Method Article

تحليل بنية RNA مقارنة للنسخ الناشئة والناضجة في Saccharomyces cerevisiae

DOI:

10.3791/69945

⸱

February 27th, 2026

 ,  ,  , 
1Molecular Biophysics and Biochemistry, Yale University, 2RNA Therapeutics Institute, UMass Chan Medical School

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لوحظ الهيكل الثانوي للحمض النووي الريبي بشكل رئيسي في الحمض النووي الريبي الناضج باستخدام طرق فحص البنية. يوحد تسلسل تتبع البنية المطابقة (CoSTseq) التسلسل النووي المستمر، الذي استخدم لدراسة موقع البوليميراز على الحمض النووي الريبي الناشئ، مع استكشاف البنية. وبالتالي، يمكن CoSTseq من مراقبة البنية الثانوية للحمض النووي الريبي في الحمض النووي الريبي تحت النسخ النشط.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أثناء النسخ، يبدأ الحمض النووي الريبي الناشئ في اقتران القواعد عند خروجه من بوليميراز الحمض النووي الريبي (Pols). تسمح هذه الاقتران القاعدي بتكوين هياكل RNA تؤثر بشكل حاسم على التعبير الجيني على مستوى معالجة RNA وترجمته واستقراره. الطرق المعتمدة لدراسة البنية الثانوية للحمض النووي الريبي تقتصر على النسخ الناضجة، بينما لا يعرف الكثير عن حالات الطي. علاوة على ذلك، فإن انخفاض الوفرة نسبيا (< 1٪) والطبيعة المؤقتة للحمض النووي الريبي الناشئ يعقدان عزله وتوصيفه. تتبع البنية المطابقة للنسخ (CoSTseq) يستفيد من التسلسل النسخي مع استكشاف البيوتين-NTP وثنائي ميثيل كبريتات (DMS) للحصول على موقع Pol وحالة اقتران القاعدة في النصوص الناشئة في الوقت نفسه. في Saccharomyces cerevisiae، تعطي CoSTseq التسلسل والمعلومات البنيوية بالقرب من الطرف الثلاثي للحمض النووي الريبي الناشئ التي تم نسخها بواسطة أي من البولات الثلاثة للحمض النووي الريبي. خلال التشغيل النسخي، يقوم البيوتين-NTP المدمج في الموقع النشط بإيقاف بولس فعليا. ثم العلاج بميثيلات DMS غير مرتبطة بنيوكليوتيدات A وC وU. تمكن عمليات إثراء البيوتين لاحقا وتخليق cDNA باستخدام نسخ عكسي من القالب من التسلسل المزدوج وحساب تفاعلات DMS كدالة لموقع Pol. يتم تنفيذ CoSTseq بسهولة جنبا إلى جنب مع فحص DMS (DMS-MaPseq)، مما يتيح التقاط نص النضج المطوي أيضا. هنا، يتم تقديم بروتوكول مفصل لنظام CoSTseq وDMS-MaPseq المتوازي، بما في ذلك التشغيل النسخي، وتحضير المكتبة، وتحليل البيانات.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يمكن للحمض النووي الريبي أن يطوي إلى هياكل ثانوية وثالثية بسبب تزاوج القواعد داخل جزيئات الحمض النووي الريبي، ويمكن أن تتأثر هذه البنى أيضا ببروتينات تعمل كمرافق لتوجيه طي الحمض النوويالريبي 1. يمكن أن تكون بنية الحمض النووي الريبي شديدة الديناميكية، حيث يمكن للحمض النووي الخلوي أن يتوافق مع مجموعة من الهياكل التي تحددها المشهد الديناميكي الحراري لتوليد مجموعات من تشكيلات الحمض النووي الريبيالمحتملة 2. التغيرات الديناميكية في التكوين لديها القدرة على التأثير على تنظيم وتعبير الجينات 3,4. وعلى العكس، يمكن أن يتبنى RNA هياكل مفضلة للغاية مرتبطة ارتباطا وثيقا بوظيفته، مثل tRNAs، وRNA نووي صغير، وrRNA. بينما تبرز هذه الأمثلة الحمض النووي الريبي الناضج ذو الأدوار التنظيمية القوية، غالبا ما تتزامن خطوات معالجة الحمض النووي الريبي حقيقيات النواة مع النسخ، بما في ذلك الربط قبل ال mRNA، والانقسام في الأطراف الثلاثية، وتعديل الحمض الريبي. وبالمثل، يمكن أن يحدث طي الحمض النووي الريبي قبل نضج النسخ، كما نوقش في مكان آخر5.

بينما يمكن لتسلسل الحمض النووي الريبي أن يشفر البنية الثانوية، فإن التحديد الدقيق غالبا ما يتطلب التحقق التجريبي في المختبر أو في الجسم الحي. لقد مهد ظهور تقنيات تعديل كيميائي خاصة بالبنية مثل DMS-MaPseq (التنميط الطفري ثنائي ميثيل كبريتات مع التسلسل) الطريق لتحديد البنية الثانوية للحمض النووي الريبي الخلوي من الخلايا الحية6. يتم إدخال DMS إلى الخلايا وبشكل خاص يثيل وجوه الاقتران القاعدي واتسون-كريك من الأدينوسين، والسيتوزين، وبدرجة أقل يوريدين، والتي لا يمكن الوصول إليها إلا عند عدم الاقتران. بعد التعديل بواسطة DMS، يمكن استخدام نسخ عكسي عالي الدقة وعالي المعالجة، مثل إنزيم Intron Reverse Transcriptase (TGIRT)7 من المجموعة الثانية الثابت حراريا (TGIRT)7، لإعادة ترميز القواعد المعدلة كطفرات في المكتبة النهائية المعدة ل cDNA. يمكن بعد ذلك استخدام هذه الطفرات لاستنتاج مدى وصول الحمض النووي الريبي على مستوى النيوكليوتيدات. على الرغم من كونها تقنية قوية، إلا أن DMS-MaPseq والطرق المرتبطة بها استخدمت بشكل أساسي لدراسة الحمض النووي الريبي الناضج المطوي بالكامل6.

تم تطوير عدة طرق لدراسة تنظيم ومعالجة الحمض النووي الريبي الناشئ. تم تطوير تسلسل التسلسل الجاري العالمي (GROseq) لتجاوز قيود تسلسل RNA، الذي يتيح القياس المستقر لمستويات RNA في الخلايا وبالتالي يوفر معلومات تتغير عبر عمليات النسخ ومعالجة الحمض النووي الريبي وعمليات التحلل التي تؤثر على مستويات RNA. استخدم GROseq البروموريدين في التدفق النووي، حيث يمكن لبوليميراز RNA (Pol) إضافة نوكليوتيدات إلى RNA الناشئ عند دقة عشرات القواعد8. تم بناء تسلسل التشغيل الدقيق (PROseq) على هذه المنهجية لربط بوليس RNA على RNA الناشئ بدقة زوج الأساس باستخدام البيوتين-NTPs. هنا، يضاف NTP بيوتينيل حيث تم اكتشاف Pol آخر مرة في نهاية 3' من RNA9 المصنوعة حديثا.

مؤخرا، طور شيرفن وآخرون واستخدموا تتبع البنية الناسخ المشتركة (CoSTseq)، الذي يستفيد ويتكييف من فحص البيوتين وفحص DMS لتمكين تحديد بنية الحمض النووي الريبي للنسخ الناشئة في S. cerevisiae10. تمكن CoSTseq من تحديد البنية الثانوية للحمض النووي الريبي أثناء النسخ النشط؛ يوضح هذا البروتوكول كيف يتم دمج التشغيلات النووية مع استكشاف DMS خلال تجارب CoSTseq. نظرا لأن CoSTseq يتطلب التعامل الدقيق أثناء تحضير العينة، بالإضافة إلى اهتمام دقيق بجودة البيانات عند المضي قدما في تحليل CoSTseq، فإن هذا البروتوكول يوضح أفضل الممارسات لإنشاء مكتبات مناسبة لتسلسل النهايات المزدوجة على منصة Illumina. يوفر بروتوكول CoSTseq في الوقت نفسه RNA ناضجا وناضجا، ويمكن تحليل الأخير كمجموعة بيانات DMS-MaPseq لتوفير مقارنة دقيقة بين الحمض النووي الريبي الناشئ والناضج (الشكل 1). تجريبيا، يتطلب الأمر الوصول إلى الكواشف اللازمة للحفاظ على زراعة الخميرة وإجراء الفحص النووي والاستكشاف عبر DMS، كما هو موضح في البروتوكول أدناه. يعد عائد الحمض النووي الريبي الناشئ أمرا بالغ الأهمية لنجاح تحضير وتحليل البيانات في مكتبة CoSTseq؛ لذا، فإن ظروف النمو التي تخلقها الحاضنات ووسائل النمو المناسبة ضرورية لضمان كمية كافية من المواد الأولية. وأخيرا، لإجراء تحليل حسابي لبيانات CoSTseq، فإن الوصول إلى عنقود الحوسبة عالية الأداء (HPC) هو الأبد.

