هنا، نقدم بروتوكولا لعزل وتنقية وزراعة الخلايا الهامشية الأولية من الشريط الوعائي للفأر، ولوضع نماذج مختبرية للإجهاد التأكسدي وشيخوخة الخلايا لدراسة اضطرابات الجدار الجانبي للقوقعة.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
عزل وزراعة الخلايا الهامشية الأولية في الستريا فاسكولاريس من الفئران حديثة الولادة
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
الشريط الوعائي هو بنية رئيسية في الأذن الداخلية مسؤولة عن توليد والحفاظ على الجهد الشاطف القوقعي (EP)، وخللها مرتبط ارتباطا وثيقا بأشكال مختلفة من فقدان السمع. تتكون الستريا الوعائية من خلايا هامشية، وخلايا وسطية، وخلايا قاعدية، تلعب خلايا الهامش دورا مركزيا في توليد وصيانة EP. لذلك، فإن إنشاء نموذج زراعة أولية في المختبر للخلايا الهامشية أمر ضروري لدراسة الخصائص البيولوجية للخلايا الوعائية وتورطها في اضطرابات فقدان السمع.
في هذه الدراسة، نجحنا في عزل وزراعة الخلايا الهامشية الأولية من العقدة المجرى الوعائي في الفئران حديثة الولادة. تم الحصول على أنسجة التجار عن طريق التشريح الدقيقي، وهضمها باستخدام الكولاجيناز من النوع الثاني، وتنقيتها بالصفائح التفاضلية لإزالة معظم الخلايا الليفية، حيث وصلت الخلايا المزروعة إلى أكثر من 80٪ من التقاء بحلول اليوم السابع. أظهر التلوين الفلوري المناعي تعبيرا مستقرا للسيتوكيراتين 18 (CK18) والفصيلة الفرعية Q 1 (KCNQ1) المرتبطة بجهد البوتاسيوم، مما أكد عزلا ناجحا، ونقاء مرتفعا، ووظيفة فسيولوجية محفوظة للخلايا الهامشية.
استنادا إلى هذا النموذج، تم إنشاء نماذج الإجهاد التأكسدي في المختبرات ونماذج الشيخوخة الخلوية باستخدام بيروكسيد الهيدروجين (H2O2) وD-جالاكتوز على التوالي. أظهرت الخلايا المعالجة زيادة ملحوظة في مستويات أنواع الأكسجين التفاعلية داخل الخلايا (ROS) وإيجابية β-جالاكتوسيداز (SA-β-gal) المرتبطة بالشيخوخة، مما يشير إلى حساسية عالية للخلايا الهامشية الأولية للإجهاد التأكسدي والمحفزات التي تحفز الشيخوخة. تؤسس هذه الدراسة مجتمعة نظاما مستقرا وقابلا للتكرار لزراعة ونمذجة الخلايا الجانبية الأولية للفئران، مما يوفر منصة مختبرية موثوقة للتحقيق في خلل وظائف الوعية الدموية في الستريا والآليات ذات الصلة.
المقدمة
في الجهاز السمعي، تعمل أنسجة مختلفة داخل القوقعة معا لتحويل الموجات الصوتية المعقدة إلى إشارات كهربائية1. تنظم الشريط الوعائي الوعائي التركيب الأيوني للإندوليمف وتولد الجهد الداخلي القوقعي (EP)، مما يحافظ على توازن القوقعة ويضمن الوظيفة الطبيعية لخلايا الشعر الداخلية والخارجية. يتكون من ثلاثة أنواع خلايا مميزة: الخلايا الهامشية، الخلايا الوسيطة، والخلايا القاعدية. تشكل الخلايا الحدية طبقة ظهارية أحادية مستقطبة تواجه مباشرة الإندوليمف وتغلق بوصلات مشدودة. الغشاء الجانبي الجانبي للخلايا الهامشية يثري بناقلين رئيسيين للبوتاسيوم، Na⁺/K⁺-ATPase وNKCC1، اللذين يعملان في تنظيم نقل أيونات الصوديوم والبوتاسيوم في الشريط الوعائي. لقد ثبت أن وظيفة Na⁺/K⁺-ATPase مرتبطة مباشرة ب EP 2,3. قنوات KCNQ1/KCNE1 تقع في الغشية القمية للخلايا الهامشية وتولد جهد انتشار إضافي ل K⁺ يساهم في تكوين EP4. الخلايا الهامشية غنية بعدة بروتينات مرتبطة بالبوتاسيوم وتعمل كوحدة خلوية أساسية تدفع إعادة تدوير البوتاسيوم في اللينيمف القوقعي. لذا، الخلايا الهامشية هي الخلايا الرئيسية المسؤولة عن توليد وصيانة EP.
