مقالة منهجية

تقييم تأثير ثيموكينون على إشارات Keap-1/Nrf-2، والإجهاد التأكسدي، والسلوك لدى الفئران

251 مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/69924

⸱

مارس 13, 2026

 , 
1Faculty of Medicine, Department of Physiology, Kirsehir Ahi Evran University, 2Faculty of Medicine, Department of Histology and Embryology, Kirsehir Ahi Evran University

في هذه المقالة

ملخص

يوضح هذا البروتوكول كيفية تقييم تأثيرات الثيموكينون على مسار Keap-1/Nrf-2، ومؤشرات الإجهاد التأكسدي، والنتائج السلوكية في نموذج الفئران للتعرض تحت المزمن للدلتاميثرين.

الملخص

أدت التطورات الأخيرة في أبحاث التعرض للمبيدات الحشرية إلى زيادة الاهتمام باستراتيجيات الحماية القائمة على مضادات الأكسدة. تم الإبلاغ عن أن ثيموكينون (TQ)، وهو مركب نشط بيولوجيا مشتق من النباتات، يمارس تأثيرات وقائية ضد عوامل سامة مختلفة. تصف هذه الدراسة بروتوكولا لتقييم تأثيرات TQ على معلمات الإجهاد التأكسدي، ومسار إشارات Keap-1/Nrf-2، والنتائج السلوكية لدى الفئران المعرضة لجرعة منخفضة من دلتاميثرين (DTM). هنا، تم توزيع 24 ذكرا بالغا من فئران ويستار ألبينو (250 ± 20 جرام) عشوائيا إلى أربع مجموعات (n = 6/مجموعة): ضابطة، TQ، DTM، وDTM+TQ. تم إعطاء DTM (1.28 ملغ/كغ) وTQ (10 ملغ/كغ) عن طريق المعدة لمدة 30 يوما. تم مراقبة وزن الجسم طوال الدراسة. تم تقييم النشاط الحركي والسلوك الشبيه بالقلق باستخدام اختبار المجال المفتوح في اليوم 31، وتم تقييم سلوك الاكتئاب باستخدام اختبار السباحة القسرية في اليوم 32. في نهاية الفترة التجريبية، تم جمع أنسجة البلازما والدماغ لإجراء تحليلات كيميائية حيوية وتاريخية وجزيئية. تم قياس مؤشرات الإجهاد التأكسدي، بما في ذلك مستويات المالونديالديهايد، وأكسيد النيتريك الكلي، والجلوتاثيون، ومستويات مجموعة السلفهيدريل، في عينات البلازما وقشرة الدماغ. تم تحليل مستويات تعبير بروتين ECH المرتبط ب 1 (Keap-1) والعامل 2 المرتبط بعامل الإريثرويد النووي 2 (Nrf-2) باستخدام البلوتينغ الغربي والكيمياء المناعية. يوفر هذا البروتوكول نهجا شاملا وقابلا للتكرار للتحقيق في السمية العصبية الناتجة عن المبيدات والتأثيرات التعديلية للمركبات المضادة للأكسدة.

المقدمة

تستخدم المبيدات الحشرية على نطاق واسع في الزراعة والبيئات المنزلية للسيطرة على الآفات؛ ومع ذلك، فإن التعرض المزمن لجرعات منخفضة يمكن أن يؤدي إلى تلوث بيئي وآثار صحية سلبية على البشر والحيوانات. هذا التعرض، خصوصا من خلال الطعام والماء الملوثين، مرتبط بزيادة خطر الإصابة بالاضطرابات العصبية والسموم الجهازية الأخرى1.

لقد حلت البيريثرويدات محل مبيدات الفوسفور العضوية إلى حد كبير بسبب اللوائح الأكثر صرامة على الأخيرة وسميتها الأقل نسبيا للثدييات. DTM، وهو بيرثرويد من النوع الثاني يحتوي على مجموعة α-سيانو، يعد من أكثر المبيدات الحشرية استخداما في العالم ويعتبر فعالا للغاية ضد الحشرات2. على الرغم من ذلك، أظهرت الدراسات التجريبية أن التعرض لل DTM يسبب الإجهاد التأكسدي والسمية العصبية في نماذج الحيوانات 3,4.

DTM هو مركب شديد المحبة للدهون يعبر بسهولة الحاجز الدموي الدماغي ويعطل وظيفة الخلايا العصبية عن طريق إطالة فتح قنوات الصوديوم المحجوزة بالجهد. يؤدي هذا التأثير إلى إطلاق متكرر للعصبون، وزيادة تدفق الصوديوم داخل الخلية، وزيادة توليد أنواع الأكسجين التفاعلية، مما يؤدي في النهاية إلى تلف تأكسدي والتهاب وتغيرات سلوكية، خاصة في المناطق الحساسة في الدماغ مثل الحصين والقشرة الدماغية1. نظرا للقلق المتزايد بشأن السمية العصبية الناتجة عن المبيدات، تم توجيه اهتمام متزايد نحو استراتيجيات الحماية القائمة على مضادات الأكسدة المستمدة من مصادر طبيعية. TQ، وهو مكون حيوي رئيسي في زيت نيجيلا ساتيفا العطري، تم الإبلاغ عن امتلاكه خصائص قوية مضادة للأكسدة ومضادة للالتهابات وحماية عصبية5. أظهرت عدة دراسات تأثيراته المفيدة ضد الإجهاد التأكسدي الكيميائي والعمليات التنكسية العصبية 5,6,7,8,9.

واحدة من الآليات الرئيسية التي تقوم عليها التأثيرات الوقائية ل TQ هي تعديل مسار الإشارة Keap-1/Nrf-2. يلعب هذا المسار دورا مركزيا في الحفاظ على توازن الأكسدة الخلوية من خلال تنظيم تعبير الإنزيمات المضادة للأكسدة وإزالة السموم. في ظروف الإجهاد التأكسدي، يتم تخفيف الكبت الذي يبوسه Keap-1 ل Nrf-2، مما يسمح ل Nrf-2 بالانتقال إلى النواة وتفعيل التعبير الجيني المعتمد على عنصر الاستجابة المضادة للأكسدة9.

