تحليل بنية RNA مقارنة للنسخ الناشئة والناضجة في Saccharomyces cerevisiae

Lokha Ranjani Alagar Boopathy; Leena P. Sen; Leonard Schärfen; Karla M. Neugebauer

doi:10.3791/69945

Method Article

تحليل بنية RNA مقارنة للنسخ الناشئة والناضجة في Saccharomyces cerevisiae

DOI:

10.3791/69945

⸱

February 27th, 2026

Lokha Ranjani Alagar Boopathy*¹ , Leena P. Sen*¹ , Leonard Schärfen¹^,² , Karla M. Neugebauer¹

¹Molecular Biophysics and Biochemistry, Yale University, ²RNA Therapeutics Institute, UMass Chan Medical School

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لوحظ الهيكل الثانوي للحمض النووي الريبي بشكل رئيسي في الحمض النووي الريبي الناضج باستخدام طرق فحص البنية. يوحد تسلسل تتبع البنية المطابقة (CoSTseq) التسلسل النووي المستمر، الذي استخدم لدراسة موقع البوليميراز على الحمض النووي الريبي الناشئ، مع استكشاف البنية. وبالتالي، يمكن CoSTseq من مراقبة البنية الثانوية للحمض النووي الريبي في الحمض النووي الريبي تحت النسخ النشط.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أثناء النسخ، يبدأ الحمض النووي الريبي الناشئ في اقتران القواعد عند خروجه من بوليميراز الحمض النووي الريبي (Pols). تسمح هذه الاقتران القاعدي بتكوين هياكل RNA تؤثر بشكل حاسم على التعبير الجيني على مستوى معالجة RNA وترجمته واستقراره. الطرق المعتمدة لدراسة البنية الثانوية للحمض النووي الريبي تقتصر على النسخ الناضجة، بينما لا يعرف الكثير عن حالات الطي. علاوة على ذلك، فإن انخفاض الوفرة نسبيا (< 1٪) والطبيعة المؤقتة للحمض النووي الريبي الناشئ يعقدان عزله وتوصيفه. تتبع البنية المطابقة للنسخ (CoSTseq) يستفيد من التسلسل النسخي مع استكشاف البيوتين-NTP وثنائي ميثيل كبريتات (DMS) للحصول على موقع Pol وحالة اقتران القاعدة في النصوص الناشئة في الوقت نفسه. في Saccharomyces cerevisiae، تعطي CoSTseq التسلسل والمعلومات البنيوية بالقرب من الطرف الثلاثي للحمض النووي الريبي الناشئ التي تم نسخها بواسطة أي من البولات الثلاثة للحمض النووي الريبي. خلال التشغيل النسخي، يقوم البيوتين-NTP المدمج في الموقع النشط بإيقاف بولس فعليا. ثم العلاج بميثيلات DMS غير مرتبطة بنيوكليوتيدات A وC وU. تمكن عمليات إثراء البيوتين لاحقا وتخليق cDNA باستخدام نسخ عكسي من القالب من التسلسل المزدوج وحساب تفاعلات DMS كدالة لموقع Pol. يتم تنفيذ CoSTseq بسهولة جنبا إلى جنب مع فحص DMS (DMS-MaPseq)، مما يتيح التقاط نص النضج المطوي أيضا. هنا، يتم تقديم بروتوكول مفصل لنظام CoSTseq وDMS-MaPseq المتوازي، بما في ذلك التشغيل النسخي، وتحضير المكتبة، وتحليل البيانات.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يمكن للحمض النووي الريبي أن يطوي إلى هياكل ثانوية وثالثية بسبب تزاوج القواعد داخل جزيئات الحمض النووي الريبي، ويمكن أن تتأثر هذه البنى أيضا ببروتينات تعمل كمرافق لتوجيه طي الحمض النووي^{الريبي 1}. يمكن أن تكون بنية الحمض النووي الريبي شديدة الديناميكية، حيث يمكن للحمض النووي الخلوي أن يتوافق مع مجموعة من الهياكل التي تحددها المشهد الديناميكي الحراري لتوليد مجموعات من تشكيلات الحمض النووي الريبي^{المحتملة 2}. التغيرات الديناميكية في التكوين لديها القدرة على التأثير على تنظيم وتعبير الجينات ^3,4. وعلى العكس، يمكن أن يتبنى RNA هياكل مفضلة ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ملاحظة: قبل البدء، تأكد من تجهيز جميع المخازن المؤقتة المذكورة في الجدول 1. يجب تحضير جميع المواد الكيميائية في ماء خال من النوكليز. يوصى بتعقيم المخازن في المرشح عند استخدام مواد كيميائية/كواشف غير جزيئية لتحضير المخازن. بالنسبة للأقسام من 1 إلى 4، جهز ما يلي مسبقا:

