يصف هذا البروتوكول استخدام نظام غشاء دهني مستوٍ مصغر من نوع Montal–Mueller مع تضخيم متكامل لإجراء تسجيلات مستقرة للقنوات الأيونية المفردة. وقد تم توضيح هذه الطريقة من خلال إعادة تشكيل قناة K2P اصطناعية منقاة للتحقق من أداء النظام.
مقالة منهجية
الفيزيولوجيا الكهربائية أحادية القناة باستخدام نظام مونتال-مولر المصغر لطبقة الدهون الثنائية المستوية لتسجيل قناة K2P اصطناعية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
يوفر إعادة التشكيل الوظيفي للقنوات الأيونية في طبقات ليبيدية ثنائية مستوية استراتيجية لاستقصاء نشاط القنوات على مستوى الجزيء الواحد. ومع ذلك، فإن أنظمة طبقات Montal–Mueller التقليدية تتطلب عادةً تجهيزات تجريبية ضخمة، وتجميعاً يدوياً للغرفة، وأحجام تسجيل كبيرة نسبيًا، مما يزيد من استهلاك الكواشف وقد يؤدي إلى ظهور مصادر إضافية للضوضاء الكهربائية بسبب الأسلاك الممتدة ومراحل الرأس الخارجية. نقدم هنا منصة طبقات ثنائية مصغرة وجاهزة للاستخدام (BLMchipMM) مدمجة مع مضخم مدمج يتيح تسجيلات مستقرة للقناة الواحدة مع تقليل استهلاك الكواشف وتبسيط التشغيل. يصف هذا البروتوكول استخدام هذا النظام لإجراء قياسات الفيزيولوجيا الكهربائية للقناة الواحدة. وباستخدام هذا النظام، قمنا بإعادة تشكيل قناة K2P اصطناعية (ancTREK1) واستخدمناها كبروتين اختبار لإثبات المبدأ للتحقق من عملية إعادة التشكيل وتسجيل القناة الواحدة. وتظهر تسجيلات القناة الواحدة علاقة بين التيار والجهد في محاليل K+ متماثلة خالية من Mg2+، مع قيم توصيل متوافقة مع تلك المسجلة لقنوات TREK1. ويثبت نجاح إعادة تشكيل هذه القناة الشبيهة بـ K2P فائدة هذا النظام لتحليل القناة الواحدة في الأغشية الاصطناعية.
المقدمة
تعد إعادة تشكيل القنوات الأيونية في أغشية ثنائية الطبقة من الدهون الاصطناعية، والمعروفة أيضاً باسم أغشية الدهون السوداء (BLMs)، إحدى التقنيات الراسخة لإجراء التوصيف الفيزيولوجي الكهربائي للقنوات الأيونية على مستوى الجزيء الواحد1. وتنشأ مزايا أغشية BLMs من بنيتها؛ حيث يتم إنشاء طبقة دهنية ثنائية مستوية (PLB) داخل ثقب في سطح غير قطبي، مما يفصل بين محلولين سائلين. وبذلك، ومن خلال محاكاة الغشاء البيولوجي، تتيح هذه التقنية تسجيل نشاط القنوات الأيونية تحت ظروف خاضعة لرقابة صارمة، بما في ذلك تركيب الدهون الغشائية وتركيزات الإلكتروليت أو المركبات الكيميائية، مع بقائها متاحة الوصول من كلا الجانبين. كما تسمح هذه الإمكانية بإدراج القنوات الأيونية مباشرة، على سبيل المثال من محلول ميسيلاري أو عن طريق الاندماج المدفوع بالليبوزومات2,3.
كان أول نظام أغشية اصطناعية يتم وصفه قد أُنشئ باستخدام تقنية الطلاء4، حيث يتم وضع قطرة من الدهون المذابة في مذيب عضوي غير متطاير على فتحة صغيرة باستخدام فرشاة طلاء. ويؤدي بعد ذلك إضافة محلول مائي إلى كلا جانبي الفتحة إلى تكوين طبقة دهنية ثنائية بشكل تلقائي. ومع ذلك، فإن العيب الرئيسي لهذه الطريقة هو بقاء آثار من المذيب، مما قد يؤثر على خصائص الغشاء. ولتقليل كمية المذيب العضوي المتبقي داخل الطبقات الدهنية الثنائية، تم تطوير طريقة الطي5، والتي تتيح تكوين أغشية ثنائية الطبقة (BLMs) "خالية من المذيبات". في هذا النهج، يتم نشر محلول دهني في مذيب متطاير على سطح الماء لتكوين طبقتين أحاديتين، ومن خلال رفع مستوى الطور المائي تدريجياً فوق الفتحة، تنطوي هذه الطبقات الدهنية الأحادية فوق الفتحة لتكوين طبقة ثنائية. ورغم أن غشاء BLM الناتج يُعرف بأنه خالي من المذيبات، فإن نجاح تكوين الطبقة الثنائية يتطلب معالجة مسبقة للفتحة بطبقة رقيقة من مذيب غير متطاير. يتكون العنصر الأساسي المطلوب لهذه التجارい من غرفة تسجيل تحتوي على حجرتين مائيتين (يشار إليهما عادةً باسم cis و trans) يفصل بينهما حاجز محب للدهون يحتوي على فتحة صغيرة (بقطر 50–250 µm) (الشكل 1). يتم إدخال أقطاب الفضة/كلوريد الفضة (Ag/AgCl) في كل حجرة. وعند غمرها في المحلول الإلكتروليتي، تنشئ هذه الأقطاب اتصالاً كهرومغناطيسياً بين الطبقة الدهنية الثنائية وجهاز التسجيل. يتكون الأخير من مضخم تثبيت الجهد (voltage-clamp amplifier)، والذي يتيح التحكم الدقيق في الجهد عبر الغشائي والقياس المتزامن للتيارات الأيونية التي تمر عبر البروتينات المكونة للمسام والمدمجة في الغشاء.
الشكل 1: مخطط لجهاز الفيزيولوجيا الكهربائية للغشاء الليبيدي المستوي (PLB). مخطط للمكونات الأساسية المطلوبة لتجارب PLB. تتكون غرفة التسجيل من حجرتين مائيتين (cis و trans) يفصلهما حاجز محب للدهون يحتوي على فتحة يتشكل عندها الغشاء الليبيدي. يتم غمر أقطاب الفضة/كلوريد الفضة (Ag/AgCl) في المحلول الإلكتروليتي في كل حجرة. يقوم أحد الأقطاب بتطبيق محفزات جهد (على سبيل المثال، أشكال موجية جيبية أو مربعة أو مثلثية)، بينما يتصل القطب الآخر، المثبت عند التأريض، بمحول تيار إلى جهد يقوم بتحويل التيار الأيوني إلى إشارة جهد تناسبية. يتم تضخيم الإشارة، وتصفيتها اختيارياً، ثم تحويلها إلى صيغة رقمية وتسجيلها للمراقبة والتحليل في الوقت الفعلي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
تم اعتماد طرق أخرى أيضاً لتكوين أغشية دهنية ثنائية الطبقة (BLMs). ومن بين هذه الطرق، يتمثل نهج شائع في إنشاء طبقات دهنية ثنائية معلقة على طرف ماصة تثبيت الجهد (patch-clamp pipette). وبناءً على ذلك، تتيح طريقة الغمس الطرفي (tip-dip method)6 تكوين طبقة دهنية ثنائية معلقة خالية من المذيبات على فتحة ماصة زجاجية دقيقة بقطر يبلغ ~4 µm عن طريق غمس الطرف بشكل متكرر عبر طبقة دهنية أحادية عند الواجهة بين الهواء والماء، مما يؤدي إلى التقاط ورقة واحدة خلال كل عملية تمرير. كما استُخدمت تقنية تثبيت الجهد (patch-clamp) لإجراء قياسات القناة الواحدة في الأغشية الدهنية ثنائية الطبقة. فعلى سبيل المثال، في طريقة الثقب (punch-out method)7، تُستخدم ماصة زجاجية بقطر يتراوح بين 10 و80 µm لتثبيت غشاء كبير كان مطلياً في الأصل فوق فتحة في غرفة التسجيل. وبدلاً من ذلك، تتضمن طريقة تثبيت الليبوزوم (liposome-patch method) استخدام حويصلة مُشكلة مسبقاً يتراوح حجمها من النانو إلى الميكرو كغشاء دهني ثنائي الطبقة (BLM) خالٍ من المذيبات8,9. وبوجه خاص، استُخدمت الحويصلات أحادية الطبقة العملاقة على نطاق واسع لتسجيلات القناة الواحدة من خلال تكوينات مختلفة لتثبيت الجهد، بما في ذلك أنماط التثبيت المتصل بالخلية (cell-attached) والقطع المستأصل (excised patch)10,11.
ظهرت أيضاً عدة منصات لتكوين طبقات ثنائية متعددة بشكل متوازٍ وآلي. وأحد هذه النهج هو تقنية الطبقة الثنائية ذات الواجهة القطيرية (DIB)12، حيث يتم وضع قطيرات مائية في خليط من الدهون والمذيب. في هذه الطريقة، تتجمع الطبقات الدهون الأحادية تلقائياً حول القطيرات، ويحدث تكوين الطبقة الثنائية عندما تتلامس قطيرتان. وفي بعض التجهيزات، يمكن تكوين DIBs على الهلام المائي (hydrogels) لتحسين استقرار الغشاء13. وهناك نهج بديل يعتمد على تكوين DIB عند طرف ماصة زجاجية وهو طريقة الطبقة الثنائية لفقاعة التلامس (CBB)14، حيث يتم إدخال فقاعات مائية في طور زيتي باستخدام ماصتين دقيقتين. وكما هو الحال في نهج DIB، تتكون طبقة دهنية ثنائية تلقائياً عندما يتم جعل فقاعتين مغطاتين بالدهون في حالة تلامس. وتتمثل منصة أخرى في أنظمة BLM المصفوفية، والتي تتكون من مصفوفات من مسام محددة بدقة تتراوح أحجامها من المقياس الميكروي إلى النانوي ومرتبة في نمط شبكي. وفي هذه الأنظمة، يمكن تكوين طبقات دهنية ثنائية معلقة إما يدوياً — باستخدام تقنيات الطلاء أو الطي، أو عبر تمزيق حويصلات الليبوزوم15,16,17 — أو آلياً عن طريق الحقن المتسلسل للمحاليل الدهنية ومحاليل المنظم عند ربطها بهياكل القنوات المائعية الدقيقة18,19.
