Method Article

تحليل رامان الطيفي بمساعدة التعلم الآلي لمستشعر نانوي ssDNA-SWCNT المستجاب للسيروتونين لتحسين الانتقائية ضد الدوبامين

DOI:

10.3791/69925

⸱

May 15th, 2026

 ,  , 
1School of Biomedical Convergence Engineering, Pusan National University, 2BB21+, Department of Chemistry, Pukyong National University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف البروتوكول تحليل رامان الطيفي لمستشعر النانو SWCNT المغلف ب ssDNA، مما يمكن من تحسين القياس الانتقائي للسيروتونين مقابل الدوبامين بمساعدة نموذج تعلم الآلة.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يلعب السيروتونين (5-هيدروكسي تريبتامين، 5-HT) أدوارا حاسمة في التعديل العصبي، ومع ذلك تواجه طرق الكشف الحالية صعوبة في توفير استشعار فوري ل 5-HT بحساسية وانتقائية عالية. لقد طورنا سابقا مستشعر نانوي للسيروتونين قريب من الأشعة تحت الحمراء (nIRHT)، يتكون من أنبوب كربون أحادي الجدار مغلف ب ssDNA يكتشف 5-HT بحساسية. ومع ذلك، لا يمكن لاستجابة nIRHT التألقية التمييز بين 5HT والدوبامين (DA)، مما يحد من تطبيقاته العملية. في هذه الدراسة، يتغلب طياف رامان مع التعلم الآلي على هذا التحدي الانتقائي. كشفت ميزات الطيف في نطاق G عن توقيعات مميزة لارتباط 5HT مقابل ارتباط DA ب nIRHT، حيث تسبب DA في زيادة كبت نطاق G. استخدمنا رامان التفاضلي (ΔRaman) لعزل التغيرات الطيفية الخاصة بالتحليل ودربنا ثلاثة نماذج تعلم آلي للتصنيف. حقق نموذج الغابة العشوائية مع ΔRaman أداء مثاليا بدقة 95.8٪، متفوقا بشكل ملحوظ على النماذج التي تستخدم أطياف رامان الخام. أظهر هذا النهج تحسنا في الخصوصية، مع استجابات ضئيلة للأسيتيل كولين وGABA والجلوتامات، وحقق حد كشف 0.1 ميكرومولار مناسب للتطبيقات الفسيولوجية. يحول هذا النهج القائم على رامان مستشعر الفلورة غير الانتقائية nIRHT إلى منصة قادرة على تمييز قوي بين الناقلات العصبية، متغلبة على مشكلات الانتقائية في الاستشعار الجزيئي القائم على أنابيب الكربون النانوية ذات الجدار الواحد (SWCNT).

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

السيروتونين (5-هيدروكسي تريبتامين، 5-HT) هو ناقل عصبي حيوي ينظم المزاج والإدراك والنوم والشهية، ويرتبط الخلل الوظيفي بالاكتئاب والقلق واضطرابات نفسية عصبية أخرى1. لا يزال المراقبة الفورية لديناميكيات السيروتونين في الأنظمة البيولوجية تحديا بسبب المدى الزمني الميلي ثانية لنقل التشابك والبيئة الكيميائية المعقدة للنسيج العصبي2. على الرغم من التقدم الكبير في تقنيات اكتشاف الناقلات العصبية، لا يزال تحقيق كل من الحساسية العالية والانتقائية الجزيئية للسيروتونين يشكل تحديات تحليلية كبيرة.

تمتد طرق كشف السيروتونين الحالية من التقنيات التحليلية التقليدية إلى منصات الاستشعار النانوية الناشئة. الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء مع الكشف الكهروكيميائي (HPLC-ED) تظل المعيار الذهبي، حيث تحقق حدود كشف تبلغ 0.056 نانومتر مع قابلية تكرار ممتازة3. ومع ذلك، يتطلب HPLC تحضيرا مكثفا للعينات وأوقات تحليل تتراوح بين 15-30 دقيقة، مما يستبعد المراقبة الفورية4. يتيح الفولتمترية الدوري السريع (FSCV) الدقة الزمنية دون الثانية عند الأقطاب الدقيقة لألياف الكربون، لكنه يعاني من تلوث الأقطاب ومحدودية الانتقائية بين الناقلات العصبية المتشابهة هيكليا5،6. تحقق التطورات الحديثة في أجهزة الاستشعار الفلورية المشفرة وراثيا، بما في ذلك iSeroSnFR7 وGRAB-5HT8، حساسية ونطاق ديناميكي ملحوظين لكنها تتطلب تعديلا جينيا للأنسجة المستهدفة، مما يحد من الترجمة السريرية.

