قياسات التخفيف الذاتي الآلية لتحديد الأجسام المضادة ذات خصائص المحلول عالي التركيز المواتية

ملخص

هنا، نصف تكييف عالي الإنتاجية لاختبار استقرار الأجسام المضادة الغروية على نطاق واسع لتوليد مجموعات بيانات كبيرة ودعم توقعات التطوير الجاهزة للذكاء الاصطناعي وتعلم الآلة.

الملخص

واحدة من التحديات الرئيسية في هندسة الأجسام المضادة هي تطوير طرق فحص تحليلية لتقييم استقرار الغرويات، لضمان ملاءمة الأدوية البيولوجية للتركيبة والإعطاء بتركيز عالي. تم تعديل مطيافية الجسيمات النانوية ذات التفاعل الذاتي المستقرة بالشحنة (CS-SINS)، وهي نسخة معدلة من مطيافية الجسيمات النانوية ذات التفاعل الذاتي التقليدية (AC-SINS)، كتقييم قوي لاستقرار الغرويات لتوقع سلوك المحلول عالي التركيز. تمكن هذه الطريقة من اتخاذ قرارات حاسمة في مرحلة التطوير المبكرة من خلال تحديد مشكلات استقرار الغرويات قبل استثمار موارد كبيرة، مما يقلل بشكل كبير من معدلات التراجع في المراحل التالية ويسرع جداول اختيار المرشحين. تظهر هذه الدراسة أن الاختبار يندمج بسلاسة مع سير عمل الاكتشاف الحالي ويمكن إجراؤه بالتوازي مع الاختبارات النموذجية في المراحل المبكرة بسبب متطلبات العينة المحدودة، مما يوفر بيانات قيمة للتنبؤ بالسلوك عالي التركيز دون التأثير على جهود التوصيف الأخرى. لقد ثبت أن قياسات تشتت الضوء الديناميكي الروتينية (DLS)، بالإضافة إلى تغير طول موجة رنين البلازمون، يمكن أن تحسن موثوقية طريقة HTP الموضحة هنا. مجتمعة، من المتوقع أن يسهل التحقق المتقاطع باستخدام قياسات DLS وبرامج التحليل الآلي اختيار العلاجات الموثوقة للأجسام المضادة المرشحة من مختلف الطرق.

المقدمة

في تطوير وصياغة الأجسام المضادة العلاجية، تعد العتمة واللزوجة اعتبارات رئيسية في تطوير منتج تجاري يركز على المريض 1,2,3,4,5,6,7,8. كلاسيكيا، تتطلب كميات كبيرة من البروتين لمراقبة هذه الخصائص مباشرة بتركيز عال، مما يمنع فعليا التعرف الأمثل على الرصاص خلال المراحل المبكرة لاكتشاف الأجسام المضادة، حيث يكون توفر البروتين محدودا. التعرف الموثوق على هذه الظواهر أمر بالغ الأهمية لتقييمات قابلية التطوير للتخفيف من سوء سلوك المحلول عالي التركيز في المراحل^{التالية} 1,2,3,4,5,6,7,8. وبالتالي، هناك اهتمام كبير بالطرق عالية الإنتاجية ومنخفضة التركيز التي تتنبأ بسلوك المحلول السيئ عند التركيز^العالي 9,10,11,12,13,14,15,16. إحدى هذه الطرق، kD-DLS، ثبت أنها موثوقة في التنبؤ بخصائص التركيز العالي لكنها لا تلبي متطلبات استهلاك البروتين المنخفض وعالي الإنتاجية في سير العمل في المراحل المبكرة^12,13.

مؤخرا، أظهر اختبار جسيمات الذهب النانوية فائق الاستهلاك المعروف باسم CS-SINS أن له ارتباط قوي مع نتائج تجارب kD-DLS، وهو فعال إلى حد معقول في التنبؤ بخصائص المحلول السيئة عند تركيز¹⁶ العالي. تجعل هذه الخصائص CS-SINS مرشحا مثاليا للتطوير كأداة فحص عالية الإنتاجية. يستخدم اختبار CS-SINS جسما مضادا للالتقاط مثبت على أسطح جسيمات الذهب النانوية لتثبيت الأجسام المضادة المرشحة عبر مناطق Fc الخاصة بها، مما يترك أذرع Fab متاحة لتفاعلات المحلول. هذا التكوين يعني أن تفاعلات Fab-Fab تهيمن على إشارة الارتباط الذاتي المقاسة، وهو أمر مفيد لأن الدراسات تشير إلى أن مجالات Fab تساهم بشكل رئيسي في خصائص الارتباط الذاتي ل mAb، ويرجح أن ذلك يعود إلى خصائص سطح المنطقة المحددة للتكامل (CDR) 17,18,19,20,21,22,23. يجعل هذا الأساس الميكانيكي CS-SINS مناسبا جدا للتنبؤ بمخاطر استقرار الغرويات ذات الصلة بالتركيبات عالية التركيز. تشمل طرق HTP البديلة، بما في ذلك كروماتوغرافيا امتصاص أحادية الطبقة (SMAC)، ونهج كروماتوغرافيا استبعاد الحجم (SEC) القائم على العمود الذي يحاكي الارتباط الذاتي مع طور ثابت عام، والكروماتوغرافيا بالتفاعل المتبادل (CIC)، وتتطلب تحضير الأعمدة ومتطلبات عينة كبيرة 17,24,25,26,27.

الطريقة الموضحة هنا توضح إعداد اختبار CS-SINS المتحقق من اللوحة وتمكن من فحص HTP من خلال أتمتة وتحليل المختبر، مما يجمع بين مزايا الطرق الحالية مع تعزيز موثوقية النتائج. تظهر هذه الدراسة أيضا كيف أن أنواع العينات المختلفة تعطي نتائج عالية الجودة بسبب طبيعة إثراء التفاعل الذاتي في الاختبار، مما يثبت أن الطريقة لا تتوافق مع مصادر البروتين. علاوة على ذلك، ننظر في كيفية دعم التواصل المبكر للخصائص الغروية مع فرق المشروع في تصميم الأدوية متعددة الأجسام المضادة الاستراتيجية 28,29,30,31,32,33,34.

عادة ما تجرى دراسة خصائص المحلول عالي التركيز في حملات اختيار المرشحين متعددة التخصصات، بعد اختيار الرصاص وإكمال الهندسة (الشكل 1A). أصبح التنبؤ المبكر بهذه الخصائص ممكنا باستخدام طرق مثل CS-SINS التي تتطلب عدة ميكروغرامات من العينة، مما يتوقع مخاطر استقرار الغروية مع القياسات فائقة التخفيف¹⁶. يمكن أن يساعد إدخال فحص قابلية التطوير المبكر (الشكل 1A)، عندما يكون عدد المرشحين كبيرا، وحملات توليد البيانات المتوازية لكل من الصيغ أحادية النوعية ومتعددة التخصصات بشكل أفضل في عملية اكتشاف الأدوية^31,32. يتناسب نظام HTP CSINS مع نموذج فحص الجزيئات الحالي بالتوازي مع تحديد الربط والوظيفة، مما يضيف إلى حزمة المعلومات دون تعطيل أو تأخير سير العمل الحالي. اختيار المرشح الرئيسي مع التركيز على الخصائص الغروية المواتية سيؤثر على تقدم الاختيار كما هو موضح في الشكل 1B.