على الرغم من تطوير العديد من الطرق لتكوين أغشية ثنائية الطبقة (BLMs) خالية من المذيبات، فإننا نركز في هذا العمل على طريقة الطي (folding method) المطبقة ضمن منصة مصغرة ومتكاملة لدراسة سلوك القناة الواحدة لبروتينات الغشاء المدمجة في طبقة دهنية ثنائية اصطناعية. أُجريت التجارب باستخدام إعداد Elements، الذي يتكون من مكونين: قارئ Elements Nanopore (مضخم eNPR) وشريحة BLMchipMM (الشكل 2A والشكل 2B). الأول عبارة عن مضخم تثبيت جهد (voltage-clamp amplifier) مدمج ومنخفض الضوضاء يبسط مساحة العمل من خلال تشكيل وحدة كاملة ومستقلة، مما يلغي الحاجة إلى أجهزة خارجية إضافية. أما BLMchipMM فهي نظام مسبق التجميع ومصغر مصمم لتقنية Montal–Mueller وتعمل كواجهة تجريبية. تتكون من غرفة تسجيل شفافة من مادة بولي ميثيل ميثاكريلات (PMMA) متكاملة مع لوحة دوائر مطبوعة (PCB)، والتي تتضمن مقبسين مصممين لاستيعاب أسلاك Ag/AgCl التي تعمل كأقطاب كهربائية للاتصال المباشر بالمضخم. يتكون الهيكل الأساسي للغرفة من حاجز بولي إيميد محكم الغلق بين مكونين شفافين من PMMA. يبلغ سمك الحاجز 50 µm، باستثناء منطقة مركزية صغيرة (3.78 mm2)، حيث ينخفض السمك إلى 25 µm لتسهيل تكوين الطبقة الثنائية. في مركز هذه المنطقة الأقل سمكاً، يتم إنشاء فتحة مستدقة عن طريق الحفر بالليزر، مما يعزز الاستقرار الميكانيكي للطبقة الدهنية الثنائية20,21. تتوفر أربعة أقطار للفتحة (50 و75 و100 و140 µm)، مما يسمح بضبط سعة الغشاء (الجدول 1). يتميز كل مكون من PMMA بتجويف على شكل حرف C بحجم 110 µL، مما يشكل حجرتين مائعتين على جانبي حاجز البولي إيميد لاحتواء محلول الإلكتروليت. يتم حفر قناتين مائعتين مائلتين في كل كتلة PMMA على جانبين متقابلين: تُستخدم إحدى القناتين لإدخال قطب Ag/AgCl، بينما تسمح الأخرى بالتعديل اليدوي لمستوى المحلول المنظم داخل الخزان عن طريق الماصة.
الشكل 2: نظام قارئ Elements Nanopore وBLMchipMM المتكامل. (A) صورة فوتوغرافية توضح شريحة BLMchipMM وهي مُدخلة في الفتحة المخصصة لمضخم قارئ Elements Nanopore (eNPR). (B) تمثيل تخطيطي لمكونات BLMchipMM، بما في ذلك غرفة التسجيل المصنوعة من بولي ميثيل ميثاكريلات (PMMA)، والحاجز البولي إيميدي الذي يحتوي على الفتحة الميكروية، ولوحة الدوائر المطبوعة (PCB) المزودة بمآخذ لأقطاب Ag/AgCl وفتحة لمحاذاة الغرفة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
| قطر الثقب (µm) | 50 | 75 | 100 | 140 |
| سمك الثقب (µm) | 25 | 25 | 25 | 25 |
| سعة الغشاء النموذجية (pF) | 20–40 | 40–60 | 60–90 | 90–140 |
الجدول 1: خصائص تنسيقات فتحات BLMchipMM المتاحة. قطر الفتحة، وسماكة الحاجز عند منطقة الفتحة، وقيم سعة الغشاء النموذجية لأجهزة BLMchipMM ذات فتحات بحجم 50، و75، و100، و140 µm. تم عرض قيم سعة الغشاء للطبقات الثنائية المكونة من ليبيدات 1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine.
عادةً ما تكون غرف التسجيل المستخدمة في المختبرات إما وحدات مُصنعة ذاتياً أو أجهزة متوفرة تجارياً. وفي الحالة الأولى، يتطلب بناء النظام تجميع مكونات مختلفة وتطوير طريقة موثوقة لعمل الفتحة في السدادة، وهو ما قد يحد من إمكانية الوصول إليها في العديد من المختبرات. وحتى عند استخدام الأجهزة التجارية، فإنها غالباً ما تتطلب دمجاً يدوياً لمكونات متعددة قبل كل تجربة. في المقابل، يتم تجميع BLMchipMM مسبقاً ولا يتطلب التفكيك بين التجارب لإجراءات التنظيف الروتينية. ويمكن غسل الوحدة نفسها وإعادة استخدامها في تجارب متعددة دون المساس بجودة تكوين الغشاء، شريطة أن تكون المذيبات المستخدمة متوافقة مع مواد الجهاز. وهذا يقلل من التباين المعتمد على المستخدم ويقلل من مخاطر التسريب المرتبطة بعناصر الختم اليدوية. كما أن استخدام أقطاب أسلاك الفضة الخارجية والقابلة للاستبدال والتجديد يطيل العمر التشغيلي للنظام، خاصة في ظل الظروف التجريبية التي تسرع استهلاك الأقطاب.
علاوة على ذلك، غالبًا ما تتميز الأجهزة المصنعة يدويًا بأحجام حجيرات كبيرة، مما يزيد من كمية المكونات البيولوجية والكيميائية المطلوبة للتجارب. وفي المقابل، يتيح تصغير حجم BLMchipMM تقليل الأحجام التجريبية إلى الحد الأدنى، مما يؤدي بدوره إلى خفض استهلاك الكواشف والبروتينات والمركبات الأخرى بشكل كبير. ويعد هذا أمرًا مفيدًا بشكل خاص عند العمل مع بروتينات غشائية يصعب التعبير عنها أو ذات إنتاجية منخفضة، أو عندما تؤدي التكلفة العالية لتخليق المركبات المختبرة إلى زيادة التكلفة الإجمالية للتجارب. والأهم من ذلك، أن BLMchipMM يتيح تكوين طبقات ثنائية ذات مذيبات مخفضة ويدعم تكوينات غشائية غير متماثلة، حيث يمكن أن تتكون كل ورقة من أنواع ليبيدات مختلفة5,22، مما يسهل دراسة وظيفة البروتين الغشائي تحت ظروف مضبوطة.
تُجرى قياسات التيار تقليدياً باستخدام مضخمات مصممة لتجارب تثبيت الرقعة (patch-clamp)، والتي غالباً ما تتطلب الاتصال بمحول رقمي منفصل للحصول على البيانات والتحكم بها عبر واجهات رسومية. ولا تقتصر مشكلات هذه الأنظمة على كونها ضخمة وباهظة الثمن، بل تشمل أيضاً إجراءات إعداد غير بديهية للمستخدمين غير الخبراء. بالإضافة إلى ذلك، ونظراً لحجم غرفة التسجيل وتصميم المضخمات القياسية — التي تفتقر عادةً إلى دروع حماية مدمجة لحماية مدخل المرحلة الرأسية (headstage) من التداخل الكهروسكوني — فإن استخدام قفص فاراداي خارجي يكون ضرورياً في كثير من الأحيان. ويمكن أن تؤثر جودة وتأريض هذا القفص بشكل كبير على أداء الضوضاء في النظام. ويعمل BLMchipMM، عند استخدامه مع مضخم متكامل ومدمج، على تبسيط هذا التكوين من خلال تقليل الحاجة إلى المكونات الخارجية؛ حيث تتم رقمنة الإشارة داخل الجهاز، ويوفر غلاف النظام درعاً يقلل من القابلية للتأثر بالتداخل الكهرومغناطيسي المحيط.
لإثبات قابلية تطبيق هذه المنصة، استُخدمت القناة الشبيهة بـ K2P والتي تُدعى ancTREK1، وهي عضو سلفي مشتق حاسوبياً من الفصيلة الفرعية TREK (الشكل التكميلي 1)، كبروتين اختبار للتحقق من نجاح عملية إعادة التشكيل وتسجيل القناة المنفردة. تُكوّن قنوات K2P قنوات تسريب بوتاسيوم ثنائية القسيمات تعمل على تنظيم جهد الغشاء وقت الراحة والاستثارة الخلوية، وتمثل قنوات TREK فصيلة فرعية موصوفة بدقة.
البروتوكول
لم تتضمن هذه الدراسة مشاركين بشرين، أو مواد مشتقة من البشر، أو حيوانات تجارب. وبناءً على ذلك، لم تكن الموافقة الأخلاقية مطلوبة وفقاً للإرشادات المؤسسية والوطنية.
1. تحضير إعدادات الفيزيولوجيا الكهربائية
- معايرة الجهاز
على الرغم من أن المعايرة الرسمية ليست مطلوبة لأن النظام مهيأ مصنعياً، إلا أنه يجب التحقق من الوظيفة السليمة للنظام قبل تكوين الغشاء.- قياس مقاومة الدخل في ظروف الدائرة المفتوحة (أي بدون إدخال BLMchipMM). يجب أن تكون المقاومة المقاسة ≥1 TΩ، مما يؤكد سلامة دخل المضخم.
- التحقق من استجابة النظام باستخدام خلية نموذجية تحتوي على مقاومة بقيمة 1 GΩ. يجب أن تكون المقاومة المقاسة 1 GΩ ضمن نطاق ±30%، بما يتوافق مع تفاوت المقاومة المدمجة.
- قياس ضجيج الخط الأساسي في ظروف الدائرة المفتوحة عند جهد ثابت (0 mV). يجب أن يكون ضجيج RMS بمقدار ≤300 fA عند معدل أخذ عينات 10 kHz وعرض نطاق ترددي 5 kHz، مما يؤكد أداء النظام منخفض الضجيج.
- تحضير أقطاب Ag/AgCl
- عند الاستخدام الأول، تُشطف الأسلاك الفضية بالإيثانول والماء المقطر مرتين.
- بالنسبة للأسلاك المستخدمة مسبقاً، استخدم ورق صنفرة ناعم جداً لإزالة طبقة Ag/AgCl القديمة من سطح السلك حتى يظهر السطح فضياً لامعاً وبشكل موحد مع بريق معدني نظيف وخالٍ من أي رواسب مرئية. ثم تُشطف بالإيثانول والماء المقطر مرتين.
- تتم كلورة الجزء الطرفي من الأسلاك الفضية عن طريق نقعها في محلول هيبوكلوريت الصوديوم (NaOCl) بتركيز 1%–5% (الشكل 3A) حتى تصبح رمادية فاتحة، وعادة ما يستغرق ذلك من 15–30 دقيقة. يجب مراقبة الأسلاك المكلورة بمرور الوقت للكشف عن أي تدهور أثناء الاستخدام، والذي يظهر على شكل تغير في اللون، أو انزياح في تيار الخط الأساسي، أو كليهما.
ملاحظة: يمكن إجراء الكلورة باستخدام مبيض منزلي شائع (1%–5% NaOCl).
تنبيه: لا تكلور الأسلاك على طولها بالكامل. اترك الجزء الطرفي الذي يركب في مقبس PCB دون كلورة لضمان التوصيل الكهربائي السليم.
تنبيه: صُممت المقابس الموجودة على PCB للأسلاك الفضية ذات القطر 0.5 mm. قد لا تتناسب الأقطار الأخرى بشكل صحيح أو قد تؤدي إلى توصيلات غير مستقرة.
- تجميع BLMchipMM
- أدخل الجزء الطرفي غير المكلور من السلكين الفضيين في مقابس PCB. استخدم الملاقط إذا لزم الأمر لوضعها بشكل صحيح (الشكل 3B).
- ضع النهايات المكلورة للأسلاك في القنوات المائعية المحفورة في مكون PMMA (الشكل 3C).
- قم بتدوير BLMchipMM برفق وثبته على PCB عن طريق تركيب السن السفلي لغرفة تسجيل PMMA في الفتحة المخصصة (الشكل 3D).
- تحقق من موضع الأسلاك وتأكد من وصولها إلى نهاية القنوات المائعية. إذا لزم الأمر، ادفع الأسلاك برفق حتى تظهر النهايات في قاع المقصورات (الشكل 3E).
تنبيه: ضع الأسلاك في أقرب وضع ممكن من مكون PMMA. قد يؤدي الانحناء المفرط إلى التلامس مع غطاء المضخم، مما يؤدي إلى حدوث دائرة قصيرة وتشبع في الإشارة.