نظرا لأن التعرض للمواد المضغوطة يسبب تغييرات على المستويات الجزيئية والكيميائية الحيوية والنسيجية والسلوكية، فإن النهج التحليلي الواحد غير كاف لالتقاط كامل تأثيراته العصبية السامة. لذلك، يدمج هذا البروتوكول التقييمات السلوكية، وتحليلات مؤشرات الإجهاد التأكسدي، والتقييم النسيجي المرضي، والتحقيق الجزيئي لمسار Keap-1/Nrf-2 لتوفير إطار شامل وقابل للتكرار لدراسة السمية العصبية الناتجة عن المبيدات والتأثيرات التعديلية للمركبات المضادة للأكسدة مثل TQ.

وعند النظر إلى الأدلة الملخصة أعلاه، تبرز الحاجة إلى نهج تجريبي متكامل لتوضيح الآليات الكامنة وراء السمية العصبية الناتجة عن DTM وتقييم التدخلات الوقائية المحتملة. من خلال دمج التقييمات السلوكية مع التحليلات الكيميائية الحيوية والنسيجية والجزيئية لمسار Keap-1/Nrf-2، يتيح البروتوكول الحالي تقييما متعدد الأبعاد للتلف العصبي المرتبط بالإجهاد التأكسدي. يؤكد تفسير النتائج التجريبية ضمن هذا الإطار الميكانيكي على كيفية تعديل TQ لإشارات الأكسدة والاختزال، وتخفيف إصابة الأنسجة، وتحسين النتائج السلوكية في سياق التعرض تحت المزمن.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

وافقت لجنة أخلاقيات التجارب المؤسسية على الحيوانات على البروتوكول التجريبي تحت رقم التسجيل 68429034/35. بلغت المدة الإجمالية للدراسة 32 يوما. قبل التجارب، كانت الحيوانات تتكيف مع الظروف المخبرية القياسية. تم إجراء جميع الإجراءات التجريبية وفقا لمعايير أخلاقيات الحيوان المؤسسية والدولية بدقة. المواد التجريبية المستخدمة في هذا البروتوكول مدرجة في جدول المواد.

ملاحظة: تم التخلص من النفايات الكيميائية والبيولوجية وفقا لإرشادات السلامة وإدارة النفايات في المختبرات الخاصة بالمؤسسة. تم جمع الأحماض والقواعد والمذيبات العضوية في حاويات منفصلة ومعلمة وتسليمها إلى وحدة النفايات الخطرة المؤسسية. تم جمع المواد البيولوجية والمستهلكات الملوثة في حاويات بيولوجية، وتعقيمها، ونقلها إلى المنشأة المؤسسية المناسبة للتخلص النهائي.

1. التصميم التجريبي

  1. احصل على 24 ذكرا بالغا من جرذ ويستار ألبينو بوزن 250 ± 20 جرام من مختبر تجارب الحيوانات. احتوى كل فأر على حدة في أقفاص عند 24 ± 2 درجة مئوية خلال دورة ضوء/ظلام مدتها 12 ساعة ، مع إمكانية الوصول إلى طعام الجرذان القياسي وماء الصنبور.
  2. قسم الحيوانات عشوائيا إلى أربع مجموعات (n = 6 لكل مجموعة): المجموعة 1: التحكم (C)، المجموعة 2: TQ، المجموعة 3: DTM، المجموعة 4: DTM + TQ.
  3. قم بإذابة DTM (نقاء 98٪) في زيت الذرة وأعطه بجرعة 1.28 ملغ/كغ عبر التشويش داخل المعدة لمدة 30 يوما.
  4. أذيب الصبغة بجرعة 10 ملغ/كغ في زيت الذرة وأعطه عبر التمقم داخل المعدة لمدة 30 يوما. جهز جميع المحاليل الدوائية طازجة يوميا وأعطها بحجم إجمالي 1 مل/كجم.
  5. في مجموعة العلاج المشتركة، أعط TQ مباشرة بعد DTM. أعط زيت الذرة فقط للمجموعة الضابطة لأخذ التوتر المرتبط بالزعزف في الاعتبار.
    ملاحظة: تم اختيار جرعة DTM بناء على الأدبيات السابقة لتحفيز الإجهاد التأكسدي دون التسبب في المراضة، وتتوافق مع حوالي 1/100 من LD501.

2. قياس وزن الجسم

  1. قس وزن الجسم في الأيام 1 و10 و20 و30 من الدراسة (الشكل 1).