لقد ثبت أن الشريط الوعائي (SV) يلعب دورا حاسما في التسبب في أمراض العديد من الاضطرابات المرتبطة بفقدان السمع الحسي العصبي (SNHL)، بما في ذلك فقدان السمع المرتبط بالعمر (ARHL)، وفقدان السمع الناتج عن الضوضاء (NIHL)، وفقدان السمع الوراثي (HHL)، وفقدان السمع الناتج عن الأدوية (DIHL). بالإضافة إلى ذلك، أظهرت الدراسات الحديثة أن هناك عدة اضطرابات سمعية أخرى، مثل مرض المناعة الداخلية المناعية (AIED)، ومرض الأذن الداخلية الالتهابية الذاتية (AID)، ومرض مينيير (MD)، رغم اختلافها السببي، إلا أنها تشارك في ال SV في آلياته الممرضة الأساسية 5,6. لذلك، فإن إنشاء نماذج خلوية موثوقة للتحقيق في مسببات فقدان السمع أمر ضروري. أظهرت الدراسات أن انخفاض كثافة الخلايا الهامشية يعمل كمؤشر قوي على وجود EP طوال عمر الفأر، بينما يمثل ضمور الشريط الوعائي آفة مميزة مبكرة في ARHL 7,8. يمكن أن توفر الزراعة المختبرية للخلايا الهامشية نموذجا موثوقا لدراسة مسببات مرض ARHL واستكشاف الأهداف العلاجية المحتملة. بعيدا عن ARHL، كشفت دراسات حديثة عن ارتباط عال وعلاقة أساسية محتملة بين الشريط الوعائي الوعائي واضطرابات سمعية أخرى، مما يشير إلى أن نماذج الخلايا الهامشية في المختبرات قد يكون لها تطبيقات أوسع 5,9,10.
تصف هذه الدراسة بروتوكولا لتشريح وزراعة الشريط الوعائي من قوقعة الفئران الوليدة، يليه تنقية الخلايا الهامشية باستخدام الصفائح التفريقية، مما يوفر نموذجا خلويا موثوقا للبحث في أمراض الستريا الوعائية الوعائية.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تم توفير جراء الفئران حديثي الولادة (P0-3) بواسطة شركة بيونت. كانت جميع الإجراءات التجريبية متوافقة مع إرشادات العناية واستخدام الحيوانات المخبرية التي نشرتها المعاهد الوطنية للصحة الأمريكية (منشور NIH، منقحة 2011) وتمت الموافقة عليها من قبل لجنة أخلاقيات الحيوان في مستشفى رينمين بجامعة ووهان (WDRM202400019).
1. التعقيم وتحضير المواد
- جهز أدوات التشريح، بما في ذلك زوجين من ملقط التشريح الدقيق، زوج واحد من الملقط القياسي، زوج من المقص الجراحي، وزوج واحد من مقصات التشريح الدقيق. قم بتعقيم جميع الأدوات باستخدام جهاز تعقيم وجففها في فرن بدرجة حرارة 60 درجة مئوية لمدة 4 ساعات.
- حضر 100 مل من وسط الخلايا الظهارية الحيوانية (EpiCM-a وسط) وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. أضف مصل الأبقار الجنيني (FBS)، ومكملات نمو الخلايا الطهارية (EpiCGS-a)، ومحلول البنسلين/ستربتوميسين إلى الوسط القاعدي لتحقيق تركيزات نهائية 2٪ FBS، 1٪ EpiCGS-a، و1٪ بنسلين/ستربتومايسين.
- قم بتعقيم مرحلة المجهر المجسم المجسم وهيكله بنسبة 75٪ إيثانول. ثم ضع أدوات التشريح المعقم والمجهر المعقم داخل خزانة أمان بيولوجي. تعرض جميع الأشياء لأشعة فوق البنفسجية لمدة 30 دقيقة لضمان التعقيم الكامل قبل بدء إجراء التشريح.
