مقالة بحثية

تأثير طول البذرة وزخارف الارتباط على تلدين sRNA-mRNA الوسيط ب Hfq، تم تحليله باستخدام FRET جزيء واحد

598 مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/69981

⸱

يناير 30, 2026

 , 
1International Institute of Molecular and Cell Biology in Warsaw

في هذه المقالة

ملخص

يتيح اختبار FRET لجزيء واحد التحليل الكمي للتلدين البوساطة ب Hfq بين sRNA وmRNA البكتيري، مما يسمح بقياس حركية التفاعل والاستقرار. تظهر النتائج التمثيلية كيف تؤثر طول البذرة، وأنماط ارتباط Hfq، وتباعد الأنماط على تكوين الدوبلكس في الحمض النووي الريبي.

الملخص

تحديد القواعد التي تحكم التلدين بين الحمض النووي الريبي الصغير البكتيري (sRNAs) وأهدافها هو تحد لأن هذه الريبات متجانسة للغاية في التسلسل والبنية. لتفكيك مساهمة الميزات الفردية، قمنا بتنويع محددات رئيسية بشكل منهجي، بما في ذلك قوة البذرة، وزخارف ارتباط Hfq، والتباعد بينها. تم اختبار تأثيرات هذه الميزات على استقرار الدوبلكس بين sRNA-mRNA باستخدام نقل طاقة رنين فورستر بجزيء واحد (smFRET)، الذي يمكن من مراقبة جزيئات RNA الفردية على مقياس الزمن الميلي ثانية ويوفر وصولا إلى أحداث ديناميكية غالبا ما تكون مخفية في اختبارات المجموعة.

نثبت أن مناطق البذور القصيرة (4-5 نطاط واحد) تشكل مركبات غير مستقرة قصيرة العمر، بينما تنتج البذور الأطول (8-10 نزال قطن) تناسلات مزدوجة مستقرة. تمديد زخارف ربط Hfq أو إدخال فاصل بين مواقع الارتباط على mRNA زاد من عمر التفاعل، مما يبرز أهمية قوة الزخارف والترتيب المكاني في كفاءة التلدين المعتمد على Hfq. علاوة على ذلك، يوفر هذا النهج إطارا قويا وقابلا للتكرار لتحليل ديناميكيات تفاعل RNA-RNA بدقة جزيء واحد ولاستكشاف آليات شابرون RNA.

المقدمة

يتم تنظيم التعبير الجيني البكتيري بشكل واسع على المستوى بعد النسخ بواسطة RNA صغيرة. تعمل هذه الحمض النووي الريبي القصير (عادة 50-300 نتوايت) عن طريق الاقتران القاعدي مع mRNA المستهدف1. في كثير من الحالات، تقوم sRNA بالتلدين بمواقع ارتباط الريبوسومات لقمع الترجمة أو تحفيز تحلل mRNA عن طريق تجنيد RNas 2,3. على الرغم من دراسة هذه التفاعلات بشكل موسع باستخدام اختبارات جينية وكيميائية حيوية، إلا أن معظم الطرق المتاحة تستنتج التنظيم بشكل غير مباشر من تأثيرات الحالة المستقرة على مستويات الحمض النووي الريبي أو مخرج البروتين، مما يصعب حل ديناميكيات الارتباط الأساسية.

غالبا ما يتطلب تنظيم الأهداف الفعال الحمض النووي الريبي (RNA) المرافق Hfq، وهو بروتين صغير يشبه Smسداسي 4,5. تمد Hfq نصف عمر sRNA من خلال حمايتها من النوكلياز6 وتعزز التلدين باستخدام mRNAالمستهدف 7,8. يحقق HFQ هذه الوظائف عبر ثلاثة أسطح مميزة لارتباط الحمض النووي الريبي بتفضيلات مختلفة: الوجه البعيد يتعرف على زخارف الحمض النووي الأسترالي (AAN) التي توجد عادة في ال mRNAs، والوجه القريب يرتبط بتسلسلات غنية بالU النموذجية لمصطلحات sRNA، والحافة تتفاعل كهربائيا مع العمود الفقري للحمض النوويالريبي 9. ومع ذلك، فإن Hfq موجود بكثرة أقل بكثير من إجمالي مجموعة الحمض النووي الريبي المتفاعل 10,11. على الرغم من هذا القيد الظاهر، تجد ال sRNA الجديدة أهدافها بسرعة وتحفز التنظيم خلال دقائق من النسخ12. تشير هذه المفارقة إلى أن تفاعلات RNA-Hfq ديناميكية للغاية، حيث تستمر الRNA في الارتباط والانفصال بدلا من البقاء مرتبطة في مركبات مستقرة13,14. فهم كيف تنتج هذه التفاعلات المؤقتة تنظيما موثوقا يتطلب وصولا تجريبيا إلى أحداث الارتباط الفردية بدلا من المتوسطات السكانية.