في سير عمل فحص قابلية التطوير المبكر المقترح، يأخذ تحديد العملاء المحتملين في الاعتبار الصورة الكاملة للخصائص الدوائية المواتية، بما في ذلك التصنيع ووصول المرضى، مما يبسط التطوير في المراحل النهائية³⁴. يمكن أن تحدد خصائص التركيز العالي للأدوية البيولوجية مسار إعطائها: الحقن الوريدي التي تتطلب زيارات للمستشفى أو حقن تحت الجلد، والتي يمكن للمريض إعطاؤها في المنزل، لكنها غالبا ما تتطلب منتجا عالي التركيز^35,36. غالبا ما يتم صياغة الميكروفونات القابلة للتطوير ذات الارتباط الذاتي المنخفض عند >100 ملغ/مل ^5,35. يمكن لتحسين الصياغة باستخدام المواد المساعدة، مثل العوامل المخفضة اللزجة، أن يتغلب على مخاطر استقرار الغرويات للمرشحين المرغوب فيهم ذوي خصائص المحلول الضعيفة في مراحل تطوير CMC^34,35. ومع ذلك، فإن هذا يطرح تحديات لاحقة في تصنيع الأدوية الحيوية ويزيد من جداول الانتظار نحو نجاح الموافقات على الأدوية³⁶. يمكن للمواد الإضافية المعروفة بخفض اللزوجة (مثل الأملاح والأحماض الأمينية) أن تؤثر أيضا على استقرار البروتين، مما يغير ملفات قابلية التطور التي تم تحديدها سابقا ويعقد العملية أكثر^36,37. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تحد الزيادات من عدد المرضى بسبب اعتبارات المناعة أو مخاوف السلامة المختلفة، أو تؤثر على الالتزام بالعلاج، وقد تسبب تحديات جديدة في مجال الإنتاج 38,39,40. نشر ستار وزملاؤه طريقة CS-SINS لأول مرة، حيث وصفوا نسبة الكتلة المثلى ل PLL و IgG بأنها 0.03 وأكدوا استقرار الجسيمات النانوية بواسطة قياسات جهد زيتا للترابط الذاتي لميلابون المآبل في تركيبات الهيستيدين¹⁶. ومن الجدير بالذكر أن إضافة الكثير من PLL تؤدي إلى استقرار زائد في الاختبار ويمنع ملاحظة التفاعل الذاتي لجسيم البلغة الباردة (تم تصوير تحسين استقرار الجسيمات النانوية الذهبية بواسطة PLL في الشكل التكميلي 1). استخدام تركيبات الهيستيدين بدون ملح يقلل من الفحص الكهروستاتيكي (زيادة طول ديباي)، مما يوسع نطاق التفاعلات بين الجزيئات، مما يعزز إشارات الارتباط الذاتي الضعيفة ويحاكي السلوك عالي التركيز عندما تكون الأجسام المضادة قريبة من بعضها. بشكل عام، تفضل التركيبات ذات القوة الأيونية المنخفضة للتركيبات عالية التركيز حيث لا يلاحظ الارتباط الذاتي.

تمنع البوليمرات الكبيرة من PLL احتلال المزيد من mAbs القابض على أسطح الجسيمات النانوية الذهبية، مما يضيق نافذة التحول البلازمونية ويتطلب برنامجا وتحليلا أكثر تطورا لتناسب المنحنيات لتحليل البيانات لاحقا. استخدمت هذه الدراسة أداة بوابة ويب تزامن مع قواعد البيانات الداخلية. الميزة الرئيسية لهذه التكلفة المسبقة هي إمكانية بناء البيانات من تجمع كبير من التسلسلات لتعظيم تنوع المرشحين في مراحل التطوير الأعلى تكلفة 34,35,36. اختبار CS-SINS الذي نصفه هنا يبرز كطريقة متوافقة مع HTP، وقد ثبت أنه يرتبط جيدا باختبارات استقرار الغرويات في المرحلة المتأخرة¹⁶. تجري عملية التحليل التفصيلي بمساعدة الذكاء الاصطناعي من أجل التصميم المدروس للنماذج متعددة التخصصات للبرامج المستقبلية ولفهم المساهمات الفردية لكل مجال في صيغ معقدة ^41,42,43,44. ستؤثر هذه الجهود بشكل جماعي على التحليلات التلوية وتحديد خصائص استقرار الغرويات بشكل أكثر تفصيلا لعلاجات الأجسام المضادة، وبالتالي توفر الوقت في مراحل البحث والتطوير المبكرة.

البروتوكول

يوضح الشكل 2 تحضير اقتران الجسيمات النانوية، والشكل 3 يوضح سير العمل بالكامل، والشكل 4 يوضح عملية أتمتة المختبر، ويحتوي الشكل 5 على مخطط لخط أنابيب تحليل البيانات. المواد المستخدمة والمواد المستخدمة مدرجة في جدول المواد.

1. تحضير المخازن

ملاحظة: الأسبوع الأول (تحضير العينة)

1. حضر الهيستيدين (10 ملليمولار)، الرقم الهيدروجيني 6.0 (عينة ومخزن اختبار).
   ملاحظة: تتم هذه الخطوات في اليوم الأول.
   1. أذاب 5 ملليموتر إل-هيستيدين مونوهيدروكلوريد مونوهيدرات و5 ملليمولار إل-هيستيدين في مياه فائقة النقي. أضف حمض الهيدروكلوريك باتجاه الأسفل أثناء التحريك حتى يصل الرقم الهيدروجيني إلى 6.0، كما يقاس بجهاز قياس الرقم الهيدروجيني المعاير.
   2. قم بترشيح المحلول عبر فلتر بحجم مسام 0.22 ميكرومتر تحت الفراغ واجمع الترشيح في زجاجة معقمة.
   3. قس التوصيلية لأغراض مراقبة الجودة وتأكد من قراءة تقارب 500 ميكروثانية/سم.
2. تحضير أسيتات البوتاسيوم (20 مللي مولار)، pH 4.3 (التقاط مخزن الاقتران mAB).
   1. قم بإذابة أسيتات البوتاسيوم في مياه فائقة النقية واضبط درجة الحموضة إلى 4.3 باستخدام حمض الخليك الجليدي.
   2. تعقيم المحلول عن طريق الترشيح بالفراغ عبر مرشح بحجم مسام بحجم 0.22 ميكرومتر كما هو موضح في الخطوة 1.1.2.
3. حضر بولي-إل-ليسين.
   1. حضر محلول مخزون بسعة 5 ملغ/مل في ماء فائق النقاء وخزن عند −20 درجة مئوية حتى الاستخدام.

2. غسيل جميع العينات (mAbs المرشح)

ملاحظة: قم بتنفيذ هذه الخطوات في الأيام من 2 إلى 5.

1. انقع مسبقا أجهزة قياس 100 ميكرولتر أو 300 ميكرولتر في هيستيدين 10 مللي مول، بدرجة حموضة 6.0، لمدة 5 دقائق.
2. نقل جميع العينات (50–100 ميكرولتر) إلى أشرطة الغسيل الكلوي. اغمر الكاسيت في مخزن الهيستيدين بحجم 10 مللي مول، درجة حموضة 6.0 (700 مل لكل علبة)، أضف قضبان تحريك إلى الخزانات، وضع الخزانات على ألواح تحريك مغناطيسية، وحضن على حرارة 4 درجات مئوية لمدة ساعتين و15 دقيقة.
3. قم بإجراء سبع تبادلات عازل باستخدام 10 مللي مولار هيستيدين، ودرجة حموضة 6.0، كل ساعتين و15 دقيقة، أو إجراء أربع تبادلات عازل ليلية لضمان إزالة الملح من العينات.
4. استرجاع العينات، ونقلها إلى قوارير مصفوفة نظيفة، وتخزينها عند 4 درجات مئوية حتى يتم إجراء اختبار CS-SINS.
5. قس تركيزات العينة وسجل معلومات التشتت المتعدد بعد الغسيل الكلوي. احسب التركيزات المصححة بقسمة قيم الامتصاص الخام عند 280 نانومتر على الامتصاص عند 280 نانومتر لمحلول بقوة 1 ملغ/مل.
6. جهز ملف إدخال معالج السائل مع عناوين البئر وتركيزاتها (ميكروغرام/مل)، بما في ذلك التحكمات.

3. تبادل المخزن المؤقت لالتقاط mAb (الشكل 2، الخطوة 1)

ملاحظة: قم بتنفيذ هذه الخطوات في اليوم الأول من الأسبوع الثاني (الاختبار).