3. المعايير السلوكية

  1. إجراء جميع اختبارات السلوك ضمن ظروف موحدة لضمان الاتساق. تسجيل كل من اختبار السباحة القسرية (FST) واختبار الحقل المفتوح (OFT) باستخدام كاميرا علوية توفر رؤية كاملة لجهاز الاختبار. حافظ على الإضاءة عند حوالي 100–150 لوكس. عرف الجمود بأنه غياب الحركة النشطة، باستثناء الحركات البسيطة المطلوبة للحفاظ على الوضعية والتنفس. نظف جميع مناطق الاختبار بنسبة 70٪ إيثانول بين الحيوانات لمنع تأثيرات الشم.
  2. FST
    1. قم بإجراء FST في اليوم 32 لتقييم السلوك الشبيه بالاكتئاب. قم بإجراء جلسة اختبار تمهيدية لمدة 15 دقيقة قبل 24 ساعة من جلسة الاختبار لمدة 5 دقائق لتعويد الحيوانات على البيئة المائية وتقليل التوتر الناتج عن الحداثة. لا تقوم بتقييم السلوك خلال جلسة ما قبل الاختبار.
    2. ضع الفئران بشكل فردي في حاويات أسطوانية (القطر: 35 سم، الارتفاع: 50 سم) تحتوي على 30 سم من الماء مع الحفاظ على درجة حرارة 25 ± 1 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
    3. سجل فترات السباحة والتسلق وعدم الحركة باستخدام كاميرا فيديو. قم بقياس معايير السلوك بالثواني من تسجيلات الفيديو10.
    4. عرف السلوكيات كما يلي:
      الجمود: اعتبر الحيوان غير متحرك عندما يبقى عائما دون حركة نشطة، حيث يبذل حركات قليلة فقط للحفاظ على رأسه فوق الماء.
      السباحة: عرف السباحة بأنها حركة أفقية نشطة عبر الأسطوانة مع حركات منسقة لجميع الأقدام الأربعة.
      التسلق: عرف التسلق بأنه الحركات القوية الموجهة للأعلى للأعلى للأعلى للكفوف الأمامية على جدار الأسطوانة بينما يبقى الحيوان في وضعية عمودية.
    5. إذا بقي الحيوان ساكنا تماما، قم بتقييم السلوك كعدم حركة وفقا للمعايير المحددة مسبقا.
    6. لا تطبق تحفيزا خارجيا أو تصحيح المسار أثناء جلسة الاختبار. اسمح للحيوان بالتصرف بحرية طوال فترة الخمس دقائق ما لم يكن هناك حاجة للتدخل لأسباب تتعلق بالسلامة (مثل خطر الغرق).
  3. OFT
    1. أجر OFT في اليوم 31 لتقييم النشاط الحركي والسلوك الشبيه بالقلق.11. سجل الحركات الفردية لمدة 5 دقائق في ساحة بقياس 90 × 35 سم، مقسمة إلى 24 وحدة متساوية بخطوط سوداء.
    2. قم بقياس المعاملات السلوكية التالية من تسجيلات الفيديو التي يقدمها الباحث الذي يعمى عن تخصيص المجموعات:
      عدد التقاطع مع جميع الأقدام الأربع (النشاط الحركي)
      الوقت الذي يقضيه في المنطقة المركزية والمحيطية (سلوك يشبه القلق)
    3. إذا بقي الحيوان ساكنا تماما، سجل السلوك كعدم حركة وحدد صفر عبورات خلال تلك الفترة.
    4. لا تطبق التحفيز الخارجي، أو إعادة التموضع، أو تصحيح المسار خلال جلسة الاختبار.
    5. اسمح للحيوان بالتصرف بحرية طوال فترة الخمس دقائق ما لم يكن هناك حاجة للتدخل لأسباب تتعلق بالسلامة.
    6. نظف الساحة بنسبة 70٪ إيثانول بين الحيوانات لإزالة إشارات الشم.