2. التشريح وعزل العظم الصدغي لجمع الظهارة السمعية
- قم بقتل جراء الفئران حديثة الولادة (P0-3) بعد تخدير إيزوفلوران بنسبة 4٪، وتعقيم بإيثانول بنسبة 75٪، وقم بقطع الرأس على الجليد. استخدم طرقا أخرى معتمدة أخلاقيا إذا لزم الأمر.
- ثبت الرأس، افتح فروة الرأس على طول الخيط السهمي باستخدام مقص التشريح الدقيق، افصل فروة الرأس من الجانبين، واقطعها.
- اقطع رأس الفأر الوليد على طول الخط الأوسط باستخدام مقص التشريح الدقيق. قم بإزالة نسيج الدماغ باستخدام الملقط لكشف العظام الصدغية (الشكل 1A).
- راقب العظام الصدغية الثنائية عند قاعدة القحفية، وإزالة عظام أخرى غير ضرورية، واحتفظ بأنسجة العظم الصدغية التي تحتوي على القوقعة (الشكل 1B).
- انقل عظمة صدغية إلى طبق معقم بحجم 35 مم يحتوي على محلول الملح المتوازن لهانك (HBSS) الطازج على الثلج.
- انقل العظم الصدغي الآخر تحت المجهر، وثبت نسيج العظم الصدغي بملقط واحد، واستخدم زوجا آخر لإجراء تشريح غير حاد لأنسجة العضلات السطحية حتى تصبح حلقة العظم نصف الدائرية البيضاء مرئية (الشكل 1C). بعد تأكيد موقع القوقعة، استمر في التشريح السطحي للأسفل حتى يلاحظ وجود نسيج قوقعة شفاف (الشكل 1D).
ملاحظة: يجب تنفيذ الخطوات 2.6-2.7 على الجليد. - باستخدام ملقط التشريح الدقيق، قم بإزالة قطعة صغيرة من جدار العظم عند الدوران القوقعي بحذر، وأدخل جانبا من الملقط بلطف في القوقعة، وافصل جدار العظم عن المتاهة الغشائية. قم بإزالة جدار العظم وتوسيع نسيج المتاهة الغشائي في محلول الملح المتوازن الجديد لهانك (HBSS) (الشكل 1E).
- ثبت الغشاء القاعدي بزوج من الملقط، وافصل الشريط الوعائي بحذر بزوج آخر من الملقط. انقله إلى أنبوب طرد مركزي دقيق بسعة 1.5 مل يحتوي على 1 مل من محلول كولاجناز من النوع الثاني 1 ملغ/مل موضوع على الثلج (الشكل 1F).
- كرر الخطوات السابقة لجمع الستريا الوعائية من الجانب الآخر.
3. التفكك الإنزيمي للحصول على الخلايا الهامشية في الشريط الوعائي
- حضن أنبوب الطرد المركزي الدقيق الذي يحتوي على الأنسجة المحصودة في محلول كولاجناز من النوع الثاني بدرجة حرارة 1 ملغ/مل على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
ملاحظة: تم تحضير محلول الكولاجناز من النوع الثاني عن طريق تخفيف الكولاجناز من النوع الثاني في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS؛ 2.7 ملليمولار كيلوسيلتر، 2.0 ملليمولار ك.ل.ل.ن، 137 ملليمولار NaCl، 10 ملليمولار ناثريوم2HPO4). - قم بعمل الطرد المركزي على الأنبوب عند 300 × جرام لمدة 8 دقائق.
- أزل السوبرناتانت بحذر. أضف 1 مل من وسط الزراعة لإنهاء الهضم، ثم قم بالتلويح بلطف لإعادة تعليق الخلايا، ثم قم بالطرد المركزي مرة أخرى عند 300 × جرام لمدة 8 دقائق.
- استنشق السوبرناتانت وأضف 1 مل من وسط الزراعة الطازج. قم بتقسيم التعليق للحصول على تعليق خلية واحدة، ثم نقل التعليق إلى أنبوب مخروطي بسعة 15 مل، وإضافة وسط إضافي لضبط الحجم الكلي إلى 10 مل.