برزت أجهزة الاستشعار البصرية ذات الأنبوب الكربوني النانوي أحادي الجدار (SWCNT) كمنصات واعدة للكشف عن الناقلات العصبية الخالية من العلامات9. تظهر الخلايا النانوية النانوية المعالجة بالحمض النووي المعالجة بالحمض النووي تعديل فلورة قريبة من الأشعة تحت الحمراء (nIR) عند ارتباط التحليلات، مما يمكن الكشف في نافذة الأنسجة الشفافة (900-1400 نانومتر)10,11. طور فريق لاندري مستشعر nIRHT من خلال التطور المنهجي للليغاندات بواسطة الإثراء الأسي (SELEC)، حيث قام بفحص ~10 تسلسلات فريدة من ssDNA لتحديد البنى المستجابة للسيروتونين12. يحقق هذا المستشعر حساسية الميكرومولر مع تعزيز فلوري بنسبة 200٪ عند ارتباط السيروتونين، ويعمل بشكل مستقل عن أكسدة الدوبامين أو السيروتونين. لاستبعاد التداخل التأكسدي، أكدت دراستنا السابقة استقرار هذه المحاليل الناقلة العصبية؛ أظهرت تحليلات UV-Vis والرنين المغناطيسي النووي عدم وجود تغييرات أكسدية أو تشكيلات ذروة جديدة مقارنة ب 5HT12 النقي. علاوة على ذلك، فإن وقت الحضانة القصير وظروف الحموضة المحايدة المستخدمة في النظام مصممة لمنع تكوين كينون بشكل كبير. وبالمثل، كانت مجموعة سترانو رائدة في التعرف الجزيئي على طور الكورونا (CoPhMoRe)، وأظهرت أن أنابيب الكربون البحرية المغلفة (GT)₁₅ تكشف عن الدوبامين بتركيزات 11 نانومتر13. وقد طورت مجموعتنا مؤخرا هذا المجال من خلال التحسين الموجه بتعلم الآلة، محققة تحسينات في الحساسية بمقدار 2.5 ضعف باستخدام فحص عالي الإنتاجية لتسلسلات متحورة بشكل منهجي14.

رغم هذه التطورات، لا يزال هناك قيد أساسي في عدم الانتقائية الكافية بين السيروتونين والدوبامين. كلا الناقلين العصبيين يحتويان على حلقات عطرية وسلاسل إيثيلامين، تختلف فقط بمجموعة هيدروكسيلواحدة 15. عادة ما تحقق حساسات SWCNT الحالية المعتمدة على التألق نسب انتقائية أقل من 5:1، وهي غير كافية لتمييز الناقلات العصبية المفرجة في البيئات المشبكية16. يعد هذا التحدي الانتقائي حاسما بشكل خاص نظرا لأن السيروتونين والدوبامين غالبا ما يتزامنان في مناطق الدماغ التي تحكم المكافأة والدافع17.

يقدم مطيافية رامان معلومات كيميائية مكملة من خلال تحليل أنماط الاهتزازات لمجمع SWCNT-analyte18. ينقسم نطاق G (~1580 سم⁻1) من الخلايا الناتوية SWCNT إلى مكونات G⁺ و G⁻، مع ترددات حساسة لامتصاص الجزيئات والتطعيم الإلكتروني19. أظهرت دراسة سابقة أن المواد غير السطحية التساهمية على SWCNT تحفز تغيرات طيفية مميزة في رامان في منطقة نطاقG 20.

في هذا العمل، نعرض تحليل رامان الطيفي بمساعدة التعلم الآلي لحساس nIRHT لتحقيق انتقائية محسنة بين السيروتونين والدوبامين. قمنا بتوصيف استجابات رامان المعتمدة على التركيز بشكل منهجي من 0.01 إلى 100 ميكرومول، كاشفا عن بصمات طيفية مميزة لكل ناقل عصبي. تم تدريب ثلاثة نماذج تعلم آلي—الشبكة العصبية الالفافية (CNN)، آلة المتجه الداعمة (SVM)، والغابة العشوائية (RF) على مجموعات بيانات الطيفية لتصنيف هوية المحلل. والأهم من ذلك، نقدم معالجة رامان التفاضلية، التي تزيل الإشارات الأساسية لعزل الميزات الخاصة بالمحلل. يحقق نموذج الترددات الراديوية المحسن مع معالجة DR دقة تصنيف تبلغ 95.8٪، مما يمثل تقدما كبيرا في التمييز الجزيئي. يوفر هذا النهج متعدد الوسائط الذي يجمع بين حساسية التألق nIR وخصوصية رامان الكيميائية مسارا نحو مراقبة السيروتونين الانتقائية في بيئات بيولوجية معقدة في الوقت الحقيقي.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. تصنيع مستشعرات نانوية SWCNT nIRHT الوظيفية بواسطة ssDNA