figure-introduction-1
الشكل 1: نظرة عامة على تحضير مكتبة CoSTseq وDMS-MaPseq من نفس العينة البيولوجية. (أ) تمكين نفاذية جدار خلية الخميرة وغشاء النواة باستخدام الساركوسيل من دمج البيوتين-NTP في الطرف الثالث للحمض النووي الريبي الناشئ أثناء تفاعل نووي. (B) ميثيلات DMS تجمع بقايا A و C غير المتوافقة (أحيانا U) على RNA الناشئ والناضج في الخلية المنفاذة، ويتم الحصول على RNA الكلي عن طريق استخراج الفينول/الكلوروفورم. ثم يتم تنقية الحمض النووي الريبي الناشئ من إجمالي الحمض النووي الريبي بواسطة خرزات مغناطيسية متقاربة بالستربتافيدين؛ استخراج التريزول يطلق الحمض النووي الريبي الناشئ من الخرز. بالتوازي، يمكن ترسيب الفائق الخرز الذي يحتوي على mRNA متعدد الأدينيلة ب EtOH؛ من هذه المادة، يمكن عزل mRNA عن طريق سحب خرزات أوليغو(dT). يتم تجزئة mRNA بولي A+ قبل إعداد المكتبة. (ج) يستخدم نسخ عكسي بتحويل القالب لتوليد cDNA منفصل من RNA ناشئ أو ناضج، يليه ربط محولات 5' و3' لإدخالN7 UMI وباركود (انظر الشكل 2 لتفاصيل CoSTseq). لاحظ أن خطوات النسخ العكسي DMS-MaPseq وCoSTseq ستستخدم محولات غير متجانسة مميزة مع تداخلات تكمل البيوتين-NTP المستخدمة في CoSTseq وN overouts المستخدمة في DMS-MaPseq. تستخدم دورات PCR الدنيا للتضخيم للحد من الانحياز في المكتبة، ويتم تطبيق اختيار الحجم لإزالة معضلات المحول. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ملاحظة: قبل البدء، تأكد من تجهيز جميع المخازن المؤقتة المذكورة في الجدول 1. يجب تحضير جميع المواد الكيميائية في ماء خال من النوكليز. يوصى بتعقيم المخازن في المرشح عند استخدام مواد كيميائية/كواشف غير جزيئية لتحضير المخازن. بالنسبة للأقسام من 1 إلى 4، جهز ما يلي مسبقا:

1. تحضير المواد والكواشف

  1. حضر محلول ساركوسيل بنسبة 10٪ (v/v) قبل يوم واحد على الأقل لإتاحة وقت كاف للذوبان الكامل. تعقيم المحلول المتجانس بالفلتر باستخدام مرشح بحجم 0.22 ميكرومتر. في يوم التجربة، استخدم محلول 10٪ ساركوسيل لصنع محلول ساركوسيل بنسبة 0.5٪، واتركه على الثلج حتى الاستخدام.
  2. أجهزة الطرد المركزي الفائقة قبل التبريد حتى 4 درجات مئوية. في غطاء البخار، اضبط الخلاط الحراري على 30 درجة مئوية وسخن مبدئيا بمقدار 2.5x من مخزن استكشاف الهيكل. سيتم استخدام هذا الخلط الحراري لاحقا للعلاج بنظام DMS.
  3. في غطاء البخار، اضبط كتلة الحرارة على 65 درجة مئوية وسخن 650 ميكرولتر من الفينول الحمضي: الكلوروفورم لكل تفاعل لاستخراج الحمض الريبي.
  4. امزج DTT مع مخزن النسخ 2.5x إلى تركيز نهائي 2 مللي مول. جهز محاليل التبريد والغسل حديثا وقم بتبريدها مسبقا للاستخدام الفوري بعد علاج DMS (انظر الجدول 1).
  5. أليكوت 40 ميكرولتر من 20٪ SDS في أنابيب لتحليل الخميرة قبل استخراج الحمض النووي الريبي. حضر محلول كلوريد الزنك (ZnCl2) بسعة 100 ملليمول وقم بتعقمه بالفلتر قبل الاستخدام.
  6. توليد سلالات خميرة حذف أو استنزاف أو دخول قد تكون مطلوبة لمعالجة أي أسئلة بحثية محددة حول اقتران قواعد RNA الناشئة مقارنة بسلالة الخميرة البرية من الخميرة المتفتحة. دائما قم بإحياء السلالات حديثا عن طريق وضع الخطوط على طبق أجار خميرة مناسب (مثل YPD، أو السقوط أو أطباق المضاد الحيوي). ابدأ زراعة سائلة من مستعمرة واحدة في اليوم الذي يسبق بدء التجربة. لمزيد من التعليمات حول نمو ومعالجة سلالات الخميرة، يرجى الرجوع إلى Schärfen وآخرون، 2025.

2. تحضير خلايا الخميرة لكوستسيك

  1. إعداد الزراعة المسبقة: ازرع سلالة S. cerevisiae BY4741 في 50 مل من وسط YPAD حتى تصل الخلايا إلى طور منتصف اللوغاريتيوم (كثافة بصرية (OD) عند 600 نانومتر = 0.6) عند 30 درجة مئوية مع اهتزاز عند 200 دورة في الدقيقة. إذا لزم الأمر، قم بتخفيف الزراعة إلى OD 0.2-0.3 ودع الخميرة تصل إلى 0.6 OD.
  2. جمع الخميرة: اجمع وقم بتدوير 1.8 يوم (~3 مل) من زراعة الخميرة بمقدار 2,500 × جرام لمدة 3 دقائق في جهاز طرد مركزي مبرد مسبقا (4 درجات مئوية). تخلص من المادة الفائقة في حاوية نفايات. غسل الحبيبات عن طريق إعادة تعليق 10 مل من محلول ملحي بارد مخزن بالفوسفات (PBS). قم بتدوير المحرك مرة أخرى عند 2500 × g لمدة 3 دقائق عند 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الفوقية واحتفظ بحبيبات الخميرة على الثلج.
  3. نفاذية خلايا الخميرة: أعد تعليق حبيبات الخميرة بعناية في 10 مل من الساركوسيل البارد 0.5٪. استخدم ماصة P1000 لإعادة تعليق الخلايا وتجنب تكوين فقاعات. حضن على الثلج لمدة 20 دقيقة لتعزيز النفاذية. قم بعمل خلايا الخميرة المنفاذة بحرارة 400 × جرام لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. أعد تعليق خلايا الخميرة المنفذة في 100 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكليز.

ملاحظة: على الرغم من أن وسم DMS لا يتطلب نفاذية جدار الخلية، إلا أن تفاعل التفاعل النووي يتطلب نفاذا لوصول النيوكليوتيدات البيوتينيلية إلى موقع النسخ. يتم تحقيق ذلك من خلال معالجة الساركوسيل، التي تنفث كل من جدار خلية الخميرة وغشاءها النووي. علاوة على ذلك، يسهل علاج الساركوسيل الاختبار الجاري من خلال منع أحداث بدء النسخ الجديدة وإزالة عوامل الإطالة السلبية من بول II والكروماتين11,12. تعامل مع العينات بلطف وحافظ على سرعة طرد مركزية منخفضة (400 × ج) لمنع تمزق الخلايا وتعزيز دمج البيوتين بنجاح في نسخ الناشئين الممدودة13.

3. الهجوم النووي واستكشاف DMS

ملاحظة: التفاعل النووي مع البيوتين-NTP يسبب عائقا استيريا يوقف بولينات RNA في موقعه النشط ويوفر مقبض بيوتين للتخصيب الانتقائي للRNA الناشئ. اعتمادا على الدقة المطلوبة، يمكن إجراء عملية تشغيل نووية باستخدام واحد أو اثنين أو جميع الريبونوكليوتيدات البيوتينيليةالأربعة 9. من أجل الكفاءة من حيث التكلفة، يستخدم سير العمل الموصوف هنا نيوكليوتيد واحد فقط بيوتينيل (أي البيوتين-CTP).