1. قم بإزالة مخزن التخزين من أعمدة إزالة الملح بحجم 2 مل عن طريق الطرد المركزي لمدة دقيقتين عند 1000 × جرام في درجة حرارة الغرفة. جهز عمودين لإزالة الأملاح لكل 700 ميكرولتر من الالتقاط mAb المطلوبة. تخلص من التدفق بعد كل خطوة طرد مركزي.
2. اغسل الأعمدة ثلاث مرات باستخدام 1 مل من محلول أسيتات البوتاسيوم 20 ملليمول، بدرجة حموضة 4.3. قم بعمل الطرد المركزي على الأعمدة لمدة دقيقتين عند 1000 × جرام خلال كل غسل.
3. أضف 700 ميكرولتر من الالتقاط mAb (الجسم المضاد المضاد المضاد للبشر من نوع Fcγ) إلى كل عمود وصب في أنبوب جديد بسعة 15 مل عن طريق الطرد المركزي لمدة دقيقتين عند 1000 × جرام.
4. اجمع اللوات المزيل من المملح، وضعه على عمود إزالة الملح الثاني المتساوي، ثم استخدم الطرد المركزي لمدة دقيقتين إضافيتين عند 1000 × جرام.
5. اجمع جميع العينات المنسوبة.
6. قس تركيز محلول mAb الالتقاط بعد إزالة الملح كما هو موضح في الأيام 2–5، الخطوة 2.5.
7. قم بتخفيف محلول مخزن الالتقاط mAb إلى 0.8 ملغ/مل مع محلول أسيتات بوتاسيوم 20 ملليمولر، pH 4.3، وضعه جانبا حتى الاستخدام.

4. تحضير مخزون عامل من بولي-إل-ليسين

1. قم بتخفيف كمية صغيرة من محلول بولي-إل-ليسين إلى 2.66 ملغ/مل باستخدام ماء فائق النقي.

5. تركيز جسيمات الذهب النانوية (الشكل 2، الخطوة 2)

1. تحضير 1.2 مل من التعليق الأصلي في أنابيب 1 مل أو 4.8 مل أليكوات في أنابيب 5 مل باستخدام أنابيب الطرد المركزي الدقيق البولي بروبيلين التي تحتوي على جسيمات ذهبية نانوية بقطر 20 نانومتر. الطرد المركزي عند 21,130 × جرام لمدة 6 دقائق.
2. إزالة المواد الفائقة (~1.1–1.15 مل) دون إزعاج الحبيبات ونقلها إلى أنبوب مخروطي منفصل.
3. اجمع الحبيبات المركزة والحجم المتبقي في أنبوب طرد مركزي دقيق نظيف. حدد حجم الجسيمات النانوية عن طريق التوصيل بأنابيب وضبط الحجم إلى (عدد أنابيب 1 مل × 50 ميكرولتر) أو (عدد أنابيب 5 مل × 200 ميكرولتر) باستخدام السوبريناتانت المحجوز. على سبيل المثال، بعد طرد 10 أليكوت بحجم 1.2 مل في أنابيب 1 مل، قم بضبط الحجم النهائي للجسيمات النانوية المركزة إلى 500 ميكرولتر.

6. تجميع الجسيمات النانوية

1. اخلط جيدا 1.5 ميكرولتر من محلول عمل بولي-إل-ليسين مع 48.5 ميكرولتر من محلول الالتقاط المتبادل بالمخزن المؤقت mAb (الشكل 2، الخطوة 3).
2. جهز خليطا بنسبة 1:1 من محلول الجسيمات النانوية المركزة من الخطوة 5 ومحلول بولي-إل-ليسين/التقاط mAb من الخطوة 6.1 (الشكل 2، الخطوة 4).
3. حضن الخليط طوال الليل في درجة حرارة الغرفة (23 درجة مئوية) (الشكل 2، الخطوة 5).

7. إعداد لوحة التحليل بمعالج السوائل

ملاحظة: قم بهذه الخطوات في اليوم الثاني.

1. جمع المواد المطلوبة للاختبار، بما في ذلك الأجسام المضادة المحللة، ملف إدخال معالج السوائل الذي يحتوي على تركيزات ما بعد الغسيل الكلوية، جسيمات الذهب النانوية المرافقة، رؤوس المناولة الروبوتية، الصفائح، والخزانات (الشكل 3، أتمتة المختبر، الخطوة 1). قم بتحميل الأطراف والعينات والألواح والخزانات مسبقا على السطح وفقا للتخطيط الموضح في الشكل 3 (أتمتة المختبر، الخطوة 1).
2. أضف أدوات التحكم إلى الآبار A12–D12 من صفيحة العينة (اثنان من الضوابط الإيجابية واثنان من التحكمات السالبة). اترك البئر H12 فارغا لعينة المخزن التي أعدها معالج السائل.
3. افتح طريقة CS-SINS بمعالج السوائل وابدأ البرنامج (الشكل 3، أتمتة المختبر، الخطوات 2–3). قم بتحميل ملف إدخال معالج السائل عند الطلب وأدخل عدد العينات (الشكل 4A). راجع نافذتي التحقق الحسابية التاليتين (الشكل 4B,C)، وأكد القيم، وتابع التشغيل.
4. تطبيع العينات، بما في ذلك أدوات التحكم، إلى 55.5 ميكروغرام/مل في مخزن هيستيدين 10 مللي مول، pH 6.0، عن طريق نقلها من أنابيب العينات المصفوفة إلى لوحة تفاعل البوليميراز المتسلسل في حجم نهائي 100 ميكرولتر (الشكل 4D، الخطوة 1). راقب التقدم، مع ملاحظة أن مناطق الألواح المكتملة تبدو رمادية والخطوات النشطة مميزة باللون الأخضر (الشكل 4E).
5. جهز تخفيفا أكبر حجما لكل عينة عند 11.1 ميكروغرام/مل في مخزن هيستيدين 10 مللي مول، pH 6.0، عن طريق نقل المادة من صفيحة تفاعل بوليميراز المتسلسل إلى كتلة بئر عميقة بحجم نهائي 200 ميكرولتر (الشكل 4D، الخطوة 2).
6. اسمح للنظام بالتوقف بعد الخطوة الثانية. عند الطلب، اخلط الجسيمات النانوية الذهبية المركزة المحضرة في الخطوة 6.3 عن طريق قلب الأنبوب ووضع الأنابيب صعودا وهبوطا حوالي 10 مرات.
   1. وزع الجسيمات النانوية بشكل متساو بين أنبوبين من البولي بروبيلين للطرد المركزي الدقيق وضع الأنابيب، مع فتح الأغطية، في موقع رف الأنابيب المخصص على السطح (الشكل 4D، مميز ب "AuNP"). استأنف المسار ودع معالج السائل يطلق 20 ميكرولتر من الجسيمات النانوية في كل بئر من كتلة البئر العميقة الثانية، بئرين في كل مرة (الشكل 4D، الخطوة 3).
7. السماح لمعالج السائل بنقل 192 ميكرولتر من العينة من كتلة البئر العميق التي تحتوي على عينات 11.1 ميكروغرام/مل (الشكل 4D، الخطوة 2) إلى كتلة البئر العميق الثانية وامزج جيدا. تولد 4× CS-SINS ماسترمكس لكل عينة، مما ينتج تركيز نهائي للعينة يبلغ 10 ميكروغرام/مل بعد إضافة 48 ميكرولتر من جسيمات الذهب النانوية إلى حجم نهائي 240 ميكرولتر (الشكل 4D، الخطوة 3). ابدأ مؤقت الحضانة لمدة 4 ساعات في هذه المرحلة.
8. يسمح لمعالج السائل بصرف 30 ميكرولتر في بئر المصدر ثم يصرف 60 ميكرولتر في ثلاثة من الأربعة آبار في كل ربع من صفيحة بئر 384 لتوليد ثلاثيات تقنية لكل عينة (الشكل 4D، الخطوة 4). أعد ال 30 ميكرولتر المتبقية إلى لوحة المصدر.
9. راقب ترتيب سطح معالجة السوائل أثناء تقدم الجولة. لاحظ أن الأطراف المستخدمة وآبار العينات المملوءة تتغير من الرمادي الفاتح إلى الرمادي الداكن في الوقت الحقيقي، بينما يتم توضيح الحركات النشطة باللون الأخضر (الشكل 4E).
10. أزل اللوحة بعد الانتهاء من الجري. أغلق اللوح بختم صفيحة شفافة قليلة اللاصق واحتضن اللوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة إجمالية 4 ساعات. عند نقطة زمنية تبلغ 3.5 ساعة، ابدأ برنامج تشتت الضوء الديناميكي لموازنة الغرفة إلى 20 درجة مئوية باستخدام الإعدادات الموضحة في الشكل التكميلي 2.
11. قس طيف الامتصاص لكل بئر من 510 إلى 570 نانومتر بزيادات 1 نانومتر (30 نانومتر على كل جانب من القمة) عند نقطة الزمن 4 ساعات.
12. قس اللوح فورا باستخدام قارئ ألواح تشتت الضوء الديناميكي عند نقطة زمنية 4.5 ساعة مع الإعدادات الموضحة في الشكل التكميلي 2.
    ملاحظة: استخدم قارئ ألواح عالي الأداء للقياسات الطيفية بسبب النطاق الديناميكي المحدود. لا تستخدم وظيفة القراءة السريعة.