- تحضير الليبيدات ومحلول التسجيل
- حضّر 100 µL من محلول هيكساديكان بتركيز 1% (v/v) في n-hexane بتركيز 100% للمعالجة المسبقة لفتحة السداد. يُحفظ هذا المحلول عند درجة حرارة −20°C لمدة تصل إلى أسبوع واحد.
- أعد تعليق ليبيدات 1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPhPC) في n-pentane بتركيز 100% للوصول إلى تركيز نهائي قدره 15 mg/mL. يُحفظ هذا المحلول عند درجة حرارة −20°C لمدة تصل إلى 24 h.
- حضّر محلول التسجيل الإلكتروليتي في درجة حرارة الغرفة (RT; 20°C–25°C) عن طريق خلط 3 mL من محلول KCl المخزون بتركيز 1 M مع 150 µL من محلول 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid المخزون بتركيز 1 M (مع ضبط pH 7.4 باستخدام KOH بواسطة مقياس pH). أضف الماء المقطر مرتين ليصل الحجم النهائي إلى 15 mL. يُحفظ المحلول عند درجة حرارة 4°C لمدة تصل إلى أسبوع واحد (الجدول 2).
الشكل 3: تجميع جهاز BLMchipMM. (أ) كلورة أسلاك Ag عن طريق النقع في المبيض. (ب) إدخال أسلاك Ag في مقابس PCB. (ج) وضع أسلاك Ag داخل القنوات الموائعية الدقيقة. (د) وضع غرفة التسجيل فوق PCB. (هـ) التحقق من الوضع الصحيح للأقطاب الكهربائية داخل القنوات الموائعية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
| كاشف | التركيز النهائي | الحجم |
| ماء مقطر مرتين | — | أضف إلى 15 مل |
| كلوريد البوتاسيوم (KCl) (1 مولار) | ٢٠٠ ميلي مولار | ٣ مل |
| هيبس pH 7.4 (هيدروكسيد البوتاسيوم) (1 مولار) | 10 ملي مولار | 150 µL |
الجدول 2: محلول تسجيل الإلكتروليت. تركيب محلول الإلكتروليت المستخدم لتسجيلات PLB، بما في ذلك تركيزات الكواشف وأحجام التحضير. يتم ضبط الحجم النهائي إلى 15 mL باستخدام ماء مقطر مرتين. يجب ترشيح محلول التسجيل باستخدام مرشح حقنة 0.2 µm قبل الاستخدام.
ملاحظة: قم بترشيح محلول التسجيل باستخدام مرشح سرنجة بمسامية 0.2 µm قبل الاستخدام. قد تتوفر ليبيدات DPhPC في شكل مسحوق جاف أو مذابة في الكلوروفورم. تُخزن كلتا الصيغتين عند درجة حرارة −20°C في قوارير زجاجية محكمة الإغلاق تحت غاز خامل لمنع الأكسدة. اترك المسحوق الجاف ليتوازن مع درجة حرارة الغرفة (RT) قبل الفتح. قم بتحضير محاليل طازجة من المسحوق الجاف واستخدمها خلال 24 h. في حال استخدام مخزونات الكلوروفورم، قم بتبخير المذيب تماماً تحت النيتروجين قبل إعادة التعليق، حيث يمكن للكلوروفورم المتبقي أن يؤدي إلى زعزعة استقرار الغشاء.
2. تكوين PLB باستخدام طريقة Montal–Mueller
تصف الخطوات التالية تكوين غشاء اصطناعي باستخدام طريقة الطي، والتي تُعرف أيضاً بتقنية مونتال-مولر (Montal–Mueller)5 (الشكل 4). يتضمن هذا النهج معالجة مسبقة لفتحة الحاجز بطبقة رقيقة من الهيكساديكان 1% (v/v) في n-hexane، وترسيب محلول دهني لتكوين طبقات أحادية عند الواجهة بين الهواء والماء، ثم طي الطبقات الأحادية فوق الفتحة مع رفع مستوى محلول الإلكتروليت بشكل تتابعي في مقصورات الغرفة.
الشكل 4: تكوين طبقات دهنية ثنائية في الثقوب (PLBs) باستخدام طريقة Montal–Mueller. (A) المعالجة المسبقة للثقب بـ 1% hexadecane في n-hexane وملء الحجرات حتى مستوى الثقب. (B) تكوين طبقات دهنية أحادية عند الواجهة بين الهواء والماء. (C> و D) الرفع المتسلسل لمستوى المنظم في كل حجرة، مما يؤدي إلى طي الطبقات الأحادية وتكوين طبقة دهنية ثنائية خالية من المذيب عبر الثقب. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
- تكوين الغشاء
- قم بمعالجة فتحة الحاجز مسبقاً بمحلول hexadecane بتركيز 1% (v/v) في n-hexane باستخدام طرف ماصة. ضع حوالي 2 µL لكل جانب (الشكل 4A).
- اترك المذيب يتبخر لمدة 5 min عند درجة حرارة 23°C–25°C ورطوبة نسبية 45%–50%.
- أدخل شريحة BLMchipMM المجمعة في المضخم.
- قم بتوصيل المضخم بجهاز الكمبيوتر عبر كابل USB وافتح برنامج الحصول على البيانات.
- اضبط نطاق التيار على 2 nA وقم بتفعيل أداة تقدير RC لمراقبة سعة الغشاء ومقاومته.
ملاحظة: يتم تكوين إعدادات تقدير RC افتراضياً ولكن يمكن تعديلها إذا لزم الأمر. - املأ كل حجرة بـ 30 ± 2 µL من محلول التسجيل وصولاً إلى الحافة السفلية للفتحة (الشكل 4A).
تنبيه: لا تسمح لمحلول التسجيل بترطيب المنطقة المحيطة بالفتحة. - وزع 2.5 ± 0.1 µL من محلول الدهون على شكل قطرات فوق سطح الطور المائي في كل حجرة (الشكل 4B).
- اترك المذيب يتبخر لمدة 2 min.
- ضع طرف ماصة في قاع إحدى الحجرتين بزاوية 90° تقريباً وأضف 80 ± 2 µL من محلول التسجيل. كرر العملية للحجرة الثانية (الشكل 4C و الشكل 4D).
ملاحظة: تشير أوقات تبخر المذيب إلى ظروف 23°C–25°C، وهواء ساكن، ورطوبة نسبية 45%–50%. - أغلق غطاء قفص فاراداي وراقب إشارة التيار. تشير قيم مقاومة الغشاء التي تزيد عن 200 GΩ إلى نجاح تكوين الطبقة الثنائية وسلامة الغشاء.
ملاحظة: يُستدل على نجاح تكوين الغشاء من خلال إشارة تيار موجية مربعة تتذبذب حول الصفر، وبسعة تتناسب مع سعة الغشاء (الشكل 5A).
الشكل 5: مراقبة تكوين الغشاء باستخدام واجهة برنامج الاستحواذ. (A) أثر تمثيلي يوضح تكوين الغشاء بنجاح. حيث ينتج شكل موجي جهد مثلثي (100 mV من القمة إلى القمة، 10 Hz) تياراً سعوياً على شكل موجة مربعة يتناسب مع سعة الغشاء (~45 pF). (B) أثر تمثيلي يشير إلى عدم تكوين الغشاء، ويتميز بتشبع إشارة التيار. (C) إشارة سعوية تقابل السعة الشاردة عندما لا يتكون الغشاء ثنائي الطبقة، كما هو الحال عندما تكون الفتحة مكشوفة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
ملاحظة: تشير الإشارة التي تتأرجح بين حدود نطاق التيار إلى فشل الغشاء (الشكل 5B).
ملاحظة: تزداد ضوضاء RMS مع زيادة سعة الغشاء وبالتالي مع زيادة حجم الفتحة. وتتراوح قيم الضوضاء النموذجية المقاسة تحت ظروف جهد ثابت (0 mV)، وبمعدل أخذ عينات 5 kHz ونطاق ترددي 2.5 kHz، على النحو التالي: 0.48–2.00 pA (50 µm)؛ و 0.74–2.62 pA (75 µm)؛ و 1.00–3.52 pA (100 µm)؛ و 1.59–5.27 pA (140 µm).
ملاحظة: يمكن أن يؤدي خفض ورفع مستوى المحلول المنظم في إحدى الحجرات إلى تعزيز تكوين الغشاء في حال فشل المحاولات الأولية.
ملاحظة: عند الحاجة، يتم تطبيق فقاعة هوائية فوق الفتحة لمدة ~5 s باستخدام رأس ماصة لتسهيل تكوين الطبقة الثنائية.
ملاحظة: قد يؤدي خفض مستوى المنظم تحت الفتحة أو وجود فقاعة هوائية إلى إنتاج إشارة مقابلة للسعة الشاردة (الشكل 5C). إذا كانت المخرجات تشبه الشكل 5B، فقد تكون المعالجة المسبقة غير فعالة. أعد تطبيق محلول المعالجة المسبقة والدهون، أو قم بتنظيف الجهاز وتكرار الإجراء.
تنبيه: قم بإجراء تعويض إزاحة الجهد فقط في حالة عدم وجود غشاء. إذا كان الغشاء موجوداً، فقم بتمزيقه باستخدام وظيفة ZAP قبل عملية التعويض.
ملاحظة: يمكن إجراء التجارب على طاولة مختبر قياسية؛ ومع ذلك، يمكن استخدام طاولة مضادة للاهتزاز إذا لزم الأمر.
3. تنظيف شريحة BLMchipMM
- قم بإزالة غرفة التسجيل من لوحة الدائرة المطبوعة (PCB).
- اغسل كلا الحجرتين والقنوات المائعية باستخدام كحول الأيزوبروبيل (IPA) بتركيز 100%.
تنبيه: لا تتجاوز مدة التعرض لـ IPA دقيقة واحدة.
تنبيه: لا تستخدم الأسيتون أو الإيثانول بتركيز 100%، حيث قد تؤدي هذه المذيبات إلى تلف مادة إحكام الغلق الخاصة بالغرفة.
ملاحظة: تحقق من توافق أي مذيبات إضافية مع مادة PMMA قبل الاستخدام. - اشطف الغرفة جيداً باستخدام ماء مقطر مرتين.
- جفف غرفة التسجيل تماماً باستخدام تيار لطيف من الهواء المضغوط حتى لا تبقى أي قطرات ماء مرئية.
ملاحظة: افحص الغرفة تحت مكبر مضاء للتأكد من عدم وجود أي طبقات زيتية متبقية. إذا لزم الأمر، كرر إجراء التنظيف والتجفيف.
ملاحظة: تأكد من أن الغرفة نظيفة وجافة تماماً قبل بدء تجربة جديدة.
4. تعبير وتنقية قناة الأيونات الاصطناعية (ancTREK1)
- تحضير بنية التعبير الجيني
تصف الخطوات التالية استراتيجيات الاستنساخ، والتعبير غير المتجانس في خلايا Freestyle-293F، وتنقية بروتين ancTREK1.
بناء ناقل التعبير باستخدام تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)، والهضم بإنزيمات القطع، والربط، والتحول إلى خلايا بكتيريا Escherichia coli كيميائية الكفاءة.23,24عَبِّر عن تسلسل ancTREK1 (الشكل التوضيحي التكميلي 1باستخدام ناقل ثديي يحتوي على وسم GFP عند الطرف الكربوكسيلي وHis₈ وسم، يتيح الكشف القائم على الفلورة25,26 وتنقية تقاربية على خطوتين باستخدام حمض النيكل-نيتريلو ثلاثي الخليك (Ni2⁺(راتنج NTA-)27,28,29 يتبع ذلك استخدام راتنج الأجسام النانوية المضادة لـ GFP30,31,32. - تضخيم الحمض النووي ancTREK1 بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)
- يُخفف كل من بادئات تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR primers) وقالب الحمض النووي (DNA template) للوصول إلى التركيزات النهائية التالية: 10 µM و~20 نانوغرام/µL باستخدام ماء مقطر مرتين ومعقم.