  1. إعداد تفاعل الهجوم النووي
    1. جهز محلول تشغيل مخزن النسخ 2.5x مع إضافة حديثة لمخزن DTT بسعة 5 مللي مول، ومخزن استكشاف هيكلي دافئ مسبقا 2.5x حتى 30 درجة مئوية (انظر الجدول 1).
    2. في أنبوب نظيف بسعة 2 مل، أضف 120 ميكرولتر من مخزن النسخ 2.5x، و3.75 ميكرولتر من 10 ملليمول ATP، و3.75 ميكرولتر من 10 ملليمول تيار النقل، و3.75 ميكرولتر من 10 مللي مولار UTP، و7.5 ميكرولتر من 1 مللي مولار بيو-CTP، و15 ميكرولتر من 10٪ ساركوسيل، ورفع الحجم إلى 200 ميكرولتر مع 46.25 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكليز.
    3. أضف 100 ميكرولتر من الخلايا إلى الأنبوب وحضن في خلاط حراري مضبوط على 30 درجة مئوية لمدة دقيقتين مع هز عند 500 دورة في الدقيقة.
      ملاحظة: هذه الخطوة حساسة جدا للوقت. حاول تحديد عدد العينات لتوليد بيانات موثوقة. من الأفضل أن يتم توزيع التوقيت بين العينات لضمان الاتساق.
  2. معالجة DMS: بمجرد اكتمال الحضانة، أضف بسرعة 200 ميكرولتر من مخزن استكشاف الهيكل المسخن مسبقا 2.5x و25 ميكرولتر من كاشف DMS إلى الأنبوب في نفس الوقت. قم بتدوير الدوامة بلطف في نبضتين واستمر في الحضانة على الخلط الحراري لمدة 4 دقائق عند 30 درجة مئوية مع الرج عند 500 دورة في الدقيقة. وزع 30 ثانية بين العينات لتكون متسقة.
    ملاحظة: استكشاف DMS هو تفاعل فوري يسمح بدقة زمنيةعالية 14 من حالة اقتران قواعد RNA. لمنع التعديل المستمر في DMS، من الضروري تبريد ملصقات DMS بسرعة باستخدام عامل الاختزال القوي β ميركابتوإيثانول. علاوة على ذلك، فإن أي DMS متبق سيعيق استرداد RNA عند الاستخراج. إضافة كحول إيزوأميل المشبع بالماء قبل الطرد المركزي يمكن أن تزيل DMS غير القابل للذوبان المتبقي في حبيبات الخلية15. هذه الخطوة حساسة جدا للوقت. من الضروري العمل بعدد محدود من العينات لتوليد بيانات موثوقة.
    تحذير: DMS سائل سام للغاية وعديم اللون مع رائحة خفيفة تشبه رائحة البصل. تتطلب الاحتياطات القصوى أثناء العمل مع DMS. قد يسبب الاتصال المباشر و/أو استنشاق الأبخرة نخر العين والفم والجهاز التنفسي، بما في ذلك تلف شديد للأعضاء. استخدم نظارات واقية، ومعطف مختبر، وقفازات مناسبة. ارتدي قفازين مزدوجين كلما أمكن وغير القفازات فورا عند التعرض أو بعد استخدام DMS. قم بخطوات تتضمن DMS تحت غطاء بخار. استخدم حاويات نفايات مخصصة للتخلص من DMS.
  3. التبريد والغسل
    1. جهز مخازن التوقف والغسل مسبقا كما هو مذكور في الجدول 1 وضعها على الثلج حتى الاستخدام. أوقف مثيلة DMS بإضافة 1 مل من مخزن التوقف.
    2. قم بتدوير العينات الموسومة ب DMS لمدة 5 دقائق عند 3,500 × جرام في جهاز طرد مركزي مبرد مسبقا. تخلص من النفايات في حاوية نفايات مناسبة.
    3. أضف 1 مل من حاجز الغسيل إلى الحبيبة وأعد تعليقها. كرر الخطوة 3.3.2. تابع فورا إلى استخراج الحمض النووي الريبي. لا تجمد حبيبات الخميرة.
  4. استخراج الكلوروفورم بالفينول
    1. أعد تعليق الخميرة الموسومة ب DMS في 600 ميكرولتر من مخزن تحلل RNA، ثم انقل التعليق إلى أنابيب تحتوي على 40 ميكرولتر من 20٪ SDS. حضن عند 65 درجة مئوية لمدة 30 ثانية مع الاهتزاز عند 950 دورة في الدقيقة.
    2. أضف 650 ميكرولتر من حمض الفينول:الكلوروفورم المسخن مسبقا إلى ليزات الخميرة واستمر في التسخين على الخلاط الحراري لمدة دقيقتين عند 65 درجة مئوية مع رج عند 950 دورة في الدقيقة. اترك العينات على الثلج لمدة 5 دقائق.
      ملاحظة: في هذه الأثناء، قم بتحويل كتلة الحرارة أو الخلاط الحراري إلى درجة حرارة الغرفة (RT).
    3. الطرد المركزي عند 20,000 × g لمدة 3 دقائق في RT.
    4. انقل الطبقة العلوية إلى أنبوب جديد وأضف 650 ميكرولتر من الكلوروفورم. دوامة لفترة وجيزة. قم بالطرد المركزي مرة أخرى وجمع الطبقة العليا في أنبوب جديد يحتوي على 700 ميكرولتر من الأيزوبروبانول.
    5. اقلبها لتخلط وتحتضن في الفريزر بدرجة حرارة -20 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، مما يسمح للحمض النووي الريبي بالترسيب. الطرد المركزي عند 20,000 × g لمدة 45 دقيقة عند 4 درجات مئوية. تخلص من السوبرناتانت. اغسل الحبيبات ب 750 ميكرولتر من 75٪ إيثانول (EtOH).
      ملاحظة: هذه نقطة توقف/إيقاف مؤقت في البروتوكول. يمكن ترك العينات في 75٪ EtOH طوال الليل عند -80 درجة مئوية.
    6. قم بتدوير لمدة 3 دقائق عند 20,000 × g وتخلص من السوبرناتانت. جفف حبيبة RNA بالهواء وأذوبها في 81 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكليز. قم بقياس عائد الحمض النووي الريبي باستخدام مقياس طيفي مضبوط على طول موجي قدره 260 نانومتر. ضع 1 ميكرولتر من التعليق المعاد أعلاه للقياس. قم بتخفيف عينة الحمض النووي الريبي إذا لزم الأمر. يجب أن يكون هناك ما لا يقل عن 80 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي الكلي للانتقال إلى الخطوة التالية.
      ملاحظة: إذا لزم الأمر، يمكن تخزين الحمض النووي الريبي الموسوم ب DMS عند -80 درجة مئوية لمدة تصل إلى أسبوعين.

4. RNA الناشئة (CoSTseq)

ملاحظة: يحتوي إجمالي الحمض النووي الريبي المستخرج من استخراج الفينول: الكلوروفورم على RNA ناضجة موسومة ب DMS بالإضافة إلى RNA ناشئ بيوتينيل موسوم ب DMS من جميع البوليميراز الثلاثة. لتنقية الحمض النووي الريبي الناشئ من إجمالي الحمض النووي الريبي، ستستخدم الخطوات التالية حبات الستربتافيدين لإثراء الحمض النووي الريبي الناشئ البيوتينيل. نظرا للتقارب القوي للبيوتين مع الستربتافيدين (Kd = 10-14 - 10-15 M)، يتم إجراء استخلاصين متتاليين من كاشف RNA (انظر جدول المواد) لاستخراج الحمض النووي الريبي من خرزات الستربتافيدين. لاحظ أن أقل من 1٪ من RNA الخميرة هو RNA ناشئ، وذلك حسب حالة النمو16.