4. تقييم مؤشرات الإجهاد التأكسدي

  1. قم بجميع الإجراءات في اليوم 32. تخدير الفئران بعمق باستخدام زيلازين عضلي (5 ملغ/كغ) وكيتامين (45 ملغ/كغ). أكد التخدير العميق بغياب رد فعل انسحاب الدواسة. اجمع حوالي 3–5 مل من الدم عبر ثقب القلب في أنابيب مغطاة ب EDTA.
  2. القتل الرحيم الكامل عن طريق النزيف تحت التخدير العميق وتأكيد الوفاة قبل جمع الأنسجة. عينات دم الطرد المركزي عند 3000 × جرام لمدة 10–15 دقيقة عند 4 درجات مئوية. اجمع البلازما بعناية دون الإزعاج بطبقة البوفي واحتفظ بالأليكوات عند −80 درجة مئوية. تشريح الدماغ بسرعة على الثلج. فصل نصف الكرة المخي الأيسر عن الحصين لإجراء تحليلات كيميائية حيوية وتجميد فوري في النيتروجين السائل (تخزين بدرجة حرارة 80 درجة مئوية). ثبت نصف الدماغ الأيمن في الفورمالين المحايد 10٪ للتقييم النسيجي.
  3. تحليلات الإجهاد التأكسدي للبلازما
    1. تحليل بيروكسيد الدهون بالبلازما (اختبار TBARS)
      1. عينات بلازما الطرد المركزي (3000 × جرام، 10 دقائق، 4 درجات مئوية). اخلط 0.5 مل بلازما مع 1 مل من مادة TCA–TBA–HCl (15٪ حمض ثلاثي كلوروأسيتيك (TCA)، 0.375٪ حمض ثيوبارتيريك (TBA)، 0.25 N حمض هيدروكلوريك (HCl)). قم بالطرد المركزي بقوة 1000 × g لمدة 10 دقائق وانقل المادة الفائقة إلى أنابيب زجاجية. أضف 50 ميكرولتر من هيدروكسي تولوين (BHT) بنسبة 0.02٪ بيوتيليه لمنع الأكسدة الصناعية.
      2. سخن على حرارة 100 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة، ثم برد إلى درجة حرارة الغرفة، وجهاز الطرد المركزي عند 1000 × جرام لمدة 10 دقائق، وقس امتصاص المادة الفائقة عند 532 نانومتر10. حساب تركيز MDA باستخدام قانون بير-لامبرت
        ε = 1.56 × 105 M⁻1 سم⁻1، l = 1 سم ويعبر عنه كبلازما nmol/mL.
    2. مستويات الثيول البلازما (RSH)
      1. اخلط 0.5 مل من البلازما مع محلول تريس-HCl (100 ملميول، درجة حموضة 8.2) يحتوي على 1٪ كبريتات الصوديوم الدودسيل (SDS) و2 ملليمول إيثيلين ديامين رباعي أسيتيك (EDTA). حضن لمدة 5 دقائق عند 25 درجة مئوية واستخدم الطرد المركزي (3000 × جرام، 10 دقائق، 4 درجات مئوية). استخدم المادة الفائقة للتحليل.
      2. أضف 0.3 ملليموتر 5,5′-ديثيوبيس-(2-نيتروبنزويك حمض DTNB) وحضن على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. قس الامتصاص عند 412 نانومتر10. احسب تركيزات RSH باستخدام ε = 13,600 M⁻1 cm⁻1 والتعبير عنها كبلازما ميكرومول/لتر.
    3. مستويات NOx في البلازما (تفاعل جريس)
      1. قم بإزالة البروتين من البلازما باستخدام 0.3 مليون هيدروكسيد الصوديوم (NaOH) و5٪ كبريتات الزنك (ZnSO₄). استخدم الطرد المركزي عند 20,000 × g لمدة 5 دقائق واجمع السوبرناتانت.
      2. تحضير محاليل مخزون النترات (100، 10، و1 م.ل/لتر) وتوليد منحنى قياسي (1–100 ميكرومول/لتر). تحميل 100 ميكرولتر من الفائق (الآبار المكررة) في صفيحة دقيقة.
      3. أضف 100 ميكرولتر من كلوريد الفاناديوم (III) (VCl₃) يليه 50 ميكرولتر من السلفانيلاميد و50 ميكرولتر من نيتروفن (1-نفثيل) إيثيلين دامين. حضن لمدة 30–45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة وقس الامتصاص عند 540 نانومتر10. تحديد تركيزات NOx من المنحنى القياسي والتعبير عنها كبلازما ميكرومول/لتر.
  4. تحليلات الإجهاد التأكسدي للأنسجة
    1. استخدم حوالي 100 ملغ من نسيج نصف الدماغ الأيسر لجميع التحليلات الكيميائية الحيوية.
    2. أكسدة الدهون في الأنسجة (اختبار TBARS)
      1. تجانس الأنسجة (1:10 w/v) في TCA بنسبة 10٪ باردة جدا. أضف نفس الحجم بنسبة 0.67٪ TBA وسخن على حرارة 100 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. بارد وطرد مركزي (3000 × جرام، 10 دقائق، 4 درجات مئوية) 10. قس امتصاص الفائق عند 535 نانومتر. احسب MDA باستخدام ε = 1.56 × 105 M⁻1 cm⁻1 وعبر عنه كنسيج رطب nmol/g.
    3. مستويات الجلوتاثيون الأنسجة (GSH)
      1. توحيد الأنسجة بنسبة 10٪ TCA (1:10 w/v) وجهاز طرد مركزي (3000 x g، 10 دقائق، 4 °C). اخلط 0.5 مل من المادة الفائقة مع 2 مل من محلول DTNB (0.4 ملغ/مل في 1٪ سترات الصوديوم)10. قس الامتصاص عند 412 نانومتر فورا. احسب GSH باستخدام ε = 13,600 M⁻1 cm⁻1 وعبر عنه كنسيج رطب ميكرومول/غ.
    4. مستويات أكاسيد النيكاد النيتروجين في الأنسجة (تفاعل جريس)
      1. تجانس الأنسجة في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) (1:5 w/v) وجهاز الطرد المركزي (2000 x جم، 5 دقائق). قم بإزالة البروتين من الفائق بكمية 0.3 M NaOH و5٪ ZnSO₄. الطرد المركزي (3000 × جم، 20 دقيقة) وجمع السوبرناتانت الشفاف.
      2. تحضير معايير النترات (1–100 ميكرومول/لتر). حمل 100 ميكرولتر من المادة الفائقة في آبار مكررة. أضف VCl₃ وكواشف جريس كما هو موضح أعلاه. احتضن لمدة 45 دقيقة عند 37 درجة مئوية وقس الامتصاص عند 540 نانومتر10. حدد التركيزات من المنحنى القياسي وعبر عنها كنسيج ميكرومول/ج.
        تحذير: تم إجراء الإجراءات التي تشمل المواد الكيميائية الخطرة، بما في ذلك TCA وHCl وNaOH والمذيبات العضوية، باستخدام غطاء أبخرة كيميائي معتمد. تم استخدام معدات الحماية الشخصية المناسبة (PPE)، مثل معاطف المختبر، والقفازات المقاومة للمواد الكيميائية، والنظارات الواقية، وعند الحاجة، واقيات الوجه، في جميع التجارب. تم التعامل مع جميع المواد الكيميائية وفقا لإرشادات السلامة المؤسسية وبيانات سلامة المواد ذات الصلة (MSDS).

