التجميد لزراعة الزرعات المتوافقة حيويا باستخدام راتنج قابل للشفاء بالأشعة فوق البنفسجية لتعزيز تحليل التألق المناعي

Summary

يقدم هذا العمل بروتوكول التقسيم بالتجميد يستخدم تثبيت الراتنج القابل للشفاء بالأشعة فوق البنفسجية للحفاظ على سلامة واجهة الزرعة-الأنسجة مع الحفاظ على إمكانية الوصول إلى المستضدات، مما يتيح تحليلا موثوقا وعالي الدقة للفلورية المناعية لزرعات البوليمر الصناعية.

Abstract

يطرح التقييم النسيجي للغرسات الصناعية المتوافقة حيويا تحديات تقنية كبيرة بسبب عدم التوافق بين طرق معالجة الأنسجة التقليدية والخصائص الفيزيائية الكيميائية لهذه المواد. توفر الأساليب الحالية التي تستخدم تضمين التشفير الكامل حفظا هيكليا كافيا لكنها تؤثر بشكل كبير على إمكانية الوصول إلى الحواتم البصرية، مما يحد من التطبيقات الكيميائية المناعية النسيجية الضرورية لتوصيف الاستجابات المناعية للمضيف. وعلى العكس، يظهر دمج البارافين التقليدي التصاق ضعيف بالركائز الصناعية ويحد من اختيار الأجسام المضادة للتنميط المناعي الشامل. تعزز بروتوكولات التقسيط بالتجميد القياسية التوافق الكيميائي المناعي النسجي من خلال تحسين حفظ المستضدات؛ ومع ذلك، غالبا ما تؤدي هذه الطرق إلى نقص في السلامة الهيكلية للعينات التي تحتوي على زرعات، مما يؤثر على التقييم الشكلي وجودة التقسيم. لمعالجة هذه القيود، تم تطوير بروتوكول معالجة جديد يتضمن راتنجا قابلا للشفاء بالأشعة فوق البنفسجية للتثبيت الانتقائي لتركيبات الزرعة-الأنسجة قبل القطع بالتجميد. تستخدم هذه المنهجية راتنجا قابلا للبلمرة الضوئية لتوفير الدعم الميكانيكي مع الحفاظ على إمكانية الوصول إلى الحواتم ومحددات المستضدات، والتي غالبا ما تتأثر ببلمرة الراتنج الكاملة. يتيح البروتوكول توليد مقاطع عالية الجودة بسمك مثالي لتقييم التألق المناعي، محققا حفظا هيكليا متفوقا مقارنة بالتقسيمات المجمدة القياسية دون الحاجة إلى الربط المتقاطع المكثف الذي يحد من اختراق الأجسام المضادة في العينات التقليدية المدمجة في الراتنج. يمثل هذا النهج حلا عمليا وفعالا من حيث التكلفة للمعالجة النسيجية للغرسات الصناعية، حيث يوفر قدرات تحليلية محسنة لتقييم التوافق الحيوي ويسهل توصيفا تفصيليا للاستجابات المناعية المحلية عند واجهات الزرعات والأنسجة.

Introduction

المجهر المناعي الفلوري هو تقنية تحليلية أساسية في أبحاث الطب التجديدي، حيث تسهل تصور بنية الأنسجة وتركيب الخلايا باستخدام الأجسام المضادة المرافقة بالفلوروفور. تدمج هذه المنهجية الخصوصية الجزيئية للتعرف الكيميائي المناعي مع حساسية ومرونة اكتشاف الفلورة، مما يتيح ملاحظة دقيقة لتوزيعات الأهداف الخلوية داخل بيئات الأنسجة الدقيقة. تشمل طرق التألق المناعي استراتيجيات وسم مباشرة وغير مباشرة، حيث توفر بروتوكولات التألق المناعي غير المباشر تضخيم الإشارة المحسنة من خلال أنظمة الأجسام المضادة الثانوية المتقاربة مع فلوروفورات متنوعة تغطي الطيف المرئي والقريب من الأشعة تحت الحمراء¹. تسهل قدرة المنهجية على الكشف المتزامن متعدد الأهداف من خلال الفصل الطيفي توصيفا ظاهريا شاملا للمجموعات الخلوية غير المتجانسة وعلاقاتها المكانية ضمن بيئات الأنسجة الدقيقة^{المعقدة 2}.