تتم التفاعلات بين sRNA وmRNA بواسطة تسلسلات بذور مكملة بشكل غير كامل، والتي يجب أن تحدد مواقع مطابقتها داخل mRNA التي غالبا ما تكون طويلة وذات هيكلية عالية. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تختلف المسافة بين منطقة بذور sRNA وموقع ارتباط Hfq على mRNA بشكل كبير15، مما يعقد عملية التلدين. يساعد HFQ في تجاوز هذه التحديات من خلال نقل sRNA بمرونة بين مواقع الارتباط المحتملة على الهدف، مما يزيد من احتمالية مواجهة منطقة الاقترانالصحيحة 16. يمكن للاقتران الذي يتوسط HFQ أيضا إعادة تشكيل هياكل mRNA المحلية، مما يؤدي إلى فك مناطق مترابطة مع القواعد بشكل مؤقت وكشف تسلسلات لا يمكن الوصول إليها بخلاف ذلك. ومع ذلك، يمكن أن تؤدي هذه التعديلات أيضا إلى أحداث تلدين غير منتجة أو فاشلة. يمكن أحيانا استقرار هذه التفاعلات العابرة بواسطة زخارف قوية لربط Hfq تقع بالقرب من موقع الاقتران17. على الرغم من هذه المرونة، ليست كل لقاءات sRNA-mRNA تؤدي إلى تكوين مزدوج مستقر، ولا تزال العوامل التي تحدد كفاءة التلدين غير مفهومة بشكل كاف. على وجه الخصوص، لا يزال من غير الواضح كيف تساهم محددات التسلسل الفردية كميا في أعمار الربط والاستقرار العقدي.

هنا، أنشأنا نظاما جزيئيا واحدا معاد تشكيله الحد الأدنى يتيح التلاعب التدريجي بمحددات التسلسل والقياس المباشر لحركيات التلدين باستخدام smFRET. في هذا النظام، صممنا أزواج RNA مع تلدين غير فعال في البداية وميزات رئيسية معدلة بشكل منهجي، بما في ذلك قوة البذرة، وقوة ربط النقوش ب Hfq، والتباعد بين هذه المواقع، لتحليل كيف تؤثر المعلمات الفردية على استقرار الدوبلكس. من خلال عزل ميزات التسلسل المحددة في نظام مختبر مضبوط، يمكن هذا النهج التحليل الآلي لقواعد استهداف sRNA التي يصعب فكها في الجسم الحي بسبب تعقيد الشبكة والتأثيرات التنظيمية غير المباشرة.

البروتوكول

يصف هذا البروتوكول اختبار FRET أحادي الجزيء لمراقبة تلدين sRNA-mRNA. تشمل إجراءات تصميم الحمض النووي الريبي النموذجي، والتخليق، والانحلال والوظيفية بالشرائح، والتصوير بجزيء واحد، وتحليل البيانات الكمي.

تحضير الحمض النووي الريبي
صمم تسلسلات sRNA و mRNA في سيليكو. يجب أن ينتهي كل sRNA بأداة إنهاء النسخ وتحتوي على نمط ربط Hfq غني بالU بالإضافة إلى تسلسل بذور مكمل لل mRNA المستهدف. يجب أن يتضمن ال mRNA المقابل تكرارات AAN التي تعمل كنمط ارتباط ب Hfq وتسلسل مكمل لمنطقة بذور sRNA. التسلسلات خارج ربط Hfq تنظم عشوائيا مع تجنب رموز AAN والمسارات الغنية بالU لمنع التفاعلات غير المقصودة مع Hfq. أضف تسلسلا مكملا للربط إلى نهاية mRNA بطول 3' لتمكين التثبيت على السطح أثناء التصوير. التنبؤ بهياكل RNA الثانوية باستثناء تسلسل التكملة مع الحبل باستخدام RNAstructure عبر خادم الويب أو محليا18. للتحليل القائم على الويب، قم برفع تسلسلات FASTA إلى خادم الويب RNAstructure (https://rna.urmc.rochester.edu/RNAstructureWeb) واختر Imagine a Secondary Structure. استخدم المعلمات الافتراضية (درجة حرارة 37 درجة مئوية، بدون قيود طي). بعد الحساب، افحص مخطط البنية واحتمالية الطي. تم تصنيف المناطق على أنها مسدودة إذا كانت النيوكليوتيدات داخل البذرة أو نمط ارتباط Hfq قد تنبأت باحتمالات اقتران القواعد >60٪. تم إعادة تصميم التسلسلات التي تتجاوز هذا الحد.