- أذب جميع الكواشف على الثلج.
- قم بإعداد 50 µL تفاعل PCR يحتوي على 10 µL من 5× محلول منظم، 2.5 µL من كل منها 10 µM بادئ، 2 µL من قالب الحمض النووي (DNA)، 1 µL من 10 ملي مولار من dNTPs، 0.5 µL من إنزيم بلمرة الدنا عالي الدقة (high-fidelity DNA polymerase)، والماء المقطر مرتين المعقم حتى الوصول إلى الحجم المطلوب (جدول 3امزج بلطف ثم قم بالطرد المركزي لفترة وجيزة.
- أجرِ تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) وفقاً للشروط التالية: المسخ الأولي عند 98°C لمدة 3 دقائق؛ 30 دورة من 98°C لمدة 30 ثانية، 68°C لمدة 30 ثانية، و 72°C لمدة 30 ثانية؛ والتمديد النهائي عند 72°C لمدة 3 دقائق (جدول 4).
- يتم تشغيل ناتج تفاعل البلمرة المتسلسلة (PCR) على هلام أغاروز بتركيز 1% (وزن/حجم) في 1× محلول منظم TAE بجهد 60 فولت لمدة 90 دقيقة، ثم استئصال النطاق الصحيح.
ملاحظة: قم بتنقية نواتج تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) باستخدام طريقة الاستخلاص من الهلام، وقياس تركيز الحمض النووي (DNA) عند طول موجي 260 نانومتر، وتخزين نواتج تفاعل البوليميراز المتسلسل المنقاة عند درجة حرارة −20°C إذا لزم الأمر.
- إجراء الهضم التقييدي
- حضّر تفاعلات الهضم التي تحتوي على 2 µg وناتج تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) و 2 µg من الحمض النووي البلازميدي (plasmid DNA) في أنابيب منفصلة. أضف 5 µL من 10× محلول منظم، 0.5 µL إنزيم EcoRI و 0.5 µL إنزيمات القطع NotI، ثم يتم الضبط إلى 50 µL بماء مقطر مرتين (جدول 5).
- امزج بلطف ثم حضّن في 37°C لمدة 3 ساعات.
- تثبيط الإنزيمات حرارياً عند 65°C لمدة 20 دقيقة.
- أضف 1 µL الفوسفاتاز القلوي إلى عملية هضم الناقل والتحضين عند 37°C لمدة ساعة واحدة.
- قم بتشغيل نواتج الهضم على هلام أجاروز بتركيز 1% واستخلص الحزم المطلوبة.
ملاحظة: قم بتنقية قطع الحمض النووي (DNA) باستخدام طرق التنقية المناسبة، واحفظ الحمض النووي المنقى في درجة حرارة −20°C إذا لزم الأمر.
- إجراء الربط والتحول الجيني
- قم بتحضير 20 µL تفاعل الربط الذي يحتوي على الناقل والمدرج (بنسبة مولية 3:1)، 2 µL 10× محلول منظم الليغاز، و 1 µL إنزيم الليغاز (جدول 6).
- تُحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة.
- قم بإذابة خلايا بكتيريا E. coli ذات الكفاءة الكيميائية على الثلج.
- أضف 5 µL من مزيج الربط إلى 50 µL من الخلايا والتحضين على الثلج لمدة 20 دقيقة.
- صدمة حرارية عند 42°C لمدة دقيقة واحدة، ثم يُعاد إلى الثلج لمدة دقيقتين.
- أضف 450 µL وسط LB والتحضين عند 37°C مع الرج لمدة ساعة واحدة.
- يُطرد مركزياً عند 3,000 دورة في الدقيقة × لمدة دقيقة واحدة، ثم أعد تعليق الراسب في 50 µL.
- تُزرع العينات على آغار انتقائي وتُحضن طوال الليل في درجة حرارة 37°C.
ملاحظة: تحقق من نجاح عملية الاستنساخ عن طريق التسلسل.
- نقل الجينات إلى خلايا HEK293F
- قم باستزراع خلايا 293F في 250 مل بتركيز 0.5 × 106 خلية/مل في وسط تعليق خالٍ من المصل، ثم تحضن عند 37°C مع 6% من أول أكسيد الكربون (CO)₂.
- تجهيز 250 µg من الحمض النووي (DNA) في حجم نهائي قدره 3 مل من وسط زراعي منخفض المصل.
- تحضير 750 µg من البولي إيثيلين إيمين (PEI) في الماء بتركيز 1 مجم/مل، مع ضبط الأس الهيدروجيني (pH) ليكون بين 6.9 و7.1 باستخدام هيدروكسيد الصوديوم (NaOH)، ثم ترشيح المحلول تعقيميًا، وتكملة الحجم النهائي إلى 3 مل باستخدام وسط غذائي منخفض المصل.
- امزج محلولي DNA وPEI معاً، ثم اخلطهما برفق، واتركهما في الحاضنة لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- أضف المزيج إلى الخلايا قطرة تلو الأخرى.
- أضف بوتيرات الصوديوم ليصل التركيز النهائي إلى 10 ميليمولار بعد مرور 4 ساعات.
- يتم حصاد الخلايا بعد 48 ساعة عن طريق الطرد المركزي عند 500 × ج لمدة 15 دقيقة.
- تُحفظ كرات الخلايا عند درجة حرارة −80°C.
- إذابة بروتينات الغشاء
- قم بإذابة كتل الخلايا الناتجة عن 100 مل من مستنبت HEK293 على الثلج.
- أعد تعليق كتلة الخلايا المترسبة في محلول التحلل بنسبة 1:10 (وزن/حجم) (جدول 7).
أضف المنظف ليصل إلى التركيزات النهائية من 1% من n-dodecyl-β-D-مالتوسيد (DDM) و0.1% من هيميسكسينات الكوليستيريل (CHS). - يُحضن مع التدوير عند 4°C لمدة ساعتين.
- يُجرى الطرد المركزي عند 100,000 × ج لمدة ساعة واحدة عند 4°C.
- اجمع السائل الطافي.
تنبيه: قم بتنفيذ جميع الخطوات في 4°C باستخدام محاليل منظمة مبردة مسبقاً.
- إجراء تنقية الكروماتوغرافيا بالألفة للأيونات المعدنية (IMAC)
- حزمة 500 µL من النيكل (Ni)2⁺راتنج NTA في عمود تصفية بالجاذبية.
- قم بموازنة الراتنج باستخدام حجمين من حجم العمود (CVs) من محلول الموازنة المنظم (جدول 8).
- يتم تحميل العينة وتحضينها مع خلط خفيف بسرعة 10 دورات في الدقيقة و 4°C لمدة 3 ساعات.
- ضع العمود بشكل رأسي واجمع السائل النافذ عن طريق التدفق بالجاذبية.
- اغسل الراتنج بـ 10 أحجام عمودية (CVs) من محلول الغسل المنظم الذي يحتوي على 30 ميليمولار من الإيميدازول.
- استخلص البروتين باستخدام 10 أحجام عمود (CVs) من محلول الاستخلاص المنظم الذي يحتوي على 300 مللي مولار من الإيميدازول.
ملاحظة: قم بتحليل الكسور باستخدام الفصل الكهربائي للهلام بوجود دوديسيل كبريتات الصوديوم (SDS-PAGE)الشكل 6). احفظ كسور السائل النافذ وكسور الغسل من أجل التحليل. خزن البروتين في 4°C طوال الليل إذا لزم الأمر
- إجراء تنقية مضادة لبروتين GFP
- عبئ 1 مل من راتنج anti-GFP في عمود ترشيح بالجاذبية.
- قم بموازنة الراتنج باستخدام حجمين من حجم العمود (2 CVs) من المنظم 1 (جدول 9قم بتحميل ناتج شطف كروماتوغرافيا الألفة للأيونات المعدنية (IMAC eluate) وحضنه مع خلط لطيف بسرعة 10 دورات في الدقيقة و 4°C لمدة 3 ساعات.
- ضع العمود بشكل رأسي واجمع السائل النافذ عن طريق التدفق بالجاذبية.
- اغسل الراتنج بالتتابع بـ 10 أحجام عمود (CVs) من المنظم 1، و10 أحجام عمود من المنظم 2، و10 أحجام عمود من المنظم 1.
- خفف بروتياز HRV-3C في 2 مل من المنظم 1 (Buffer 1) بنسبة بروتياز إلى بروتين تبلغ 1:50.
- أضف المنظم 1 (Buffer 1) المدعم ببروتياز HRV-3C إلى الراتنج، واخلط بلطف، ثم حضّن طوال الليل عند 4°C في وضعية عمودية ثابتة.
- اجمع البروتين المشطور في جزء الاستخلاص.
- ركّز العينة باستخدام جهاز تركيز بالطرد المركزي بحد قطع يبلغ 50 كيلو دالتون عند 3,000 دورة في الدقيقة. × و و 4°C حتى يصل الحجم النهائي إلى حوالي 500 µL تم الوصول إليه.
ملاحظة: يتم تحليل الكسور باستخدام الفصل الكهربائي للهلام بوجود دوديسيل كبريتات الصوديوم (SDS-PAGE) (الشكل 7). أعد تعليق البروتين بشكل دوري أثناء التركيز لمنع التجميع. يُحفظ البروتين المنقى عند درجة حرارة −80°C بعد التجميد السريع. تقريبًا 60 µg يمكن الحصول على كمية من البروتين من 100 مل من المزرعة.
الشكل 6: تنقية ancTREK1 بواسطة كروماتوغرافيا الألفة للأيونات المعدنية المثبتة (IMAC). تحليل كسور الشطف من IMAC باستخدام الفصل الكهربائي لهلام بولي أكريلاميد ودوديسيل كبريتات الصوديوم (SDS-PAGE) مع الكشف الفلوري. المسار M: مؤشر الوزن الجزيئي. المسار a: كسر الشطف من IMAC يظهر ancTREK1 الموسوم بالبروتين الفلوري الأخضر (GFP) (السهم الأصفر). يشار إلى GFP الحر الناتج عن الانشطار الذاتي بـ (*eGFP). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 7: تنقية ancTREK1 بواسطة كروماتوغرافيا الألفة باستخدام جسم مضاد نانوي مضاد لـ GFP. تحليل SDS-PAGE للأجزاء المستخلصة المصبوغة بصبغة Coomassie Blue. المسار M: مؤشر الوزن الجزيئي. المسار a: جزء الاستخلاص المضاد لـ GFP الذي يظهر وجود بروتياز 3C. المسار b: بروتين ancTREK1 المنقى بعد التركيز. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
| كاشف | الحجم لـ 50 µL تفاعل | التركيز النهائي |
| ماء مقطر مزدوج | أضف إلى 50 µL | — |
| 5× Phusionعلامة تجارية محلول منظم GC | 10 µL | 1× |
| dNTPs (بتركيز 10 ملي مولار لكل منها) | 1 µL | 200 µM كل من |
| بادئ أمامي (10 µM) | 2.5 µL | 0.5 µM |
| بادئ عكسي (10 µM) | 2.5 µL | 0.5 µM |
| الحمض النووي القالب (20 نانوجرام/µL) | 2 µL | ٠.٨ نانوجرام/µL |
| Phusionعلامة تجارية مسجلة بوليميراز الحمض النووي عالي الدقة (High-Fidelity DNA polymerase) | 0.5 µL | ٠,٠٢ وحدة/µL |
الجدول 3: إعداد تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) لتضخيم ancTREK1. تركيب الكواشف، والأحجام، والتركيزات النهائية المستخدمة في تضخيم تسلسل DNA لـ ancTREK1 باستخدام نظام DNA polymerase عالي الدقة.