تمتد القدرات التقنية لمجهر الفلورة المناعية إلى ما هو أبعد من تحديد المواقع التقليدية للبروتينات لتشمل التطبيقات التحليلية الكمية، بما في ذلك قياسات شدة الفلورة، وتحليلات التزامن الموضعي، وتقييمات التوزيع المكاني التي هي ضرورية لفهم وظيفة الخلية وتنظيم الأنسجة³. في سياق أبحاث التوافق الحيوي للزرعات، يوفر تحليل التألق المناعي رؤى حاسمة حول استجابات المناعة للمضيف، بما في ذلك تفاعلات الأجسام الغريبة، والسلاسل الالتهابية، وعمليات دمج الأنسجة التي تحدد قبول أو رفض الزرعة على المستويين الخلوي والجزيئي⁴.

يتطلب التنفيذ الناجح لبروتوكولات التألق المناعي دراسة دقيقة لمنهجيات معالجة الأنسجة التي تحافظ على السلامة الشكلية مع الحفاظ على الإشارة الفلورية وتقليل التألق الذاتي في الخلفية. يعتمد اختيار وسائط التضمين التقليدية على نوع النسيج، ومتطلبات التحليل اللاحق، والمستضدات المحددة محل الاهتمام. بالنسبة للمواد الصناعية والزرعات، توصي الأدبيات الحالية بشكل أساسي بدمج كامل للتشبهات، للحفاظ على الاستقرار الهيكلي^{أثناء إجراءات} التقسيم. ومع ذلك، فإن هذا النهج يفرض قيودا كبيرة بسبب الحاجة إلى ميكروتومات فائقة الميكروتومات والشفرات المتخصصة لتقسيم كتل الراتنج المبلمرة، مما يمثل استثمارا كبيرا في المعدات وخبرة تقنية. التضمين بالبارافين، مع توفير دعم هيكلي كاف للتقسيم، يدخل تغييرات شكلية على محددات المستضدات أثناء التثبيت والمعالجة من خلال الجفاف المكثف، والتقسية الكيميائية، والتسرب مع مذيبات عضوية يمكنها تشوه البروتينات وإخفاء الحواتم الجسدية. تنتج معالجة البارافين أيضا تداخلا ذاتيا في التألق الذاتي يؤثر على كشف الإشارة والتحليل الكمي. تتطلب هذه التعديلات إجراءات استرجاع المستضدات، والتي غالبا ما تتضمن استرجاع الحواتم المحفز بالحرارة (HIER) أو استرجاع الحواتم المحفزة بالبروتيوليات (PIER)، لاستعادة إمكانية الوصول إلى الأجسام المضادة⁶. على الرغم من هذه التدخلات، لا تزال العديد من الأجسام المضادة المتاحة تجاريا غير متوافقة مع العينات المدمجة في البارافين، وقد تؤدي ظروف الاسترجاع القاسية إلى تعريض جودة الإشارة الفلورية إلى تعريض تبييض ضوئي.