5. تحديد مستويات Keap-1 و Nrf-2 بواسطة تحليل البقعة الغربية

  1. قطع نسيج الحصين إلى قطع 50 ملغ وضعها في أنابيب التجانس تحتوي على 500 ميكرولتر من محلول RIPA مع مزيج مثبط للبروتياز.
  2. أضف كمية مناسبة من الخرزات المغناطيسية وقم بتجانس عند 1000 × جرام لمدة دورتين. الطرد المركزي عند 14,000 × جرام لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  3. انقل المادة الفائقة إلى أنابيب الطرد المركزي الدقيق النظيفة والطرد المركزي مرة أخرى تحت نفس الظروف. احتفظ بالعينات على الحفظ وحدد تركيزات البروتين.
  4. قس تركيزات البروتين باستخدام جهاز قياس فلوري باستخدام مجموعة اختبار Protein BR، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
  5. حضر 10٪ جل SDS–PAGE للرحلان الكهربائي. اضبط تركيز البروتين إلى 30 ميكروغرام/ميكرولتر.
  6. أضف 4x من محلول Laemmli بنسبة 3:1 وأضف 10٪ β ميركابتوإيثانول. قم بتسخين العينات عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، ثم استخدم الطرد المركزي لفترة وجيزة.
  7. حمل 5 ميكرولتر من مؤشر البروتين و30 ميكروغرام بروتين لكل مسار. شغل الجل عند 110 فولت لمدة 60–90 دقيقة.
  8. قم بتفعيل أغشية PVDF في 100٪ ميثانول لمدة 3–5 دقائق، ثم توازن في 1× مخزن النقل لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة قبل النقل.
  9. قم بترشيح أوراق الترشيح والإسفنج مع مخزن نقل وقم بتجميع ساندويتش النقل بعناية، لضمان إزالة فقاعات الهواء بالكامل. قم بنقل البروتين باستخدام نظام نقل رطب عند 100 فولت لمدة 90 دقيقة عند 4 درجات مئوية (جهد ثابت).
  10. حجب الأغشية في ألبومين مصل البقري بنسبة 3٪ (BSA) لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة على جهاز هزاز مداري. تحضن الأغشية طوال الليل عند 4 درجات مئوية مع الأجسام المضادة الأولية المخففة في 3٪ من BSA (Keap-1 و Nrf-2، 1:3,000؛ β-أكتين، 1:1,000).
  11. اغسل الأغشية 5 مرات لمدة 5 دقائق مع محلول ملحي × تريس مع مغسل Tween 20 بنسبة 0.1٪ (TBS-T). حضانة الأجسام المضادة الثانوية (1:15,000) لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
  12. غسل الأغشية كما هو موضح وحضانة مع ركيزة الإضاءة الكيميائية المعززة (ECL) (مثل ركيزة HRP القائمة على اللومينول) وفقا لتعليمات الشركة المصنعة (خلط كميات متساوية من الكواشف A و B مباشرة قبل الاستخدام). ضع كمية كافية من الركيزة لتغطية سطح الغشاء بالكامل (حوالي 1 مل لكل غشاء) وحضن لمدة 1–2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  13. اكتشاف إشارات الإضاءة الكيميائية باستخدام نظام تصوير رقمي مجهز لاكتشاف التلميض الكيميائي (لا حاجة لطول موجة إثارة محدد، حيث ينتج انبعاث الضوء عن تفاعل HRP–لومينول). احصل على الصور باستخدام إعدادات التعريض التلقائي مع ضمان عدم تشبع النطاقات. حافظ على معايير تعرض متطابقة لجميع العينات ضمن نفس البقعة.
  14. إجراء تحليل كثافة الكثافة باستخدام برامج تحليل الصور تحت معايير اختيار عائد على الاستثمار (ROI)، وطرح الخلفية، ومعايير التطبيع المتطابقة. تطبيع شدة نطاقي Keap-1 وNrf-2 مع بروتين β-أكتين المقابل للتنظيف المنزلي. تصدير القيم المقررة كملفات .csv للتحليل الإحصائي.

6. التحليل الأنسجي المرضي

  1. ثبت نصف الدماغ الأيمن بغضبة فورمالين محايدة 10٪ لمدة 72 ساعة. تجفيف من خلال سلسلة إيثانول متدرجة (70٪–100٪)، ثم أدمج في البارافين، وقسم على عمق 5 ميكرومتر.
    احصل على مقاطع الدماغ الإكليلية عند مستويات الحصين وقشرة التورين وفقا للإحداثيات الستيريوتاكسيكية المحددة في كتاب باكسينوس وواتسون، دماغ الجرذ في الإحداثيات المجسمة (أكاديميك برس). استخدم عارض أطلس دماغ الفئران التفاعلي (https://labs.gaidi.ca/rat-brain-atlas للتحقق من وتحسين تحديد الموقع التشريحي11.
  2. جهز أربع مقاطع تاجية متتالية (بسماكة 5 ميكرومتر) من نسيج دماغي مدمج بالبارافين باستخدام الإجراءات النسيجة القياسية. صبغ الأقسام بالهيماتوكسيلين والإيوزين (H&E) وفقا للبروتوكولات التقليدية12. افحص جميع الشرائح تحت المجهر الضوئي بتكبير 200×. تأكد من أن التقييم النسيجي يتم بواسطة محقق أعمى لتقليل تحيز المراقب13.
    ملاحظة: ضمنت هذه العملية مقارنة تشريحية متسقة بين المجموعات.
  3. تقييم شبه كمي فقدان الخلايا العصبية، والوذمة الخلوية، والنسج النووي، والتسلل الالتهابي، والاحتقان الوعائي في 10 حقول عشوائية لكل قسم.
  4. احسب متوسط الدرجات لكل معلمة لكل مجموعة. كانت معايير التقييم كما يلي: 0 (لا شيء، <5٪)، 1 (خفيف، <33٪)، 2 (متوسط، 33–66٪)، و3 (شديد، >66٪؛ الجدول 1).

7. التحليل الكيميائي المناعي لتفاعل Nrf-2 وKeap-1 في الحصين والقشرة الداخلية

  1. جهز مقاطع بسماكة 5 ميكرومتر من الحصين والقشرة الداخلية وركبها على شرائح زجاجية.
  2. قم بإزالة البارارافين وإعادة ترطيب الأجزاء، ثم اغسله في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) في درجة حرارة الغرفة.
  3. حضن مقاطع تحتوي على بيروكسيد هيدروجين بنسبة 3٪ لمدة 5 دقائق لمنع نشاط البيروكسيداز الداخلي. أقسام الغسيل باستخدام PBS
  4. قم بسحب المستضدات عن طريق تسخين الشرائح في محلول سترات الصوديوم (pH 6.0) لمدة 10–15 دقيقة. اترك الشرائح تبرد لمدة 30 دقيقة، ثم اغسلها ب PBS.
  5. حضن الأقسام مرة أخرى بنسبة 3٪ بيروكسيد الهيدروجين لمدة 15 دقيقة لضمان تثبيط بيروكسيداز كامل. اغسل الأقسام باستخدام PBS.
  6. ضع محلول حاجز لمدة 10 دقائق لتقليل الارتباط غير النوعي. حضن الأقسام طوال الليل عند 4 درجات مئوية مع الأجسام المضادة الأولية ضد Nrf-2 (تخفيف 1:100) وKeap-1 (تخفيف 1:200). اغسل الأقسام ب PBS بعد الحضانة.
  7. حضن مقاطع بجسم مضاد ثانوي مناسب لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. اغسل الأقسام باستخدام PBS.
  8. طبق ستريبتافيدين-بيروكسيداز على الأقسام وحضن لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في غرفة رطبة (حافظ على رطوبة نسبية 95–100٪ باستخدام صندوق حضانة مغلق يحتوي على ورق ترشيح مبلل). اغسل الأقسام ب PBS بعد الحضانة.
  9. تطبيق كروموجين DAB ومراقبة تطور اللون تحت مجهر ضوئي بتكبير 100×. أوقف التفاعل بشطف الزلاجات بماء الصنبور.
  10. قم بصبغ الأجزاء بمادة الهيماتوكسيلين المخففة بنسبة 1:9 لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. اشطف جيدا ب PBS والماء المقطر. تركيب الأقسام باستخدام وسط تثبيت دائم.
  11. افحص الأقسام الملونة تحت المجهر الضوئي. التقاط صور مجهرية بدرجة تكبير ×400 من 16 حقلا تمثيليا لكل قسم.
  12. قم بقياس نشاط المناعة Nrf-2 وKeap-1 باستخدام برامج تحليل الصور. تسجيل وتحليل البيانات الكمية لمزيد من التقييم الإحصائي.
  13. لتحليل الكيمياء المناعية، افتح الصور في ImageJ وقم بمعايرتها باستخدام أداة Set Scale. حول جميع الصور إلى تدرج رمادي 8-بت لتوحيد قياسات الشدة. حدد مناطق الاهتمام (ROIs) يدويا للمناطق الملطخة إيجابيا والمناطق الخلفية المجاورة وحفظها في مدير العائد على الاستثمار.
  14. قم بقياس شدة التلوين باستخدام فك التفاف الألوان المتسق H-DAB، يليه معاملات عتبة متطابقة عبر جميع العينات. قس متوسط القيمة الرمادية، الكثافة الضوئية، ونسبة المساحة الموجبة.
  15. للتحليل القائم على الخلايا، قم بقياس عتبة المقاطع باستخدام أداة Waterched، وقياس الخلايا الموجبة باستخدام تحليل الجسيمات. تم تصدير جميع البيانات كملفات .csv للتحليل الإحصائي.