- اخلط تعليق الخلية جيدا عن طريق التوصيل المتكرر، ثم انقل 1 مل من التعليق إلى كل بئر من صفيحة ذات 6 آبار. زرع الخلايا في محلول 2 مل من DMEM مع 2٪ FBS، 1٪ EpiCGS-a، و1٪ بنسلين/ستربتوميسين عند 37 درجة مئوية في حاضنة 5٪CO2 .
- استبدل الوسيط يوميا وراقب حالة الخلايا. يمكن عادة ملاحظة نمو تجمعي للخلايا الهامشية بعد يومين من الطبق.
4. تنقية الخلايا الهامشية
- في اليوم الثالث من الزراعة، لاحظ ظهور العديد من الأرومات الليفية على شكل المغزل تحيط بعناقيد الخلايا الهامشية الشبيهة بالحصى (الشكل 2B).
- مستفيدا من الفروق في معدلات الالتصاق، استخدم الماصة بلطف لإزالة جزئيا من الخلايا الليفية على شكل المغزل. باستخدام ماصة بحجم 1 مل، اشطف محلول الملح المتوازن من D-Hanks بلطف على مساحات واسعة في كل من الأرباع الأربعة. راقب تنقية الخلايا تحت المجهر، وضبط قوة واتجاه الرش وفقا لذلك. عادة ما يتم إجراء الغسل في منطقة واسعة مرتين. بعد كل جولة، افحص كثافة الأروى الليفية مجهريا؛ استنادا إلى هذه الملاحظات، يمكنك تطبيق الماصات اللطيفة المحلية على المناطق المكتظة بالأرواح الليفية لتحقيق توزيع متفرق وموحد عبر طبق الزراعة.
ملاحظة: تم الاحتفاظ بكثافة مناسبة من الخلايا الليفية، حيث أن الإزالة الكاملة أو التنقية المفرطة قد تحد من نمو الخلايا الأولية. نوصي بالحفاظ على نسبة تقريبية 2:1 بين الخلايا الهامشية والأرومات الليفية. - توقف التنقية عندما تظهر الخلايا الليفية موزعة بشكل متفرق بين تجمعات الخلايا الهامشية تحت الفحص المجهري. أزل المادة الفائقة وأضف 2 مل من وسط الزراعة الطازج لمواصلة الزراعة.
5. التلوين بالفلورة المناعية
- في اليوم الثاني بعد التنقية، افحص شكل الخلايا تحت المجهر. عند ملاحظة تكوين تجمع الخلايا بشكل كاف وكثافة مناسبة، استنشق وسط الزراعة وغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS، رقم الهيدروجينات 7.4).
- ثبت الخلايا ب 4٪ بارافورمالديهيد لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد إزالة المحلول المثبت، اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام PBS (5 دقائق لكل غسلة).
- قم بنفاح الخلايا بنسبة 0.5٪ من ترايتون X-100 لمدة 15 دقيقة. أزل المحلول واغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام PBS (5 دقائق لكل غسل).
- قم بحجب الخلايا التي تحتوي على 10٪ مصل ماعز يحتوي على PBS لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- حضانة الخلايا بالجسم المضاد وحيد النسيلة المضاد للفأر CK18 (مخفف بنسبة 1:300 في PBS يحتوي على 3٪ مصل ماعز) أو الجسم المضاد KCNQ1 (G-8) (مخفف بنسبة 1:100 في PBS يحتوي على 3٪ مصل ماعز) طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
- اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام PBS (10 دقائق لكل غسلة). حضن الجسم المضاد الثانوي المقابل (مخفف بنسبة 1:300 في PBS يحتوي على 3٪ مصل ماعز) لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.
- قم بإزالة الأجسام المضادة الثانوية واغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام PBS (10 دقائق لكل غسلة).
- ضع 1-2 قطرة من وسط تركيب مضاد التصبغ يحتوي على DAPI على الشرائح، وتركيب أغطية النوافذ، وفحص العينات باستخدام نظام مسح ليزر كونفوكلي.
ملاحظة: باستثناء خطوات الغسيل، تمت إضافة جميع محاليل الحضانة، بما في ذلك الأجسام المضادة، بكميات كافية لتغطية الخلايا بالكامل.