يقدم التقسيم بالتبريد منهجية معالجة بديلة لتطبيقات التألق المناعي. يمكن استخدام طريقتين للحفظ بالتجميد لتحضير الأنسجة. تتضمن الطريقة الأولى الحفظ السريع بالتجميد عن طريق الغمر المباشر لعينات الأنسجة الطازجة في حمام إيزوبنتان مبرد مسبقا بالنيتروجين السائل لتحقيق درجات حرارة أقل من –20 درجة مئوية، تليها التقسيم باستخدام ميكروتومات كريوستات مزودة بغرف قطع مضبوطة في درجة الحرارة. يستخدم البروتوكول الثاني فترة تثبيت قصيرة في البارافورمالديهايد (PFA) أو الفورمالين، تليها الحماية بالتجميد عبر تسرب السكروز التدريجي قبل التجميد. تخلق عملية الحفظ بالتجميد مصفوفة صلبة تحافظ على سلامة الأنسجة مع الحفاظ على تكوين البروتين الأصلي الضروري للتعرف على الأجسام المضادة. يحافظ التقسيم المجمد على الأنسجة في حالة شبه طبيعية مع تعديلات كيميائية طفيفة⁷، مما يقلل الحاجة إلى إجراءات استرجاع المستضدات القاسية ويتيح استخدام مجموعة أوسع من الأجسام المضادة الأولية، بما في ذلك تلك غير المتوافقة مع الأنسجة المدمجة بالبارافين بسبب تغطية الحواتم^{أو إزالة} الطبيعة.

عادة ما تستخدم عملية التبريد مركب درجة حرارة القطع المثلى (OCT)، وهو وسط تذوبان في الماء مكون من كحول البولي فينيل والبولي إيثيلين جليكول يوفر الدعم البنيوي أثناء التقسيم مع بقائه شفافا ومتوافقا مع أنظمة كشف الفلورة. يسهل تضمين OCT توليد مقاطع رقيقة ومنتظمة تتراوح سماكتها بين 5–15 ميكرومتر، حسب المتطلبات التحليلية المحددة^وخصائص الأنسجة. الحفاظ على تكوينات البروتين الأصلية في المقاطع المجمدة يحافظ على نسب الإشارة إلى الضوضاء المثلى الضرورية لتحليل الفلورة المناعية الكمي، مع الحفاظ أيضا على الحواتم السليمة التي تسمح باستخدام مجموعة أوسع من الأجسام المضادة الأولية، بما في ذلك تلك غير المتوافقة مع الأنسجة المدمجة بالبارافين⁸.

ومع ذلك، يطرح تقسيم الأنسجة المجمدة تحديات تقنية فريدة، خاصة عند معالجة مواد الزرعات الصناعية التي تتمتع بخصائص فيزيائيةوكيميائية مميزة مقارنة بالأنسجة البيولوجية الأصلية. يمكن أن يؤدي التمدد الحراري التفاضلي بين البوليمرات الصناعية وواجهات الأنسجة البيولوجية أثناء التجميد إلى إجهاد ميكانيكي موضعي يضر بسلامة الهيكل ويخلق تشوهات تقسيمية¹⁰. علاوة على ذلك، فإن الصلابة الجوهرية للعديد من المواد الصناعية مقارنة بالأنسجة البيولوجية المجمدة يمكن أن تسبب انحراف الشفرة أثناء التقسيم، مما يؤدي إلى سمك مقطع غير متساو وتلف لكل من العينة ومعدات القطع. تتطلب هذه القيود التقنية بروتوكولات معالجة متخصصة يمكنها تلبية المتطلبات الفريدة للعينات التي تحتوي على زرعات مع الحفاظ على مزايا التقسيم المجمد لتطبيقات التألق المناعي.

لمعالجة هذه القيود، طورت هذه الدراسة بروتوكول التجميد الذي يجمع بين تثبيت راتنج قابل للعلاج بالأشعة فوق البنفسجية انتقائيا مع معايير تقسيم الكريوستات المسيطر عليها لتمكين تحليل فلورية مناعية عالية الدقة ومتعددة المعلمات لتركيبات الأنسجة المزروعة.

Protocol

تم إجراء هذا البحث وفقا لإرشادات لجنة رعاية واستخدام الحيوانات المؤسسية في مايو كلينك (IACUC) بموجب رقم الموافقة A00003765-18-24. تم إجراء جميع الإجراءات المتعلقة بالزرعات الصناعية المتوافقة حيويا في ظروف معقمة، وفقا لبروتوكولات السلامة البيولوجية المناسبة.

