دراسات مستقلة لتقدير تكاثر الفيروس10، 13، 14، 15. صممت هذه الدراسة اختبارا لتعادلية HEV باستخدام g1-HEV المنقى الذي تم الحصول عليه من مريض. تم تنقية الفيروس، وتصنيفه، وتوصيفه وتخزينه في أليكوات عند -80 درجة مئوية لاستخدامه مستقبلا في اختبارات التعادل. نظرا لأن HEV غير سيتوباثي، فإن طريقة PRNT التقليدية ليست مفيدة لتقدير قدرة الأجسام المضادة المضادة للفيروس على تعادلها للفيروس. كانت هناك عدة محاولات لتطوير اختبارات تعادلية لفيروس الهرمون المرتفع (HEV)، بما في ذلك اختبار تعادلية قائم على تدفق الخلايا القياسية، واختبار تعادلية قائم على مجموعة ELISA للكشف عن pORF2 المفرز في الخلايا الفائقة، واختبار ارتباط قائم على ELISA في المختبر، واختبار قائم على RT-PCR، واختبار تعادلية قائم على الفلورة16،17،18،19،20. يكشف اختبار قائم على ELISA بشكل غير مباشر عن ارتباط الأجسام المضادة لتقييم التعادلية الوظيفية للفيروس، لكنه لا يستطيع قياس العدوى الحقيقية. عادة ما تقيس طريقة قياس تدفق الخلايا نسبة الخلايا المصابة باستخدام فيروس زائف. طريقة التعادلية المعتمدة على RT-PCR أكثر تعقيدا من FRNT؛ لذلك، فإن فرص الخطأ في التعامل أعلى. من ناحية أخرى، فإن طريقة FRNT الموصوفة هنا محدودة بتوفر قدرات التصوير والعدوى عالية التيتر. ومع ذلك، فهي طريقة فعالة لقياس NT50 من الأجسام المضادة لفيروس HEV.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم الحصول على موافقة لجنة الأخلاقيات المؤسسية (IEC) لجمع عينة براز من مريض مصاب بفيروس التهاب الدم المرتفع تم إدخاله إلى قسم أمراض الجهاز الهضمي في AIIMS، نيودلهي. تم الحصول على موافقة مستنيرة من المرضى المشاركين في الدراسة. تفاصيل المواد والمواد المستخدمة مدرجة في جدول المواد.

1. عزل الفيروس وقياسه

  1. بموافقة مستنيرة، احصل على عينة البراز من مريض مصاب بفيروس التهاب الدم المرتفع لتنقية الفيروس.
  2. أعد تعليق عينة البراز في محلول دولبيكو الملحي الفوسفاتي المخزن (DPBS) بتركيز نهائي 10٪ (w/v) وجهاز الطرد المركزي عند 7800 x جرام لمدة ساعة واحدة عند 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: استخدم القفازات عند التعامل مع عينة براز HEV، ونظف منطقة العمل بنسبة 70٪ إيثانول بعد العمل (قم بجميع الخطوات داخل خزانة السلامة البيولوجية).
  3. اجمع المادة الفائقة ومررها عبر مرشح بحجم 0.45 ميكرومتر.
  4. أضف 8٪ PEG6000 محضر في 0.4 ميل من NaCl إلى الفائق الهوائي للفيروس وحضن لمدة 16 ساعة عند 0 درجة مئوية.
  5. قم بجهاز الطرد المركزي للعينة عند 18,000 × جرام لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
  6. قم بإزالة المادة الفائقة وأعد تعليق الحبيبة في 40 مل من مادة Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM).
  7. تركيز نظام التعليق إلى حجم 5 مل عن طريق ترشيح التدفق المماسي (TFF) باستخدام خرطوشة غشاء بقوة 30 كيلو دالتون. قم بتصفية القرص عبر فلتر بحجم 0.2 ميكرومتر داخل خزانة السلامة البيولوجية، وقم بعمل أليكوات، وخزنها عند -80 درجة مئوية. استخدم أليكوت واحد لعزل الحمض النووي الريبي الكلي وإجراء RT-qPCR.
  8. استخدم عدة تخفيفات من بلازميد pSK-HEV2 [ناقل pBluscript يحتوي على cDNA لنسخة معدية من g1-HEV (معرف Genbank: AF444002.1)] (1 ng إلى 0.000001 ng DNA/تفاعل عند تخفيف تسلسلي 10x) لرسم معيار لقياس كمية الحمض النووي الريبي الفيروسي.
  9. ارسم الرسم البياني بكمية حمض نووي pSK-HEV2 على المحور X وقيم Ct المقابلة على المحور Y. استنتاج تركيز الحمض النووي الريبي الفيروسي من الرسم البياني القياسي.
  10. قم بقياس مستوى الحمض النووي الريبي الجينومي HEV من المخطط القياسي وحساب عدد نسخ الجينوم للفيروس باستخدام الصيغة التالية: عدد النسخ = ng*(عدد/مول) / القواعد *(ng/g)*(g/مول القواعد).