  1. اجمع بين 1 ملغ من أنابيب الكربون النانوية أحادية الجدار (SWCNTs)، و100 ميكرولتر من 1 مللي مولار من الحمض النووي E6#9، و900 ميكرولتر من محلول ملحي مخزن الفوسفات 1x (PBS) في أنبوب بسعة 1.5 مل.
    تحذير: مسحوق SWCNT الجاف يشكل خطرا محتملا للاستنشاق. تعامل مع المسحوق داخل غطاء بخار كيميائي معتمد وارتد معدات الحماية الشخصية المناسبة، بما في ذلك الكمامة والقفازات.
  2. وزع الخليط باستخدام جهاز استحمام لمدة 5 دقائق. قم بسونيك الخليط باستخدام جهاز صوت ذو طرف مزود بمسبار 3 مم بسعة 50٪ لمدة 30 دقيقة في حمام ثلج.
  3. قم بطرد المحلول الصوتي عند 21,500 x g لمدة ساعة واحدة لترسيب أنابيب SWCNT غير مشتتة. اجمع بعناية 850 ميكرولتر من المادة الفائقة وانقلها إلى أنبوب جديد.
  4. قس امتصاص تعليق SWCNT المجمع عند طول موجي قدره 632 نانومتر. احسب التركيز باستخدام معامل انقراض SWCNT البالغ 0.036 (mg/L)⁻1 سم⁻1. تخزين محلول مستشعر nIRHT النهائي عند 4 درجات مئوية حتى الاستخدام مرة أخرى.

2. قياس طيف رامان

  1. تحميل 90 ميكرولتر من تشتت nIRHT بقوة 10 ملغ/لتر في صفيحة بئر 96. قس طيف رامان للحساس في مخزن PBS باستخدام مصدر إثارة ليزر 532 نانومتر. اضبط هذا الطيف المسجل كخط أساس.
    تحذير: من الضروري الحفاظ بدقة على قوة الليزر عند 10 مللي واط وطول موجي عند 532 نانومتر عند التحقيق في العينات البيولوجية الحية. يمكن أن تسبب قوى الليزر الأعلى سمية ضوئية شديدة وتضعف قدرة الجيش على الخلايا. تم إثبات ليزر 532 نانومتر بقوة 10 مللي واط المستخدم في هذا البروتوكول كونه آمنا وغير مدمر لتحليل الخلايا الحية، محافظا على العضيات الحساسة21 والنشاط الكهربائي الفيزيولوجي للخلايا العصبية الأولية22 مع ضمان استقباله القوي لإشارة رامان.
  2. قم بزيادة كل محلول حساس بسعة 90 ميكرولتر (10 ملغ/لتر) مع 10 ميكرولتر من محلول المحلل للوصول إلى تركيزات نهائية 0.01، 0.1، 1، 5، 10، 50، و100 ميكرومول. انتظر 5 دقائق بعد إضافة المحلل للسماح بحضانة كافية.
  3. قس أطياف رامان للعينات الحاضنة. جهز العينات على ثلاث نسخ لكل تركيز وكرر الخطوات من 2.1 إلى 2.2 لضمان قابلية التكرار.