1. معالجة العينات والحماية بالتبريد

ملاحظة: استخدم الفورمالين حصريا في غطاء بخار كيميائي وارتد معدات الحماية الشخصية المناسبة (PPE)، لأن الفورمالين يحتوي على فورمالديهايد، وهو مهيج قوي، ومسبب للحساسية، ومسرطن.

1. تثبيت عينات الزرع الصناعي المتوافقة حيويا المدمجة مع الأنسجة في الفورمالين المحايد 10٪ طوال الليل عند 4 درجات مئوية باستخدام ما لا يقل عن 10 مجلدات من التثبيت بالنسبة لحجم الأنسجة لضمان الغمر الكامل والاختراق الكافي. الهدف من فترة التثبيت المحدودة هذه هو تحقيق أقل قدر ممكن من الترابط المتقاطع مع الحفاظ على شكل الأنسجة. (انظر جدول المواد للمواد المستخدمة في البروتوكول.)
2. انقل العينات إلى محلول السكروز بنسبة 15٪ محضر في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) للحضانة الليلية عند درجة حرارة 4 درجات مئوية مع تحريك لطيف. تأكد من تسرب السكروز الكامل كما يتضح من غمر الأنسجة.
3. نقل العينات إلى محلول السكروز بنسبة 30٪ في PBS لحضانة ليلية ثانية عند 4 درجات مئوية. تأكيد التوازن الكامل عن طريق غوص الأنسجة إلى قاع الحاوية، مما يشير إلى تسرب السكروز الكافي وإزاحة الماء.
4. جهز نسبة حجم 1:1 من محلول السكروز 30٪ ومركب OCT. يحتضن العينات في هذا الوسط الانتقالي لمدة ساعتين عند 4 درجات مئوية، ثم ينتقل إلى 100٪ OCT لمدة ساعة واحدة لتحقيق التوازن الكامل، كما يتضح من مظهر النسيج المعتم بشكل منتظم.
5. ضع العينات بعناية في قوالب التجميد القياسية المملوءة بمركب OCT الطازج، لضمان التوجيه الأمثل لمستويات التقسيم. استمر مع واجهة الزرعة-النسيج المتاحة للإجراءات التالية. تخلص من فقاعات الهواء باستخدام ملقط مبرد مسبقا.
6. ضع قوالب التجميد المملوءة فورا على منصة الجليد الجاف لإنشاء تدرج درجة حرارة يعزز تكوين بلورات الجليد السريع من الأسفل إلى الأعلى. راقب لمدة 10–15 دقيقة حتى التصلب الكامل، ويؤكد ذلك المظهر الأبيض المعتم المميز لمركب OCT المتجمد. انقل الكتل المجمدة إلى التخزين بدرجة –80° مئوية أو مباشرة إلى غرفة التجميد للتقسيم الفوري.

2. إعداد الكريوستات والتقسيم الأولي

1. حافظ على حجرة التجميد المتحكم بها في درجة الحرارة عند –15° مئوية. تحقق من درجة الحرارة باستخدام المراقبة الرقمية المتكاملة وضبط التوازن طوال الليل قبل إدخال العينة.
2. تركيب شفرات قابلة للاستخدام مرة واحدة جديدة. اضبط زاوية الشفرة لتقسيم المواد الصناعية البيولوجية المدمج وفقا لمواصفات الشركة المصنعة.
3. يتم برمجة سمك القسم المطلوب (50–100 ميكرومتر) في التجميد عن طريق اختيار إعداد السماكة في لوحة التحكم، وضبط العنصر باستخدام مفاتيح الأسهم ، وتأكيد المعامل بالضغط على زر الضبط .
4. تقدم عبر العينة المدمجة للوصول إلى العمق المحدد مسبقا المطابق لواجهة الزرعة-الأنسجة. مراقبة سطح المقطع المتقدم لتحديد المستوى الأمثل لتطبيق راتنج الأشعة فوق البنفسجية، والذي يتميز بتغيرات طفيفة في تعتيم الأنسجة والتعرض الأولي للغرسة المحيطية، ويتم تأكيد العمق عندما تبقى هذه الميزات مرئية باستمرار عبر المقاطع المقذوعة المتتالية.
   ملاحظة: أوقف تقسيم المناطق فور وصولك إلى الواجهة الحرجة لمنع التقدم خارج المنطقة المستهدفة.