2. إصابة خلايا Huh7 بفيروس G1-HEV

  1. خذ قارورة T75 تحتوي على خلايا Huh7. تحقق تحت المجهر إذا كانت الخلايا متلاقية وصحية.
  2. قم بإزالة الوسائط بواسطة جهاز الشفط (قم بجميع الخطوات في خزانة السلامة البيولوجية). أضف 10 مل DPBS، ثم لف، ثم أزل.
  3. أضف 1 مل محلول تريبسين بنسبة 0.05٪، لضمان انتشاره بشكل متساو على السطح.
  4. الحضانة داخل حاضنة ثاني أكسيد الكربون لمدة 30–60 ثانية، حتى تنفصل الخلايا بنسبة 90٪.
  5. أضف 5 مل من الوسط الكامل، وزعه بالتساوي على كامل سطح T75، ثم استخدم الماصة عدة مرات لتكوين مجموعة خلية واحدة متجانسة، خالية من التجمعات.
  6. انقل تعليق الخلية إلى أنبوب مخروطي بسعة 50 مل، وجهاز طرد مركزي على حرارة 200 x g لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  7. استنشق وسط الزراعة من الأنبوب المخروطي داخل خزانة السلامة البيولوجية.
  8. أضف 5 مل من الوسط الكامل إلى الأنبوب، وعلق الخلايا إلى تعليق موحد عن طريق التوصيل اللطيف بالماصبات.
  9. خذ 10 ميكرولتر من تعليق الخلية وضعه على شريحة عداد الخلية. عد الخلايا في 4 أرباع، احسب المتوسط/مل.
  10. بذور 0.5 ×10 6 خلايا/بئر من صفيحة ب 6 آبار في 2 مل DMEM (مع 10٪ FBS).
  11. في اليوم التالي، أزل الوسط، وغسل في 1 مل DPBS، وأضف 50 ميكرولتر فيروس g1-HEV (ما يعادل 4.5 ×10 4نسخ جينومية من g1-HEV المنقى) في 1 مل من وسط خال من المصل (SFM).
  12. حضن الخلايا في حاضنة بتركيز ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪ على درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.
  13. اغسل الخلايا ب 500 ميكرولتر DPBS، ثم أضف 2 مل من الوسط الكامل (DMEM مع 2٪ FBS).
  14. حضانة الخلايا لمدة 72 ساعة في حاضنة 5٪ ثاني أكسيد الكربون 2 عند 37 درجة مئوية.
  15. تابع إجراء الاختبارات اللاحقة.