  1. سحب البيوتين
    1. تحضير خرز سترابتافيدين المغناطيسي
      1. جهز مخزن ما قبل الغسل A ومخزن الغسل المسبق B كما هو موضح في الجدول 1 للتركيب. توحيد خرز السترابتافيدين المغناطيسي عن طريق الدوامة. احصل على 44 ميكرولتر من الخرزات المغناطيسية المتجانسة لكل عينة تحتوي على 80 ميكروغرام RNA إجمالي.
        ملاحظة: قم بتكبير الحجم بضرب الحجم في عدد العينات.
      2. ضع الخرزات المغناطيسية على الرف المغناطيسي وأزل محلول التخزين. أعد تعليق الخرزات المغناطيسية في 1 مل من مخزن ما قبل الغسيل A.
      3. حضن لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة. قم بتمغنط وإزالة السوبرناتانت. كرر الغسيل. اغسل مرة واحدة باستخدام 1 مل من مخزن ما قبل الغسيل B. قم بتمغنط وإزالة السوبرناتانت، ثم انتقل بسرعة إلى مرحلة الربط والغسيل.
    2. الربط والغسل
      1. جهز مخازن غسيل 2x للربط، 1x buffers bond، عالي الملح، ومنخفض الملح كما هو موضح في الجدول 1.
      2. أعد تعليق الخرز المغسول مسبقا بإضافة ضعف الحجم الأصلي (88 ميكرولتر) من مخزن الربط 2x. نقل 80 ميكرولتر من الخرزات إلى أنبوب معقم بسعة 1.5 مل يحتوي على 80 ميكرولتر من عينة RNA البيوتينيلية.
      3. قم بتدوير خليط العينة على مدور لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. اجمع الحمض النووي الريبي الناضج الذي يحتوي على تدفق عبر المرحلة المغناطيسية (تابع إلى خطوة الهطول).
      4. شطف مركب الحمض النووي الريبي الناشئ من الخرزة ب 500 ميكرولتر من محلول الملح العالي مرتين مرتين. قم بشطف واحد ب 500 ميكرولتر من الارتباط 1x تليها شطف واحد بمحلول 500 ميكرولتر من محلول منخفض الملح.
  2. الاستبعاد من خلال استخراج كاشف الحمض النووي الريبي
    1. سخن الخلاط الحراري إلى 60 درجة مئوية. تبرد جهاز طرد مركزي قادر على الوصول إلى سرعة تتراوح بين 20,000 × g إلى 4 درجات مئوية.
    2. أضف 300 ميكرولتر من مادة الحمض النووي الريبي (انظر جدول المواد) إلى مركب الحمض النووي الريبي الناشئ وأعد تعليقه. حضانه على خلط حراري لمدة 5 دقائق واضبطه على 60 درجة مئوية.
    3. أضف 60 ميكرولتر من الكلوروفورم والدوامة، وحضن 3 دقائق عند RT. قم بتدوير 14,000 × جرام لمدة 5 دقائق في جهاز طرد مركزي مبرد مسبقا.
    4. نقل الطور المائي العلوي إلى أنبوب تجميع جديد (~180 ميكرولتر). تخلص من الطور العضوي، تاركا الخرزات والمرحلة المائية المتبقية.
    5. كرر عملية الاستخراج لتحقيق حجم نهائي 360 ميكرولتر طور مائي في أنبوب التجميع.
    6. أضف 360 ميكرولتر من الكلوروفورم إلى أنبوب الجمع والدوامة لفترة وجيزة. قم بتدوير 14,000 × جرام لمدة 5 دقائق في جهاز طرد مركزي مبرد مسبقا.
    7. نقل (حوالي 350 ميكرولتر) من الطبقة العليا إلى أنبوب جديد. ترسيب الحمض النووي الريبي بإضافة 900 ميكرولتر من EtOH المطلق و1 ميكرولتر من المادة المشتركة.
    8. دوامة لفترة وجيزة وتسمح بحدوث الأمطار عند -20 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة أو -80 درجة مئوية خلال الليل.
    9. في جهاز الطرد المركزي المبرد مسبقا، الطرد المركزي بقوة 20,000 × جرام لمدة 20 دقيقة. تخلص من السوبرناتانت بعناية.
    10. اغسل الحبيبة ب 750 ميكرولتر بنسبة 75٪ EtOH، تليها عملية طرد مركزي بارد أخرى بقوة 20,000 × جرام لمدة 5 دقائق.
    11. جفف الحبيبة لإزالة بقايا EtOH لمدة 10 دقائق. قم بإذابة حبيبة RNA في 3.75 ميكرولتر منH2O.
      ملاحظة: المسح النقطي للحمض النووي الريبي الممزوج يليه الفحص باستخدام الستريبتافيدين-HRP هو الطريقة الأكثر فعالية لتقييم سحب البيوتين للأسفل. ومع ذلك، يستهلك هذا النهج كمية كبيرة من المادة العينة، مما يترك مواد غير كافية للتحضير في المكتبة.
  3. ترسيب المادة الفائقة
    1. ترسيب المادة الفائقة التي تحتوي على RNA ناضجة بإضافة 2.5-3 أحجام من EtOH. يسمح بحدوث الأمطار عند -20 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.
    2. في جهاز طرد مركزي مبرد مسبقا، ادور لمدة 45 دقيقة عند 20,000 × جم. استنشق السوبرناتانت بحذر.
    3. اغسل حبيبات RNA ب 0.5 مل من 75٪ EtOH. جفف وأذيب الحبيبات في 50 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكليز. ضع الأنبوب على كتلة حرارية عند 65 درجة مئوية لتحسين ذوبان حبيبات RNA.
    4. قس تركيز الحمض النووي الريبي باستخدام مقياس طيف للخطوات التالية.

5. الحمض النووي الريبي الناضج (DMS-MaPseq)