8. تحليل البيانات (الشكل 5، مخطط معالجة البيانات)

1. تصدير الملفات الخام من منصة Spectrophotometer وحفظها في مجلد قرص يمكن الوصول إليه.
2. ادخل بوابة الويب الخاصة بالبرمجة النصية المرتبطة بالخادم الداخلي. أدخل معلمات الإدخال المطلوبة من CS-SINS، بما في ذلك: (1) الطول الموجي الابتدائي؛ (2) موقع دليل ملف النتائج الخام؛ (3) معرفات مجموعة اللوحات والمرشحين؛ (4) عناوين الآبار ذات التحكم الإيجابي والسالب للتطبيع؛ (5) تسمية إعداد الطريقة ("يدوي" أو "معالج سائل"); (6) الأدوات المستخدمة في المسح الطيفي وقياسات تشتت الضوء الديناميكي؛ (7) معرف دفتر المختبر الإلكتروني (ELN)؛ (8) تاريخ الاستحواذ.
3. أرسل المعلمات إلى بوابة الويب وتحقق من أن ثلاثة ملفات Excel تم إنشاؤها في مجلد فرعي من دليل النتائج الخام.
4. احسب قيم λmax باستخدام السكريبت الملاءمة للمنحنى الذي يتم تنفيذه بواسطة بوابة الويب.
5. راجع ملفي الإخراج اللذين يحتويان على قيم مكررة، ونتائج مطبعة، ورسوم بيانية تمثيلية لقياسات المسح الطيفي والتشتت الديناميكي للضوء.
6. استخدم ملف الإخراج الثالث، الذي يحتوي على بيانات وصفية للاختبار والنتائج المطبعة، لإنشاء نتائج مختبرية جماعية في واجهة مستخدم قاعدة البيانات. حدد سمات التقارير وفقا لمتطلبات المجموعة الخاصة ورفع النتائج إلى قاعدة البيانات لتمكين الوصول على مستوى الشركة.

النتائج

يوضح الشكل 6 النتائج، والشكل التكميلي 3A يوضح مثال على درجة CS-SINS من عينة ممثلة من الخام والنقاء، والشكل التكميلي 3B يوضح تباين الإشارة من البئر إلى البئر عبر أيام مختلفة، والشكل التكميلي 4 يحتوي على نتائج عملية التحقق من صحة اللوحة، والشكل التكميلي 5 يصف حساب التطبيع لكلا قراءتي CS-SINS.

ومن المهم أن عينات تم جمعها بتركيزات تبلغ لا تقل عن 55 ميكروغرام/مل بعد الغسيل في هيستيدين 10 ملليمول، pH 6.0، لجدوى الاختبار، حيث أن هذا هو الحد الأدنى لتركيز المخزون (الحد الأدنى 6 ميكروغرام لكل عينة) وأنشأت معرفات فرعية جديدة. كان هناك في المجموع 70 عينة منقاة و20 عينة تعبير خام، كل منها يمثل أنواع العينات في نقاط تحقق مختلفة للتطوير (تم تنقية في مرحلة تحسين الرصاص ومواد خام منقاة من مرحلة تحديد الرصاص بخطوة أو خطوتين كما هو موضح في الشكل 1A). تم توليد المواد الخام من نظام تعبير الثدييات الآلي بالكامل، وهو منصة التعبير والتنقية البروتينية (PEPP؛ GNF، سان دييغو، كاليفورنيا، الولايات المتحدة الأمريكية). تم اشتقاق هذه الضوابط من مواد تجارية وتم التحقق منها سابقا على أنها تمتلك لزوجة قصوى أو دنيا مثل قيم اللزوجة، وkD-DLS، وقيم CS-SINS. يتم تخزين الأليكوات الجديدة عند -80°م، ويستخدم أليكوت جديد لكل اختبار.

تظهر الأشكال 6A,B متوسط درجات الطيف وDLS المرسوم حسب نوع العينة، وتعرض الرسوم البيانية الشريطية أشرطة الخطأ (الانحراف المعياري) مع رموز ألوان متطابقة. يتم حساب التطبيع بواسطة النص بقسمة الفرق بين العينة وقيم التحكم السالبة (محسوبة أقصى لامبدا حسب الإزاحة الطيفية أو متوسط Z، القطر الهيدروديناميكي بالنانومتر) على الفرق بين الضوابط (الشكل التكميلي 5). يوضح الشكل 6C الدرجات الطيفية مقابل درجات DLS، موضحا وجود ارتباط واضح بين الأساليب التحليلية. يعرض الجدول 1 المعرفات، وعناوين الآبار، ونوع العينة، ودرجات الطيف، ودرجات DLS مع انحرافاتها المعيارية للرجوع إليها. الحد الأدنى لخطر استقرار الغرويات (بغض النظر عن قراءة الطيف أو DLS) لIgG أحادي النوع هو أي قيمة موحدة هي 0.35 (موضحة بخط أخضر منقط في الشكل 6A,B)، 6/70 (باستثناء العينات المكررة) حصلت على مخاطر عالية، بينما 64/70 حصلت على تقييم منخفض للمادة المنقاة. من المهم أننا نتوقع أن يتجه الحد الأعلى للصيغ متعددة التخصصات. بالنسبة لعينات التعبير البدائية، حصلت 2 من 20 عينة على درجات عالية، بينما حصلت 18 من 20 على درجات منخفضة. من بين المواد المنقاء التي تم اختبارها هنا، تم أيضا فحص تعبير بدائي لدفعات الوالدين من مجموعة فرعية وأعطى نتائج مماثلة (موضحة في الشكل التكميلي 3A)، مما يشير إلى الطبيعة التمثيلية للاختبار عند التوسع (التنقية) للبروتينات المرشحة من دفعات مستقلة. على الرغم من تقييد حجم العينات، لوحظ أن الخطأ المعياري قد يتجه نحو ارتفاع في عينات PEPP الخام مقارنة بالعينات المنقاة. تضمن فائدة إجراء CS-SINS في المراحل المتأخرة إجراء تقييمات متعامدة باستخدام اختبارات تتطلب المزيد من البروتين للتحليل، مثل قياسات اللزوجة وkD-DLS، بينما تعالج فائدة إجراء CS-SINS في فحوصات التطور المبكرة مخاطر استقرار الغرويات بشكل استباقي، مما قد يؤثر على تجمع المرشحين الرئيسيين النهائيين (الشكل 1B). يمكن تأكيد المرشحين الحديين ذوي الخطأ العالي على أنهم مرتفعون أو منخفضون المخاطر من خلال الاختبارات اللاحقة.

نظرا لصغر حجم التحولات البلازمونية التي يتم اكتشافها، تم وصف قراءة بديلة لتعزيز الثقة في الاختبار، مما يوسع النطاق الديناميكي، وهو ما قد يكون مفيدا بشكل خاص في غياب قارئ ألواح عالي المستوى لاكتشاف التغيرات الدقيقة. تميز قراءة DLS بين تجمع الجسيمات النانوية والاعتماد على خصائص الجسيمات النانوية الطيفية؛ ومع ذلك، فإن كلا الوصفين لهما نطاقات خطأ معيارية متشابهة وهما صغيران مقارنة بقياساتهما. يبدو أن العينات الأكثر عرضة لقراءات الشاذة ستواجه خطأ أعلى (أو تكون "متعددة النمط" ولا تبلغ عن نتيجة بواسطة DLS)، لكن قيم CS-SINS ضمن نطاق عمل الاختبار لها توزيعات خطأ منخفضة. عند مقارنة قيم DLS بقيم الدرجات الطيفية، يكون توزيع الخطأ أكثر إحكاما لنتائج DLS المأخوذة من عينات خام مقارنة بالدرجات الطيفية؛ ومع ذلك، كان هذا يحدث فرقا فقط لمرشح واحد كان أقل من الحد الأدنى كدرجة DLS وليس كدرجة طيفية. قد يكون هذا مفيدا إذا كانت المختبرات توفر أدوات مختلفة.