8. التحليل الإحصائي

  1. قم بإجراء تحليلات إحصائية باستخدام SPSS الإصدار 29.0. أدخل البيانات الخام في تبويب عرض البيانات، حيث يمثل كل صف حيوانا فرديا والمتغيرات المعرفة في تبويب عرض المتغيرات؛ تم ترميز المجموعة التجريبية كمتغير تصنيفي (Control، TQ، DTM، و DTM+TQ).
  2. تقييم طبيعية البيانات باستخدام اختبار شابيرو-ويلك باختيار تحليل > الإحصاء الوصفي > الاستكشاف، وتعيين متغيرات النتائج لقائمة التابعين والمجموعة إلى قائمة العوامل، وتمكين مخططات الطبيعة من خلال الاختبارات. بالنسبة للمتغيرات الموزعة بشكل طبيعي، قم بإجراء مقارنات جماعية باستخدام تحليل التباين أحادي الاتجاه (ANOVA) عبر تحليل > مقارنة المتوسطات > تحليل التباين أحادي الاتجاه، مع تمكين الإحصاء الوصفي واختبار ليفين لتجانس التباين تحت خيار الخيارات.
  3. عند اكتشاف تأثير رئيسي كبير، تطبيق اختبار ما بعد الحدث لتوكي من خلال قائمة ما بعد الحدث لتحديد الفروق الزوجية بين المجموعات. استخدم نتائج اختبار ليفين لتأكيد تجانس التباين (p > 0.05).
  4. بالنسبة لبيانات التقييم النسيجية المرضية التي لم تستوف الافتراضات البارامترية، قم بإجراء تحليل غير معلمي باستخدام اختبار كروسكال–واليس باختيار تحليل > اختبارات غير معلمية > حوارات قديمة > عينات مستقلة K، يليه اختبار دان بعد الفحص مع تصحيح بونفيروني باستخدام وحدة اختبار العينات المستقلة غير المعيارية.
  5. تصدير المخرجات الإحصائية والجداول الملخصة كملفات .xls أو .csv، وتم التعبير عن النتائج كمتوسط ± انحراف معياري (SD)، واعتبرت قيمة p < 0.05 ذات دلالة إحصائية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

قياسات وزن الجسم
تم تسجيل وزن الجسم في الأيام 1 و10 و20 و30. أظهرت الفئران في مجموعتي C وTQ زيادة تدريجية في وزن الجسم خلال فترة التجارب، دون وجود فرق ذي دلالة إحصائية بين هاتين المجموعتين في اليوم 30. على النقيض من ذلك، أظهرت الفئران التي تعرضت ل DTM انخفاضا كبيرا في وزن الجسم مقارنة بالمجموعة الضابطة. أدى الإعطاء المشترك لمادة TQ إلى تخفيف فقدان الوزن المرتبط ب DTM. لم تلاحظ أي وفيات خلال فترة الدراسة (الشكل 1).

ا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

تظهر هذه الدراسة أن التعرض الفموي شبه المزمن ل DTM يسبب تغيرات سلوكية وكيميائية حيوية وجزيئية ونفسية نسيجية متسقة في الفئران، وأن TQ يخفف بفعالية من هذه التأثيرات عند إعطائه في نفس الوقت. من خلال دمج الاختبارات السلوكية الموحدة مع التنميط التأكسدي للتوتر، والتحليل على مستوى المسار لإشارات Keap-1/Nrf-2، والتقييم النسيجي المرضي، يوفر البروتوكول إطارا قويا وقابلا للتكرار لتقييم السمية العصبية الناتجة عن المبيدات والحماية العصبية القائمة على مضادات الأكسدة.

استندت...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

لا توجد تضارب مصالح أو مصالح مالية متنافسة للمؤلفين.