3. تطبيق راتنج قابل للمعالجة بالأشعة فوق البنفسجية

ملاحظة: تعامل مع الراتنج القابل للعلاج بالأشعة فوق البنفسجية في منطقة جيدة التهوية وارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة واحمي العينين والبشرة من ضوء المعالجة بضوء LED والأشعة فوق البنفسجية. تحتوي هذه الراتنجات على مهيجات يمكن أن تسبب تفاعلات جلدية وعينين، وقد يؤدي التعرض للأشعة فوق البنفسجية LED إلى إصابات في العين الناتجة عن الأشعة فوق البنفسجية.

1. اقطع البارافيلم باستخدام المقص بأبعاد 2–3 مم تتجاوز محيط الزرعة. افصل بعناية عن الغلاف الورقي الواقي باستخدام ملقط معقم.
2. قم بتوزيع راتنج قابل للمعالجة بالأشعة فوق البنفسجية من 5 إلى 10 ميكرولتر على سطح باراغشية مكشوف (الشكل 1A). يتم تحسين حجم الراتنج من خلال إجراء تطبيقات اختبار أولية يتم فيها توزيع أحجام تدريجية، ويتم تقييم الانتشار الناتج بصريا لضمان تغطية موحدة لسطح العينة دون فيضان زائد أو تراكم راتنج مفرط قد يتداخل مع التقسيم.
3. استبدل الغلاف الورقي الواقي فورا فوق الفيلم المحمل بالراتنج. تطبيق أسطوانة درزة بولي يوريثان (2 إنش) بضغط ثابت في تمريرات متداخلة ومتوازية، تليها تمريرات عمودية لتحقيق طبقة راتنج رقيقة وموحدة (الشكل 1B).
4. أزل طبقة الورق الواقية بعناية، كاشفا عن فيلم راتنج موزع بشكل منتظم. ضع الراتنج-بارافيلم مباشرة فوق سطح الزرعة المكشوف، لضمان محاذاة دقيقة مع واجهة الزرعة-الأنسجة (الشكل 1C).
5. ضع أسطوانة خياطة البولي يوريثان من مركز الزرعة إلى الخارج لإزالة فقاعات الهواء وضمان التلامس الوثيق بين الراتنج والأسطح الصناعية والبيولوجية (الشكل 1D).
6. الموقع 405 نانومتر بطول موجة مصدر ضوء UV LED على مسافة 2–3 سم مباشرة عند سطح الزرع. تعرض لمدة 90 ثانية لضمان البلمرة الكاملة، مع التحقق من خلال التقييم اللمسي لصلابة الراتنج وخصائصه غير اللاصقة (الشكل 1E). ضع غطاء واق من الأشعة فوق البنفسجية فوق نافذة غرفة التجميد قبل البلمرة الضوئية للأشعة فوق البنفسجية لحماية المشغل من التعرض الضار للأشعة فوق البنفسجية أثناء عملية معالجة الراتنج.