لمعالجة موثوقية معالجة البيانات والطريقة نفسها تحديدا، تم تعديل أوقات المسح من البداية إلى النهاية لكل من القراءات للعناصر الإيجابية والسلبية في مجموعة البيانات أعلاه، بالإضافة إلى عدة ضوابط متوسطة ومنخفضة لتكون نقاط مرجعية وسيطة في بداية ونهاية لوحة 384 بئر. يوضح الشكل التكميلي 4 نتائج التحقق النهائي من اللوحة، مع وجود قيم مختلفة بشكل طفيف في الغالب عن العينات الموضوعة في البداية مقابل نهاية اللوحة (الشكل التكميلي 4A,B) وارتباطا عاليا بين قيمتي القراءة (الشكل التكميلي 4C). وأخيرا، تم حساب عامل Z ونسبة الرؤية المئوية للعناصر من المسح الطيفي ومجموعة بيانات DLS في الشكل 6. من البيانات المولدة للعناصر الضابطة والمعروضة هنا، تم تحديد أن قراءة المسح الطيفي لها عامل Z يبلغ 0.648، مع 0.019٪ CV للتحكم الإيجابي و0.012٪ للتحكم السلبي. بالنسبة لقراءة DLS، تم حساب عامل Z مقداره 0.998، مع 0.025٪ من ال CV للمجموعة الإيجابية و0.021٪ للمجموعة الضابطة السلبية. بشكل عام، تم حساب معامل الارتباط لسبيرمان بين قيم العينة في هذا الاختبار (الشكل 6C) ليكون إيجابيا بقوة عند 0.829. تمثل هذه القيم دقة وقابلية تكرار قوية لكلا نوعي القياس، وليس من المستغرب أن استراتيجية اكتشاف DLS الجديدة والمفيدة تحسن عامل Z، لكن المسح الطيفي يوفر نطاق فصل كاف لتسجيل نتائج موثوقة (Z > 0.5). من المهم ملاحظة أن درجة DLS هي قراءة متعامدة تجمع في نفس الوقت ضمن سير عمل CS-SINS، ولا تتطلب تحضير عينات إضافي. الفرق الأكبر في القيم لدرجات DLS الخام يفسر تحسن عامل Z، لكن "الدرجات" تفسر بنفس الطريقة لأنها تطبيع من القيم الخام. علاوة على ذلك، تلتقط قراءات DLS أحجام ثلاثية الأبعاد لتجمع الجسيمات النانوية مقابل المؤشرات غير المباشرة على القرب من الانزياح البلازموني والمعلومات الطيفية، مما قد يعزز فهمنا لديناميكيات اختبار CS-SINS. وبالنظر إلى الطبيعة المعتمدة على الألواح والأهمية الزمنية لاختبار HTP، هدفنا إلى زيادة موثوقية الاختبار باستخدام هذه الطرق.

الشكل 1: نموذج التطوير وجمع بيانات CS-SINS. (أ) يتم تصوير سير العمل النموذجي من حملة الاكتشاف إلى اختيار المرشح للأجسام المضادة متعددة الأنواع في هذا الرسم التخطيطي. تؤدي عملية الاكتشاف إلى مرشحين أحادية النوع للفرز، تليها التحقق من حزم البيانات المختلفة لتضييق نطاق النوعيات الأحادية المهمة قبل الدمج في صيغ متعددة النوع. يتم تكرار أو توسيع حزم البيانات لتضييق نطاق المرشحين الرئيسيين حتى يتم اختيار أفضل مرشح للتطوير. تجرى اختبارات منخفضة الإنتاجية في مسار العمل الحالي عندما يتم اختيار لوحة صغيرة من الجزيئات (صناديق بنفسجية). يمكن تنفيذ اختبارات HTP CS-SINS في كل مرحلة من مراحل المسار، مما يضيف بيانات قيمة ويحسن عملية الاختيار. (ب) يتم عرض النتيجة الافتراضية لخصائص الغرويات لأفضل 6 مرشحين لمسارين محتملين: اختيار المرشح الرئيسي مع اختبارات منخفضة الإنتاجية، واختيار المرشح الرئيسي باستخدام HTP CS-SINS. يتم تمثيل المرشحين الذين لديهم سلوك حل سلبي بشكل متوهج. في السيناريو الأول، يظهر نصف المرشحين الرئيسيين بناء على خصائص الارتباط المثلى من شاشات الاكتشاف سلوكا سيئا عالي التركيز. في السيناريو الثاني، تم تضمين مرشح واحد فقط ذو استقرار غروائي ضعيف إلى حد ما، لأن بيانات CS-SINS تم النظر فيها بالتوازي مع بيانات الربط في شاشات الاكتشاف المبكرة. في السيناريو الثاني، يكون تنوع المرشحين المحتملين المتاحين أعلى من السيناريو الأول. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 2: سير عمل اختبار SINS. تحضير وترافق جسيمات الذهب النانوية للذهب: (1) يتم تبادل الميكروفون الالتقاط mAb بقوة العزل إلى أسيتات بوتاسيوم 20 ملليمولار، بدرجة حموضة 4.3، وتخفيفه إلى 0.8 ملغ/مل. (2) تتركز جزيئات الذهب النانوية من المخزون. (3) يتم خلط بولي-إل-ليسين مع الالتقاط المتبادل عبر المخزن mAb. (4) يتم حضن جسيمات الذهب النانوية مع البولي-إل-ليسين والتقاط mAb، وتخلط بشكل جيد. (5) حضانة مركب CS-SINS طوال الليل في درجة حرارة الغرفة. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 3: سير عمل أتمتة المختبر. سير عمل أتمتة المختبرات: (1) يتم تجميع المواد والعينات لطريقة معالجة السوائل. يتم جمع العينات المحللة في هيستيدين 10 ملليمولار، pH 6، في أنابيب مصفوفة أو صفائح بئر 96. يتم تنسيق تركيزات العينات إلى ملف إدخال معالج سائل. يتم جمع جسيمات نانوية معقدة من الذهب CS-SINS مرتبطة لالتقاط mAb، وأركان معالجة السوائل الروبوتية، وأدوات بلاستيكية استعدادا لإعداد اختبار معالجة السوائل. (2) يتم تجهيز صفيحة الفحص على معالج السائل وحضانها لمدة 4 ساعات في درجة حرارة الغرفة. 3) عند علامة 4 ساعات، يتم جمع المسح الطيفي (القراءة 1) من آبار عينات تمتد لمدة 25 دقيقة؛ بعد علامة 4.5 ساعة، يجمع التشتت الديناميكي للضوء (القراءة 2) معلومات عن حجم كل مجموعة بئر أكثر انتظاما. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 4: برنامج معالج السوائل وإعداد اللوحة. (أ) عند بدء البرنامج وبعد تهيئة النظام، يفتح نافذة/تنبيه منفصل لاختيار ملف الإدخال الذي يحتوي على عناوين الآبار المخصصة وتركيزات العينات. يجب تحديد عدد العينات في كل مرة، لكن حجم 200 ميكرولتر (الحجم النهائي للكواشف المختلطة قبل ختم لوحة 384 بئر) يبقى كما هو. (B) بعد النقر على متابعة من النافذة السابقة في (A)، ستظهر هذه النافذة الثانية لتأكيد التفسيرات من ملف الإدخال على اليسار والقيم على اليمين. (ج) بعد تأكيد التفسيرات من (B)، تظهر هذه النافذة الثالثة مع مربع حوار يتحقق مرتين من الرياضيات لتركيز العينة للتطبيع (حجم 100 ميكرولتر) إلى صفيحة البئر العميقة النهائية (حجم 200 ميكرولتر). (د) يأتي هذا التخطيط من عرض محرر الطرق لوحدة برنامج معالج السائل. على اليسار، تحمل أطراف قياسية بسعة 300 ميكرولتر، وفي وسط المسرح، تم تحميل صندوق واحد بسعة 50 ميكرولتر، و3 صناديق من رؤوس نحيفة بسعة 300 ميكرولتر، وهي متوافقة مع روبوتات مناولة السوائل. يتم تحميل مخزن مؤقت في المقدمة ب 10 ملليمولار هيستيدين، بدرجة حموضة 6 (المخزن الذي تم تحليل العينات إليه). يتم تقسيم الجسيمات النانوية الذهبية بالتساوي إلى أنبوبين من الطرد المركزي الدقيق ويتم تحميلها، غير مغبوطة، في الجزء الخلفي من رف الأنابيب على اليمين. يتم تحميل لوحة المصفوفة مع أنابيب العينة في الجزء الخلفي من الحامل في العمود 10. بعد العينات، يتم الإشارة إلى لوحة التطبيع (1)، ولوحة البئر العميقة ذات العينة 11.1 ميكروغرام/مل (2)، وصفيحة بئر بعمق 200 ميكرولتر للعينة المجمعة والجسيمات النانوية (3)، ولوح بئر 384 (4). (ه) يوضح تخطيط سطح معالجة السائل استرجاع الأطراف وتوزيع العينات في الوقت الحقيقي ويحدد الآبار مع تقدم كل خطوة. هنا، جميع العينات (صورة 96 بئر في خلف الحامل^{في العمود} الثالث) رمادية وكذلك لوحة التطبيع اللاحقة، مما يشير إلى أن العينات أضيفت إلى لوحة التطبيع من ألواح المصفوفة المصدرية. باللون الأخضر، نظهر رأس القنوات الثمانية بعد سحب المخزن من الحوض وتصرفه في العمود الأول من لوحة التطبيع أثناء الخلط. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 5: مخطط معالجة البيانات. نظام معالجة البيانات: (1) يتم إرسال ملفات البيانات الخام إلى خادم داخلي. (2) تقرأ ملفات البيانات وتعالج بواسطة سكريبت مخصص لضبط ملاءمة منحنيات المسوحات الطيفية، وحساب الحد الأقصى لامبدا لتكرارات CS-SINS، والتحقق من السكان المتعددة الوسائط بواسطة DLS. (3) يتم تجميع البيانات حسب النسخ المكررة، ثم يتم تسويتها وتطبيعها لاحقا إلى ضوابط محددة؛ يتم الحصول على خرائط اللوحات المطابقة في بوابة قاعدة البيانات لربط النتائج. (4) يتم تنظيم جميع البيانات في قالب جاهز للرفع إلى قاعدة البيانات، ويتم إنشاء الرسوم البيانية تلقائيا لتقارير ELN. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 6: بيانات ممثلة من القراءة 1 و2. (أ) تم رسم درجات الإزاحة الطيفية المطبعة بواسطة معرف PPB لعينات تعبير نقية وخامة، وعينات التحكم حيث تم الإشارة إليها وفصلها بخط عمودي منقط، في رسم بياني شريطي لتحديد توزيع شريط الخطأ بين أنواع العينات. يشير الخط الأحمر الصلب إلى الحد الأعلى للاختبار، والذي يتوافق مع الضابط الموجب، بينما يحدد الخط الأخضر المنقط قيمة القطع لملف جزيء منخفض المخاطر ل CS-SINS. (ب) تم رسم درجات DLS المطبعة بواسطة معرف PPB لعينات تعبير نقية وخامة، وعينات التحكم، حيث تم تحديد ذلك وفصلها بخط منقط، في رسم بياني شريطي لتحديد توزيع شريط الخطأ بين أنواع العينات. بعض القيم مفقودة (^{مثل القيمة الثانية} في اللون الأزرق الفاتح مع درجة أعلى من المتوسط في (A) بسبب الفحوصات متعددة الوسائط من مخرجات DLS، والتي حددتها بوابة الويب لبرنامج السكريبتات غير صالحة. يشير الخط الأحمر الصلب إلى الحد الأعلى للاختبار، والذي يتوافق مع الضابط الموجب، بينما يحدد الخط الأخضر المنقط قيمة القطع لملف جزيء منخفض المخاطر ل CS-SINS. (ج) تم مقارنة الدرجات المتوسطة والمعيارية لقيم الإزاحة الطيفية وDLS بواسطة رسم نقطي الترابط، كما هو موضح (درجات الإزاحة الطيفية تتوافق مع المحور Y ودرجات DLS تتوافق مع المحور X). يتم تنسيق رمز الألوان مع درجات DLS فقط. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الجدول 1. درجات استقرار الغماء لعينات الأجسام المضادة تم تحديدها بواسطة CS-SINS. يلخص الجدول معرفات العينات، وعناوين الآبار، وتصنيفات العينات، ودرجات الطيف المطبعة، ودرجات تشتت الضوء الديناميكي (DLS) التي تم الحصول عليها من اختبار CS-SINS. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.