تحضير قوالب الحمض النووي للنسخ الصناعي عن طريق تمديد الأوليجونوكليوتيدات المتداخلة باستخدام بوليميراز DNA، وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. كان تركيز البرايمر 3 ميكرومولار لكل منها. تم استخدام برنامج الدورات الحرارية كما أوصى به المصنع، باستثناء أن عدد دورات التضخيم تم تقليله إلى 8، وهو ما كان كافيا لتمديد البادئات.

نحك RNA عند 37 درجة مئوية لمدة 3 ساعات إلى الليل باستخدام بوليميراز T7 RNA في 1× محلول نسخ (80 mM Tris-HCl، pH 8.0، 2 mM سبيرميدين، 10 mM NaCl)، مع 1 مللي مولار لكل NTP، 40 mM DTT، و30 mM MgCl2. أوقف التفاعل بإضافة EDTA إلى تركيز نهائي يبلغ 30 ملمولار. لترسيب الحمض النووي الريبي، أضف 1/10 حجم 3 M NaOAc (pH 5.4)، يليه 2.5-3 أحجام من ≥99٪ إيثانول. اخلط جيدا وحضن على درجة حرارة -80 درجة مئوية لمدة ساعة. حمض النووي الريبي الحبيبي بالطرد المركزي عند ≥20,000 جرام × لمدة 35 دقيقة عند 4 درجات مئوية. أزل السوبرناتان، اغسل الحبيبة بنسبة 70٪ إيثانول، وجففها في الهواء لفترة وجيزة. قم بإذابة حبيبة RNA في 20 ميكرولتر من 8 مولار يوريا وسخنها على 90 درجة مئوية لمدة دقيقتين. قم بتنقية الحمض النووي الريبي على جل بولي أكريلاميد بنسبة 8٪ يحتوي على 8 مولار يوريا. قم بإزالة النطاقات المعنية وسحب الحمض النووي الريبي خلال الليل في مخزن الإزالة (0.3 مليون أسيتات الصوديوم، درجة الحموضة 5.4، 1 مللي مولار EDTA). استرجاع الحمض النووي الريبي عن طريق ترسيب الإيثانول (اتبع تعليمات ترسيب الحمض النووي) وذيب الحبيبة في ماء خال من النوكلياز.

لتحضير الحمض النووي الريبي لوضع العلامات الفلورية، قم بإجراء النسخ الصناعي كما هو موصوف، مع إضافة 32 مللي مولار GMP للتفاعل لتوليد نسخ تحمل مونوفوسفات بقطر 5 أقدام. عالج الحمض النووي الريبي ب 1-إيثيل-3-[3-ثنائي ميثيل أمينوبروبيل] كربوديميد هيدروكلوريد19 (EDC) وإيميدازول لإدخال مجموعة أمين في نهاية 5 أقدام (5'). حضن الحمض النووي الريبي الريبي النووي النووي في مخزن كربونات-بيكربونات (pH 8.5) باستخدام إما أليكسا فلور 555 أو إستر Cy3 NHS، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. قم بتنقية الحمض النووي الريبي المعدل باستخدام أعمدة دوران الكروماتوغرافيا، وترسيب الإيثانول، وإذابة الحبيبات في ماء خال من النوكلياز. تحديد كفاءة الوسم مطيافا فوتومتريا عن طريق قياس الامتصاص عند 260 نانومتر وعند أقصى امتصاص خاص للصبغة باستخدام مقياس طيف نانودروب أو مئويف فوتوفوتوميتر مكافئ. احسب تركيزات الحمض النووي الريبي والصبغة باستخدام قانون بير-لامبرت ومعاملات الانقراض المقابلة التي يوفرها مصنع الفلوروفور. تعرف كفاءة الوسم بأنها النسبة المولية للصبغة إلى الحمض النووي الريبي وكانت تقترب بشكل روتيني من 100٪. يمكن تخزين الحمض النووي الريبي الموسوم عند -20 درجة مئوية.