3. تحليل البيانات المعتمد على التعلم الآلي

  1. قم ببناء مجموعة البيانات من إجمالي 208 طيف رامان، تتكون من 77 استجابة للدوبامين (DA)، و76 استجابة للسيروتونين (5HT)، و47 استجابة مجموعة ضابطة (PBS).
  2. قم بإجراء طرح الخلفية على منطقة نطاق G في البيانات الطيفية. تطبيع البيانات التي تم طرحها من الخلفية بناء على ذروة نطاق G+.
  3. تطبيق مرشح وسيط لتقليل الضوضاء في الأطياف الممطبعة. عزل التغيرات الطيفية (ΔRaman) عن طريق طرح طيف التحكم المعياري من كل طيف معالج بالمحلول.
  4. تطوير نموذج شبكة عصبية الالتفافية (CNN)، ونموذج الغابة العشوائية (RF)، ونموذج آلة متجه الدعم (SVM) للتصنيف الثلاثي ل 5HT أو DA أو الضابطة.
  5. قسم مجموعة البيانات بالكامل إلى مجموعات تدريب، وتأكيد، واختبار باستخدام نسبة 6:2:2.
  6. قم بتكوين بنية CNN بثلاث طبقات الالتفاف أحادية الأبعاد باستخدام دالة تفعيل ReLU وحجم تجميع أقصى هو 2، تليها طبقتان متصلتان بالكامل.
  7. قم بتكوين SVM باستخدام نواة دالة الأساس الشعاعي (RBF) للتصنيف غير الخطي.
  8. تكوين نموذج RF باستخدام المعلمات الفائقة الافتراضية.
  9. تدريب النماذج المنشأة باستخدام التحقق المتقاطع الخماسي (5 أرض). احسب متوسط مقاييس الأداء عبر جميع الجوانب الخمسة لضمان المتانة الإحصائية.
  10. اختر النموذج الذي يعطي أعلى دقة في بيانات التحقق من صحة التحليل النهائي.
  11. تقييم النموذج المختار على مجموعة الاختبار للتحقق من قدرته على التعميم.
  12. تحديد الحد غير المباشر للكشف (LOD) عن طريق استبعاد البيانات من مجموعة التدريب التي تنخفض تحت عتبة تركيز 0.1 ميكرومولار بشكل تسلسلي.
  13. اختبر النموذج المدرب على كامل نطاق التركيز، بما في ذلك التركيزات التي تقل عن المعايير، لتحديد العائد النهائي للتركيز.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يستشعر جهاز استشعار النانويات النانوية الكربونية النانوية (nIRHT) الوظيفي لفيروس ال SWCNT الوظيفي ل S9#9 ssDNA، الذي تم تطويره سابقا من خلال منهجية SELEC، تعزيزا قابلا للعكس في فلورة nIR عند الارتباط ب 5HT، مما يتيح التصوير اللحظي بتقنية 5HT في المختبر وخارج الجسم الحي12. تسلسل E6#9 (5'-CCCCCCAGCACCACCAGACACAACTCCCCCCC-3') يلتف حول الأنابيب الصلبية الغربية لإنشاء مواقع ارتباط ل 5HT. ومع ذلك، يفتقر هذا المستشعر إلى التحديد: فكل من 5-HT وDA يؤديان ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

قدم تحليل رامان الطيفي تحسينا كبيرا في خصوصية حساس nIRHT، وهي قدرة لا يمكن تحقيقها باستجابة فلورية تقليدية. لاحظنا أن DA تسبب في كبت أكثر وضوحا لنطاق G⁻ (1570 سم-1) مقارنة ب 5HT. من المحتمل أن تنشأ هذه التواقيع من اختلاف الاتجاهات الجزيئية وهندسات الارتباط على سطح SWCNT. على وجه التحديد، من المرجح أن يشكل جزء الكاثيكول في DA تفاعلات أقوى π π مع سطح SWCNT، مما يؤدي إلى اضطراب إلكتروني أكبر يظهر ككبت معزز للG⁻. على النقيض من ذلك، يبدو أن نظام حلقة الإندول في 5HT ينتج اقتران إلكت...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد تم دعم هذا العمل بمنحة بحثية لمدة سنتين من جامعة بوسان الوطنية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
HiPCo raw  النانو إنتغريس
iDus1.7 InGaAsأندورDU490A-1,9
رامانتاتشنانو فوتون
Vibra Cell 130سونيكس