  1. اختيار بولي أ
    ملاحظة: يتم تنقية الحمض النووي الريبي الناضج متعدد الأدينيل باستخدام التقاط الألفة المعتمدة على الخرزات الأوليغو(dT). تم تحسين هذا البروتوكول لاستخدام مجموعة التنقية المباشرة mRNA من Dynabeads (انظر جدول المواد). كتحضير أولي، قم بتسخين 1 مل من الماء الخالي من النوكلياز إلى 80 درجة مئوية للتسهيل، وضبط كتلة الحرارة إلى 70 درجة مئوية.
    1. تحضير الحمض النووي الريبي لسحب بولي A للسحب: نقل 50 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي المتأصل ورفعه إلى حجم نهائي 300 ميكرولتر مع ماء خال من النوكلياز. سخن الحمض النووي الريبي على درجة حرارة 70 درجة مئوية لمدة دقيقتين لتعطيل الهياكل الثانوية وضعه على الثلج فورا. اخلط الحمض النووي الريبي مع 300 ميكرولتر من محلول التحلل/الربط والدوامة لفترة وجيزة.
    2. تحضير الخرز المغناطيسي: اجعل الخرزات المغناطيسية معلقة عن طريق الدوران لمدة لا تقل عن 30 ثانية. نقل 100 ميكرولتر من الخرزات المعلقة لكل عينة إلى أنبوب معقم بسعة 1.5 مل. قم بالمغنطة للتخلص من مخزن التخزين. اشطف الخرزات المغناطيسية بحجم متساو من محلول التحلل/الربط، ثم مغنط، وتخلص من السوبرناتان.
    3. الربط والغسل
      1. أضف 100 ميكرولتر من الخرزات المغسولة مسبقا إلى 600 ميكرولتر من الحمض النووي النووي الريبي العينة المحضر. قم بتدوير الجهاز بشكل مستمر على المدور لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
      2. اجمع الخرزات بوضعها على رف مغناطيسي وتخلص من التدفق عبر الزجاج. اغسل الخرزات بمحلول غسيل بسعة 600 ميكرولتر من محلول الغسيل A. Pipette لخلطه.
      3. اجمع الخرزات مرة أخرى لتخلص الغسيل. اغسل الخرزات بمحلول غسيل سعة 300 ميكرولتر من محلول B. Pipete لخلطها.
      4. اجمع الخرزات مرة أخرى لتخلص الغسيل. اخلط الخرزات مع 90 ميكرولتر من الماء الدافئ (80 درجة مئوية) وترك الارتباط بإضافة 90 ميكرولتر من محلول التحلل/الربط العاحد. كرر الخطوة 5.1.3.1-5.1.3.3.
    4. الشفافية: أعد تعليق الخرزات في 30 ميكرولتر من ماء دافئ (80 درجة مئوية) خالي من النوكليز. حضن عند 75 درجة مئوية إلى 80 درجة مئوية لمدة دقيقتين. اعرض الخرزات لمجال مغناطيسي بسرعة واجمع القطرات في أنبوب خال من RNase. كرر عملية الإزالة واجمع الحمض النووي الريبي المائل.
  2. التجزئة
    ملاحظة: يمكن تحقيق تجزئة ال mRNA إما بوسائل إنزمية أو كيميائية. هنا، يستخدم كلوريد الزنك والحرارة للتجزئة. على عكس الإنزيمات التي تتطلب تسلسلا أو عناصر هيكلية محددة، تعمل أيونات الزنك كحمض لويس لتنشيط الأكسجين بقطر 2' (وهو نيوكليوفيل) وقطع العمود الفقري للفوسفوديستر. ينتج عن ذلك تكوين إستر فوسفات دوري بحجم 5' OH و2',3' على خيوط RNA17 الناتجة.
    1. قم بتسخين الثيرموسايلر مسبقا مع ضبط درجة حرارة الكتلة على 94 درجة مئوية ودرجة حرارة الغطاء على 105 درجة مئوية. ضع 54 ميكرولتر من mRNA المائل في أنبوب PCR.
    2. أضف 6 ميكرولتر من محلول كلوريد الزنك بسعة 100 ملليمول (تركيز نهائي 10 ملليمتر)، دوامة لمدة 2 ثانية، وحضن فورا عند 94 درجة مئوية لمدة 55 ثانية على جهاز التسخين الحراري المسخن.
    3. في نهاية الحضانة، يتم تبريد تفاعل التجزئة بجرعة 6.6 ميكرولتر من 0.5 M EDTA (التركيز النهائي 50 ملميول)، ثم رفع وأسفل الماصة لخلطها، ثم ضع الأنابيب بسرعة على الثلج. انقل المحتوى إلى أنابيب معقمة بسعة 1.5 مل.
    4. السماح بترسيب ال mRNA المجزأة مع إضافة 150 ميكرولتر من الإيزوبروبانول، و15 ميكرولتر من أسيتات الصوديوم 3 مولار، ودرجة حموضة 5.2، و1 ميكرولتر من الترسب المشترك.
    5. ضع على درجة حرارة -20 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. ادور عند 20,000 × جرام لمدة 45 دقيقة في جهاز طرد مركزي مبرد مسبقا. اغسل الحبيبة بنسبة 75٪ EtOH واذبها في 15 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكلياز.
  3. علاج PNK
    ملاحظة: التجزئة الكيميائية باستخدام ZnCl2 يولد نهايات 5' و3' غير مناسبة للربط17. لذا، بعد التجزئة الكيميائية، تتعرض الحمض النووي الريبي لمعالجة كيناز بولي نيوكليوتيد (PNK)، الذي يفسفر 5' OH ويزيل الفسفرة أطراف الفوسفات 3' التي يمكن ربطها بالمحولات18.
    1. أضف 1 ميكرولتر من مثبط الريبونوكلياز، و2 ميكرولتر من 10x PNK Buffer، و2 ميكرولتر من T4 PNK. حضن على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة. أوقف التفاعل بإضافة 30 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكليز، و50 ميكرولتر من محلول ربط الحمض النووي الريبي، و50 ميكرولتر من EtOH.
    2. استخدم طريقة تنقية RNA تعتمد على عمود الدوران لإزالة الملوثات وتركيز الحمض النووي الريبي. يمكن القيام بذلك باستخدام مجموعة تجارية متوفرة (مجموعة تنظيف وتركيز RNA، انظر جدول المواد). باختصار، اخلط مجلدين من مخزن ربط الحمض النووي الريبي مع حجم واحد من العينة، وامزج حجما متساويا من هذا الخليط مع 100٪ EtOH، ثم حمل أنبوب جمع جديد على عمود الدوران. قم بتدوير هذه العينة وتخلص من التدفق عبر الماء. اغسل عمود الدوران ب 700 ميكرولتر من مخزن غسيل RNA ومرة واحدة ب 400 ميكرولتر من مخزن غسيل RNA. تخلص من تدفق المرور. قم بتدوير العمود الفارغ لمدة دقيقة واحدة لضمان إزالة محلول الغسيل بالكامل.
    3. يتم إخراج الحمض النووي الريبي في 10 ميكرولتر من الماء الدافئ الخالي من النوكليز.
      ملاحظة: قم بجميع خطوات الطرد المركزي عند 10,000 - 16,000 × g عند RT لمدة 30 ثانية.

6. تفاعل النسخ العكسي بتحويل القوالب

ملاحظة: تخضع الحمض النووي الريبي الناشئ من سحب البيوتين (الخطوة 4.2) والرنا المجزأة بعد معالجة PNK (الخطوة 5.3) للخطوات التالية لتحضير المكتبة (انظر الشكل 1 والشكل 2). باختصار، سيتم إعداد نموذج RNA صناعي/مبرايمر DNA مزدوج بداية (محول RNA/DNA غير متجانس RNA) يمكن أن يحدث عليه تبديل القالب. يوفر هذا التماثل التكميلي تسلسلا قصيرا مكملا يتيح تبديل القوالب بواسطة النسخة العكسية (RT) لتبديل الخيوط، وهو الوقت الذي يغير فيه RT الخيوط من الحمض النووي الريبي إلى الحمض النووي، مما يمكن من تخليق cDNA بسلاسة من الحمض النووي إلى تسلسل المحول. يستخدم هنا إنزير Induro العكسي للنسخ، وقد تم اختباره وتحسينه لهذا البروتوكول. يمكن استخدام نسخ عكسية أخرى بتبديل القوالب لتحضير مكتبة CoSTseq إذا رغب الأمر، لكنها تتطلب تحسينا من المستخدم.

  1. تسلسلات محولات الحمض النووي النووي/الحمض النووي الريبي غير المتجانسة
    ملاحظة: محولات الدينا/RNA غير المتجانسة المستخدمة في النسخ العكسي لعينة DMS-MaPseq هي نفسها تلك المدرجة في Xu وآخرون 7 والتي أشار إليها Schärfen وآخرون 10.
    1. بالنسبة لمحول الدينام/RNA غير المتجانس الذي سيستخدم للنسخ العكسي لعينة CoSTseq، استخدم محولا يحتوي على حرف 'G' في منطقة التلويل. سيسمح ذلك ل G بالتقاط البيوتين-C في نهاية 3's من RNA. إذا كنت تستخدم NTP بيوتينيل مختلف، قم بتعديل بادئة DNA غير متجانسة ليكون النيوكليوتيد الاقتران المناسب كبروز (انظر الجدول 2).
    2. بالنسبة لمحول DMS-MaPseq، تأكد من وجود بروز N واحد، نظرا لأن الطرف الثلاثي سيكون عشوائيا بعد التجزئة. للحصول على نظرة عامة على خطوات إعداد المكتبة التالية، انظر الشكل 2.
  2. تحضير الهجين بين DNA/RNA لتبديل القوالب: جهز 1 ميكرومولار من بادئات R2 RNA وR2R في مخزن مؤقت مكون من 10 ملليمولار Tris-HCl، ودرجة الحموضة 7.5، و1 مللي مولار EDTA. حضن خليط البرايمر عند 82 درجة مئوية لمدة دقيقتين، ثم برد إلى 25 درجة مئوية بمعدل 0.1 درجة مئوية/ثانية. قم بتجميد الخليط لاستخدامه لاحقا.
  3. تحويل القوالب إلى العكس
    1. أضف الكواشف التالية وحضن لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة: 2 ميكرولتر من مخزن تفاعل 5x، 1 ميكرولتر من 1 ميكرو ميكروليتر DNA/RNA غير متجانس (استخدم heteroduplex يحتوي على بروز G واحد لعينة CoSTseq؛ استخدم heteroduplex يحتوي على بروز N عشوائي لعينة DMS-MaPseq)، 0.5 ميكرولتر من الإنزيم، 0.5 ميكرولتر مثبط RNase، 3.75 ميكرولتر من عينة RNA (أو أضف ماء لتحقيق حجم إجمالي 7.75 ميكرولتر).
    2. حضن هذا الخليط (بدون dNTPs) لمدة 30 دقيقة عند RT. ثم أضف 1.25 ميكرولتر من 10 ملليمولار dNTP إلى التفاعل وطبق شروط الدورة التالية في جهاز التدوير الحراري: 25 درجة مئوية لمدة 10 دقائق، 42 درجة مئوية لمدة 10 دقائق، 50 درجة مئوية لمدة 10 دقائق، 55 درجة مئوية لمدة 10 دقائق، 60 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، 65 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة، 75 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
    3. أضف 1 ميكرولتر من RNase H وحضن عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. قم بتنقية تفاعل PCR باستخدام طريقة تنقية DNA تعتمد على الأعمدة لإزالة البادئات والنيوكليوتيدات والإنزيمات المتبقية. إلوت في المجلد النهائي 20 ميكرولتر.