| الخطوة | درجة الحرارة | الزمن | الدورات |
| المسخ الأولي | 98°C | 3 min | 1 |
| المسخ | 98°C | 30 s | 30 |
| الارتباط | 68°C | 30 s | 30 |
| الاستطالة | 72°C | 30 s | 30 |
| الاستطالة النهائية | 72°C | 3 min | 1 |
| الحفظ | 12°C | حفظ | — |
الجدول 4: ظروف دورات PCR لتضخيم ancTREK1. معلمات الدورة الحرارية المستخدمة لتضخيم تسلسل DNA الخاص بـ ancTREK1، بما في ذلك خطوات المسخ، والارتباط، والتمديد، والتمديد النهائي.
| مكوّن | هضم القطعة المُدرجة (50 µL) | هضم الناقل وإزالة الفوسفات (50 µL) |
| ماء مقطر مزدوج₂أو | إلى 50 µL | إلى 50 µL |
| 10× المحلول المنظم الأحمر ANZA | 5 µL | 5 µL |
| الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين (DNA) | منتج PCR لـ ancTREK1 (2 µg) | الحمض النووي لناقل pEG BacMam C-term 3C eGFP His8 (2 µg) |
| أنزا™ EcoRI | 0.5 µL | 0.5 µL |
| أنزا™ NotI | 0.5 µL | 0.5 µL |
| أنزا™ الفوسفاتيز القلوي | — | 1 µL |
الجدول 5: هضم إنزيمي لقطعة الإدراج والناقل لاستنساخ ancTREK1. ظروف التفاعل للهضم التقييدي لناتج PCR الخاص بـ ancTREK1 وناقل التعبير باستخدام إنزيمي EcoRI و NotI. يتضمن هضم الناقل خطوة إضافية لإزالة الفسفرة باستخدام الفوسفاتاز القلوي لمنع الربط الذاتي.
| مكوّن | الكمية (20 µL تفاعل) |
| ماء مقطر مزدوج₂هـ | إلى 20 µL |
| 10× محلول منظم لإنزيم تي 4 دي إن إيه ليغاز (T4 DNA Ligase Buffer) | 2 µL |
| حمض DNA المدرج لـ ancTREK1 (بطول 843 زوج قاعدي) | ١٠ نانوجرام |
| الحمض النووي لناقل pEG BacMam C-term 3C eGFP His8 (7673 زوج قاعدي) | 30 نانوغرام |
| إنزيم تي 4 دي إن إيه ليغاز (T4 DNA Ligase) | 1 µL |
الجدول 6: ظروف ربط الناقل والقطعة المدرجة لاستنساخ ancTREK1.مزيج التفاعل لربط قطعة ancTREK1 المدرجة في ناقل التعبير pEG BacMam بنسبة مولية 1:3 باستخدام T4 DNA ligase.
| مكوّن | التركيز النهائي | الكمية (حتى 5 مل) |
| ماء مقطر مزدوج₂O | — | إلى 5 مل |
| KCl (1 مولار) | ٢٠٠ ميليمولار | 1 مل |
| تريس-HCl بأس هيدروجيني 8 (1 مولار) | 20 ميلي مولار | 100 µL |
| MgCl2₂ (١٠٠ ميليمولار) | 1 ملي مولار | 50 µL |
| مثبط البروتياز PMSF (بتركيز 100 ملي مولار) | 1 ملي مولار | 50 µL |
| مثبط البروتياز ليوبيبتين (1 ملغ/مل) | 1 µg/mL | 5 µL |
| مثبط البروتياز أبروتينين (1 ملغ/مل) | 1 µg/mL | 5 µL |
| مثبط البروتياز Pepstatin A (١ مجم/مل) | 1 µg/mL | 5 µL |
| دي إن إيز I (50 مجم/مل) | 25 µg/mL | 2.5 µL |
| ن-دوديسيل-β-D-مالتوسيد (DDM، 10%) | 1% | 500 µL |
| كوليستيريل هيميسكسينات (CHS, 2%) | 0.10% | 250 µL |
الجدول 7: تركيب محلول التحلل لاستخلاص بروتينات الغشاء.تركيبة محلول التحلل المستخدم لإذابة بروتينات الغشاء، بما في ذلك الأملاح، وعوامل التنظيم، ومثبطات البروتياز، والنوكلياز، والمنظفات. ملاحظة: يجب تحضير المحاليل المنظمة حديثاً قبل الاستخدام.
| محلول التوازن المنظم (الحجم الإجمالي 10 مل) | ||
| المكوّن | التركيز النهائي | الكمية |
| ماء مقطر مزدوج₂أو | — | إلى 10 مل |
| KCl (1 مولار) | ٢٠٠ ملي مولار | ٢ مل |
| تريس-HCl بأس هيدروجيني 8 (1 مولار) | ٢٠ ميلي مولار | 200 µL |
| ن-دوديسيل-β-D-مالتوسيد (DDM، 10%) | 0.05% | 50 µL |
| هيميسكسينات الكوليستريل (CHS، 2%) | 0.01% | 50 µL |
| محلول الغسيل المنظم (الحجم الإجمالي 10 مل) | ||
| مكوّن | التركيز النهائي | الكمية |
| ماء مقطر مزدوج₂O | — | إلى 10 مل |
| KCl (1 مولار) | 200 ميلي مولار | ٢ مل |
| Tris-HCl بأس هيدروجيني 8 (1 مولار) | 20 ملي مولار | 200 µL |
| إن-دوديسيل-β-D-مالتوزيد (DDM، 10%) | 0.05% | 50 µL |
| كوليستيريل هيميسكسينات (CHS، 2%) | 0.01% | 50 µL |
| إيميدازول بأس هيدروجيني 8 (5 مولار) | 30 ميلي مولار | 60 µL |
| محلول الاستخلاص المنظم (بحجم إجمالي 10 مل) | ||
| مكوّن | التركيز النهائي | الكمية |
| ماء مقطر مزدوج₂أو | — | إلى 10 مل |
| KCl (1 مولار) | ٢٠٠ ميلي مولار | ٢ مل |
| Tris-HCl بأس هيدروجيني 8 (1 مولار) | 20 ملي مولار | 200 µL |
| ن- دوديسيل-β-D-مالتوسيد (DDM، 10%) | 0.05% | 50 µL |
| هيميسكسينات الكوليسترول (CHS, 2%) | 0.01% | 50 µL |
| إيميدازول بأس هيدروجيني (pH) 8 (5 مولار) | 300 ميلي مولار | 600 µL |
الجدول 8: تركيبات منظمات IMAC لتنقية ancTREK1. تركيبات منظمات التوازن والغسيل والاستخلاص المستخدمة في تنقية ancTREK1 عن طريق كروماتوغرافيا الألفة للأيونات المعدنية المثبتة. ملاحظة: يمكن تخزين المحاليل عند 4°C لمدة تصل إلى ستة أشهر.
| المحلول المنظم 1 (الحجم الإجمالي 10 مل) | ||
| مكون | التركيز النهائي | الكمية |
| ماء مقطر مزدوج₂أو | — | إلى 10 مل |
| KCl (1 مولار) | ٢٠٠ ملي مولار | ٢ مل |
| تريس-HCl بأس هيدروجيني 8 (1 مولار) | 20 ملي مولار | 200 µL |
| ن-دوديسيل-β-D-مالتوسيد (DDM، 10%) | 0.05% | 50 µL |
| هيميسكسينات الكوليستيريل (CHS، ٢٪) | 0.01% | 50 µL |
| المحلول المنظم 2 (الحجم الإجمالي 10 مل) | ||
| مكوّن | التركيز النهائي | الكمية |
| ماء مقطر مزدوج₂O | — | إلى 10 مل |
| كلوريد البوتاسيوم (1 مولار) | 500 مللي مولار | ٥ مل |
| تريس-HCl بأس هيدروجيني 8 (1 مولار) | 20 مللي مولار | 200 µL |
| ن-دوديسيل-β-D-مالتوزيد (DDM، 10%) | 0.05% | 50 µL |
| كوليستريل هيميسكسينات (CHS، 2%) | 0.01% | 50 µL |
الجدول 9: تركيبات المنظمات لكروماتوغرافيا الألفة باستخدام الجسم المضاد النانوي لـ GFP. تركيبات المنظمات المستخدمة لتنقية ancTREK1 باستخدام كروماتوغرافيا الألفة للجسم المضاد النانوي لـ GFP. ملاحظة: يمكن تخزين المحاليل عند 4°C لمدة تصل إلى ستة أشهر.
5. تسجيل نشاط القنوات الأيونية
- تقييم جودة الغشاء
- أغلق غطاء قفص فاراداي.
- طبق موجة جهد مثلثية (100 mV، 10 Hz) لتقييم سعة الغشاء.
- طبق خطوات جهد (بزيادات ±20 mV وصولاً إلى ±200 mV) لتقييم مقاومة الغشاء.
- راقب قيم التيار والضجيج.
ملاحظة: استخدم معدل أخذ عينات 5 kHz وترشيح تمرير منخفض 2.5 kHz ما لم يتطلب الأمر خلاف ذلك.
- تسجيل نشاط ancTREK1
- خفف بروتين ancTREK1 في محلول التسجيل إلى حوالي 2 µg/mL.
ملاحظة: أثناء التخفيف، قم بإجراء تخفيفات متوسطة في Buffer 1 حسب الحاجة للحفاظ على تركيز المنظف فوق التركيز المذيل الحرج (CMC) قبل التخفيف النهائي في محلول التسجيل. - أضف 1 µL من محلول البروتين المخفف إلى غرفة cis بالقرب من فتحة الحاجز.
ملاحظة: يُعرف جهد الغشاء على أنه Vcis − Vtrans. لم يتم تحديد اتجاه القناة بشكل مباشر في هذه الدراسة؛ لذا، يتم وصف التسجيلات فيما يتعلق بقطبية الجهد المطبق بدلاً من تعيين جانب الغشاء. - طبق خطوات جهد بزيادات ±20 mV وصولاً إلى ±120 mV.
- راقب أحداث إقحام القنوات.
ملاحظة: يُستدل على إقحام القناة من خلال انتقالات تيار منفصلة بين الحالتين المغلقة والمفتوحة. إذا لم يحدث إقحام، أضف المزيد من البروتين أو أعد تشكيل الغشاء. إذا تم إقحام قنوات متعددة، قم بتمزيق الغشاء وخفض تركيز البروتين.
- خفف بروتين ancTREK1 في محلول التسجيل إلى حوالي 2 µg/mL.
النتائج
خصائص التيار-الجهد (I–V) لأغشية PLB
تؤدي الطبيعة الكارهة للماء المتأصلة في الغشاء ثنائي الطبقة إلى جعله غير نفاذ للأنواع المشحونة. ومع ذلك، فإن تطبيق مجال كهربائي خارجي يمكن أن يحفز تكوين مسام عابرة بحجم النانومتر، مما يؤثر بالتالي على نفاذية الغشاء وموصليته33. ولتقييم جودة الطبقات الثنائية الاصطناعية المكونة من ليبيدات 1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine، تم قياس سعة الغشاء، ومقاومته، وخصائص I–V في غياب البروتينات المدرجة. تم تطبيق سلسلة من خطوات الجهد تتراوح من ±20 إلى ±200 mV (بزيادات قدرها ±20 mV)، وتسجيل التيارات عبر الغشائية الناتجة. وقد تم أخذ عينات من البيانات بتردد 5 kHz وترشيحها باستخدام مرشح تمرير منخفض عند 2.5 kHz.