الشكل الإضافي 1: PLL حسن استقرار AuNP في 10 مللي مول. مخزن مؤثره، pH 6، ل CS-SINS. يصور هذا الشكل التراكب القريب لجهاز التحكم السلبي mAb المرتبط بمركب CS-SINS المغطى بPLL والتحكم المؤقت فقط، على عكس الجسيمات النانوية الذهبية غير المطلية التي تحتوي على mAb أو المخزن السالب فقط، والتي لها قمم في نطاقات مختلفة تماما. موضحة باللون الأزرق هي المسوحات الطيفية التزايدية (المأخوذة بزيادات 1 نانومتر عند نقطة زمنية 4 ساعات) لAuNP مترافق حضن ب 10 مللي مول. المخزن المؤقت الخاص به مغطاة بخرزات متقاربة تم حضانها مع الضابط السلبي (PPB-117487) في غياب حضانة ما قبل حضانة بولي-إل-ليسين. تظهر باللون الأحمر الفحوصات الطيفية التزايدية (المأخوذة بزيادات 1 نانومتر عند نقطة زمنية 4 ساعات) لAuNP المترافقة الحضانة ب 10 مللي مول. المخزن المؤقت الخاص به مغطاة بخرزات مترافقة تم حضنها مع التحكم السالب (PPB-117487) بعد الحضانة المسبق لبولي-إل-ليسين. الحد الأقصى المحسوب لامبدا لكلا التحكمين السلبيين في وجود PLL متقارب. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الشكل الإضافي 2: إعدادات DLS واختيار ألواح البئر لقارئ الألواح DLS. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الشكل الإضافي 3: درجات CS-SINS من عضلات البطن المعبر عنها في PEPP مقابل التنقيي في المسار النهائي. (أ) تم رسم درجات الإزاحة الطيفية المطبعة بواسطة معرف البئر واللوحة لعينات PEPP (مثلا، A1PL1 = بئر A1 من اللوحة 1) التي تعبر عن Ab64 ومفصولة بخط عمودي منقط عن درجات الانزاحة الطيفية الموحدة أو DLS من الانحراف الطيفي المنقي في الأسفل في مخطط الشريط لتحديد توزيع شريط الخطأ (الانحراف المعياري) بين أنواع العينات. الخط المنقط الأخضر يحدد قيمة القطع لملف جزيء منخفض المخاطر ل CS-SINS. (ب) يتم رسم إجمالي AUC والتوزيع عبر اللوحة لجميع العينات في التجارب التي أجريت في (A) هنا (مرمز بالألوان للتجارب المقابلة). يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الشكل الإضافي 4: التحقق من صحة لوحة 384 بئر من الطرف إلى الطرف للضوابط. (أ) يتم رسم وعرض الدرجات الطيفية المتوسطة والمموضعة للعينات في الأعمدة الأولى من صفيحة البئر 384 باللون الأحمر، بينما تعرض القيم المكررة في نهاية صفيحة البئر 384 باللون الأخضر الليموني. قيم النسخ متجاورة، تتراوح من التحكم الموجب (المشار إليه بعلامة الزائد بجانب معرف PPB) إلى التحكم السلبي (المشار إليه بعلامة سالبة بجانب معرف PPB). القيمة الخاصة بالتحكم في المخزن المؤقت التي أعدها برنامج معالج السائل (مستقلة عن موجه العينة المدخل) تعرض بنمط مربع. (ب) يتم رسم وعرض درجات DLS المتوسطة والمطبعة للعينات في الأعمدة الأولى من صفيحة 384 بئر باللون الأحمر، بينما تعرض القيم المكررة في نهاية صفيحة البئر 384 باللون الأخضر الليموني. قيم النسخ متجاورة، تتراوح من التحكم الموجب (المشار إليه بعلامة الزائد بجانب معرف PPB) إلى التحكم السلبي (المشار إليه بعلامة سالبة بجانب معرف PPB). لا توجد قيمة تحكم في المخزن المؤقت لقراءة DLS (بسبب القراءات متعددة الوسائط). (ج) يتم رسم الدرجات الطيفية المتوسطة والمطبعة مقابل درجات DLS في رسم نقطي ارتباطي للعينات التي تتراوح من القراءات في الأعمدة الأولى للوحة 384 بئر إلى نهاية صفيحة 384 بئر. ترميز الألوان لنقاط البيانات يتوافق مباشرة مع متوسط درجات المسح الطيفي المطبع. نظرا لعدم وجود قيمة تحكم مخزن مؤقت لقراءة DLS (بسبب القراءات متعددة الوسائط)، يتم مقارنة الستة فقط في النسخة المكررة من كلا القراءتين في هذا الرسم البياني. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الشكل التكميلي 5: الحسابات الخاصة بتطبيع درجات الطيف أو درجات DLS لتمكين التقارير والإشارة الشاملة بين المستخدمين والأيام. تضبط قيم التحكم الإيجابية على قيمة 1، بينما تضبط القيم السلبية على قيمة 0، وترتبط الدرجات العالية بسلوك غروي سيء. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