ترتيب أوليغونيوكليوتيدات DNA التي تحمل جزءا من البيوتين 3′ ورابط C6 بزاوية 5′ أمين. ترسيب الحمض النووي باستخدام الإيثانول وأسيتات الصوديوم كما هو موضح أعلاه. ضع علامة على مجموعة الأمين ب Cy5 NHS إستر في محلول الكربونات-بيكربونات (pH 8.5) حسب تعليمات الشركة المصنعة. حدد تركيز الحمض النووي الموسوم مطيافا ضوئيا كما هو موضح أعلاه. يمكن تخزين الحمض النووي الموسوم عند -20 درجة مئوية.

تنقية Hfq
ازرع خلايا الإشريكية القولونية BL21 (DE3) Δhfq::cat-sacB التي تحمل تعبير البلازميد Hfq pET21b-EcHfq، حيث يتم التعبير عن جين Hfq من خلال محفز محفز ل IPTG. يعبر عن Hfq بدون وسم ألفة؛ يحتوي البروتين الأصلي على بقايا هيستيدين مكشوفة على السطح للسماح بالتنقيتها بواسطة كروماتوغرافيا النيكل2+ الألف. تنمو الخلايا في 1 لتر من وسط LB-Miller مع إضافة 100 ميكروغرام/ملل أمبيسيلين عند درجة حرارة 37 درجة مئوية إلى OD600 بقيمة 0.6. تحفز تعبير Hfq بإضافة IPTG إلى تركيز نهائي 1 مللي مول، وحضن لمدة 4 ساعات عند 37 درجة مئوية. احصد الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 5,000 × جرام لمدة 10 دقائق، ثم أعد تعليق الحبيبات في 50 مل من محلول التحلل (50 ملليمتر تريس-HCl، درجة حموضة 8.0، 500 ملليمول NH4Cl، 250 ملليمولار MgCl2، 1 ملليمول 2-ميركابتوإيثانول، تحذير: 2-ميركابتوإيثانول سام، مقبض في غطاء أبخرة). قم بتحليل الخلايا عن طريق الصوتية على الجليد باستخدام إعداد نبضي بدورة عمل 50٪. طبق ثلاث نبضات لمدة 40 ثانية مع فترات تبريد مدتها دقيقة واحدة على الجليد بين النبضات. قم بالطرد المركزي بعمل الليزات عند 27,000 × جرام لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية. سخن المادة الفائقة على درجة حرارة 85 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة، ثم استخدم الطرد المركزي مرة أخرى تحت نفس الظروف. عالج المادة الفائقة الناتجة ب RNase A (30 ميكروغرام/مل) وDNase I (5 U/mL) لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة مع هز لطيف، تليها الترشيح عبر مرشح 0.45 ميكرومتر. طبق الليزات الموضح على عمود كروماتوغرافيا الألفة المشحون مسبقا ب NiSO4. اغسل العمود بمحلول مؤقت (50 ملليموتر ثلاثي الهيكروليكيت، درجة حموضة 8.0، 500 ملمولار NH4Cl، 0.5 ملليمولار 2-ميركابتوإيثانول). قم بإخراج البروتين باستخدام نفس المخزن مع تركيز خطي من تدرج الإيميدازول من 10 ملليمولار إلى 1 م. اجمع الكسور التي تحتوي على Hfq وحملها على عمود كروماتوغرافيا HiLoad 16/600 Superdex 200 استبعاد الحجم، متوازن مع مخزن HB (50 ملليمو، تريس-HCl، درجة حموضة 7.5، 250 ملم، NH4Cl، 1 ملليمو، EDTA، 10٪ جلسر). شغل العمود وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. يظهر تحليل SDS-PAGE التمثيلي لتنقية Hfq في الشكل التكميلي 1. تركيز البروتين المنقي، إذا لزم الأمر، باستخدام مرشحات طرد مركزي (3 كيلو دالتون MWCO). يمكن تخزين أليكوتات Hfq المنقاة عند -80 درجة مئوية.