figure-protocol-1
الشكل 2: تمثيل مخطط مفصل لتحضير مكتبة CoSTseq. يتم حضن RNA الناشئ الذي يحمل طرفا بيوتينيلا من 3' بواسطة محول تبديل قالب يحتوي على بروز G مكمل للبيوتين-CTP. بالنسبة للحمض النووي الريبي الناضج المجزأ (DMS-MaPseq)، يستخدم محول بزيادة N (انظر الشكل 1). يتم إجراء تخليق cDNA باستخدام نسخ عكسي عالي المعالجة، مثل الإنترون العكسي من المجموعة الثانية (TGIRT)، يليه معالجة RNase H لتحليل سلسلة RNA. لاحقا، يربط ليغاز الحمض النووي الريبي/الحمض النووي الريبي 5' المملو بالريبوز (rApp) منرابط N7 UMI ب 3' OH من cDNA أحادي السلسلة. يحتوي محولN7 UMI على نهاية مسدودة بطول 3 أقلاع، مما يمنع الربط الذاتي بين المحولات. أخيرا، يتم تضخيم PCR باستخدام برايمرات تشمل مناطق متداخلة وفتحات بطول 5 أقدام تحمل رموز شريطية فريدة من نوع Illumina i5 و i7 مخصصة لكل عينة. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

7. ربط محول ب 5' لتحضير مكتبات cDNA النهائية لتسلسل العلامات المزدوج النهايات

  1. تحضير محول بزاوية 5 أقدام
    1. أدينيل محول الطرف 5 أقدام باستخدام تفاعل قائم على ليغاز RNA (مثل ليغاز Mth RNA، المدرج في جدول المواد) مع المكونات التالية: 8 ميكرولتر من 10x 5'-DNA لتفاعل أدينيل، 8 ميكرولتر من 1 mM ATP، 100 ميكرومولار R1R DNA (هذا هو برايمر TruSeq الذي يحتوي على معرف جزيئي فريد أو UMI)، 8 ميكرولتر من ليغاز Mth RNA, 52 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكليز.
      ملاحظة: للتفاصيل المتعلقة بتصميم محول N7 UMI، انظر الجدول 2 والشكل 2.
    2. حضن هذا التفاعل عند 65 درجة مئوية لمدة ساعة، ثم عند 85 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. تابع تنقية المنتج باستخدام ترسيب EtOH أو باستخدام طريقة تنظيف DNA تعتمد على عمود الدوران الغشائي السيليكا لعزل cDNA، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
    3. بالنسبة لترسيب EtOH، يمكن ترسيب الحمض النووي عند -20 درجة مئوية (لا تقل عن 20 دقيقة) باستخدام أسيتات الصوديوم (pH 5.2) بتركيز نهائي 0.3 M و2x-2.5x من 95٪-100٪ EtOH بارد. قم بطرد المركزي بالتفاعل الناتج عن ال EtOH لمدة 15 دقيقة بأقصى سرعة في جهاز طرد مركزي مبرد مسبقا (4 درجات مئوية)، ثم غسل الحبيبة باستخدام 70٪ من EtOH، ثم إعادة الطرد المركزي، وجفف الحبيبة بالهواء. أعد تعليق (أو إلوت، إذا استخدمت عمود دوران) الحبيبة في 40 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكلياز. خزن عند -20 درجة مئوية على المدى الطويل.
  2. ربط محول 5 أقدام
    1. للحصول على حجم تفاعل واحد بحجم 20 ميكرولتر، أضف المكونات التالية إلى 10 ميكرولتر من cDNA: 2 ميكرولتر من 10x NE Buffer 1، 2 ميكرولتر من 50 مللي مولار MnCl2، 2 ميكرولتر من 5' AppDNA/RNA ليغاز، 4 ميكرولتر من 10 ميكرومولار (100 نانوغرام/ميكرولتر) من المحول المأدينيل من الخطوة 7.1.
    2. حضن هذا التفاعل عند 65 درجة مئوية لمدة ساعة، ثم 3 دقائق عند 90 درجة مئوية. نظف التفاعل باستخدام مجموعة تنقية minElute PCR وسحب في حجم نهائي من 20 ميكرولتر ماء خال من النوكلياز.
  3. تضخيم PCR بالحد الأدنى لمكتبات cDNA باستخدام اختبار تجريبي
    1. قبل المتابعة، جهز مخزونا بحجم 10 ميكرومولار من بادئات المؤشر التي تحتوي على رموز شريطية فريدة. يجب أن يكون لكل عينة فريدة من نوع CoSTseq أو DMS-MaPseq رمز شريطي فريد مرتبط بها لتحليل سلس في مرحلة ما بعد التيار. انظر تسلسلات البادئية في الجدول 2. يمكن دمج البرايمرات الفردية التي تحتوي على الباركود للأمام والخلف في خليط بنسبة 1:1 وتخزينها كخلطة باركودية.
    2. باستخدام 2 ميكرولتر من منتج PCR من الخطوة 7.2، أضف 2.5 ميكرولتر من مخزن PCR عالي الدقة (مثل مخزن HiFi تجاري)، 0.375 ميكرولتر من dNTP (10 مللي مولار)، 0.75 ميكرولتر من خلطة الباركود (أو 0.375 ميكرولتر من بادئات البارترميز الفريدة i5 وi7)، 0.25 ميكرولتر من بوليميراز DNA عالي الدقة (مثل إنزيم HiFi التجاري لبدء التشغيل)، 6.625 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكليز.
    3. حضن هذا التفاعل عند 95 درجة مئوية، وكرر [15 ثانية 98 درجة مئوية، 30 ثانية 62 درجة مئوية، 30 ثانية 72 درجة مئوية] لمدة 23 دورة، وانتهى بحضانة دقيقة واحدة عند 72 درجة مئوية. استخدم جل أغاروز بنسبة 1٪ لتحديد رقم الدورة الأمثل.
      ملاحظة: لاختبار ظروف الدوران الأدنى، يمكن تحضير عينة في نهاية دورة أدنى (مثل نهاية 15 أو 16 دورة) وتشغيلها على جل أغاروز لمقارنة شدة مسحة مكتبة cDNA على جل الأغاروز عبر أطوال الدورة.
  4. الاختبار النهائي لدفع الركوز الثانوي لتضخيم المكتبة
    1. باستخدام 18 ميكرولتر من منتج PCR من الخطوة 7.2، أضف التالي من مجموعة KAPA HiFi PCR Kit: 22.5 ميكرولتر من مخزن PCR عالي الدقة، 3.375 ميكرولتر من dNTP (10 مللي مولار)، 6.75 ميكرولتر من خلطة الباركود (أو 3.375 ميكرولتر من بادئات الباركود الفريدة الفردية i5 وi7)، 2.25 ميكرولتر من بوليميراز DNA عالي الدقة الساخن، و59.625 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكليز.
    2. حضن هذا التفاعل عند 95 درجة مئوية، وكرر العملية [15 ثانية 98 درجة مئوية، 30 ثانية 62 درجة مئوية، 30 ثانية 72 درجة مئوية] لعدد الدورات المحددة في الخطوة 7.3. ينهي بفترة حضانة لمدة دقيقة واحدة عند 72 درجة مئوية.
  5. اختيار الحجم
    1. قم باختيار الحجم على منتج PCR باستخدام تنقية معتمدة على خرزات بارامغناطيسية (مثل AMPure XP أو ما يعادلها). استخدم حجم 1.3 ضعف حجم الخرزات (مثلا، لتفاعل PCR بسعة 50 ميكرولتر، استخدم 65 ميكرولتر من خليط الخرز) وامزج جيدا حتى يصبح متجانسا. دع الخرزات تربط العينة لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
      ملاحظة: تمكن نسبة العينة إلى الخرزات 1:1.3x إزالة معادلات العزل وتضمن أن شظايا الحمض النووي المحتجزة لا تقل عن 150 بيس ولا تزيد عن 800 بيت.
    2. أزل المادة الفائقة دون إزعاج الخرزات وقم بغسل الخرزات بنسبة 80٪ من EtOH وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
    3. يتم إخراج المنتج النهائي في 11 ميكرولتر. شغل 1 ميكرولتر على جل أغاروز للتحقق من المكتبات. قدم المنتج النهائي للتسلسل.

8. تحليل البيانات

ملاحظة: حزمة CoSTseq الكاملة وكود التحليل متاحان على GitHub (https://github.com/NeugebauerLab/CoSTseq)، وسير العمل للتحليل موضح في الشكل 3. تم تصميم هذا الخط لمعالجة بيانات تسلسل CoSTseq وDMS-MaPseq معا. يستخدم CoSTseq Snakemake، وهو سير عمل في المعلوماتية الحيوية يتوازى بسهولة مع التحليل من خلال تحسين عدد أنوية المعالج المتاحة19. يتم تعريف سير العمل بواسطة ملف الأفعى، الذي يتكون من مجموعة من القواعد التي تحدد التحليلات التي ستنفذ. لا حاجة لتعديل ملف Snakefile المتوفر عند تثبيت حزمة GitHub.