3. اختبار RT-qPCR

  1. أزل وسط النمو من صفيحة الستة آبار (من الخطوة 2.15) واغسل الخلايا ب 1 مل DPBS.
  2. أضف 1 مل من مادة TRI مباشرة إلى صفيحة الستة آبار لتحليل الخلايا. قم بتقليد الليسات صعودا وهبوطا عدة مرات، ثم نقله إلى أنبوب طرد مركزي دقيق بسعة 1.5 مل.
    ملاحظة: مادة TRI سامة إذا تم استنشاقها أو ابتلاعه أو ملامسته للجلد. استخدم قفازات واقية أثناء استخدام الكاشف، وتجنب استنشاق الأبخرة. ويفضل أن تستخدم داخل غطاء المحرك الكيميائي. يجب أن تكون جميع الأدوات البلاستيكية خالية من الحمض النووي الريبي.
  3. حضن العينات في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. أضف 0.2 مل من الكلوروفورم، ثم أغلق الأنبوب بإحكام، ثم استمر دوامة لمدة 10–15 ثانية (الكلوروفورم خطير وسام؛ يتم التعامل معه باستخدام معدات الحماية الشخصية المناسبة). احتضن لمدة 2–3 دقائق.
  4. قم بالطرد المركزي للعينات لمدة 15 دقيقة عند 12,000 × جرام عند 4 درجات مئوية. انقل الطور المائي إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد بسعة 1.5 مل. أضف 0.5 مل من الأيزوبروبانول إلى الطور المائي، وامزج جيدا عن طريق قلب الأنبوب عدة مرات.
  5. حضن لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  6. الطرد المركزي لمدة 10 دقائق عند 12,000 × جرام عند 4 درجات مئوية. تخلص من السوبرناتانت.
  7. أعد تعليق الحبيبة في 1 مل إيثانول بنسبة 75٪. الطرد المركزي لمدة 5 دقائق عند 7500 × جرام عند 4 درجات مئوية. تخلص من السوبرناتانت.
  8. جفف حبيبة RNA في الهواء لمدة 5–10 دقائق.
  9. أعد تعليق الحبيبة في مياه خالية من النوكلياز بسعة 50 ميكرولتر (NFW)، واحتضنها عند 55 درجة مئوية لمدة 10 دقائق، وامزج يدويا، وقس تركيز الحمض النووي الريبي بواسطة القياس الطيفي.
  10. نفذ RT-qPCR بخطوة واحدة معتمد على المجس TaqMan باستخدام البادئات التالية:
    g1-HEV FP: 5′TATACTCGAGGGTGCCGATCGGTCCC3′;
    g1-HEV RP: 5′TATACCATGGCATCTGGCAGCAAGCTCAG3′;
    g1-HEV مسبار: 5′[FAM] TTGACGCCTGGGAGCGGAATCACC [BHQ1]3′; ريبونوكلياز P (RP) FP: 5′AGATTTGGACCTGCGAGCG3′;
    RP RP: 5′GAGCGGCTGTCTCCACAAGT3′;
    مسبار RP: 5′[FAM]TTCTGACCTGAAGGCTGCGGGG[BHQ1]3′.
  11. حساب القياس النسبي للحمض النووي الريبي g1-HEV باستخدام طريقة 2−ΔΔCT .

4. اختبار التألق المناعي (IFA)