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Berger, M., Gray, J. A., Roth, B. L. The expanded biology of serotonin. Annu Rev Med. 60, 355-366 (2009).
  2. Dankoski, E. C., Wightman, R. M. Monitoring serotonin signaling on a subsecond time scale. Front Integr Neurosci. 7, 44(2013).
  3. Zhang, X., et al. Highly sensitive assay for serotonin in microdialysates using capillary HPLC with electrochemical detection. J Chromatogr B. 844, 112-118 (2006).
  4. Huang, F., et al. Simultaneous quantification of seven hippocampal neurotransmitters in depression mice by LC–MS/MS. J Neurosci Meth. 229, 8-14 (2014).
  5. Saylor, A., et al. In vivo hippocampal serotonin dynamics in male and female mice: Determining effects of acute escitalopram using fast scan cyclic voltammetry. Front Neurosci. 13, 362(2019).
  6. Mendoza, A., Asrat, T., Liu, F., Wonnenberg, P., Zestos, A. G. Carbon Nanotube Farm Microelectrodes Promote High Temporal Measurements of Serotonin Using Fast Scan Cyclic Voltammetry. Sensors. 20, 1173(2020).
  7. Unger, E. K., et al. Directed evolution of a selective and sensitive serotonin sensor via machine learning. Cell. 183, 1986-2002 (2020).
  8. Wan, J., et al. A genetically encoded sensor for measuring serotonin dynamics. Nat Neurosci. 24, 746-752 (2021).
  9. Kruss, S., et al. Neurotransmitter detection using corona phase molecular recognition on fluorescent single-walled carbon nanotube sensors. J Am Chem Soc. 136, 713-724 (2014).
  10. Gong, H., Peng, R., Liu, Z. Carbon nanotubes for biomedical imaging: The recent advances. Adv Drug Deliv Rev. 65, 1951-1963 (2013).
  11. Yaari, Z., et al. Carbon Nanotubes in Biomedicine: Properties, Methods, and Instrumentation. Handbook Carbon Nanomater. 11, 1-62 (2024).
  12. Jeong, S., et al. High-throughput evolution of near-infrared serotonin nanosensors. Sci Adv. 5, eaay3771(2019).
  13. Zhang, J., et al. Molecular recognition using corona phase complexes made of synthetic polymers adsorbed on carbon nanotubes. Nat Nanotechnol. 8, 959-968 (2013).
  14. Lee, D., et al. Systematic selection of high-affinity ssDNA sequences to carbon nanotubes. Adv Sci. 11, 2308915(2024).
  15. Manciu, F. S., et al. Simultaneous Detection of Dopamine and Serotonin—A Comparative Experimental and Theoretical Study of Neurotransmitter Interactions. Biosensors. 9, 3(2019).
  16. An, S., et al. Directed Evolution of Near-Infrared Serotonin Nanosensors with Machine Learning-Based Screening. Nanomaterials. 14 (3), 247(2024).
  17. Boi, L., et al. Serotonergic and dopaminergic neurons in the dorsal raphe are differentially altered in a mouse model for parkinsonism. eLife. 12, RP90278(2024).
  18. Dresselhaus, M. S., et al. Raman spectroscopy of carbon nanotubes. Phys Rep. 409, 47-99 (2005).
  19. Jorio, A., et al. G-band resonant Raman study of 62 isolated single-wall carbon nanotubes. Phys Rev B. 65, 155412(2002).
  20. Moore, V. C., et al. Individually suspended single-walled carbon nanotubes in various surfactants. Nano Lett. 3, 1379-1382 (2003).
  21. Pieczara, A., Arellano Reyes, R. A., Keyes, T. E., Dawiec, P., Baranska, M. New highly sensitive and specific Raman probe for live cell imaging of mitochondrial function. ACS Sens. 9 (2), 995-1003 (2024).
  22. Tentellino, C., et al. Electrode- and label-free assessment of electrophysiological firing rates through cytochrome c monitoring via Raman spectroscopy. ACS Sens. 10 (2), 1228-1236 (2025).
  23. Jorio, A., et al. Raman spectroscopy of carbon nanotubes. Phys Rep. 409, 47-87 (2005).
  24. Gravely, M., et al. Aggregation Reduces Subcellular Localization and Cytotoxicity of Single-Walled Carbon Nanotubes. ACS Appl Mater Interfaces. 14, 19168-19177 (2022).
  25. Miyaura, K., et al. Extended-conjugation ?-electron systems in carbon nanotubes. Sci Rep. 8, 8098(2018).
  26. Krasley, A. T., Chakraborty, S., Vuković, L., Beyene, A. G. Molecular Determinants of Optical Modulation in ssDNA–Carbon Nanotube Biosensors. ACS Nano. 19 (8), 7804-7820 (2025).
  27. Chakraborty, S., Krasley, A. T., Smith, C. H., Beyene, A. G., Vuković, L. Machine Learning Prediction of Analyte-Induced Fluorescence Perturbations in DNA-Functionalized Carbon Nanotubes. Nano Lett. 26 (2), 787-794 (2026).
  28. Gianni, M., Pasqualetti, M. Wiring and volume transmission: An overview of the dual modality for serotonin neurotransmission. ACS Chem Neurosci. 14 (23), 4030-4040 (2023).
  29. Mayer, S., Saxena, P., Crayen, M. A., Treue, S. Establishing in vivo brain microdialysis for comparing concentrations of a variety of cortical neurotransmitters in the awake rhesus macaque between different cognitive states. J Neurosci Meth. 415, 110361(2025).
  30. Bunin, M. A., Wightman, R. M. Quantitative Evaluation of 5-Hydroxytryptamine (Serotonin) Neuronal Release and Uptake: An Investigation of Extrasynaptic Transmission. J Neurosci. 18, 4854-4860 (1998).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Raman Spectral AnalysisMachine LearningSerotonin NanosensorDopamine SelectivitySingle Walled Carbon NanotubessDNA SWCNTNeurotransmitter DiscriminationRandom Forest ModelG Band SpectroscopyMolecular Sensing

Related Articles