  1. قم بضبط ملف التكوين (ملف .yaml) مع مسارات الملفات الصحيحة إلى مكان تخزين البيانات الخام. يجب تضمين هذه الإعدادات مسارا إلى تسلسلات المحولات وأسماء العينات المرتبطة بها. قم بتعديل ملف الإعدادات لتشغيل تحليلات محددة محددة في ملف سنيك.
  2. لبدء التحليل، قم بتنزيل قراءات النهاية المزدوجة الخام بصيغة fastq.gz. تقرأ العملية باستخدام fastp20 لقص تسلسلات المحولات ومرشح الجودة للقراءات التي تحصل على درجات Phred لا تقل عن 20. قم بمحاذاة هذه القراءات مع الجينوم المرجعي باستخدام STAR21 لتوليد ملفات BAM.
  3. كتأكيد إضافي، يمكنك تصور ملفات BAM التي تم إنشاؤها بعد تشغيل خط تحليل CoSTseq في متصفح عارض الجينوم المتكامل (IGV). باستخدام IGV، يجب أن تكون ملفات BAM قابلة للتفسير بسهولة لعرض القراءات على جميع أجزاء الجينات المعنية، مما يشير إلى أن القراءات تمثل RNA ناشئ. كما هو متوقع، يجب أن تظهر قراءات الحمض النووي الريبي الناضجة تغطية قليلة في المناطق الإنترونيكية، نظرا لأن هذه القراءات متوقعة أن تكون مشتقة من نسخ ناضجة ومن المحتمل أن تكون مقسمة بكفاءة.
  4. استخدم مخرج fastp (ملف .html يمكن فتحه في متصفح الويب) لنسبة تقديرية من القراءات المكررة. لاحظ أن قراءات CoSTseq قد تكون مكررة بشكل كبير، مما يبرز أهمية الخطوة التالية.
  5. باستخدام UMICollapse22، تقوم القراءات بإزالة التكرار لدمج القراءات ذات الفروع الفريدة والمحاذاة المتطابقة، مما يسمح بالحفاظ على القراءات الفريدة فقط والتخفيف من تحيز PCR. يجب أن تكون الملفات الناتجة خالية من القراءات المكررة وبصيغة BAM، حيث يتم فصل القراءات المتوافقة مع rRNA عن تلك المرتبطة بالجينات غير rRNA.
  6. للمكون الرئيسي النهائي لخط أنابيب CoSTseq المعياري، استخدم تنفيذا مخصصا بلغة بايثون لحساب عدد الطفرات وتغطية القراءة على كل نيوكليوتيد. يمكن العثور على الدوال التي تصف هذا التنفيذ في الشيفرة المصدرية على GitHub، ويشرح ملف Snakefile الإدخالات، والمخرجات، والمعلمات، والوظائف اللازمة لتوليد هذه البيانات المخزنة بصيغة .pkl.
    ملاحظة: هناك العديد من التحليلات الأخرى التي يمكن إجراؤها باستخدام خط أنابيب تحليل CoSTseq، رغم أن المعلمات قد تتطلب تحسينا لاحتياجات التحليل الشخصية. طريقة قيمة تم تكييفها ل CoSTseq هي HDProbe، وهي حزمة R تتيح مقارنات على مستوى الجينوم لمعدلات الطفرات10. باختصار، يتطلب HDProbe بيانات من جميع النسخ ويمكنه تصنيف الفروق الكبيرة في معدلات الطفرات مقارنة بالفرد الضابط بشكل منهجي. تشمل أنواع التحليلات الإضافية التي قد يرغب المرء في إجراؤها التنبؤ بالبنية بناء على تفاعلات DMS التجريبية. يمكن تنفيذ ذلك باستخدام حزمة RNAstructureرقم 23.

figure-protocol-2
الشكل 3: خطوات التحليل والمخرجات المتوقعة لخط أنابيب تحليل CoSTseq المعياري. خطوات التحليل، التي تشير إلى استخدام الأدوات الحالية الموصى بها بالإضافة إلى خط أنابيب تحليل CoSTseq الجاهز للاستخدام مع ملفات الإخراج المتوقعة والمحتوى. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعرض هذا القسم النتائج الفعلية الناتجة عن تنفيذ سير عمل CoSTseq وتحليله، كما هو موضح في هذا البروتوكول. أولا، يصف هذا القسم النتائج المتوقعة بعد تقييم الجودة لنجاح التحضيرات المكتبية قبل وبعد التسلسل. قبل التسلسل، يمكن للباحثين استخدام اختبار PCR وتحليل TapeStation لتأكيد وجود RNA بعد إثراء البيوتين. يشير هذا إلى العزلة الناجحة للحمض النووي الريبي الناشئ أثناء تحضير مكتبة CoSTseq. تقييم جودة البيانات بعد التسلسل، على سبيل المثال، من خلال الفحص البصري لتغطية القراءة ولاحقا باستخدام تحليل ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يبدأ الحمض النووي الريبي في الطي بشكل متزامن بسبب الحركة الأسرع لاقتران القواعد مقارنة بمعدل التخليق24، 25، 26، 27. معرفتنا الحالية بطي الحمض النووي الريبي الناشئ تأتي من دراسات جزيئية واحدة للحمض النووي الريبي بدائي، أو الاستكشاف الصناعي، أو الأساليب السيليكوية. في هذا البروتوكول، يتم تقديم سير عمل مفصل ل CoSTseq؛ تسمح هذه التقنية بالكشف في

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يرغب المؤلفون في شكر الدكتور إس كيه بوباثي جيغاثامبال على الترميز وأعضاء مختبر نويجباور، وخاصة ب. بيش، على النقاشات المفيدة. وقد دعمت هذه الأعمال المعاهد الوطنية للصحة (R01GM112766 إلى KMN) وزمالة ما قبل الدكتوراه من الجمعية الأمريكية للقلب (908949 إلى LS). تم دعم LPS بمنحة تدريب من NIH 5T32GM14943803. حظي LRAB بدعم من زمالة ما بعد الدكتوراه من الجمعية الأمريكية للقلب (26POST1569544). تم دعم جمع البيانات في مركز ييل للتحليل الجينومي من قبل المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة التابع للمعاهد الوطنية للصحة تحت رقم الجائزة 1S10OD03036301A1. هذا العمل يقع على عاتق المؤلفين وحدها ولا يمثل بالضرورة الآراء الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
10 مللي متر ATPإنفيتروجين18330019
10 ملليمولار بيوتين-11-CTPجينا للعلوم الحيويةNU-831-BIOX
10 مللي متر GTPإنفيتروجين18332015
10mM UTPإنفيتروجين18333013
10X NEBuffer 1مختبرات نيو إنجلاند البيولوجيةB7001Sاستخدم في الخطوة 7.2.1
محلول ملحي مخزن بالفوسفات 10X (PBS)جيبكو70011-044
20٪ SDSRPI L23100-500
الفينول الحمضي: الكلوروفورم  أمبيونAM9722
خرز AMPure XP لاختيار الحجمبيكمان كولتر  A63880يستخدم لاختيار الحجم في الخطوة 7.5.1
باكتو بيبتونجيبكو211677
مستخلص خميرة الباكتوجيبكو212750
البيسينسيغما ألدريتشB3876-100G
الكلوروفورمسيغما ألدريتش319988
D-(+)-جلوكوزسيغما ألدريتشG5767-500G
ديفكو آجاربي دي ديفكو214010
ثنائي ميثيل كبريتاتسيغما ألدريتشD186309-5ML
داينابيدز والتجارة؛ خرز MyOne Streptavidin C1  إنفيتروجين65001يستخدم لسحب البيوتين في القسم 4.1
داينابيدز والتجارة؛ mRNA DIRECT™ طقم التنقيةإنفيتروجين61011يستخدم لاختيار بولي أ في القسم 5.1
EDTA، درجة الحموضة 8، 0.5 ميلسيغما ألدريتش  03690-100ML
الإيثانولسيغما ألدريتشE7023-500ML
جليكو بلوإنفيتروجينAM9516المستخدم في الترسيبين المشترك في الخطوة 4.2.7 و5.2.4
إندورو وريج؛   النسخات العكسيةمختبرات نيو إنجلاند البيولوجيةM0681Sإنزيم RT المستخدم في الخطوة 6.3.1
كحول الأيزواميلسيغما ألدريتش  W205710-1KG-K
إيزوبوبانولجي تي-بيكر9084-05-01
مجموعة PCR من KAPA HiFi HotStart    روش07958889001استخدم حمض نووي بول عالي الدقة في 7.3.2 و7.4.1 لتفاعلات PCR
كلوريد المغنيسيومسيغما ألدريتشSLCM2154
مجموعة تنقية PCR من MinEluteتشياغن28004استخدم لتنظيف الحمض النووي في الخطوة 6.3.3 و7.2.2
الليغاز الريبي الريبي الأممختبرات نيو إنجلاند البيولوجيةM2611A
أوليغو كلين آند المركززيمو للأبحاثD4060اقتراح لتنظيف حمض نووي أوليغو في الخطوة 7.1.2
أسيتات البوتاسيوم  سيغما ألدريتش236497-500G
كلوريد البوتاسيومجي تي بيكر3040-01
هيدروكسيد البوتاسيومأفانتور6984-04-01
تنظيف RNA & Concentrator-5زيمو للأبحاثR1014مجموعة تنظيف الحمض النووي الريبي المستخدمة في الخطوة 5.3.2 بعد علاج PNK
RNaseOUT & trade; مثبط الريبونوكلياز المؤتلفثيرمو فيشر العلمي10777019مثبط RNase المستخدم في الخطوة 5.3.1 أثناء علاج PNK
ساركوسيلIBI العلميIB07080
أسيتات الصوديومجودة بيولوجية351-035-721
كلوريد الصوديومسيغما ألدريتشS5150-1L
هيدروكسيد الصوديوم ماكرون7708-10
SUPERase و middot; In&Trade; مثبط RNase (20 U/μ L)ثيرمو فيشر العلميAM2696مثبط RNase المستخدم في الخطوة 6.3.1
كيناز متعدد النوكليوتيدات T4مختبرات نيو إنجلاند البيولوجيةM0201S
الثبات الحراري 5 أقدام الحمض النووي النووي/الحمض النووي الريبي للتطبيق ليغازمختبرات نيو إنجلاند البيولوجيةM0319L
تريس-HCl، درجة الحموضة 7.4، 1Mثيرمو ساينتفيكJ60202. K2
ترايتون X-100تيكنوفاT1105
تريزول وتجارة؛ المادة الكيميائيةإنفيتروجين15596-026بالنسبة لاستخفاض RNA الناشئ في القسم 4.2؛ ويشار إليه أيضا باسم "مادة RNA" في القسم 4
β-ميركابتوإيثانولسيغما ألدريتشM6250-1L