تجارب الجزيء الواحد
التوزيع المنحني للزيارات الكوارتزية20
جهز شرائح كوارتز مع خمسة ثقوب متوازية (قطر 0.8 مم) محفورة بالقرب من كل حافة طويلة. ضع شرائح الكوارتز وغطاء الغطاء في جرة تلوين Hellendahl (حامل الشريحة للسحب) واستخدم سونيكات في الأسيتون لمدة 20 دقيقة (تحذير: الأسيتون قابل للاشتعال ومتطاير؛ اعمل في غطاء أبخرة). كرر خطوة التنظيف باستخدام الميثانول (تحذير: الميثانول سام وقابل للاشتعال؛ ممسكه في غطاء أبخرة). اشطف الشرائح جيدا بالماء وقم بعمل صوت في 1 متر KOH لمدة ساعة واحدة (تحذير: KOH كاوه، ارتد قفازات وحماية للعين). اشطف السلايد بالماء، ثم قم بسونيك بالتتابع بالأسيتون والميثانول لمدة 20 دقيقة لكل منهما. كرر تنظيف KOH باستخدام 5 M KOH لمدة ساعة، تليها شطف مائي شامل (تحذير: تعامل مع KOH المركز مع معدات الحماية المناسبة). جفف الشرائح بالهواء. حضر مجموعة نظيفة من برطمانات تلوين هيلندال وشطفها بالهيكسان (تحذير: الهكسان قابل للاشتعال بشدة؛ امسكها في غطاء بخار)، ثم دعها تجف في الهواء. ضع الشرائح في حامل الشرائح وشطفها مرتين بالهيكسان. أضف 75 مل من الهكسان إلى حامل الشريحة وحقن بحذر 50 ميكرولتر من ثنائي كلوروديميثيل سيلان (DMDCS) تحت سطح الهكسان (ملاحظة: تجنب تعريض DMDCS للهواء). حضن السلايدات بحركة هادئة لمدة 1.5 ساعة. شطف وصوت الشرائح بالهيكسان لمدة دقيقة واحدة وكرر هذه الخطوة ثلاث مرات لإزالة بقايا DMDCS. جفف السلايدات بالهواء وأغلقها بالتفريغ في أنابيب سعة 50 مل (مثل أنابيب فالكون أو المخروطية). يمكن تخزين الشرائح المحضرة عند −20 درجة مئوية حتى الاستخدام الإضافي.

تجميع وتشغيل قنوات التدفق
يمكن تجميع قناة تدفق بسيطة باستخدام شريحة كوارتز، وغطاء زجاجي، وشريط مزدوج الوجهين، ورؤوس الماصات، والإيبوكسي. ضع شرائط رفيعة من الشريط ثنائي الوجه بين فتحات شريحة الكوارتز وضع غطاء الغطاء فوقها. أغلق الحواف الطويلة بالإيبوكسي. اقطع حوالي 5 مم أجزاء من طرف الماصة (كل من الطرف الضيق والطوق الأعرض) وأدخل واحدة في فتحة لتكون مخرجا والأخرى في فتحة موازية لتشكيل خزان مدخل. ثبت كلاهما بالإيبوكسي. يجب أن يحتفظ خزان المدخل بالسائل دون تسرب قبل الحقن. لسحب المحاليل عبر القناة، قم بتوصيل أنابيب من حقنة بسعة 1 مل إلى المخرج.

عالج القنوات بشكل مسبق باستخدام الكواشف التالية لجعل السطح وظيفيا: BSA البيوتينيل (0.2 ملغ/مل) لمدة 5 دقائق، Tween-20 (0.2٪) لمدة 10 دقائق، ونيوترأفيدين (0.1 ملغ/مل) لمدة دقيقة واحدة. حوالي 100 ميكرولتر من كل محلول يكفي لكل قناة. تجنب سحب سائل أكثر مما هو موجود في خزان المدخل، لأن ذلك سيدخل الهواء إلى القناة ويولد فقاعات. اترك كمية صغيرة من المحلول في الخزان بين الدرجات لمنع جفاف القناة. اشطف جيدا باستخدام 1× TNK (10 ملليموتر تريس-HCl، درجة الحموضة 7.5، 50 ملليمولار NaCl، 50 ملليمولار KCl) بين كل خطوة. هذا العلاج يؤسس سطحا من البيوتين-نيوترأفيدين لتثبيت الحمض النووي الريبي.