4. استعادة المقاطع وتحضير الشريحة

1. إزالة الباراغشية باستخدام حركة مستمرة واحدة لمنع التعطيل الميكانيكي لواجهة الراتنج والأنسجة. يتم تأكيد الالتصاق الكامل بالراتنج من خلال فحص السطح المكشوف تحت إضاءة التجميد بحثا عن تغطية راتنج متجانسة، وغياب رفع عند حافة الأنسجة، وغياب بقايا باراغليما مرئية.
2. يتم قطع عينات إلى سمك محدد مسبقا يبلغ 8 ميكرومتر باستخدام آلية تقدم ميكروتوم معايرة. راقب كل قسم للتأكد من وجود سمك متسق وغياب العيوب (الضغط، التمزق، القطع غير المكتمل). ضع لوح مقاومة الانقلاب بشكل مثالي لمنع الالتواء (الشكل 1F).
   ملاحظة: تستخدم شرائح زجاجية لاصقة موجبة الشحنة المحبة للماء لأنها توفر احتفاظا أفضل بالعينات الصعبة، مما يحسن الالتصاق أثناء نقل القطع والمعالجة اللاحقة. يتم توزيع الشرائح الفردية قبل نقل القسم.
3. ضع سطح اللاصق الشريح، مع ضمان التلامس الأولي عند حافة المقطع قبل التلامس التدريجي عبر المنطقة بأكملها. تأكد من التصاق سطح الراتنج المعالج بالأشعة فوق البنفسجية بالشريحة مع الحفاظ على سطح النسيج للأعلى لزيادة الفلورة المناعية (الشكل 1G).
4. اضغط بلطف على مجموعة الشريحة الجزئية لإزالة فقاعات الهواء. تحقق من الاتجاه الصحيح تحت إضاءة الكريوستات، مؤكدا أن واجهة الزرعة-الأنسجة سليمة.

5. التخزين والحفظ

1. ضع الشرائح المكتملة في صناديق تخزين معنونة مسبقا عند درجة حرارة –20° مئوية للتطبيقات التي تتطلب معالجة خلال 72 ساعة.
2. استخدم – ظروف 80 درجة مئوية لفترات الحفظ التي تتجاوز أسبوعا.

6. بروتوكول التلوين بالفلورة المناعية

ملاحظة: تعامل مع البيبسين باستخدام معدات الحماية الشخصية المناسبة، لأنه مهيج للجلد والتنفس.

1. استرجاع الشرائح من التخزين ونقلها إلى غرف الرطوبة لمدة 15–20 دقيقة لتحقيق توازن درجة حرارة الغرفة.
2. قم بثلاث دورات غسيل متتالية مدتها دقيقتان من PBS.
3. استرجاع المستضدات:
   1. طريقة استرجاع الحواتم المحفزة بالحرارة (HIER): تنزلق الموضع أفقيا في حاويات آمنة للاستخدام في الميكروويف مع محلول استرجاع هدف 1x. الميكروويف (خرج 1000 واط) عند طاقة عالية، لمدة 15 دقيقة، تليها التبريد إلى درجة حرارة الغرفة.
   2. طريقة استرجاع الحواتم المستحثة بالبروتيوليتيك (PIER): تطبيق محلول بيبسين جاهز للاستخدام بسعة 100–150 ميكرولتر لكل مقطع. غطها بأغطية بلاستيكية مؤقتة وحضن على حرارة 37° مئوية لمدة 10 دقائق في غرفة رطبة.
4. قم بثلاث دورات غسيل متتالية من PBS (دقيقتان لكل دورة).
5. ضع محلول حاجز بسعة 1 مل يحتوي على 0.1٪ سابونين و2.5٪ مصل الماعز العادي في PBS. حضن لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في غرفة رطبة.
6. قم بثلاث دورات غسيل متتالية من PBS (دقيقتان لكل دورة).
7. تطبيق 100 ميكرولتر من محاليل الأجسام المضادة الأولية بتركيزات مثالية:
   1. مضاد الكولاجين IV للأرنب متعدد النسيلات عند تخفيف 1:100.
   2. الأرانب المضادة للامينين متعددة النسيلات عند تخفيف 1:500.
   3. الأجسام المضادة وحيدة النسيلة للأرنب المضادة F4/80 عند تخفيف 1:500.
8. غط بأغطية بلاستيكية مؤقتة واحتضن الغرفة طوال الليل عند درجة حرارة 4 درجات مئوية في غرف رطبة.
9. قم بثلاث دورات غسيل PBS (دقيقتان لكل منهما).
10. تطبيق الأجسام المضادة الثانوية بتركيز 10 ميكروغرام/مل.
    1. Donkey Anti-Rabbit IgG Alexa Fluor Plus 555
    2. ماعز مضاد للأرنب IgG أليكسا فلور 488
11. حضن لمدة 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في ظروف مظلمة.
12. التلوين الاختياري لعرق جرثومة القمح (WGA):
    1. طبق WGA-Alexa Fluor 647 بمعدل 5 ميكروغرام/مل في PBS مع 2.5٪ سيروم ماعز طبيعي.
    2. غط واحتضن عند 37° مئوية لمدة 30 دقيقة. قم بثلاث دورات غسيل متتالية لمدة دقيقتين من PBS.
13. ضع وسائط تثبيت صلبة بسعة 80 ميكرولتر مع صبغة نووية مضادة لكل قسم.
14. غط الغطاء بزجاج الغطاء لإزالة فقاعات الهواء.
15. اترك الشرائح تتجف أفقيا في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين في الظلام.
16. احتفظ بالحرارة عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوع للحصول على أفضل جودة تصوير.