شكر وتقدير

لم يحصل هذا البحث على تمويل خارجي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
5,5'-ديثيوبيس (2-نيتروبنزويك اسم)ثيرمو ساينتيفيك   69-78-3 
الطرد المركزي على سطح الطاولة NF048Nü ve43560
Beta_Actin ثيرموفيشر ساينتفيك، الولايات المتحدة7D2C10
حل BSA  Proteintech، الولايات المتحدة)66201-1-Ig
هيدروكسي تولوين البوتيليهسيغما ألدريتش128-37-0
Dijital Homojenizatö r دايهان العلميhttps://www.artlaboratuv
arcihazlari.com/urun/dai
han-hg-15d-dijital-homoje
nizator-set-a?srsltid=Afm
BOorx_az06ulcHpSzKZs
uP8-47Za4BkvLOM22Xh
p00tgwWhJ-86Vc
DTM   باير TR01426058O
هيماتوكسيلين & ndash; إيوسين  بايو أوبتيكاW01030708
حمض الهيدروكلوريكميرك7647-01-0
برنامج Image J NIH؛ واشنطن، الولايات المتحدة الأمريكية.https://imagej.net/ij/
مجموعة التلوين الكيميائي المناعي  نظام الكشف عن الحجم الكبير من Lab VisionTM UltraVisionTM: مضاد للعوامل متعددة التكلفاتHRP، TA-125-HL
لايكا أوتوكت 14051956472ألمانياhttps://www.leicabiosystems
.com/histology-equipment/mi
crotomes/histocore-cut/
المجهر الضوئي نيكون، إكليبس ني-يو، 940728
N-(1-نفثيل) إيثيلين ديامينثيرمو ساينتيفيك 1465-25-4
قارئ الميكروبليت النانوBMG LABTECHنجم سبيكترو نانو
محلول ملحي مخزن بالفوسفات ميركP4417
الأجسام المضادة الأولية Keap-1 بروتين تكالفئة رقم 10503-2-AP، 1:200
الأجسام المضادة الأولية Nrf-2 بروتين تكرقم الفئة 16396-1-AP، 1/100
مجموعة اختبار بروتين كيوبت BR ثيرموفيشر ساينتيفيك-إنفيتروجينس33211
سترات الصوديومميرك03-04-6132
كبريتات الصوديوم دوديسيلثيرمو ساينتيفيك 151-21-3
هيدروكسيد الصوديومميرك1310-73-2
نترات الصوديومميرك7631-99-4
ستريبتافيدين بيروكسيداز  ثيرمو ساينتيفيك SHRP248-B
سولفانيلاميدثيرمو ساينتيفيك   63-74-1 
حمض ثيوباربيتوريك  ميرك504-17-6
TQ كايمان 490-91-5
حمض التريكرباباليليك، 99٪الكيمياويات العلمية الحرارية  139360500
حمض ثلاثي كلوروأسيتيكالكيمياويات العلمية الحرارية76-03-9
تريس-HClثيرمو ساينتيفيك   1185-53-1 
كلوريد الفاناديوم(III)سيغما ألدريتش7718-98-1
ركيزة West Pico PLUS الكيميائية المضيئة وiBright 750 ؛نظام الترمو فيشر العلميhttps://www.clinxsci.com/product
/mini_chemiluminescence_imagi
ng_system?gad_source=1& GAD
_campaignid=16224184202& gbr
aid=0AAAAAoN6UOOtoB8UD0d
eumBAMD8Xi-1l-& gclid=CjwKCAj
wgeLHBhBuEiwAL5gNEXtK2CNS
LS1GqllMuNgkrFYDaW7yK585njQ
jFja485Fkwj9lRUEKDBoCgLoQA
vD_BwE
محلول كبريتات الزنكميرك7733-02-0