تمثل سعة الغشاء (Cm) ومقاومة الغشاء (Rm) معايير أساسية لتقييم جودة الطبقة الثنائية. يمكن وصف PLB بدائرة مقاومة-مكثف (RC) مكافئة، حيث يعمل الغشاء كمكثف على التوازي مع مقاومة34. يعكس المكون السعوي قدرة الغشاء على تخزين الشحنة، بينما يعكس المكون المقاوم نفاذية الأيونات. يؤدي تطبيق شكل موجي جهدي مثلثي إلى توليد استجابة تيار سعوي مربعة الشكل، وتتناسب هذه الاستجابة مع سعة الغشاء وفقًا لما يلي:
(1)
هنا، تمثل Cm سعة الغشاء، وV الجهد المطبق، وt الزمن. بعد تشكيل الغشاء، يمكن أن تزداد قيم السعة بمرور الوقت بسبب الترقق التدريجي للطبقة المزدوجة35. وباعتبار الغشاء كمكثف ذو لوحين متوازيين، فإن السعة ترتبط بمساحة الغشاء وسماكته وفقاً لما يلي:
(2)
هنا، يمثل εlipids ثابت العزل الكهربائي للنواة الدهنية (~2)، وε0 هو سماحية الفضاء الحر، وA هي مساحة الغشاء، وd هو سمك الغشاء36,37.
تم تحديد مقاومة الغشاء باستخدام قانون أوم33:
(3)
هنا، تمثل V الجهد المطبق وتمثل Rm مقاومة الغشاء. وفي حالة غياب القنوات الأيونية، يظل تيار الغشاء قريباً من 0 pA، وهو ما يقابل قيم مقاومة في نطاق الجيجا أوم (GΩ)33.
أظهرت العلاقة بين التيار والجهد (I–V) سلوكاً خطياً (أومياً) بين 0 و ±200 mV لأجهزة BLMchipMM ذات الفتحات بقطر 75 و 100 µm. وأسفر التناسب الخطي للبيانات عن قيم لمقاومة الغشاء بلغت 847 ± 16 GΩ (n = 6) للفتحة ذات قطر 75 µm (الشكل 8A، الدوائر) و 980 ± 32 GΩ (n = 7) للفتحة ذات قطر 100 µm (الشكل 8A، المربعات). وكانت قيم ضوضاء جذر متوسط المربعات (RMS)، المقاسة عبر مقاطع مدتها 3 s من تتبع التيار، 3.1 ± 2 pA (n = 7) للفتحة ذات قطر 100 µm و 2.6 ± 0.1 pA (n = 6) للفتحة ذات قطر 75 µm. تم تقييم استقرار الغشاء عن طريق قياس المقاومة على فترات زمنية تقارب 2 min على مدى مدة إجمالية قدرها 1 h (الشكل 8B). وقد ظلت الأغشية جيدة التكوين مستقرة باستمرار لأكثر من 1 h، وهي مدة كافية لمعظم تجارب الفسيولوجيا الكهربائية. وعادةً ما تحملت الأغشية الجهود المطبقة حتى ±200 mV دون ظهور علامات على عدم الاستقرار، بينما حدث الانهيار بين ±220 و ±300 mV اعتماداً على كل طبقة ثنائية. واعتُبرت الأغشية مناسبة لإدراج البروتين عندما تراوحت قيم السعة من 40 إلى 60 pF للفتحات ذات قطر 75 µm ومن 60 إلى 90 pF للفتحات ذات قطر 100 µm، مع قيم تيار ≤0.5 pA عند 100 mV.
الشكل 8: التوصيف الكهربائي لـ PLBs. (أ) علاقات التيار والجهد (I–V) للطبقات الثنائية المتكونة على فتحات بحجم 75 µm و 100 µm، والتي تظهر سلوكاً خطياً (أومياً) بين ±200 mV. يعطي الانحدار الخطي قيم مقاومة غشائية تبلغ 847 ± 16 GΩ (n = 6) و 980 ± 32 GΩ (n = 7)، على التوالي. (ب) تقييم استقرار الغشاء عن طريق مراقبة المقاومة على مدار 1 h بفواصل زمنية قدرها 2 min. تظل الأغشية مستقرة حتى ±200 mV وتتمزق عند جهود تتراوح بين ±220 و ±300 mV. البيانات معروضة كمتوسط ± الخطأ المعياري للمتوسط (SEM). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
التوصيف الأولي لسلوك القناة المنفردة لبروتين ancTREK1
تم تنقية بروتين ancTREK1 الاصطناعي وإعادة تشكيله في PLBs، وتمت مراقبة نشاط القناة المفردة باستخدام بروتوكولات خطوات الجهد التي تتراوح من −120 إلى 120 mV بزيادات قدرها 20 mV. وأظهرت تسجيلات القناة المفردة (الشكل 9A والشكل 9B) سلوك الوميض المميز لقنوات K2P38. وعند 80 mV، كان متوسط سعة التيار 13.02 ± 0.78 pA (n = 5)، بينما عند −80 mV زادت سعة التيار إلى −18.72 ± 0.25 pA (n = 5) (الشكل 9C). وأظهرت علاقة I–V الناتجة تيارات قناة مفردة قابلة للقياس عند كل من الجهود الموجبة والسالبة في ظل ظروف بوتاسيوم متماثلة بتركيز 200 mM وخالية من Mg2+ (الشكل 9D). وبما أن سعات التيار قد قُدرت من مدرجات تكرارية لجميع النقاط من تسجيلات تم الحصول عليها بتردد 5 kHz وتم ترشيحها بمرشح تمرير منخفض عند 2.5 kHz، فإن علاقة I–V هذه تُعرض كإثبات وصفي للمبدأ بدلاً من كونها توصيفاً بيوفيزيائياً شاملاً.
الشكل 9: نشاط القناة الواحدة لبروتين ancTREK1 الاصطناعي. (A و B) آثار تيار القناة الواحدة التمثيلية المسجلة عند 80 mV و −80 mV، على التوالي. تشير الخطوط المنقطة إلى مستوى القناة المغلقة. (C) مخططات توزيع السعة لجميع النقاط للجهود الموجبة (يساراً) والسالبة (يميناً). (D) العلاقة بين التيار والجهد (I–V) لبروتين ancTREK1 تحت ظروف بوتاسيوم (K+) متماثلة بتركيز 200 mM بدون كاتيونات ثنائية التكافؤ. تم تمثيل المنحنى باستخدام حدودية من الدرجة الرابعة، واشتقت قيم الموصلية من الميل عند ±80 mV. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
على الرغم من افتقار ancTREK1 إلى المناطق الطرفية N وC الممتدة مقارنة بقنوات TREK1 الثديية، إلا أنه ظل نشطاً وظيفياً عند إعادة التكوين. وعلى عكس TREK1 الثديي، الذي يظهر أنماط توصيل عالية ومنخفضة (132 ± 5 pS و 41 ± 5 pS عند الجهود الموجبة، على التوالي)39، أظهر ancTREK1 نمط التوصيل الكبير فقط. بلغت موصلية القناة الواحدة عند الجهود الموجبة 112.8 ± 10.8 pS (80 mV، n = 5)، وهو ما يتوافق مع القيم المسجلة لقنوات TREK (85–130 pS في ظل ظروف البوتاسيوم المتماثلة)38,39,40,41. أما عند الجهود السالبة، فقد ارتفعت الموصلية إلى 205.6 ± 2.05 pS (−80 mV، n = 5)، بما يتفق مع سلوك TREK1 المبلغ عنه سابقاً39. والجدير بالذكر أن ancTREK1 أظهر احتمالية فتح طبيعية (NPo) أعلى مقارنة بقياسات TREK1 التي تم الحصول عليها باستخدام تكوينات الرقعة المستأصلة42. وأظهرت العلاقة بين NPo والجهد زيادة في نشاط القناة عند الجهود الموجبة، حيث وصلت إلى 0.78 ± 0.02 (n = 5) عند 80 mV. وفي المقابل، انخفضت NPo عند الجهود السالبة، بقيم بلغت 0.53 ± 0.04 عند −80 mV و 0.28 ± 0.03 عند −120 mV (الشكل 10).
الشكل 10: تحليل اعتماد نشاط القناة المفردة لـ ancTREK1 على الجهد. احتمالية الانفتاح المعيارية (NPo) كدالة لجهد الغشاء (يساراً) ومقارنة NPo عند 80 mV و −80 mV (يميناً)، مما يظهر زيادة في انفتاح القناة عند الجهود الموجبة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل التكميلي 1. تسلسل الأحماض الأمينية لقناة البوتاسيوم الاصطناعية السلفية ذات النطاقين المساميين (K2P) (ancTREK1). تسلسل الأحماض الأمينية كامل الطول لـ ancTREK1 المستخدم في التسجيلات الفيزيولوجية الكهربائية. تم إعادة بناء التسلسل عن طريق استنتاج التسلسل السلفي من مجموعة بيانات منسقة لأعضاء عائلة TREK/TRAAK، بما في ذلك التسلسلات المتناظرة التي تم جمعها من قاعدتي بيانات UniProt وNCBI، وتم ترشيحها بناءً على أنماط المسام المحفوظة، ومحاذاتها، وتحليلها باستخدام علم الوراثة العرقي للقيمة القصوى للاحتمالية.يرجى النقر هنا لتحميل هذا الملف.
المناقشة
في هذه الدراسة، استخدمنا تقنية PLB لتقييم الخصائص الفيزيولوجية الكهربائية لقناة K2P اصطناعية على مستوى الجزيء الواحد. ومن بين نماذج الدهون المستوية المختلفة الموصوفة في الأدبيات العلمية، ركزنا على تكوين BLMs، والتي يتم طلاؤها فوق فتحة يتراوح قطرها بين 50 و 140 µm، محفورة على سطح رأسي غير قطبي يفصل بين حجرتين مائيتين. يتيح هذا التكوين محاكاة بيئة الغشاء الخلوي مع الحفاظ على التحكم في المعايير التجريبية، بما في ذلك تحضير الغشاء الدهني وتركيب الإلكتروليت (على سبيل المثال، القوة الأيونية و pH)3. وقد أعدنا تكوين BLMs باستخدام طريقة Montal–Mueller (الطي)5، والتي يتجمع فيها الغشاء تلقائياً عندما تلتحم طبقتان أحاديتان من الدهون، كانتا قد فُرشتا مسبقاً عند السطح الفاصل بين الهواء والماء للمحلولين المائيين، فوق الفتحة عن طريق رفع مستوى الماء.
إن البروتوكول المقدم هنا لتكوين الغشاء بديهي للغاية؛ ومع ذلك، هناك عدة خطوات حاسمة تؤثر بقوة على نجاح التجربة. لضمان التوصيل الكهربائي السليم بين BLMchipMM والمضخم، من الضروري تجنب كلورة نهايات أسلاك Ag/AgCl التي يتم إدخالها في مقابس PCB. وأثناء تجميع BLMchipMM، قد يؤدي الموضع غير الصحيح للأسلاك إلى ملامسة هيكل المضخم، مما يؤدي إلى حدوث دوائر قصيرة وتشبع الإشارة. كما يعد إجراء المعالجة المسبقة للفتحة عاملاً حاسماً آخر: إذ قد تؤدي القوة المفرطة أثناء تطبيق محلول المعالجة المسبقة إلى تلف الحاجز البوليميدي، بينما يمكن أن يؤدي التعامل غير السليم مع محلول الإلكتروليت - وخاصة نقع منطقة الفتحة - إلى إعاقة تكوين الغشاء. علاوة على ذلك، فإن التنظيف الدقيق لغرفة تسجيل BLMchipMM ضروري لضمان قابلية تكرار النتائج. حيث يضمن استخدام كحول الإيزوبروبيل بتركيز 100% متبوعاً بالشطف الجيد والتجفيف التام عدم تداخل الرواسب مع التجارب اللاحقة.