7. المجهر الفلوري والتقاط الصور

1. قم بإجراء التصوير باستخدام مجهر فلوري مقلوب مع مجموعات مرشحات الشركة المصنعة: 360/460 نانومتر إثارة/انبعاث، 470/525 نانومتر إثارة/انبعاث، 545/605 نانومتر إثارة/انبعاث، 620/700 نانومتر إثارة/انبعاث.
2. يتم التقاط الصور عن طريق اختيار كل قناة فلورية ضمن قائمة التصفية في برنامج المجهر. قبل تحسين التعريض، يتم إجراء إجراء توازن الأسود عن طريق اختيار تعديل توازن الأسود لضمان تصحيح دقيق لكل قناة. ثم يتم تحسين معلمات التعريض عن طريق فتح نافذة التقاط الصورة ، وتفعيل وضع البث المباشر ، وضبط ضوابط التعريض وشدة الضوء حتى يتم تحقيق نسبة إشارة إلى ضوضاء عالية دون تشبع البكسل. يتم مراقبة التشبع باستخدام شاشة الهيستوجرام الخاصة بالبرنامج وأداة تمييز البكسلات المشبعة . يتم تعديل كل قناة بشكل مستقل قبل التقاط الصورة.
3. قم بالحصول على البلاط الآلي مع تداخل الشركة المصنعة بنسبة 10٪ بين الحقول المجاورة. حافظ على ضبط التركيز التلقائي طوال فترة الاستحواذ.

Results

تقييم جودة الأقسام وتحسينها
بعد تثبيت راتنج الأشعة فوق البنفسجية وتقطيعه بسماكة 8 ميكرومتر، اجمع المقاطع على شرائح لاصقة وقيم لمراقبة الجودة. تظهر المقاطع عالية الجودة شكلا سليما دون تشققات كبيرة أو تشققات متقطعة، مع بنية نسيج مستمرة وواجهة زرعة-نسيج محفوظة (الشكل 2A). تستبعد المقاطع التي تظهر أضرارا هيكلية كبيرة، بما في ذلك التكسير أو انفصال الأنسجة عن سطح الزرعة المثبت بالراتنج، من التحليل الإضافي (الشكل 2B...