جهز دوبلكس mRNA وربط الحبال مباشرة قبل التثبيت عن طريق خلط 40 نانومولار mRNA مع 20 نانومالي بيوتينيل الحامل على حبل DNA موسوم ب Cy5. قم بإزالة طبيعة الخليط عند 75 درجة مئوية لمدة 5 دقائق في محلول TNK 1× (10 ملليموتر ثلاثي HCl، درجة حموضة 7.5، 50 ملليمولار NaCl، 50 ملليمولار كلاريكل)، ثم أعد التعبئة عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة واستقر عند 20 درجة مئوية.

تخفيف العينة بنسبة 50 ضعفا في مخزن التصوير (10 ملليموتر تريس-HCl، درجة الحموضة 7.5، 50 ملليمولار NaCl، 50 ملليمولار KCl، 4 ملليمول 6-هيدروكسي-2,5,7,8-تيتراميثيل كرومان-2-كربوكسيليك، 0.01٪ أوكتايلين غليكول مونودودسيل إيثر، 0.8٪ جلوكوز، 2 U/mL مثبط RNase) وحقنها في قناة التدفق لتثبيت mRNAs. حضن لمدة دقيقة واحدة، ثم اغسله باستخدام مخزن تصوير مدعوم بنظام تنظيف الأكسجين (165 U/mL جلوكوز أكسيداز و2170 U/mL كاتالاز) لتقليل التبييض الضوئي.

جهز مجمعات sRNA-Hfq عن طريق خلط المكونات بنسبة 1:1 إلى تركيز نهائي 250 نانومتر في مخزن TNK 1× وحضن لمدة 5-15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. قم بتخفيف المجمعات بنسبة 50 ضعفا في مخزن التصوير الذي يحتوي على نظام جمع الأكسجين وحقنها في قناة التدفق مباشرة قبل التصوير.

اكتساب بيانات جزيء واحد
قم بتركيب مجهر الفلورة الداخلية الشاملة (TIRF) المعتمد على المنشور عن طريق تشغيل كاميرا EMCCD والليزر. قم بتركيب الشريحة المعدة مع قنوات التدفق المجمعة على مرحلة المجهر وضع المنشور فوقها. استخدم برنامج واحد (https://github.com/Ha-SingleMoleculeLab) للحصول على البيانات. في البرنامج، حدد مستوى الخلفية باختيار التدرج التلقائي وانسخ القيمة التي تم الحصول عليها إلى حقل الخلفية. اضبط معدل الإطارات على 100 مللي ثانية. استخدم إكسايت أليكسا فلور 555 أو Cy3 باستخدام ليزر 532 نانومتر وCy5 باستخدام ليزر 633 نانومتر. اجمع الانبعاثات من القناتين في نفس الوقت من خلال هدف غمر في الماء بزاوية 60×. لكل فيلم، ابدأ بعشرة إطارات من الإثارة بسرعة 633 نانومتر لتحديد مواقع mRNA الموسومة ب Cy5 في مجال الرؤية. استمر في التسجيل لمدة 5 دقائق مع إثارة 532 نانومتر. أنه عملية الاقتناء بثث واحد من إثارة 633 نانومتر للتحقق من تبييض Cy5. سيؤدي ذلك إلى إنتاج ملف .pma film، والذي يمكن استخدامه للتحليل.

تحليل بيانات الجزيء الواحد
تحليل ملفات .pma الخام باستخدام سكريبتات IDL مخصصة لإجراء رسم خرائط قنوات المتبرع والمستقبل واستخراج مسارات شدة الفلورة. أولا، سجل فيلم معايرة باستخدام خرز فلوري متعدد الألوان يمكن اكتشافه في قنوات المانح والمستقبل عند الإثارة إما بليزر 532 نانومتر أو 633 نانومتر. استخدم هذا الفيلم للمعايرة لإنشاء ملف تعيين يربط قنوات المتبرع والمستقبل. تطبيق ملف التعيين الناتج على جميع التسجيلات التجريبية لتحديد أزواج المتبرع والمستقبل المقابلة، واكتشاف البقع الفلورية، وتصدير آثار زمن الشدة لتحليل FRET في المراحل النهائية. يتم توفير تعليمات مفصلة خطوة بخطوة مع النص (https://github.com/Ha-SingleMoleculeLab).