من الممكن إجراء عدة تعديلات على البروتوكول. فبينما يمثل الكلورة عن طريق النقع في المبيض نهجاً عملياً وشائع الاستخدام، يمكن أيضاً توظيف طرق بديلة مثل الطلاء الكهربائي43. وبالمثل، يمكن إجراء تغييرات في المعالجة المسبقة وتحضير الدهون. تتكون محاليل المعالجة المسبقة القياسية عادةً من ألكانات طويلة السلسلة مذابة في مذيبات هيدروكربونية متطايرة36؛ ورغم أن محلول hexadecane بنسبة 1% في n-hexane يُستخدم بشكل شائع، إلا أن مذيبات أخرى قد تكون مناسبة. كما يمكن تكييف تركيب الدهون بناءً على المتطلبات التجريبية. وبينما توفر دهون DPhPC استقراراً مثالياً للغشاء، يمكن استخدام خلائط دهنية بديلة، بما في ذلك التركيبات الطبيعية أو الاصطناعية36. وتتمثل إحدى المزايا الرئيسية لطبقات الدهون الثنائية العمودية التي يتم تشكيلها عبر طريقة الطي في القدرة على توليد أغشية غير متماثلة، حيث تتكون كل ورقة من أنواع دهنية مختلفة5,22، وهي سمة معروفة بتأثيرها على وظيفة بروتين الغشاء.
تتضمن استكشاف أخطاء تكوين الغشاء وإصلاحها عمومًا إجراء تعديلات على مستويات الطور المائي. إذا لم يحدث تكوين الغشاء في البداية، فإن خفض ورفع مستوى المحلول المنظم بشكل متكرر في أحد المقصورات يمكن أن يسهل تجميع الطبقة الثنائية. وفي حال عدم نجاح ذلك، يمكن أن يؤدي تطبيق فقاعة هواء فوق الفتحة إلى تعزيز إعادة توزيع الدهون وتكوين الغشاء. وعادةً ما يشير الفشل المستمر إلى مشكلات تتعلق بالمعالجة المسبقة أو التلوث، وفي هذه الحالة يُوصى بتنظيف غرفة التسجيل وإعادة بدء التجربة.
تتكون المكونات الأساسية لهذا الإعداد من المضخم المدمج eNPR 100 kHz وBLMchipMM. يعد المضخم نظام تثبيت جهد (voltage-clamp) مدمجاً ومنخفض الضجيج يغني عن الحاجة إلى أجهزة خارجية إضافية، بما في ذلك أقفاص فاراداي الخارجية، حيث يوفر غلاف المضخم نفسه حماية فعالة من التداخل الكهرومغناطيسي. أما BLMchipMM فهي غرفة تسجيل مصغرة ومجمعة مسبقاً، مدمجة مع لوحة دوائر مطبوعة (PCB) للاتصال المباشر بالمضخم. وتتكون من حجرتين على شكل حرف C يفصلهما حاجز من البوليميد يحتوي على فتحة مستدقة مثقوبة بالليزر حيث يتكون الغشاء الاصطناعي. وتؤدي الأبعاد المختزلة للنظام، بحجم حجرات يبلغ حوالي 110 µL، إلى خفض استهلاك الكواشف بشكل كبير وتقليل السعة الكهربائية الجوهرية، مما يؤدي بدوره إلى تحسين جودة الإشارة. بالإضافة إلى ذلك، يمكن إعادة استخدام الجهاز عدة مرات دون تفكيكه عند اتباع إجراءات التنظيف المناسبة، مما يقلل من التباين ويعزز إمكانية تكرار التجارب.
على الرغم من هذه المزايا، يجب مراعاة بعض القيود؛ إذ لا يتضمن الإعداد الحالي وحدات متكاملة للتحكم في درجة الحرارة أو الضغط أو التروية. وقد أفادت التقارير أن التوتر الغشائي الجوهري يؤثر على القنوات الحساسة للميكانيكا مثل TREK144,45,46؛ ومع ذلك، فإن الإعداد الحالي لا يتضمن تحكماً موجهاً في التوتر الغشائي، ولم يتم استخلاص أي استنتاجات ميكانيكية هنا. وبشكل عام، توفر هذه المنصة نظاماً قوياً وسهل الوصول لتسجيل نشاط القنوات الأيونية في الأغشية الاصطناعية. في هذه الدراسة، بحثنا في قناة K2P الاصطناعية ancTREK1، وهي قناة سلفية مشتقة حاسوبياً من الفصيلة الفرعية TREK. وتظهر البيانات المسجلة أن بروتين ancTREK1 المُنقى والمعاد تركيبه في PLBs يُبدي سلوك قناة مفردة يتفق مع خصائص الموصلية المبلغ عنها والمماثلة لـ TREK1. وتحت ظروف بوتاسيوم متماثلة بتركيز 200 mM وخالية من Mg2+، تُظهر القناة علاقة I–V قابلة للقياس، بقيم سعة تبلغ حوالي 13 pA عند 80 mV و −19 pA عند −80 mV. بالإضافة إلى ذلك، يُظهر ancTREK1 نمط الموصلية العالية المميز الملاحظ في قنوات TREK1، مع موصلية أعلى عند الجهود السالبة (~205.6 pS) مقارنة بالجهود الموجبة (~112.8 pS). ومن الملاحظ أن ancTREK1 يُظهر زيادة في NPo عند الجهود الموجبة (0.78 عند 80 mV) وانخفاضاً في NPo عند الجهود السالبة (0.53 عند −80 mV و 0.28 عند −120 mV)، وهو ما يختلف عن الملاحظات في تكوينات الرقعة المستأصلة42. تدعم هذه النتائج استخدام هذا النظام لإثبات مبدأ تسجيل القنوات المفردة لبروتينات الغشاء المعاد تركيبها.
الإفصاحات
يشغل F.T. منصب الرئيس التنفيذي، بينما يشغل A.P. منصب موظف في شركة Elements S.r.l. ويقر جميع المؤلفين الآخرين بعدم وجود أي تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
نشكر Sofia Diletta Guzzeloni على المساعدة في إجراء عملية عفن الخلايا (cell transfection). كما نعرب عن امتناننا لموظفي Elements، الدكتور Leon Juarez والدكتور Michelangelo Paci. تم دعم هذا العمل من قبل قسم الطب الجزيئي في جامعة Pavia، إيطاليا، بموجب مبادرة Dipartimenti di Eccellenza (2023–2027)، ومن مؤسسة Cariplo (#2019-1809)، وعن طريق برنامج أبحاث PNRR رقم CN00000013 "المركز الوطني للحوسبة عالية الأداء والبيانات الضخمة والحوسبة الكمومية" الممنوح لـ M.L.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPhPC) | Avanti Polar Lipids | 850356P | تكوين طبقات ليبيدية اصطناعية مزدوجة |
| 2-Propanol (≥99.5%) | Honeywell | 24137-5L | تنظيف جهاز BLMchipMM |
| Agarose | Fisher BioReagents | BP160-500 | تحضير هلامات الأجاروز |
| نظام الرحلان الكهربائي الأفقي لهلام الأجاروز | BTLabSystems | BT102 | فصل قطع DNA |
| Ampicillin | Fisher BioReagents | BP1760-25 | اختيار البكتيريا المحولة |
| راتنج Sepharose للجسم المضاد النانوي Anti-GFP (محضر محلياً) | — | — | التنقية بالتقارب للبروتينات المدمجة مع GFP |
| Anza Alkaline Phosphatase | Invitrogen | IVGN2208 | إزالة مجموعة الفوسفات من الناقل |
| Anza EcoRI | Invitrogen | IVGN0116 | الهضم بالإنزيمات القاطعة |
| Anza NotI | Invitrogen | IVGN0014 | الهضم بالإنزيمات القاطعة |
| Anza Red Buffer (10×) | Invitrogen | IVGN2008 | محلول منظم للهضم بالإنزيمات القاطعة |
| مثبط البروتياز Aprotinin | Fisher Scientific | 15996008 | منع تحلل البروتين |
| جهاز طرد مركزي مكتبي | Eppendorf | EP5420000164 | ترسيب الخلايا وتحضير العينات |
| BLMchipMM | Elements s.r.l. | — | تكوين طبقات ليبيدية مزدوجة مستوية |
| Cholesteryl hemisuccinate (CHS) | Anatrace | CH210 | تثبيت بروتينات الغشاء |
| Coomassie Brilliant Blue | Sigma-Aldrich | 1125530025 | صبغ البروتين |
| مبيض منزلي شائع | — | — | كلورة أسلاك Ag |
| DNase I | Sigma-Aldrich | 11284932001 | تقليل لزوجة المستخلص الخلوي |
| ماء مقطر مزدوج | — | — | تحضير المحاليل المنظمة والمحاليل الأخرى |
| Ethanol (نقي, 99.9%) | Girelli Alcool s.r.l. | — | تنظيف أسلاك Ag/AgCl |
| Ethidium bromide | Sigma-Aldrich | 1116080030 | صبغ DNA |
| ورق صنفرة ناعم للغاية | — | — | إزالة طلاء Ag/AgCl من الأسلاك |
| مضخم eNPR 100 kHz | Elements s.r.l. | — | تسجيلات الفيزيولوجيا الكهربائية |
| طقم Gel-Out لاستخلاص DNA من الأجاروز | A&A Biotechnology | 023-250 | تنقية DNA |
| سلم DNA GeneRuler 1 kb | Thermo Fisher Scientific | SM0311 | مرجع لحجم DNA |
| FreeStyle™ 293-F | Thermo Fisher Scientific | R79007 | التعبير عن بروتين ancTREK1 |
| HEPES (≥99.5%) | Sigma-Aldrich | H3375-500G | عامل تنظيم pH |
| Hexadecane (≥99%) | Sigma-Aldrich | H6703-100ML | المعالجة المسبقة للفتحة |
| Hexane (≥99%) | Sigma-Aldrich | 139386-100ML | مذيب ليبيدي |
| صبغة تحميل DNA محضر محلياً (5×) | — | — | تحضير عينة DNA |
| محلول Laemmli SDS المنظم محضر محلياً (6×) (مختزل) | — | — | تحضير عينة البروتين |
| محلول إزالة الصبغة محضر محلياً | — | — | إزالة الصبغة من هلامات SDS-PAGE |
| بروتياز HRV-3C محضر محلياً | — | — | قطع البروتينات المدمجة |
| محلول تشغيل SDS-PAGE المنظم محضر محلياً (10×) | — | — | محلول منظم للرحلان الكهربائي SDS-PAGE |
| Imidazole | Alfa Aesar | A10221 | شطف البروتينات المدمجة مع His |
| أعمدة تنقية مدمجة في الدفعة | — | — | سير عمل تنقية البروتين |
| حاضنة هزازة Innova44 | New Brunswick Innova | M1282 | نمو المزارع الخلوية |
| KCl | Honeywell | 31248-1KG | تحضير الإلكتروليت والمحلول المنظم |
| مرق LB (Lennox) | Condalab | 1231 | مزرعة بكتيرية |
| مثبط البروتياز Leupeptin | Thermo Scientific | 78435 | منع تحلل البروتين |
| سداسي هيدرات كلوريد المغنيسيوم | Acros Organics | 447700010 | مكون للمحلول المنظم |
| مقياس طيف ضوئي Nanodrop | DeNovix | DS-11 | تقدير كمية DNA والبروتين |
| n-Dodecyl-β-D-maltoside (DDM) | NeoBiotech | NB-19-0056-25G | إذابة بروتينات الغشاء |
| راتنج Ni Sepharose عالي الأداء | Cytiva | 17526801 | تنقية IMAC |
| حاسوب محمول | — | — | التحكم في الأجهزة والحصول على البيانات |
| جهاز طرد مركزي فائق Optima LE-80K | Beckman | 365668 | عزل جزء الغشاء |
| Pentane (≥99%) | Sigma-Aldrich | 236705-100ML | مذيب ليبيدي |
| مثبط البروتياز Pepstatin A | Thermo Scientific | 78436 | منع تحلل البروتين |
| محلول Phusion GC المنظم (5×) | Thermo Fisher Scientific | F519 | محلول منظم لـ PCR |
| إنزيم Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | Thermo Fisher Scientific | F530S | تضخيم PCR |
| مثبط البروتياز PMSF | Thermo Scientific | 36978 | حماية البروتين أثناء التحلل |
| Polyethylenimine (PEI) | Clinisciences | 24765-100 | كاشف ترانسفكشن |
| هلام ProteinEle مسبق الصب Tris-Glycine (4–20%) | TransGen Biotech | DG101-01-V2 | فصل البروتين |
| نظام الرحلان الكهربائي لهلام SDS-PAGE | Bio-Rad | 1658002FC | الرحلان الكهربائي للبروتينات |
| Sodium butyrate | Fisher Scientific | A11079 | معزز للتعبير البروتيني |
| T4 DNA ligase | Thermo Fisher Scientific | EL0011 | ربط DNA |
| محلول T4 DNA ligase المنظم (10×) | Thermo Fisher Scientific | B69 | محلول منظم للربط |
| جهاز دورة حرارية (Mastercycler Nexus) | Eppendorf | 6331000025 | تضخيم PCR |
| Tris base | Sigma-Aldrich | T1503-1KG | تحضير المحلول المنظم |
| أجار Tryptone SOYA مع الليسيثين وبوليسوربات 80 | HiMedia | M449-5KG | زراعة البكتيريا في أطباق |
| سلكان من Ag | Elements s.r.l. | — | أقطاب كهربائية للفيزيولوجيا الكهربائية |
| مركز Ultra-spin (بحد قطع 50 kDa) | Merck Amicon | UFC8050 | تركيز البروتين |
| ناقل التعبير pEG BacMam | Addgene | 160687 | التعبير البروتيني |
| كابل USB | — | — | التوصيل بين المضخم والحاسوب |
المراجع
- Wickenden, A. D. Overview of electrophysiological techniques. Curr Protoc Pharmacol. 11 (1), (2000).