المناقشة

يمثل هذا البروتوكول عدة تعديلات رئيسية عن طريقة^{CS-SINS الأصلية رقم 16}. ومن المهم أن نسبة PLL:IgG المحسنة ومخزن الهيستيدين تم الحفاظ عليها منذ الدراسة الأصلية¹⁶. ومن الجدير بالذكر أن الاختبار تم تكييفه لمنصة معالجة السوائل الروبوتية لتمكين معالجة HTP (حتى 352 عينة في يوم واحد مقابل ~20)، مما يقلل من وقت التجربة ويحسن قابلية التكرار من خلال التعامل الآلي مع السوائل. نظام الروبوتات متوافق مع الصيغ القائمة على اللوحات، بما في ذلك الختم في صيغ جديدة مثل لوحة 384 بئرا وأنواع مختلفة من أدوات المختبر. يمكن للبرامج العمل بشكل مستقل، ويوفر سير العمل من البداية إلى النهاية قراءة عالية الحجم مع قابلية إعادة إنتاج محسنة في بيئة محدودة للعينات. كما تم دمج قياسات DLS كقراءة متعامدة للانزاحة الطيفية بعامل Z أكثر مثالية من تفسيرات الإزاحة الطيفية (0.998 مقابل 0.648)، وهو ما يثبت قيمته بشكل خاص للعينات ذات الدرجات الطيفية الحدية أو الانحرافات القياسية العالية، ويصف تفسير إزاحة البلازمون لتعزيز النطاق الديناميكي الظاهر من مخرجات قارئ اللوحة فقط. يقترح أن المختبرات التي لا تتوفر فيها قارئات لوحات متعددة الأنماط عالية المستوى يمكنها استخدام DLS لأداء CS-SINS بشكل موثوق. لمعالجة التغيرات المحتملة المعتمدة على الوقت عبر صفيحة تحتوي على 384 بئرا، تم إجراء تحقق مكثف لللوحة (الشكل التكميلي 4) عن طريق وضع عناصر التحكم في بداية ونهاية الصفيحة، مما يؤكد تأثيرات زمن المسح البسيطة. بالإضافة إلى ذلك، ثبت أن عينات PEPP الخام تعطي نتائج مماثلة للمواد المنقاء (الشكل 6، الشكل التكميلي 3A)، مما يوسع تطبيق الطريقة على مراحل الاكتشاف السابقة التي لا يتوفر فيها البروتين المنقى، وهو ما لم يتم الإبلاغ عنه سابقا. تشير البيانات في الشكل التكميلي 3 إلى موثوقية العينة بين المصادر، لكنها تشير أيضا إلى تباين طفيف في الاختبارات من يوم لآخر لأن البيانات جمعت وتم تطبيعها من مجموعات بيانات مختلفة. وبشكل أكثر تحديدا، يوضح الشكل التكميلي 3B المساحة الكلية تحت المنحنى لجميع الآبار من صفائح التجربة المعنية (مرمزة بالألوان لتطابق مع لوحة نفس التجربة في الشكل التكميلي 3A) لإظهار التباين المتوقع، ولكن في الأيام المختلفة، مع تحضيرات خرزات مميزة. في مرحلة الاكتشاف المبكرة، لا تكون طرق مثل kD-DLS والأساليب القائمة على الأعمدة (SMAC، CIC) غير قابلة للتنفيذ بسبب متطلبات استهلاك العينة الأعلى وعدم القدرة على معالجة المواد الخام 12,13,24,25,26,27; يتيح CS-SINS بشكل فريد فحص استقرار الغرويات في هذه المرحلة مع 6 ميكروغرام فقط لكل عينة، ويمكن تنقيطها بخطوة واحدة. وأخيرا، تم تحديث سكريبت ملاءمة المنحنى لاستيعاب الضبط الدقيق للتغييرات القصوى الطفيفة في لامبدا ولتمكين تحسين التعامل مع الملفات وتقارير البيانات المؤتمتة إلى قواعد البيانات الداخلية.

تشمل السيناريوهات الشائعة لحل المشكلة: (1) الانحرافات القياسية العالية في درجات الطيف أو DLS، وغالبا ما تشير إلى خلط غير كامل للجسيمات النانوية (الخطوة 7.6) أو تجميع العينات - وفي مثل هذه الحالات، ينصح بإجراء فحص مراقبة جودة مع العينات المحللة بواسطة DLS لضمان السلامة بعد الغسيل الكلوي والاعتماد الافتراضي على الدرجات الطيفية كقراءة قياسية؛ (2) توزيعات DLS متعددة الوسائط أو قراءات DLS فاشلة، عادة بسبب تجميع عينات موجود مسبقا أو تلوث الغبار - يمكن أن يخفف الترشيح عبر مرشحات 0.22 ميكرومتر قبل الغسيل الكلوي من ذلك؛ (3) الفروقات بين درجات الطيف وDLS، والتي تعزى عادة إلى قياسات DLS منحرفة (على الأرجح بسبب التعدد العالي العالي الذي يظهر ضمن النطاق الطبيعي-العالي بواسطة الدرجة الطيفية)؛ (4) قيم تحكم إيجابية غير متسقة، عادة ما تنتج عن تخزين غير صحيح للجسيمات النانوية أو تدهور التقاط mAb؛ يجب استخدام أليكوات جديدة مخزنة عند -80 درجة مئوية لكل اختبار (لا يتم تخزينها عند 4 °م لأكثر من بضعة أيام).

تشمل بعض قيود الاختبار الحاجة إلى وقت لتحليل العينات بشكل كامل وتحضير الجسيمات النانوية المترافقة شبه يدويا في اليوم السابق للاختبار؛ ومع ذلك، فإن زمن الغسيل الكلوي مكافئ بغض النظر عن حجم مجموعة العينة. فيما يتعلق بمخاطر انسداد الرؤوس، تراقب رؤوس معالجة السائل تغيرات الضغط أثناء الشفط، وتظهر الأخطاء ذات الصلة أثناء التشغيل. خلال مرحلة تطوير الطريقة، قمنا بفحص ملفات السجلات (واستمررنا في الخدمة) للتأكد من أن الأحجام المتوقعة يتم حسابها بواسطة السكريبت. تم اختبار وظائف التنقل لتحضيرات الخرزات المركزة ولا تتوقع مشاكل. نعترف بالطبيعة الحساسة للوقت للاختبار، والطبيعة التي يهيمن عليها Fab للتقييم، ودوره كاختبار بديل دون قياس سلوكيات الغروية مثل اللزوجة والتعتيم بشكل مباشر. ومع ذلك، فإن هذا التكيف يمكن من توصيف مجموعات بيانات أكبر بكفاءة في وقت مبكر من عملية اكتشاف الدواء، مما يعد أداة فحص قوية حيث لم تكن موجودة من قبل.