تتبع شدة العمليات في MATLAB باستخدام السكريبت s_tr_E.m. شغل السكريبت وأدخل الدليل الذي يحتوي على ملفات .traces و .pks، يليه فهرس الملف ودقة الوقت. اختر نافذة الإطار المستخدمة لتحديد النقطة عند طلب ذلك. ثم يعرض النص شدة المتبرع والمستقبل لكل نقطة واحدة. التنقل بين الجزيئات باستخدام أوامر لوحة المفاتيح (b للعودة، g للقفز إلى جزيء محدد). حدد خطوط الأساس للمانح والمستقبل (k) وتصحيح التسرب (l) بالنقر على المخططات عند الحاجة. حفظ الآثار المقبولة بشكل فردي كملفات .dat تحتوي على شدة الوقت والمتبرع والمستقبل بالضغط على s. استخدم الملفات المصدرة للتحليل الكمي في مرحلة لاحقة.

استخدم برنامج محدد الذروة لتحليل آثار smFRET الفردية واستخراج أحداث الارتباط للكمية، بما في ذلك تحليل وقت التوقف وتوزيعات حالات FRET. شغل البرنامج وافتح المجلد الذي يحتوي على ملفات .dat التتبع المصدرة باستخدام قائمة الملفات. اضبط القيم الأساسية وقيم تسرب المتبرع إلى المستقبل التي تم تحديدها مسبقا باستخدام سكريبت MATLAB. بعد ذلك، اضبط عتبات الشدة لتوجيه الكشف التلقائي عن الذروة بحيث تقع جميع أحداث الربط المثبتة بصريا فوق القيم المحددة. إذا تسبب الضوضاء في تقسيم حدث واحد إلى عدة ذروة، قم بدمجها يدويا باستخدام دالة الدمج المدمجة. انقر على حفظ ذروات الاكتشاف لتصدير الأحداث المكتشفة كملفات .csv تحتوي على وقت البدء، وقت النهاية، ومتوسط كفاءة FRET لكل حدث. تحفظ ملفات الإخراج في مجلد القمم، بينما تكتب قيم FRET المحسولة بالإطار لكل حدث في مجلد فريت الذروة. يتم حساب كفاءة FRET بقسمة شدة فلورة المستقبل على مجموع شدة المانح والمقبل، باستخدام قيم مصححة لتسريب الخلفية والمانح إلى قناة المستقبل. افحص التتبع يدويا للكشف عن تبييض ضوئي Cy5، ويحدد ذلك بانخفاض مفاجئ في كفاءة FRET مصحوبا بزيادة في شدة Cy3. عند حدوث التبييض الضوئي، افترض أن الارتباط يستمر طالما بقي فلورة Cy3 قابلة للكشف، وصحح مدة الذروة عن طريق تحرير ملفات .csv المقابلة.

استيراد قيم كفاءة FRET المحللة من ملفات فريت القمة إلى منشور GraphPad. إنشاء مخططات FRET باستخدام دالة توزيع التردد ومطابقة التوزيعات مع نماذج غاوسيان لتحديد المجموعة السائدة من FRET.

حدد أوقات التثبيت لأحداث الربط الفردية عن طريق طرح الارتباط من نقاط زمن التفكك باستخدام جدول بيانات. احسب نسبة الأحداث العابرة (<10 ثوان) لكل تكرار تجريبي. تم إجراء تحليلات إحصائية باستخدام GraphPad Prism. تم تقييم المقارنات بين حالتين باستخدام اختبارات t غير مزدوجة، وتم تحليل المقارنات بين ثلاث حالات أو أكثر باستخدام تحليل التحليل العميق أحادي الاتجاه مع اختبار توكي بعد الاختبار.

النتائج

يحدد طول البذرة النظام الديناميكي لاقتران sRNA-mRNA
أنشأنا اختبارا جزيئيا واحدا الحد الأدنى لاختبار كيفية تحكم ميزات التسلسل التلدين الذي يعبر عنه Hfq. تم تصميم النماذج الريبية وفقا للهياكل الموصوفة سابقا لأزواج sRNA-mRNA المعتمدين على Hfq 16,17، وكانت تحمل نمط ارتباط Hfq غني بالأدينوزين على mRNA وموقع ارتباط حافي غني بالأيديدين على sRNA (الشكل 1A). تم تصنيف sRNA بمادة Alexa Fluor 555 (المتبرع) في نهاية 5 أقدام وربط mRNA-DNA ب Cy5 (المستقبل)، مما سمح بالكشف عن القرب الناتج عن اقتران القاعدة عبر FRET.