6. معالجة H2O2 وتلوين ROS
- بعد 7 أيام من الزراعة، عندما تكون الخلايا الهامشية طبقة أحادية متلافرة، يتم تحفيز الإجهاد التأكسدي بالعلاج ب 1 مللي مولارH2O2. جهز محلول العمل بحجم 1 ملليمتر عن طريق تخفيفمحلول المخزون بنسبة 30٪ H2O 2 بنسبة 1:10000 في وسط خلايا ظهارية. احتضن المجموعات التجريبية باستخدام هذا الحل العامل، مع معالجة مجموعات الضابطة باستخدام وسط خلية ظهارية فقط.
- بعد 16 ساعة من العلاج، قم بإزالة الوسط بعناية وغسل الخلايا ب PBS. قيم مستويات ROS داخل الخلايا في الخلايا الهامشية باستخدام مجموعة اختبار نوع الأكسجين التفاعلية وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
- أزل وسط الزراعة، ثم أضف صبغة مخففة من MitoTracker Red CMXRos (صبغة انتقائية للميتوكوندريا) وDCFH-DA إلى الخلايا، وحضن على حرارة 37 درجة مئوية في حاضنة زراعة الخلايا لمدة 30 دقيقة.
- اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام PBS (كل منها 5 دقائق)، وثبت الألواح الجانبية، وراقب العينات باستخدام مجهر ليزر كونفوكلي.
7. علاج D-جالاكتوز وتلوين SA-β-gal
- بعد 7 أيام من الزراعة، عندما تشكل الخلايا الهامشية طبقة أحادية متلافقة، تم إذابة مسحوق D-galactose في وسط EpiCM لتحضير محلول D-gal يعمل بقوة 40 ملغ/مل. حضن مجموعات تجريبية باستخدام هذا المحلول (2 مل لكل بئر من صفيحة ذات 6 آبار، 48 ساعة، عند 37 درجة مئوية) لتحفيز الشيخوختة الخلوية، مع معالجة مجموعات التحكم التي تحتوي على نفس حجم وسط الإبينيفرينيوم فقط.
- بعد 48 ساعة من العلاج، قم بإزالة الوسط بعناية واغسل الخلايا باستخدام PBS. قيم شيخوخة الخلايا في الخلايا الهامشية باستخدام مجموعة التلوين SA-β-gal وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
- ثبت الخلايا بالمحلول الثابت لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد إزالة المثبت، اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام PBS (5 دقائق لكل غسل).
- حضن الخلايا باستخدام محلول تلوين SA-β جالون يحتوي على 5٪ X-Gal (1 مل لكل بئر من صفيحة ذات 6 آبار) طوال الليل عند 37 درجة مئوية في حاضنة رطبة بدون ثاني أكسيد الكربون.
- التقط صورا لتلوين SA-β جالون تحت إضاءة المجال الساطع باستخدام المجهر.
8. التحليل الإحصائي
- للمقارنات بين مجموعتي العلاج بالهيدروجين والمجموعات الضابطة فيما يتعلق بمتوسط شدة الفلورية المناعية في تلوين ROS، وبين مجموعات D-galactoise والضابطة فيما يتعلق بنسبة الخلايا SA-β-gal-إيجابية، يجب تطبيق اختبارات T بعد التقييمات للطبيعية واللوغاريتمية.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
نمو وخصائص الخلايا المزروعة
وباستخدام هذا البروتوكول، نجحنا في تأسيس الثقافات الأولية لخلايا هامشية معزولة من قوقعة الفئران. في اليوم الثاني من الزراعة، كشفت المجهر الضوئي أن الخلايا التصقت بالركيزة وبدأت في تكوين مستعمرات متجمعة (الشكل 2Aa). في اليوم الثالث، قمنا بتنقية الخلايا (الشكل 2B). كشفت الملاحظات اللاحقة خلال الأيام التالية أن الخلايا الهامشية الأولية خضعت لتوسع أسي، وأظهرت شكلا مميزا يشبه الحصى ووصل...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
على مدى عقود، ركزت الأبحاث حول فقدان السمع بشكل أساسي على دور خلايا الشعر الحسية وروابطها المشبكية مع الخلايا العصبية الحلزونية11. تم تخصيص العديد من الدراسات المنشورة لإنشاء وتحسين نماذج الزراعة المختبرية لخلايا الشعر، والتي لعبت دورا لا غنى عنه في دراسة تلف خلايا الشعر، وتجددها، وتأثيرات الأدوية السامة للأذن 12,13. ومع ذلك، سلطت مجموعة متزايدة من الأبحاث والمراجعات الضوء على الدور الحاسم الذي طا...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
يعلن المؤلفون أن البحث لا يحتوي على تضارب مصالح تجارية أو مالية.