- Polak, A., Mulej, B., Kramar, P. System for measuring planar lipid bilayer properties. J Membr Biol. 245 (10), 625-632 (2012).
- Zakharian, E. Recording of ion channel activity in planar lipid bilayer experiments. Methods Mol Biol. 998, 109-118 (2013).
- Mueller, P., Rudin, D., Tien, H. T., Wescott, W. C. Reconstitution of cell membrane structure in vitro and its transformation into an excitable system. Nature. 194, 979-980 (1962).
- Montal, M., Mueller, P. Formation of bimolecular membranes from lipid monolayers and a study of their electrical properties. Proc Natl Acad Sci U S A. 69 (12), 3561-3566 (1972).
- Coronado, R., Latorre, R. Phospholipid bilayers made from monolayers on patch-clamp pipettes. Biophys J. 43 (2), 231-236 (1983).
- Andersen, O. S. Ion movement through gramicidin A channels. Single-channel measurements at very high potentials. Biophys J. 41 (2), 119-133 (1983).
- Tank, D. W., Miller, C., Webb, W. W. Isolated-patch recording from liposomes containing functionally reconstituted chloride channels from Torpedo electroplax. Proc Natl Acad Sci U S A. 79 (24), 7749-7753 (1982).
- Criado, M., Keller, B. U. A membrane fusion strategy for single-channel recordings of membranes usually non-accessible to patch-clamp pipette electrodes. FEBS Lett. 224 (1), 172-176 (1987).
- Varnier, A., et al. A simple method for the reconstitution of membrane proteins into giant unilamellar vesicles. J Membr Biol. 233, 85-92 (2010).
- Garten, M., et al. Reconstitution of a transmembrane protein, the voltage-gated ion channel KvAP, into giant unilamellar vesicles for microscopy and patch clamp studies. J Vis Exp. (95), e52281 (2015).
- Funakoshi, K., Suzuki, H., Takeuchi, S. Lipid bilayer formation by contacting monolayers in a microfluidic device for membrane protein analysis. Anal Chem. 78 (24), 8169-8174 (2006).
- Heron, A. J., Thompson, J. R., Mason, A. E., Wallace, M. I. Direct detection of membrane channels from gels using water-in-oil droplet bilayers. J Am Chem Soc. 129 (51), 16042-16047 (2007).
- Iwamoto, M., Oiki, S. Contact bubble bilayers with flush drainage. Sci Rep. 5, 9110 (2015).
- Han, X., et al. Nanopore arrays for stable and functional free-standing lipid bilayers. Adv Mater. 19 (24), 4466-4470 (2007).
- Miyata, R., et al. Parallel recordings of transmembrane hERG channel currents based on solvent-free lipid bilayer microarray. Micromachines. 12 (1), 98 (2021).
- Kresak, S., Hianik, T., Naumann, R. L. C. Giga-seal solvent-free bilayer lipid membranes: from single nanopores to nanopore arrays. Soft Matter. 5 (20), 4021 (2009).
- Suzuki, H., Pioufle, B. L., Takeuchi, S. Ninety-six-well planar lipid bilayer chip for ion channel recording fabricated by hybrid stereolithography. Biomed Microdevices. 11, 17-22 (2009).
- Zagnoni, M., Sandison, M. E., Morgan, H. Microfluidic array platform for simultaneous lipid bilayer membrane formation. Biosens Bioelectron. 24 (5), 1235-1240 (2009).
- Baker, C. A., Bright, L. K., Aspinwall, C. A. Photolithographic fabrication of microapertures with well-defined, three-dimensional geometries for suspended lipid membrane studies. Anal Chem. 85 (19), 9078-9086 (2013).
- Tadaki, D., et al. Mechanically stable solvent-free lipid bilayers in nano- and micro-tapered apertures for reconstitution of cell-free synthesized hERG channels. Sci Rep. 7 (1), 17736 (2017).
- Collins, M. D., Keller, S. L. Tuning lipid mixtures to induce or suppress domain formation across leaflets of unsupported asymmetric bilayers. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (1), 124-128 (2008).
- Cohen, S. N., Chang, A. C. Y., Boyer, H. W., Helling, R. B. Construction of biologically functional bacterial plasmids in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. 70 (11), 3240-3244 (1973).
- Hoseini, S., Sauer, M. G. Molecular cloning using polymerase chain reaction, an educational guide for cellular engineering. J Biol Eng. 9 (1), 2 (2015).
- Goehring, A., et al. Screening and large-scale expression of membrane proteins in mammalian cells for structural studies. Nat Protoc. 9 (11), 2574-2585 (2014).
- Kawate, T., Gouaux, E. Fluorescence-detection size-exclusion chromatography for precrystallization screening of integral membrane proteins. Structure. 14 (4), 673-681 (2006).
- Porath, J., Carlsson, J., Olsson, I., Belfrage, G. Metal chelate affinity chromatography, a new approach to protein fractionation. Nature. 258 (5536), 598-599 (1975).
- Hochuli, E., Dobeli, H., Schacher, A. New metal chelate adsorbent selective for proteins and peptides containing neighbouring histidine residues. J Chromatogr A. 411, 177-184 (1987).
- Hochuli, E., et al. Genetic approach to facilitate purification of recombinant proteins with a novel metal chelate adsorbent. Biotechnology (N Y). 6 (11), 1321-1325 (1988).
- Kirchhofer, A., et al. Modulation of protein properties in living cells using nanobodies. Nat Struct Mol Biol. 17 (1), 133-138 (2010).
- Kubala, M. H., Kovtun, O., Alexandrov, K., Collins, B. M. Structural and thermodynamic analysis of the GFP:GFP-nanobody complex. Protein Sci. 19 (12), 2389-2401 (2010).
- Lee, H., Lolicato, M., Arrigoni, C., Minor, D. L. Production of K2P2.1 (TREK-1) for structural studies. Methods Enzymol. 653, 151-188 (2021).
- Kramar, P., Miklavcic, D., Kotulska, M., Lebar, A. M. Voltage- and current-clamp methods for determination of planar lipid bilayer properties. Adv Planar Lipid Bilayers Liposomes. 11, 29-69 (2010).
- Golowasch, J., Nadim, F. Capacitance, membrane. Encyclopedia of Computational Neuroscience. , (2014).
- Niles, W. D., Levis, R. A., Cohen, F. S. Planar bilayer membranes made from phospholipid monolayers form by a thinning process. Biophys J. 53 (3), 327-335 (1988).
- Gutsmann, T., et al. Protein reconstitution into freestanding planar lipid membranes for electrophysiological characterization. Nat Protoc. 10 (1), 188-198 (2015).
- White, S. H. A study of lipid bilayer membrane stability using precise measurements of specific capacitance. Biophys J. 10 (12), 1127-1148 (1970).
- Bockenhauer, D., Zilberberg, N., Goldstein, S. A. N. KCNK2: reversible conversion of a hippocampal potassium leak into a voltage-dependent channel. Nat Neurosci. 4 (5), 486-491 (2001).
- Li, X. T., et al. The stretch-activated potassium channel TREK-1 in rat cardiac ventricular muscle. Cardiovasc Res. 69 (1), 86-97 (2006).
- Honoré, E., Maingret, F., Lazdunski, M., Patel, A. J. An intracellular proton sensor commands lipid- and mechano-gating of the K+ channel TREK-1. EMBO J. 21 (12), 2968-2976 (2002).
- Patel, A. J., et al. A mammalian two pore domain mechano-gated S-like K+ channel. EMBO J. 17 (15), 4283-4290 (1998).
- Maingret, F., Honore, E., Lazdunski, M., Patel, A. J. Molecular basis of the voltage-dependent gating of TREK-1, a mechano-sensitive K+ channel. Biochem Biophys Res Commun. 292 (2), 339-346 (2002).
- Lemtiri-Chlieh, F., Ali, R. Characterization of heterologously expressed transporter genes by patch- and voltage-clamp methods: application to cyclic nucleotide-dependent responses. Methods Mol Biol. 1016, 67-93 (2013).
- Opsahl, L. R., Webb, W. W. Lipid-glass adhesion in giga-sealed patch-clamped membranes. Biophys J. 66 (1), 75-79 (1994).
- Perez-Mitta, G., MacKinnon, R. Freestanding lipid bilayer tensiometer for the study of mechanosensitive ion channels. Proc Natl Acad Sci U S A. 120 (12), e2221541120 (2023).
- Sorum, B., et al. Tension activation of mechanosensitive two-pore domain K+ channels TRAAK, TREK-1, and TREK-2. Nat Commun. 15 (1), 3142 (2024).
إعادة الطباعة والأذونات
تم نشر هذه المقالة
الفيديو قريباً