تتطلب عدة خطوات حاسمة في هذا البروتوكول اهتماما دقيقا لضمان نتائج قابلة للتكرار. أولا، الضبط الدقيق لدرجة الحموضة أثناء تحضير المخزن المؤقت (الخطوات 1.1.1 و1.2.1) أمر ضروري، حيث يمكن أن تؤثر الانحرافات التي تتجاوز وحدات الرقم الهيدروجيني ±0.1 على استقرار الجسيمات النانوية وكفاءة التقاط الأجسام المضادة. يضمن المخزن المنخفض للرقم الهيدروجيني المستخدم لتحضير الأجسام المضادة الالتقاط الاقتران الأمثل، وتم تحسين ظروف العزل المحددة لتثبيت الشحنة والتوافق الواسع للأجسام المضادة (عادة في سياق التركيبة). يوفر مخزن الهيستيدين pH 6.0 بقيمة 10 مللي مولار تفاعلات كهروستاتيكية مثالية مع الحفاظ على استقرار البروتين. ثانيا، الغسيل الكامل مع إزالة الملح بالكامل (الخطوة 2.3) أمر بالغ الأهمية؛ يمكن أن يتداخل الغسيل غير الكامل مع التفاعلات الكهروستاتيكية أثناء تجميع الجسيمات النانوية. ثالثا، يجب تنفيذ خطوة تركيز الجسيمات النانوية الذهبية (خطوات البروتوكول 5.1–5.3) بحذر لتجنب إزعاج الحبيبة، حيث تؤثر تركيزات الجسيمات النانوية غير المتسقة مباشرة على حساسية الاختبار. رابعا، نسبة PLL:التقاط mAb البالغة 0.03 (الخطوة 4.1) محسنة لتحقيق أقصى تغطية سطحية مع الحفاظ على نافذة إزاحة بلازمونية كافية، كما تم إثبات¹⁶ سابقا. فيما يتعلق بديناميكيات التعامل مع السائل، تم استخدام رؤوس استشعار السائل لإجراء عمليات تطبيع وخلط الألواح حتى يتم إدخال جسيمات الذهب النانوية التي لا تقاس بشكل موثوق في المحلول (وبالتالي تضبط أحجام التوزيع على الكميات القياسية). يسمح الاستشعار للسائل في الأعلى بتحديد مشاكل عدم محاذاة الألواح أو العينات المفقودة من قبل المشغل، بينما خطوة ختم 384 بئر ستحدد مشاكل محاذاة Z. أخيرا، الالتزام الصارم بتوقيت الحضانة 4-h (خطوات البروتوكول 7.10–7.12) والقراءة المستمرة لللوحة من البداية إلى النهاية (بغض النظر عن وجود صفيحة غير مكتملة) أمر بالغ الأهمية، حيث أن التحول البلازموني وتجميع الجسيمات النانوية هما ظاهرتان تعتمد على الزمن؛ التأخيرات أو القراءات المبكرة قد تؤدي إلى نتائج CS-SINS غير دقيقة، بينما تضمن قراءة اللوحة الكاملة اتساق الدرجات عبر الأيام في صيغة HTP.

مع تزايد دراسة استقرار الأجسام المضادة متعددة الأنواع الغروية، فإن مجموعات البيانات الكبيرة التي توفرها اختبارات HTP الفيزيائية الحيوية مثل CS-SINS لديها القدرة على تغذية نماذج AI/ML لفهم أفضل للتأثيرات التوافقية على استقرار الجزيئات. أظهرت الدراسات أنه مع زيادة تنوع التسلسلات، تزداد الحاجة إلى مجموعات بيانات أكبر^{لتحسين دقة} نتائج الذكاء الاصطناعي وتعلم الآلة^. قد تتغير الخصائص والوصفات الجزيئية للأنواع الأحادية عند إعادة التنسيق إلى ثنائية النوعية أو ثلاثية النوع، مع الأخذ في الاعتبار توزيع وتوازن شحنة الجزيئات بأكملها بدلا من الاعتبارات الخاصة بالتسلسل أو النقوش لخصائص مثل ضعف التحلل الكيميائي^{17، 18، 19، 20، 21، 22}. ومن الجدير بالذكر أن الميزات الهيكلية مثل البقع الكهروستاتيكية المتوقعة، والكراهية للماء، ومساحة السطح المتاحة للمذيبات يمكن أن تحسن التنبؤات بالتجمع والاستقرار بغض النظر عن الخصائص الخاصة بالسلسلة، مما يجعل عدة مجموعات بيانات أصغر متوافقة مع تحضير التنبؤ 17,18,19,20,21,22 . بساطة درجة CS-SINS كمرجع للذروة التمثيلية للملف الفيزيائي الحيوي للجزيء تجعل الاختبار مناسبا لتدريب نماذج الذكاء الاصطناعي وتعلم الآلة.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
CLEARSEAL FILM 100PKCLEARSEAL	Fisher Scientific	500214
CO-RE II (50 μL Conductive Tips, 300 μL Conductive Tips, 300 µL Slim Conductive Tips)	Hamilton Company	235966, 235902, 235806
Eppendorf Tubes Snap Cap (5.0 mL, Microtube)	Eppendorf	30119401
Falcon Conical Centrifuge Tubes (15 mL)	Thermo Fisher Scientific	Falcon 352196
Goat antihuman Fcγ-specific antibody	Jackson ImmunoResearch Laboratories	109-005-008
Gold nanoparticles (20 nm)	Ted Pella Inc.	157051
Greiner Bio-One 384-well μClear Bottom Polystyrene Microplates – (SS & DLS assay plates)	Fisher Scientific	07-000-057
Greiner Bio-One MASTERBLOCK 96 Deep Well Conical Bottom 2 mL Storage Plate – (mastermix and reagent mixing plates)	Fisher Scientific	07-000-122
Hard-Shell PCR Plates normalization (96-Well, low profile, thin wall, skirted, white/clear HSP9601)	Bio-Rad	HSP9601	URL: https://www.bio-rad.com/en-us/sku/HSP9601-hard-shell-96-well-pcr-plates-low-profile-thin-wall-skirted-white-clear?ID=HSP9601
Histidine hydrochloride buffer sample (10 mM, pH = 6.0, sample and assay buffer)	Sigma	H8125; H6034	Prepare final concentration of 5 mM per reagent in ultra-pure water, adjust pH to 6.0, adjust final volume with ultra-pure water, and filter with 0.22 μm filter
Matrix ScrewTop Tubes sample (500 μL)	Thermo Fisher Scientific	3744
MD100 or MD300 Xpress Mini Dialyzer (Xpress Micro Dialyzer, Scienova, 6-8 kDa, 96 pcs. in deep well plate (12 cartridges), sealing sheet) and dialysis reservoir/box (low volume dialysis cassettes)	Vivaproducts, Inc.	40789, 40076
Microcentrifuge tubes pure polypropylene (1.5 mL)	USA Scientific	1615-5500
Nalgene Disposable Polypropylene Robotic Reservoirs – (buffer trough)	Thermo Fisher Scientific	1200-2300
Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Units with PES Membranes	Thermo Fisher Scientific	567-0020
Poly-L-lysine, >70,000 MW	MP Biomedicals	219454405	Prepare a 5 mg/mL stock solution in ultra-pure water
Positive and negative Controls (1 mg/mL dialyzed into 10 mM Histidine, pH 6)	Internally-produced commercial antibodies	N/A	~2 nm spectral shift and DLS size of 250-300 nm for positive control; negligible spectral shift and DLS size comparable to buffer only control
Potassium acetate buffer capture (20 mM, pH = 4.3, mAb conjugation buffer)	Fisher Scientific	P171-500	Prepare final concentration of 10 mM reagent in ultra-pure water, adjust pH to 4.3 with acetic acid, adjust final volume with ultra-pure water, and filter with 0.22 μm filter
Zeba desalting columns (2 mL, 5 mL, or 10 mL)	Thermo Fisher Scientific	PI-89889; 89891; 89893