شكر وتقدير
نعبر عن امتناننا لقسم طب الأنف والأذن والحنجرة - جراحة الرأس والرقبة، ومستشفى رينمين بجامعة ووهان (ووهان، الصين) ومعهد أبحاث طب الأنف والأذن والحنجرة - جراحة الرأس والرقبة، مستشفى رينمين بجامعة ووهان (ووهان، الصين) على دعمهم السخي وتشجيعهم. وقد دعم هذا العمل مؤسسة بناء وحضانة مركز الخدمات الصحية الوطنية في الصين (ZX0000000037)، والمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (81700916، 82301294)، ومؤسسة العلوم الطبيعية في مقاطعة هوبي (2017CFB242)، ومشروع البحث العلمي للجنة الصحة في مقاطعة هوبي (WJ2017Q005).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| أنبوب الطرد المركزي بسعة 15 مل | سيرفيسبيو | EP-1501-J | الاستخدام للثقافة |
| طبق زراعة الخلايا بقطر 35 مم | NEST | 706001 | الاستخدام للتشريح |
| 4٪ بارافورمالديهيد | سيرفيسبيو | G1101 | التلوين المناعي الفلوري |
| صفيحة ذات 6 آبار | سيرفيسبيو | CCP-6H | الاستخدام للثقافة |
| أليكسا فلور 488-الأجسام المضادة المضادة للأرانب الماعز المتزامن | بروتين تك | SA00013-2 | التلوين المناعي الفلوري |
| وسيط تركيب مضاد التدرج مع DAPI | الأبسين | ABS9235 | التلوين المناعي الفلوري |
| مجموعة عد الخلايا-8 | بيوتايم | C0037 | الاستخدام في عد الخلايا |
| كولاجناز النوع الثاني | بايوشارب | BS164 | الاستخدام للثقافة |
| نظام المسح بالليزر الكونفوكال | أوليمبوس | FV1200 | التلوين المناعي الفلوري |
| DCFH-DA | إنفيتروجين | C2938 | صبغة ROS |
| دي-غال | سولاربيولوجيا | D8310 | الاستخدام لنمذجة الخلايا |
| وسيط إبي سي إم إيه | ساينس ل | 4131 | الاستخدام للثقافة |
| الملقط الدقيق | الدفع الخلفي | F11020-11 | الاستخدام للتشريح |
| مصل الماعز | بيوتايم | C0265 | التلوين المناعي الفلوري |
| H2O2 | مكبيو | MM0707 | الاستخدام لنمذجة الخلايا |
| محلول الملح المتوازن لهانك (HBSS) | بايوشارب | BL561A | الاستخدام للثقافة |
| إيزوفلوران | الدفع الخلفي | R510-22-10 | الاستخدام للتشريح |
| الأجسام المضادة KCNQ1 (G-8) | سانتا كروز | SC-365186 | التلوين المناعي الفلوري |
| المجهر | أوليمبوس | SZX7-1063 | الاستخدام للتشريح |
| المجهر | أوليمبوس | IX71 | يستخدم لمراقبة نتائج التلوين الفلوري المناعي |
| ميتو تراكر الأحمر CMXRos | إنفيتروجين | M7512 | صبغة ROS |
| جراء الفئران حديثة الولادة (P0-P3) | مقدمة من BIONT | ||
| PBS | سيرفيسبيو | G4202 | التلوين المناعي الفلوري |
| الأجسام المضادة وحيدة النسيلة من رابيت مضاد للفأر CK18 | بروتين تك | 10830-1-AP | التلوين المناعي الفلوري |
| طقم التلوين للشيخوخة وبيتا;-جالاكتوسيداز | بيوتايم | C0602 | تصبغات التقدم في العمر |
| ترايتون X-100 | سيغما-ألدرتش | X100 | التلوين المناعي الفلوري |
المراجع
- Raphael, Y., Altschuler, R. A. Structure and innervation of the cochlea. Brain Res Bull. 60 (5-6), 397-422 (2003).
- Bovee, S., et al. The stria vascularis: Renewed attention on a key player in age-related hearing loss. Int J Mol Sci. 25 (10), 5391(2024).