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zhang, J., Fei, Y., Sun, L. Advances and opportunities in RNA structure experimental determination and computational modeling. Nature Methods. 19 (10), 1193-1207 (2022).
  2. Bonilla, S. L., Jones, A. N., Incarnato, D. Structural and biophysical dissection of RNA conformational ensembles. Current Opinion in Structural Biology. 88, (2024).
  3. Bose, R., Saleem, I., Mustoe, A. M. Causes, functions, and therapeutic possibilities of RNA secondary structure ensembles and alternative states. Cell Chemical Biology. 31 (1), 17-35 (2024).
  4. Rapakko, J., Scaravilli, M., Änkö, M. L. Interplay between RNA-protein interactions and RNA structures in gene regulation. FEBS Open Bio. , (2025).
  5. Rodgers, M., Woodson, S. A. A roadmap for rRNA folding and assembly during transcription. Trends in biochemical sciences. 46 (11), 889-901 (2021).
  6. Tomezsko, P., Swaminathan, H., Rouskin, S. DMS-MaPseq for Genome-Wide or Targeted RNA Structure Probing In Vitro. Methods in Molecular Biology. 2254, 219-238 (2021).
  7. Xu, H., Douglas, C. W., Lambowitz, A. M. Improved TGIRT-seq methods for comprehensive transcriptome profiling with decreased adapter dimer formation and bias correction. Scientific Reports. 9 (1), (2019).
  8. Lopes, R., Agami, R., Korkmaz, G. GROseq, A Tool for Identification of Transcripts Regulating Gene Expression. Methods in molecular biology (Clifton, N.J). 1543, 45-55 (2017).
  9. Mahat, D. B., et al. Base-Pair Resolution Genome-Wide Mapping Of Active RNA polymerases using Precision Nuclear Run-On (PROseq). Nature protocols. 11 (8), 1455-1476 (2016).
  10. Schärfen, L., Vock, I. W., Simon, M. D., Neugebauer, K. M. Rapid folding of nascent RNA regulates eukaryotic RNA biogenesis. Molecular Cell. 85 (8), 1561-1574 (2025).
  11. Hawley, D. K., Roeder, R. G. Functional steps in transcription initiation and reinitiation from the major late promoter in a HeLa nuclear extract. Journal of Biological Chemistry. 262 (8), 3452-3461 (1987).
  12. Hawley, D. K., Roeder, R. G. Separation and partial characterization of three functional steps in transcription initiation by human RNA polymerase II. Journal of Biological Chemistry. 260 (13), 8163-8172 (1985).
  13. Zubradt, M., et al. DMS-MaPseq for genome-wide or targeted RNA structure probing in vivo. Nature Methods. 14 (1), 75-82 (2017).
  14. Tijerina, P., Mohr, S., Russell, R. DMS foot-printing of structured RNAs and RNA-protein complexes. Nature Protocols. 2 (10), 2608-2623 (2007).
  15. Liebig, A., Waldsich, C. W. Probing RNA structure within living cells. Methods in enzymology. 468, 219-238 (2009).
  16. Pelechano, V., Chávez, S., Pérez-Ortín, J. E. A Complete Set of Nascent Transcription Rates for Yeast Genes. PLOS ONE. 5 (11), (2010).
  17. Wery, M., Descrimes, M., Thermes, C., Gautheret, D., Morillon, A. Zinc-mediated RNA fragmentation allows robust transcript reassembly upon whole transcriptome RNA-Seq. Methods. 63 (1), 25-31 (2013).
  18. Wang, L. K., Lima, C. D., Shuman, S. Structure and mechanism of T4 polynucleotide kinase: an RNA repair enzyme. The EMBO Journal. 21 (14), 3873-3880 (2002).
  19. Köster, J., Rahmann, S. Snakemake a scalable bioinformatics workflow engine. Bioinformatics. 28 (19), 2520-2522 (2012).
  20. Chen, S., Zhou, Y., Chen, Y., Gu, J. fastp: an ultrafast all-in-one FASTQ preprocessor. Bioinformatics (Oxford, England). 34 (17), i884-i890 (2018).
  21. Dobin, A., et al. STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner. Bioinformatics (Oxford, England). 29 (1), 15-21 (2013).
  22. Liu, D. Algorithms for efficiently collapsing reads with Unique Molecular Identifiers. PeerJ. 7, (2019).
  23. Spasic, A., Assmann, S. M., Bevilacqua, P. C., Mathews, D. H. Modeling RNA secondary structure folding ensembles using SHAPE mapping data. Nucleic Acids Research. 46 (1), 314-323 (2018).
  24. Saldi, T., Fong, N., Bentley, D. L. Transcription elongation rate affects nascent histone pre-mRNA folding and 3′ end processing. Genes & Development. 32 (3-4), 297-308 (2018).
  25. Pan, T., Artsimovitch, I., Fang, X., Landick, R., Sosnick, T. R. Folding of a large ribozyme during transcription and the effect of the elongation factor NusA. Proceedings of the National Academy of Sciences. 96 (17), 9545-9550 (1999).
  26. Heilman-Miller, S. L., Woodson, S. A. Effect of transcription on folding of the Tetrahymena ribozyme. RNA. 9 (6), 722-733 (2003).
  27. Yu, A. M., et al. Computationally reconstructing co-transcriptional RNA folding from experimental data reveals rearrangement of nonnative folding intermediates. Molecular Cell. 81 (4), 870-883 (2021).
  28. Yu, G., et al. Genome-wide probing of eukaryotic nascent RNA structure elucidates cotranscriptional folding and its antimutagenic effect. Nature communications. 14 (1), (2023).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

RNA Structure AnalysisNascent RNA FoldingMature RNA StructureSaccharomyces CerevisiaeCo Transcriptional Structure TrackingDMS ProbingRNA Polymerase PositionBiotinylated RNATemplate SwitchingRNA Secondary Structure

Related Articles