1. تحضير المواد والكواشف

حضر محلول ساركوسيل بنسبة 10٪ (v/v) قبل يوم واحد على الأقل لإتاحة وقت كاف للذوبان الكامل. تعقيم المحلول المتجانس بالفلتر باستخدام مرشح بحجم 0.22 ميكرومتر. في يوم التجربة، استخدم محلول 10٪ ساركوسيل لصنع محلول ساركوسيل بنسبة 0.5٪، واتركه على الثلج حتى الاستخدام.
أجهزة....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعرض هذا القسم النتائج الفعلية الناتجة عن تنفيذ سير عمل CoSTseq وتحليله، كما هو موضح في هذا البروتوكول. أولا، يصف هذا القسم النتائج المتوقعة بعد تقييم الجودة لنجاح التحضيرات المكتبية قبل وبعد التسلسل. قبل التسلسل، يمكن للباحثين استخدام اختبار PCR وتحليل TapeStation لتأكيد وجود RNA بعد إثراء البيوتين. يشير هذا إلى العزلة الناجحة للحمض النووي الريبي الناشئ أثناء تحضير مكتبة CoSTseq. تقييم جودة البيانات بعد التسلسل، على سبيل المثال، من خلال الفحص البصري لتغطية القراءة ولاحقا باستخدام تحليل .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يبدأ الحمض النووي الريبي في الطي بشكل متزامن بسبب الحركة الأسرع لاقتران القواعد مقارنة بمعدل التخليق²⁴^، ²⁵^، ²⁶^، ²⁷. معرفتنا الحالية بطي الحمض النووي الريبي الناشئ تأتي من دراسات جزيئية واحدة للحمض النووي الريبي بدائي، أو الاستكشاف الصناعي، أو الأساليب السيليكوية. في هذا البروتوكول، يتم تقديم سير عمل مفصل ل CoSTseq؛ تسمح هذه التقنية بالكشف في