- Schulte, B. A., Schmiedt, R. A. Lateral wall Na,K-ATPase and endocochlear potentials decline with age in quiet-reared gerbils. Hear Res. 61 (1-2), 35-46 (1992).
- Hibino, H., et al. How is the highly positive endocochlear potential formed? The specific architecture of the stria vascularis and the roles of the ion-transport apparatus. Pflugers Arch. 459 (4), 521-533 (2010).
- Johns, J. D., et al. The role of the stria vascularis in neglected otologic disease. Hear Res. 428, 108682(2023).
- Yu, W., et al. Role of the stria vascularis in the pathogenesis of sensorineural hearing loss: A narrative review. Front Neurosci. 15, 774585(2021).
- Ohlemiller, K. K., et al. Cellular correlates of age-related endocochlear potential reduction in a mouse model. Hear Res. 220 (1-2), 10-26 (2006).
- Mahendrasingam, S., et al. Relative time course of degeneration of different cochlear structures in the CD/1 mouse model of accelerated aging. J Assoc Res Otolaryngol. 12 (4), 437-453 (2011).
- Lee, J. E., et al. Mechanisms of apoptosis induced by cisplatin in marginal cells in mouse stria vascularis. ORL J Otorhinolaryngol Relat Spec. 66 (3), 111-118 (2004).
- Ohlemiller, K. K., et al. The endocochlear potential as an indicator of reticular lamina integrity after noise exposure in mice. Hear Res. 361, 138-151 (2018).
- Liberman, M. C., Kujawa, S. G. Cochlear synaptopathy in acquired sensorineural hearing loss: Manifestations and mechanisms. Hear Res. 349, 138-147 (2017).
- Levano, S., et al. Whole neonatal cochlear explants as an in vitro model. J Vis Exp. (197), e65160(2023).
- Wu, K. Y., et al. Isolation and culture of primary cochlear hair cells from neonatal mice. J Vis Exp. (199), e65687(2023).
- Schmiedt, R. A., et al. Effects of furosemide applied chronically to the round window: A model of metabolic presbyacusis. J Neurosci. 22 (21), 9643-9650 (2002).
- Kurata, N., et al. Histopathologic evaluation of vascular findings in the cochlea in patients with presbycusis. JAMA Otolaryngol Head Neck Surg. 142 (2), 173-178 (2016).
- Wangemann, P., et al. Loss of KCNJ10 protein expression abolishes endocochlear potential and causes deafness in Pendred syndrome mouse model. BMC Med. 2, 30(2004).
- Ding, L., Wang, J. miR-106a facilitates the sensorineural hearing loss induced by oxidative stress by targeting connexin-43. Bioengineered. 13 (6), 14080-14093 (2022).
- Wan, H., et al. PARP1 inhibition prevents oxidative stress in age-related hearing loss via PAR-Ca(2+)-AIF axis in cochlear strial marginal cells. Free Radic Biol Med. 220, 222-235 (2024).
- Zhang, Y., et al. Decreased poly(ADP-ribose) polymerase 1 expression attenuates glucose oxidase-induced damage in rat cochlear marginal strial cells. Mol Neurobiol. 53 (9), 5971-5984 (2016).
- Fetoni, A. R., et al. Pathogenesis of presbycusis in animal models: A review. Exp Gerontol. 46 (6), 413-425 (2011).
- Marie, A., et al. Senescence-accelerated mouse prone 8 (SAMP8) as a model of age-related hearing loss. Neurosci Lett. 656, 138-143 (2017).
- Li, W., et al. Rodent models in sensorineural hearing loss research: A comprehensive review. Life Sci. 358, 123156(2024).
- Bommakanti, K., et al. Cochlear histopathology in human genetic hearing loss: State of the science and future prospects. Hear Res. 382, 107785(2019).
- Nicolson, T. Navigating hereditary hearing loss: Pathology of the inner ear. Front Cell Neurosci. 15, 660812(2021).
- Liu, W., et al. Applications and challenges of CRISPR-Cas gene-editing to disease treatment in clinics. Precis Clin Med. 4 (3), 179-191 (2021).
- Guo, D., et al. Establishment methods and research progress of livestock and poultry immortalized cell lines: A review. Front Vet Sci. 9, 956357(2022).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