  1. قسم خلايا Huh7 كما هو موضح في الخطوات السابقة.
  2. ضع غطاء الزجاج المخصص للمجهر في صفيحة بها 12 بئرا وزرع 0.2 ×10 6 خلايا/بئر في وسط كامل بسعة 1 مل (DMEM مع 10٪ FBS).
  3. أصيب الخلايا بنسخ جينومية من 1.8 × 10إلى 4 نسخ جينومية من g1-HEV المنقى في 500 ميكرولتر SFM. حضن الخلايا في حاضنة بتركيز ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪ على درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.
  4. اغسل الخلايا ثلاث مرات ب 500 ميكرولتر من DPBS.
  5. أضف 2 مل من الوسط الكامل (DMEM مع 2٪ FBS).
  6. احتضن الخلايا لمدة 72 ساعة في حاضنة ثاني أكسيد الكربون 5٪، بدرجة حرارة 37 درجة مئوية.
  7. اغسل الخلايا ثلاث مرات ب 500 ميكرولتر DPBS، مع احتضان الخلايا لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة بين كل غسل.
  8. أضف 500 ميكرولتر 4٪ من PFA (بارافورمالديهايد) إلى الخلايا وحضن لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: 4٪ من PFA ضار إذا تم استنشاقه، ويسبب تهيجا في الجلد والعين، وقد يسبب رد فعل تحسسي للجلد. للسلامة، ارتد قفازات واقية وواقيات للعين أثناء استخدام المادة وتجنب استنشاق الأبخرة.
  9. اغسل الخلايا ب 500 ميكرولتر DPBS، ثلاث مرات لمدة 5 دقائق لكل منها، ثم حضن في DPBS لمدة 30 دقيقة.
  10. أضف محلول حاجز بسعة 250 ميكرولتر (5٪ سيروم الماعز العادي، 0.5٪ BSA، 0.3٪ ترايتون X-100 في DPBS) إلى الخلايا وحضن لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة (RT).
  11. أزل محلول المانع، واغسلها مرة واحدة ب 500 ميكرولتر DPBS، وحضن الخلايا بجسم مضاد أولي 250 ميكرولتر (DPBS، 0.3٪ ترايتون X-100، 5٪ BSA، 0.5٪ مصل الماعز الطبيعي، تخفيف 1:500 من الأجسام المضادة المضادة ORF2 أو IgG الأرانب)، طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
  12. اغسل الخلايا ب 500 ميكرولتر من DPBS ثلاث مرات لمدة 5 دقائق لكل منها.
  13. حضن الخلايا بالأجسام المضادة الثانوية (DPBS، 0.3٪ ترايتون X-100، 5٪ BSA، 0.5٪ سيروم الماعز الطبيعي، تخفيف 1:1000 من الجسم المضاد المضاد لأليكسا فلور 594 المضاد للأرانب 1:1000) لمدة ساعة واحدة في العلاج الطبيعي.
  14. اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام DPBS لمدة 5 دقائق لكل واحدة. أضف 10 ميكرولتر من مادة مضاد التصبغ الذهبي Prolong مع محلول DAPI (4′,6-دياميدينو-2-فينيل إندول) إلى شريحة الزجاج. قم بتركيب الخلايا التي تحتوي على غطاء الانزلاق، بحيث تواجه الخلايا نحو محلول DAPI على شرائح زجاجية، متجنبا فقاعات الهواء.
  15. أغلق غطاء الغطاء بطلاء الأظافر.
  16. احصل على صور فلورية بمجهر كونفوكال بهدف 60x.
  17. اضبط المجهر لتصوير واكتساب الإشارة الفلورية.
  18. أولا، ركز النوى في الشريحة المقابلة للخلايا الوهمية (غير المصابة) بتكبير 60x. اضبط جهد العتبة والليزر بحيث لا تظهر إشارة فلورية خلفية. تحقق من شريحة الجسم المضاد الضابط (IgG الأرنب) الملونة بالأرنب وتحقق من عدم وجود إشارة فلورية خلفية مرئية.
  19. عرض شرائح لخلايا مصابة بفيروس التهاب الدم دون تغيير المعايير السابقة. احصل على صور بدقة 1028 × 1028 بكسل.

5. اختبار تعادلية تقليل الفلورة (FRNT)

  1. تحييد الفيروس وعدوى خلايا Huh7
    1. قسم خلايا Huh7 كما هو موضح في الخطوات السابقة. ضع غطاء الغطاء في صفيحة مكونة من 12 بئر وازرع 0.2 ×10 6 خلايا/بئر في وسط كامل بحجم 1 مل (DMEM + 10٪ FBS).
    2. في اليوم التالي، جهز تخفيفا تسلسليا بمقدار 10 مرات للأجسام المضادة (مضاد ORF2 وIgG الأرنب) في SFM مع تركيز ابتدائي للأجسام المضادة 25 ميكروغرام/مل بخطوات 1:10 حتى تخفيف1 :10 5. يجب أن يكون الحجم النهائي للتخفيف 100 ميكرولتر.
    3. أضف 1.8 ×10 4 نسخ جينومية تعادل g1-HEV المنقى إلى كل تخفيف من الأجسام المضادة.
    4. حضن خليط الأجسام المضادة والفيروس عند حاضنةCO2 بنسبة 5٪، بدرجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.
    5. قم بإزالة الطبق ذو ال 12 بئر الذي يحتوي على خلايا Huh7 (التي تم زرعها في اليوم السابق) وغسل الخلايا ب 500 ميكرولتر DPBS.
    6. أضف خليط الأجسام المضادة والفيروس إلى الخلايا وضع اللوحة في حاضنة 5٪ ثاني أكسيد الكربون 2 على درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.
    7. اغسل الخلايا ب 500 ميكرولتر DPBS.
    8. أضف DMEM + 2٪ وسط FBS إلى الخلايا وحضن الصفيحة في حاضنةCO2 بنسبة 5٪ عند 37 درجة مئوية لمدة 72 ساعة.
    9. قم بإجراء IFA كما هو مذكور في القسم 4 (الخطوة 4.7 وما بعدها).
    10. احصل على صور فلورية لخمسة حقول عشوائية باستخدام هدف 10x في 1028 × 1028 بكسل.
    11. احفظ الصور بصيغة JPEG/TIFF. قم بقياس البقع الفلورية باستخدام تحليل ImageJ كما هو موضح أدناه.
    12. لتحليل الصورة في ImageJ، قم بتحويل صورة RGB إلى صورة 8-بت. انقر على الصورة > اكتب > 8-بت.
    13. اضبط عتبة الصورة. انقر على الصورة > ضبط > العتبة. اختر مستوى العتبة الأدنى ليكون 40 والمستوى الأعلى 255.
    14. للعد، اختر تحليل> تحليل الجسيمات. اختر نتائج العرض، وامسح النتائج، والتلخيص، واستبعد الحواف، وعائد الاستثمار المركب. إلغاء تحديد إضافة إلى المدير، وإدراج الثغرات، والتراكب (overlay). اضغط على موافق وسيظهر عد النقاط الفلورية.
  2. تقدير NT50
    1. احسب نسبة التعادلية لكل تخفيف باستخدام الصيغة التالية:
      ٪ تحييد= 100-[(((الخلايا الموجبة ORF2 في التخفيف المستمر)⁄(الخلايا الإيجابية ل ORF2 في التحكم في الفيروس)) X 100]
    2. احسب NT50 باستخدام الصيغة التالية:
      log10(NT50) = log10D1+(50-N1 ⁄ N2-N1) X (log10D2-log10D1)
      حيث D1 = التخفيف عندها تكون نسبة التحييد أقل من 50
      D2 = التخفيف الذي يكون عنده نسبة التحييد فوق 50
      N1= ٪ تحييد أقل من 50
      N2= ٪ تحييد فوق 50
    3. احسب مضاد لوغاريتما10 NT50 باستخدام الصيغة:
      NT50= 10لوغاريتيم10(NT50)
    4. رسم رسم الرسم البياني ل (المتوسط±SD) لجميع الحقول.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

عدوى خلايا Huh7 بفيروس g1-HEV وتوصيف الفيروس

تم عزل g1-HEV من عينة براز باستخدام سلسلة من الخطوات، كما هو موضح (الشكل 1A). تم تقدير عدد نسخ الجينوم للجرعة g1-HEV المنقاة بواسطة RT-qPCR، تلاه التخزين عند -80 درجة مئوية. لتأكيد العدوى الفيروسية والتكاثر، تم إصابة خلايا Huh7 ب 1.8 × 10 نسخ جينومية مكافئة من4 نسخ جينومية من مخزون g1-HEV المنقى لمدة 72 ساعة، تلاها RT-qPCR وIFA. تم اكتشاف مستوى كبير من RNA م...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

FRNT هو طريقة قائمة على صبغ المناعة لتقدير القدرة المعادلة للأجسام المضادة. وقد استخدم لتقدير قيم NT50 للأجسام المضادة ضد عدة فيروسات، بما في ذلك فيروس الضنك (DENV)، وفيروس كورونا (SARS-CoV-2)، وفيروس التهاب الدماغ الياباني (JEV)23,24,25. في هذه الطريقة، يحتضن الفيروس بجسم مضاد اختبار (أو سيرا)، يليه إصابة الخلايا المزروعة بالخليط. يسمح للخلايا المصابة بأن تحتضن لفترة طويلة للسماح بتك...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون عدم وجود مصالح متنافسة.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تمويل هذا البحث جزئيا من خلال منحة من مجلس مساعدة أبحاث صناعة التكنولوجيا الحيوية، وزارة التكنولوجيا الحيوية، حكومة الهند، منحت ل MS وS وBN. يدعم البحث في مختبر التصلب المتعدد منحة أساسية من معهد علوم وتكنولوجيا الصحة الانتقالية. تحظى SA بدعم من وظيفة عالم أبحاث مشروع ممولة من المجلس الهندي للأبحاث الطبية، حكومة الهند. تحظى جامعة بويل بدعم من زمالة بحثية عليا من وزارة التكنولوجيا الحيوية في حكومة الهند.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL microfuge tubesAxygenMCT-150-C
12-well cell culture dishCorning3512
37 degree incubator shakerThermo Scientific50163013
4′,6-diamidino-2-phenylindoleAbcamAB104139DAPI
50mL centrifuge tubeFalcon352070
6-well cell culture dishCorning 3516
Alexa flour 594 secondary IgG AntibodyThermo ScientificA-11012
Anti-ORF2 antibodyGenscriptNACustom synthesized by Genscript and characterized in our laboratory14
Anti-rabbit IgG antibodyGenscriptNA
Bovine Serum AlbuminHIMEDIAMB083BSA
Confocal microscopeOlympusFV3000
DMEM, high glucoseHIMEDIAAL007A
Fetal Bovine SerumGIBCO16000-044FBS
ImageJ 1.54gImageJ.org (Wayne Rasband and contributors, NIH, USA)
Normal Goat SerumHIMEDIARM-10701
ParaformaldehydeHIMEDIAGRN3660PFA
Phosphate Buffer Saline pH 7.4HIMEDIATL1006PBS
Polyethyleneglycol 6000SIGMA81255PEG6000
SOLIScript 1-step Probe KitSOLIS BIODYNE08-57-00250
TRI reagentMolecular Research CentreTR118
Triton X100SIGMAX100
Trypsin-EDTAGIBCO25300-54