Discussion

توفر هذه الطريقة القابلة للمعالجة بالأشعة فوق البنفسجية نهجا بديلا لتشريح عينات الأنسجة المدمجة في OCT التي تحتوي على مواد صناعية يصعب معالجتها باستخدام تقنيات التقسيم المجمد القياسية. على الرغم من توفر مجموعة متنوعة من خيارات اللاصق، مثل الشرائح المشحونة، وأشرطة ربط الأنسجة، وغيرها من الدعامات اللاصقة للمساعدة في منع انفصال مقاطع الأنسجة أو العينات الهشة أثناء التعامل، إلا أن هذه المنتجات توفر التصاق بالشريحة ولا توفر التعزيز الميكانيكي اللازم عند واجهة الزرعة-الأنسجة أثناء القطع. علاوة...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
ضوء فوق البنفسجي 5W Gooseneck 395– 405 نانومتر لمعالجة الراتنج	أمازون	UPC & lrm; 603335835561
الأجسام المضادة - مضاد F4/80 (أحادي النسيلة)	أبكام	AB300421	1:500
الأجسام المضادة - الكولاجين IV (متعدد النسيلات)	أبكام	ab6586	1:100
الأجسام المضادة - Donkey Anti-Rabbit IgG AlexaFluor Plus 555	إنفيتروجين	A32794	10 ميكروغرام/مل
الأجسام المضادة - ماعز مضاد للأرانب IgG AlexaFluor 488	إنفيتروجين	A-11008	10 ميكروغرام/مل
الأجسام المضادة - لامينين (متعدد النسائل)	إنفيتروجين	PA1-16730	1:500
بايومد كلير	مختبرات الشكل	FLBMCL01	المادة المتوافقة حيويا #1
BioMed Durable	مختبرات الشكل	FLBMDU01	المادة المتوافقة حيويا #2
فورمالين مخزن بنسبة 10٪	كاردينال هيلث	C4320-101
مرشح BZ-X Cy5	كينس	OP-87766	مجموعة المرشحات
BZ-X فلتر DAPI	كينس	OP-87762	مجموعة المرشحات
BZ-X فلتر GFP	كينس	OP-87763	مجموعة المرشحات
BZ-X فلتر TRITC	كينس	OP-87764	مجموعة المرشحات
برمجيات محلل BZ-X800	كينس	BZ-X800	البرمجيات المتكاملة
زجاج فيشربراند بريميوم كوورجلاس  50 × 24 مم	فيشر ساينتيفك	12-544-14
طابعة Form4B ثلاثية الأبعاد	فورملابز	F4B-طابعة
خزان راتنج Form4	مختبرات الشكل	RT-F4-01
مصل الماعز	جيبكو	16210064
HM525 NX Cryostat	إبريديا	956641EC
فرن الميكروويف المنزلي	باناسونيك	NN-S766BA	خرج 1000 واط
أغطية البلاستيك IHC-Tek بأبعاد 24 مم × 60 مم	عالم IHC	IW-2601	غطاء مؤقت
راتنج الأشعة فوق البنفسجية منخفض اللزوجة JDiction	أمازون	6974143904430	التألق الذاتي العالي
Keyence BZ-X800	كينس	BZ-X800
لنقم بعمل راتنج الأشعة فوق البنفسجية شفاف النوع الصلب	أمازون	ALR00038	التألق الذاتي العالي
لنقم براتنج شفاف بالأشعة فوق البنفسجية عالي اللزوجة	أمازون	ALR00048
شرائح زجاجية ماتسونامي MAS مايكرو سلايد	مصدر الوافدين الجدد	SUMAS1190	شريحة لاصقة
زرع ميدبور الجراحي	سترايكر	8662	المادة المتوافقة حيويا #3
راتنج السيد راتنج الأشعة فوق البنفسجية شفاف	أمازون	B08FRF9QTB	التألق الذاتي العالي
شفرة MX35 ألترا ميكروتوم	إبريديا	3053835
فيلم مختبر بارافلام إم	بارافيلم	P7543-1EA
بيبسين	سيغما	R2283-15ML
درجة حموضة ملحية مخزفة بالفوسفات 7.4	سيغما & nbsp;	P3813
بلان أبو ولامبدا؛ 40X	كينس	BZ-PA40	عدسة الهدف
بلان أبو ولامبدا؛ 4X	كينس	BZ-PA04	عدسة الهدف
أسطوانة الدرزة البولي يوريثان	أمازون	682698799567
تركيب مضاد التلاشي الزجاجي ProLong مع صبغة NucBlue	إنفيتروجين	P36985	هوشت 33342 كونترستين
سابونين	ميليبور	558255-100 جي إم
ستينتراي	Simport	M920-2
صفائح السيليكون المعقمة	بنتك	PR72034-51N
محلول استرجاع الهدف، pH السيترات	أجيلينت	S236984-2
مركب O.C.T من Tissue-Tek	ساكورا	4583
جرثومة القمح أغلوتينين أليكسا فلور 647	إنفيتروجين	W32466	5 ميكروغرام/مل