المراجع

  1. Ogut, E., et al. Protective effects of syringic acid on neurobehavioral deficits and hippocampal tissue damages induced by sub-chronic deltamethrin exposure. Neurotoxicol. Teratol. 76, 106839(2019).
  2. Souza, M. F., et al. anxiety-like behavioral impairments associated with brain-derived neurotrophic factor and dopaminergic imbalance after inhalational exposure to deltamethrin. Brain Res Bull. 181, 55-64 (2022).
  3. Chandra, N., Jain, N. K., Sondhia, S., Srivastava, A. B. Deltamethrin induced toxicity and ameliorative effect of alpha-tocopherol in broilers. Bull Environ Contam Toxicol. 90 (6), 673-678 (2013).
  4. Sharma, P., Jan, M., Singh, R. Deltamethrin toxicity. Int J Biol Stud Res. 2 (2), 91-107 (2013).
  5. Abdulbaki, H., Al-Deeb, M. A. Neuroprotective effects of ferulic acid and thymoquinone against deltamethrin-induced neurotoxicity in Drosophila melanogaster. Adv Life Sci. 10 (2), 289-297 (2023).
  6. Ince, S., Kucukkurt, I., Demirel, H. H., Turkmen, R., Sever, E. Thymoquinone attenuates cypermethrin induced oxidative stress in Swiss albino mice. Pestic Biochem Physiol. 104, 229-235 (2012).
  7. Hafez, E., El-Atrash, A., Massoud, A., Attia, M. The impact of the organophosphate insecticide "Malathion" on rat and the possible ameliorating role of "Thymoquinone". Egypt J Exp Biol (Zool.). 13 (2), 309-318 (2017).
  8. Imam, A. L., et al. Orally administered Thymoquinone mitigates cypermethrin-induced dentate gyrus oxidative stress, preventing GABAergic interneuron degeneration and memory impairment in rats via the Nrf2/ARE pathway. Mol Neurobiol. 61, 20(2024).
  9. Dong, J., et al. Thymoquinone Prevents Dopaminergic Neurodegeneration by Attenuating Oxidative Stress Via the Nrf2/ARE Pathway. Front Pharmacol. 14 (11), 615598(2021).
  10. Kuzay, D., Dileköz, E., Özer, Ç Effects of thymoquinone in a rat model of reserpine-induced depression. Braz J Pharm Sci. 58, e19847(2022).
  11. Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , 7th ed, Academic Press. (2013).
  12. Bancroft, J. D., Gamble, M. Theory and Practice of Histological Techniques. , 7th ed, Churchill Livingstone. (2013).
  13. Klopfleisch, R. Multiparametric and semiquantitative scoring systems for the evaluation of mouse model histopathology. BMC Vet Res. 9, 123(2013).
  14. Brocardo, P. S., et al. Anxiety- and depression-like behaviors are accompanied by an increase in oxidative stress in a rat model of fetal alcohol spectrum disorders: Protective effects of voluntary physical exercise. Neuropharmacology. 62, 1607-1618 (2012).
  15. Arora, D., et al. Evaluation and physiological correlation of plasma proteomic fingerprints for deltamethrin-induced hepatotoxicity in Wistar rats. Life Sci. 160, 72-83 (2016).
  16. Zaki, S. M., Algaleel, W. A. A., Imam, R. A., Soliman, G. A., Ghoneim, F. M. Nano curcumin versus curcumin in amelioration of deltamethrin induced hippocampal damage. Histochem Cell Biol. 154, 157-175 (2020).
  17. Zhang, J., et al. Exposure to deltamethrin in adolescent mice induced thyroid dysfunction and behavioral disorders. Chemosphere. 241, 125118(2020).
  18. Ahmed, W. M. S., Abdel-Azeem, N. M., Ibrahim, M. A., Helmy, N. A., Radi, A. M. Neuromodulatory effect of cinnamon oil on behavioural disturbance, CYP1A1, İnos transcripts and neurochemical alterations induced by deltamethrin in rat brain. Ecotoxicol Environ Saf. 209, 111820(2021).
  19. Khalifa, A. G., et al. Deltamethrin and Its Nanoformulations Induce Behavioral Alteration and Toxicity in Rat Brain through Oxidative Stress and JAK2/STAT3 Signaling Pathway. Toxics. 10, 303(2022).
  20. Khalil, H. M. A., et al. Selenium nanoparticles impart robust neuroprotection against deltamethrin-induced neurotoxicity in male rats by reversing behavioral alterations, oxidative damage, apoptosis, and neuronal loss. Neurotoxicology. 91, 329-339 (2022).
  21. Lazarinia, C. A., Florioa, J. C., Lemonicab, I. P., Bernardi, M. M. Effects of prenatal exposure to deltamethrin on forced swimming behavior, motor activity, and striatal dopamine levels in male and female rats. Neurotoxicol. Teratol. 23, 665-673 (2001).
  22. Takasaki, I., et al. Type II pyrethroid deltamethrin produces antidepressant-like effects in mice. Behav Brain Res. 257, 182-188 (2013).
  23. Ramachandran, S., Thangarajan, S. A novel therapeutic application of solid lipid nanoparticles encapsulated thymoquinone (TQ-SLNs) on 3-nitroproponic acid induced Huntington’s disease-like symptoms in wistar rats. Chem Biol Interact. 256, 25-36 (2016).
  24. Ramachandran, S., Thangarajan, S. Thymoquinone loaded solid lipid nanoparticles counteracts 3-Nitropropionic acid induced motor impairments and neuroinflammation in rat model of Huntington’s disease. Metab Brain Dis. 33, 1459-1470 (2018).
  25. Firdaus, F., Zafeer, M. F., Ahmad, M., Afzal, M. Anxiolytic and antiinflammatory role of thymoquinone in arsenicinduced hippocampal toxicity in Wistar rats. Heliyon. 4, e00650(2018).
  26. Abu-Elfotuh, K., et al. The protective effect of thymoquinone or/and thymol against monosodium glutamate-induced attention-deficit/hyperactivity disorder (ADHD)-like behavior in rats: Modulation of Nrf2/HO-1, TLR4/NF-?B/NLRP3/caspase-1 and Wnt/?-Catenin signaling pathways in rat model. Biomed. Pharmacother. 155, 113799(2022).
  27. Eker, A., Eraslan, G. Single and combined effect of chrysin and N-acetylcysteine against deltamethrin exposure in rats. Food Chem. Toxicol. 196, 115191(2025).
  28. Tekeli, M. Y., Eraslan, G., Bayram, L. Ç, Sarıca, Z. S. Effect of diosmin on lipid peoxidation and organ damage against subacute deltamethrin exposure in rats. Environ Sci Pollut Res Int. 28, 15890-15908 (2021).
  29. Armstrong, L. E., et al. Effects of Developmental Deltamethrin Exposure on White Adipose Tissue Gene Expression. J Biochem Mol Toxicol. 27 (2), 165-171 (2013).
  30. Shi, W., Zhang, D., Wang, L., Sreeharsha, N., Ning, Y. Curcumin synergistically potentiates the protective effect of sitagliptin against chronic deltamethrin nephrotoxicity in rats: Impact on pro-inflammatory cytokines and Nrf2/Ho-1pathway. J Biochem Mol Toxicol. 33, e22386(2019).
  31. Li, M., et al. Protective effects of thymol on deltamethrin-induced toxicity of Channa argus in association with the NF-κB/Nrf2/p53 pathway. Aquaculture. 559, 738429(2022).
  32. Li, H., Shi, N., Wu, S., Huang, X. Effect of deltamethrin on production of free radical and transcription factor Nrf2 in rats' brain tissue. Chin. J. Ind. Hyg. Occup. Dis. 27 (10), 593-596 (2009).
  33. Li, H. Y., Wu, S. Y., Ma, Q., Shi, N. The pesticide deltamethrin increases free radical production and promotes nuclear translocation of the stress response transcription factor Nrf2 in rat brain. Toxicol Ind Health. 27 (7), 579-590 (2011).
  34. Aboubakr, M., et al. Antioxidant and Anti-Inflammatory Potential of Thymoquinone and Lycopene Mitigate the Chlorpyrifos-Induced Toxic Neuropathy. Pharmaceuticals (Basel). 14, 940(2021).
  35. Abdel-Daim, M. M., et al. Thymoquinone and diallyl sulfide protect against fipronil-induced oxidative injury in rats. Environ Sci Pollut Res Int. 25, 23909-23916 (2018).
  36. Qadri, M. M., et al. Thymoquinone Ameliorates Carfilzomib-Induced Renal Impairment by Modulating Oxidative Stress Markers, Inflammatory/Apoptotic Mediators, and Augmenting Nrf2 in Rats. Int J Mol Sci. 24, 10621(2023).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة