Method Article

اختبار تعادلية تقليل التألق لفيروس التهاب الكبد E لقياس عيارات الأجسام المضادة المعادلة

DOI:

10.3791/69892

⸱

May 22nd, 2026

 ,  ,  ,  , 
1Virology Laboratory, Centre for Virus Research, Therapeutics and Vaccines, Translational Health Science and Technology Institute, 2Department of Gastroenterology, All India Institute of Medical Sciences, New Delhi

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لا يوجد اختبار قياسي لتحييد الفيروس لفيروس التهاب الكبد E (HEV)، وهو فيروس RNA إيجابي غير سيتوباثي. هنا، يوصف اختبار تعادلية تقليل التألق (FRNT) يعتمد على قياس كمية بروتين الكبسيد الفيروسي الموسوم بالفلورية لتقييم فعالية الأجسام المضادة المضادة لفيروس HEV.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يقيس اختبار تعادلية الفيروس إمكانية تعادلية الجسم المضاد أو مزيج من الأجسام المضادة ضد الفيروس المقابل. تعد هذه تقنية قيمة لتقييم فعالية مرشحي اللقاح والأجسام المضادة المعادلة التي تم تطويرها ضد الفيروس. اختبار تقليل اللويحات (PRNT) هو طريقة شائعة لتقييم عيار الأجسام المضادة المعادلة الخاصة بالفيروس. ومع ذلك، فإن PRNT غير ممكن في حالة الفيروسات غير السيتوباتية. فيروس التهاب الكبد E (HEV) هو فيروس RNA أحادي الحس إيجابي، وينتمي إلى عائلة Hepeviridae. وهو سبب رئيسي لالتهاب الكبد الفيروسي الحاد حول العالم. لا يظهر أي تأثير خلوي في زراعة الخلايا الثديية. يتوفر لقاح ضد فيروس الكلب التشابه في الصين. ومع ذلك، لا تتوفر اللقاحات أو الأجسام المضادة العلاجية ضد HEV في معظم أنحاء العالم. تعمل عدة مختبرات على مرشحات لقاح ضد فيروس الكهرومغناطيسي العالي (HEV). اختبار تحييد لقياس فعالية لقاحات HEV سيكون أداة مفيدة جدا للباحثين. هنا، نصف اختبار تعادلية تقليل الفلورة (FRNT) لتقدير مقياس تعادلية 50٪ (NT50) للأجسام المضادة المضادة HEV. تم استخدام HEV المحايد لمضاد HEV ORF2، أو HEV المحايد من IgG للأرانب، لإصابة خلايا Huh7، تلاها تلوين فلوري مناعي لبروتين ORF2 الفيروس. تم قياس الخلايا الفلورية الموجبة في تطبيق ImageJ، وقدر NT50 بحجم 2.1 × 103. يمكن تطبيق هذه الطريقة لتقدير NT50 للأجسام المضادة لفيروس HEV الموجودة في الفئران المحصنة، والأجسام المضادة المضادة HEV المنتجة في المختبرات.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

فيروس التهاب الكبد E (HEV) هو فيروس RNA أحادي السلسلة ذو الإحساس الإيجابي وينتمي إلى عائلة Hepeviridae 1,2. عادة ما يسبب التهاب الكبد الحاد المحدود ذاتيا، لكنه قد يسبب التهاب الكبد المزمنلدى الأشخاص الذين يعانون من ضعف المناعة. النساء الحوامل معرضات لخطر كبير للإصابة بفشل كبدي حاد، حيث يرتفع معدل الوفاة حتى 30٪5. أفادت منظمة الصحة العالمية (WHO) بحوالي 19.47 مليون حالة التهاب الكبد الحاد E (AHE) و3450 حالة وفاة ناجمة عن HEV حول العالم في عام 2021. ينتقل فيروس الك....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم الحصول على موافقة لجنة الأخلاقيات المؤسسية (IEC) لجمع عينة براز من مريض مصاب بفيروس التهاب الدم المرتفع تم إدخاله إلى قسم أمراض الجهاز الهضمي في AIIMS، نيودلهي. تم الحصول على موافقة مستنيرة من المرضى المشاركين في الدراسة. تفاصيل المواد والمواد المستخدمة مدرجة في جدول المواد.

1. عزل الفيروس وقياسه

  1. بموافقة مستنيرة، احصل على عينة البراز من مريض مصاب بفيروس التهاب الدم المرتفع لتنقية الفيروس.
  2. أعد تعليق عينة البراز في محلول دولبيكو الملحي الفوسفاتي المخزن (DPBS) بتركيز نهائي 10٪ (w/v) وجهاز الطرد المركزي عند 7800 x جرام لمدة ساعة واحدة عند 4 درج....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

عدوى خلايا Huh7 بفيروس g1-HEV وتوصيف الفيروس

تم عزل g1-HEV من عينة براز باستخدام سلسلة من الخطوات، كما هو موضح (الشكل 1A). تم تقدير عدد نسخ الجينوم للجرعة g1-HEV المنقاة بواسطة RT-qPCR، تلاه التخزين عند -80 درجة مئوية. لتأكيد العدوى الفيروسية والتكاثر، تم إصابة خلايا Huh7 ب 1.8 × 10 نسخ جينومية مكافئة من4 نسخ جينومية من مخزون g1-HEV المنقى لمدة 72 ساعة، تلاها RT-qPCR وIFA. تم اكتشاف مستوى كبير من RNA م.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

FRNT هو طريقة قائمة على صبغ المناعة لتقدير القدرة المعادلة للأجسام المضادة. وقد استخدم لتقدير قيم NT50 للأجسام المضادة ضد عدة فيروسات، بما في ذلك فيروس الضنك (DENV)، وفيروس كورونا (SARS-CoV-2)، وفيروس التهاب الدماغ الياباني (JEV)23,24,25. في هذه الطريقة، يحتضن الفيروس بجسم مضاد اختبار (أو سيرا)، يليه إصابة الخلايا المزروعة بالخليط. يسمح للخلايا المصابة بأن تحتضن لفترة طويلة للسماح بتك.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون عدم وجود مصالح متنافسة.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تمويل هذا البحث جزئيا من خلال منحة من مجلس مساعدة أبحاث صناعة التكنولوجيا الحيوية، وزارة التكنولوجيا الحيوية، حكومة الهند، منحت ل MS وS وBN. يدعم البحث في مختبر التصلب المتعدد منحة أساسية من معهد علوم وتكنولوجيا الصحة الانتقالية. تحظى SA بدعم من وظيفة عالم أبحاث مشروع ممولة من المجلس الهندي للأبحاث الطبية، حكومة الهند. تحظى جامعة بويل بدعم من زمالة بحثية عليا من وزارة التكنولوجيا الحيوية في حكومة الهند.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
أنابيب ميكروفوج بسعة 1.5 ملأكسجينMCT-150-C
طبق زراعة الخلايا ذو 12 بئركورنينغ3512
هزاز الحاضنة بزاوية 37 درجةثيرمو ساينتفيك50163013
4′,6-دياميدينو-2-فينيليندولأبكامAB104139DAPI
أنبوب طرد مركزي 50 ملفالكون352070
طبق زراعة الخلايا ذو 6 آباركورنينغ 3516
دقيق أليكسا 594 الأجسام المضادة الثانوية IgGثيرمو ساينتفيكA-11012
الأجسام المضادة المضادة ل-ORF2جنسكريبتNAتم تركيبه خصيصا بواسطة Genscript وتم توصيفه في مختبرنا14
الأجسام المضادة IgG المضادة للأرنبجنسكريبتNA
مصل البقر ألبومينهيميدياMB083BSA
المجهر الكونفوكالأوليمبوسFV3000
DMEM، ارتفاع الجلوكوزهيميدياAL007A
مصل الأبقار الجنينيجيبكو16000-044FBS
ImageJ 1.54gImageJ.org (واين راسباند والمساهمون، المعاهد الوطنية للصحة، الولايات المتحدة الأمريكية)
مصل الماعز العاديهيميدياRM-10701
بارافورمالديهايدهيميدياGRN3660PFA
محلول الفوسفات الملحي pH 7.4هيميدياTL1006PBS
بولي إيثيلين غليكول 6000سيغما81255PEG6000
مجموعة SOLIScript للاستطلاع ذات الخطوة الواحدةسوليس بيوداين08-57-00250
كاشف TRIمركز البحوث الجزيئيةTR118
ترايتون X100سيغماX100
تريبسين-إيدتاجيبكو25300-54

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Smith, D. B., et al. International Committee on Taxonomy of Viruses Hepeviridae Study Group. Consensus proposals for classification of the family Hepeviridae. J Gen Virol. 95 (Pt 10), 2223-2232 (2014).
  2. Nan, Y., Zhang, Y. J. Molecular biology and infection of hepatitis E virus. Fron....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Hepatitis E VirusNeutralization AssayFluorescence ReductionNeutralizing Antibody TitersVirus NeutralizationAntibody EfficacyVaccine EvaluationImmunofluorescent StainingORF2 ProteinHuh7 Cells
Video Coming Soon

Related Articles