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Smith, D. B., et al. International Committee on Taxonomy of Viruses Hepeviridae Study Group. Consensus proposals for classification of the family Hepeviridae. J Gen Virol. 95 (Pt 10), 2223-2232 (2014).
  2. Nan, Y., Zhang, Y. J. Molecular biology and infection of hepatitis E virus. Front Microbiol. 7, 1419(2016).
  3. Kamar, N., et al. Hepatitis E virus and chronic hepatitis in organ-transplant recipients. N Engl J Med. 358 (8), 811-817 (2008).
  4. Purcell, R. H., Emerson, S. U. Hepatitis E: An emerging awareness of an old disease. J Hepatol. 48 (3), 494-503 (2008).
  5. Nimgaonkar, I., Ding, Q., Schwartz, R. E., Ploss, A. Hepatitis E virus: Advances and challenges. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 15 (2), 96-110 (2018).
  6. Hepatitis E. , WHO. Available from: https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/hepatitis-e (2025).
  7. Songtanin, B., et al. Hepatitis E virus infections: Epidemiology, genetic diversity, and clinical considerations. Viruses. 15 (6), 1389(2023).
  8. Lee, G. H., et al. Chronic infection with camelid hepatitis E virus in a liver transplant recipient who regularly consumes camel meat and milk. Gastroenterology. 150 (2), 355-357 (2016).
  9. Zhou, Z., Xie, Y., Wu, C., Nan, Y. The hepatitis E virus open reading frame 2 protein: Beyond viral capsid. Front Microbiol. 12, 739124(2021).
  10. Nair, V. P., et al. Endoplasmic reticulum stress induced synthesis of a novel viral factor mediates efficient replication of genotype-1 hepatitis E virus. PLoS Pathog. 12 (4), e1005521(2016).
  11. Meister, T. L., et al. Cell culture systems for the study of hepatitis E virus. Antiviral Res. 163, 34-49 (2019).
  12. Fu, R. M., Decker, C. C., Dao Thi, V. L. Cell culture models for hepatitis E virus. Viruses. 11 (7), 608(2019).
  13. Kaushik, N., et al. Zinc salts block hepatitis E virus replication by inhibiting the activity of viral RNA-dependent RNA polymerase. J Virol. 91 (21), 10-1128 (2017).
  14. Gupta, J., et al. Antiviral activity of zinc oxide nanoparticles and tetrapods against the Hepatitis E and Hepatitis C viruses. Front Microbiol. 13, 881595(2022).
  15. Ansari, S., et al. Network controllability analysis reveals the antiviral potential of Etravirine against hepatitis E virus infection. mSystems. 10 (9), e00438-25(2025).
  16. Gremmel, N., et al. Hepatitis E virus neutralization by porcine serum antibodies. J Clin Microbiol. 61 (11), e00373-23(2023).
  17. Cai, W., et al. A high-throughput neutralizing assay for antibodies and sera against hepatitis E virus. Sci Rep. 6 (1), 25141(2016).
  18. Liu, C., et al. An optimized high-throughput neutralization assay for hepatitis E virus (HEV) involving detection of secreted Porf2. Viruses. 11 (1), 64(2019).
  19. Meng, J., Dubreuil, P., Pillot, J. A new PCR-based seroneutralization assay in cell culture for diagnosis of hepatitis E. J Clin Microbiol. 35 (6), 1373-1377 (1997).
  20. Emerson, S. U., et al. Putative neutralization epitopes and broad cross-genotype neutralization of Hepatitis E virus confirmed by a quantitative cell-culture assay. J Gen Virol. 87 (3), 697-704 (2006).
  21. Deshmukh, T. M., et al. Immunogenicity of candidate hepatitis E virus DNA vaccine expressing complete and truncated ORF2 in mice. Vaccine. 25 (22), 4350-4360 (2007).
  22. Gupta, J., et al. Expression, purification and characterization of the hepatitis E virus like-particles in the Pichia pastoris. Front Microbiol. 11, 141(2020).
  23. Guo, J., et al. Fluorescence Reduction Neutralization Test: A novel, rapid, and efficient method for characterizing the neutralizing activity of antibodies against dengue virus. Curr Issues Mol Biol. 47 (3), 140(2025).
  24. Bewley, K. R., et al. Quantification of SARS-CoV-2 neutralizing antibody by wild-type plaque reduction neutralization, microneutralization and pseudotyped virus neutralization assays. Nat Protoc. 16 (6), 3114-3140 (2021).
  25. Islam, M. D., et al. Neutralizing antibodies against the Japanese encephalitis virus are produced by a 12ákDa E coli expressed envelope protein domain III (EDIII) tagged with a solubility-controlling peptide. Vaccine. 56, 127143(2025).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Hepatitis E VirusNeutralization AssayFluorescence ReductionNeutralizing Antibody TitersVirus NeutralizationAntibody EfficacyVaccine EvaluationImmunofluorescent StainingORF2 ProteinHuh7 Cells

Related Articles