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يرغب المؤلفون في شكر الدكتور إس كيه بوباثي جيغاثامبال على الترميز وأعضاء مختبر نويجباور، وخاصة ب. بيش، على النقاشات المفيدة. وقد دعمت هذه الأعمال المعاهد الوطنية للصحة (R01GM112766 إلى KMN) وزمالة ما قبل الدكتوراه من الجمعية الأمريكية للقلب (908949 إلى LS). تم دعم LPS بمنحة تدريب من NIH 5T32GM14943803. حظي LRAB بدعم من زمالة ما بعد الدكتوراه من الجمعية الأمريكية للقلب (26POST1569544). تم دعم جمع البيانات في مركز ييل للتحليل الجينومي من قبل المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة التابع للمعاهد الوطنية للصحة تحت رقم الجائزة 1S10OD03036301A1. هذا العمل يقع على عاتق المؤلفين وحدها ولا يمثل بالضرورة الآراء الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number	Comments
10 مللي متر ATP	إنفيتروجين	18330019
10 ملليمولار بيوتين-11-CTP	جينا للعلوم الحيوية	NU-831-BIOX
10 مللي متر GTP	إنفيتروجين	18332015
10mM UTP	إنفيتروجين	18333013
10X NEBuffer 1	مختبرات نيو إنجلاند البيولوجية	B7001S	استخدم في الخطوة 7.2.1
محلول ملحي مخزن بالفوسفات 10X (PBS)	جيبكو	70011-044
20٪ SDS	RPI	L23100-500
الفينول الحمضي: الكلوروفورم	أمبيون	AM9722
خرز AMPure XP لاختيار الحجم	بيكمان كولتر	A63880	يستخدم لاختيار الحجم في الخطوة 7.5.1
باكتو بيبتون	جيبكو	211677
مستخلص خميرة الباكتو	جيبكو	212750
البيسين	سيغما ألدريتش	B3876-100G
الكلوروفورم	سيغما ألدريتش	319988
D-(+)-جلوكوز	سيغما ألدريتش	G5767-500G
ديفكو آجار	بي دي ديفكو	214010
ثنائي ميثيل كبريتات	سيغما ألدريتش	D186309-5ML
داينابيدز والتجارة؛ خرز MyOne Streptavidin C1	إنفيتروجين	65001	يستخدم لسحب البيوتين في القسم 4.1
داينابيدز والتجارة؛ mRNA DIRECT™ طقم التنقية	إنفيتروجين	61011	يستخدم لاختيار بولي أ في القسم 5.1
EDTA، درجة الحموضة 8، 0.5 ميل	سيغما ألدريتش	03690-100ML
الإيثانول	سيغما ألدريتش	E7023-500ML
جليكو بلو	إنفيتروجين	AM9516	المستخدم في الترسيبين المشترك في الخطوة 4.2.7 و5.2.4
إندورو وريج؛ النسخات العكسية	مختبرات نيو إنجلاند البيولوجية	M0681S	إنزيم RT المستخدم في الخطوة 6.3.1
كحول الأيزواميل	سيغما ألدريتش	W205710-1KG-K
إيزوبوبانول	جي تي-بيكر	9084-05-01
مجموعة PCR من KAPA HiFi HotStart	روش	07958889001	استخدم حمض نووي بول عالي الدقة في 7.3.2 و7.4.1 لتفاعلات PCR
كلوريد المغنيسيوم	سيغما ألدريتش	SLCM2154
مجموعة تنقية PCR من MinElute	تشياغن	28004	استخدم لتنظيف الحمض النووي في الخطوة 6.3.3 و7.2.2
الليغاز الريبي الريبي الأم	مختبرات نيو إنجلاند البيولوجية	M2611A
أوليغو كلين آند المركز	زيمو للأبحاث	D4060	اقتراح لتنظيف حمض نووي أوليغو في الخطوة 7.1.2
أسيتات البوتاسيوم	سيغما ألدريتش	236497-500G
كلوريد البوتاسيوم	جي تي بيكر	3040-01
هيدروكسيد البوتاسيوم	أفانتور	6984-04-01
تنظيف RNA & Concentrator-5	زيمو للأبحاث	R1014	مجموعة تنظيف الحمض النووي الريبي المستخدمة في الخطوة 5.3.2 بعد علاج PNK
RNaseOUT & trade; مثبط الريبونوكلياز المؤتلف	ثيرمو فيشر العلمي	10777019	مثبط RNase المستخدم في الخطوة 5.3.1 أثناء علاج PNK
ساركوسيل	IBI العلمي	IB07080
أسيتات الصوديوم	جودة بيولوجية	351-035-721
كلوريد الصوديوم	سيغما ألدريتش	S5150-1L
هيدروكسيد الصوديوم	ماكرون	7708-10
SUPERase و middot; In&Trade; مثبط RNase (20 U/μ L)	ثيرمو فيشر العلمي	AM2696	مثبط RNase المستخدم في الخطوة 6.3.1
كيناز متعدد النوكليوتيدات T4	مختبرات نيو إنجلاند البيولوجية	M0201S
الثبات الحراري 5 أقدام الحمض النووي النووي/الحمض النووي الريبي للتطبيق ليغاز	مختبرات نيو إنجلاند البيولوجية	M0319L
تريس-HCl، درجة الحموضة 7.4، 1M	ثيرمو ساينتفيك	J60202. K2
ترايتون X-100	تيكنوفا	T1105
تريزول وتجارة؛ المادة الكيميائية	إنفيتروجين	15596-026	بالنسبة لاستخفاض RNA الناشئ في القسم 4.2؛ ويشار إليه أيضا باسم "مادة RNA" في القسم 4
β-ميركابتوإيثانول	سيغما ألدريتش	M6250-1L

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zhang, J., Fei, Y., Sun, L. Advances and opportunities in RNA structure experimental determination and computational modeling. Nature Methods. 19 (10), 1193-1207 (2022).
Bonilla, S. L., Jones, A. N., Incarnato, D. Structural....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

تحليل بنية RNA مقارنة للنسخ الناشئة والناضجة في Saccharomyces cerevisiae

In This Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgements

Materials

References

Reprints and Permissions

Tags

Related Articles