تغيير تكامل البذور من 4 و5 و8 إلى 10 سنوات قبل معركة أدى إلى سلوكيات ديناميكية مميزة. مع بذرة 4 أقراص مضرات، كانت التفاعلات في الغالب مؤقتة وأظهرت كفاءة FRET غير متجانسة، مما يشير إلى اقتران قواعد غير مكتمل (الشكل 1B-D). على النقيض من ذلك، أنتجت بذور 8 و10 أحاديث مستقرة غالبا ما استمرت حتى نافذة الملاحظة (الشكل 1C). أنتجت التفاعلات حالة FRET عالية متوقعة (EFRET ≈ 0.79-0.80، الشكل 1D)، بما يتوافق مع اقتران القواعد الكامل بين الحمض النووي الريبي. تنتج بذرة بطول 5 وحدات أساس أحداث ارتباط قصيرة العمر لكنها محددة جيدا (EFRET ≈ 0.66)، مما يوفر نطاقا ديناميكيا قابلا للعمل للتعديلات اللاحقة في تسلسل الحمض النووي الريبي (الشكل 1B-D). لذلك استخدمنا تكاملية 5 نقاط أساس لجميع الاختبارات اللاحقة.

الزخارف الأقوى المرتبطة ب Hfq تزيد من استقرار مركب sRNA-mRNA
سألنا بعد ذلك كيف تعدل قوة ارتباط Hfq أعمار الربط عند تكامل ثابت 5 نقاط ضروف. تمديد نمط mRNA من AAN4 إلى AAN6 زاد بشكل كبير من احتمال تكوين مركبات مستقرة (p < 0.001). ارتفع متوسط الأعمار من 7.5 ثانية إلى 18 ثانية، وانخفض نسبة الأحداث غير المستقرة < 10 ثوان من 80 ± 2٪ إلى 68.3 ± 2.9٪ (الشكل 2A-C).

ثم اختبرنا تأثير رمز ارتباط Hfq على sRNA. تقصير موقع ربط الحافة من UUAUUUUUU إلى CUUC (sRNA-SR، "الحافة القصيرة") أدى إلى تفاعلات غير مستقرة للغاية (متوسط عمر 1.9 ثانية مع AAN4)، وتعزيز نمط mRNA في هذا السياق كان له تأثير معتدل فقط (متوسط 3.0 ثانية مع AAN6، غير معنو، الشكل 2B,C). وبالتالي، يساهم كلا الشريكين في استقرار المركب المنتج، لكن نقاط الاتصال الضعيفة بين sRNA-Hfq تحد من المكاسب الناتجة عن نمط mRNA أقوى.

يمنح فاصل بين مواقع Hfq- ومواقع البذور على mRNA مركبات أطول عمرا
يمكن أن يبقى Hfq مرتبطا بمنطقة AAN مع استخدام سطح الحافة لتسهيل البحث عن موقع اقتران sRNA الأمثل16. تشير هذه الخاصية إلى أن التباعد الإضافي بين منطقتي الارتباط في mRNA قد يؤثر على استقرار التفاعل.

لاختبار ذلك، قدمنا فاصل أحادي السلسلة بقوة 15 NT بين مواقع ارتباط Hfq و sRNA (N15). أدى هذا التعديل إلى زيادة عمر أحداث التلدين المستقرة بشكل كبير من 7.5 ثانية (AAN4) إلى 47 ثانية (AAN4-N15) (ص < 0.01) (الشكل 3A,B). كما انخفضت نسبة أحداث الربط التي استمرت أقل من 10 ثوان من 80 ± 2٪ إلى 44 ± 6٪ (الشكل 3C). تشير هذه البيانات إلى أن المرونة الإضافية بين وحدات الربط يمكن أن تستقر الوسائط الوسيطة في التلدين وتعزز الدوبلكس لفترة أطول.

توفر البيانات:
جميع البيانات الداعمة لنتائج هذه الدراسة، بما في ذلك مسارات FRET الجزيء الواحد، ومجموعات البيانات المعالجة، ونصوص التحليل، متاحة للجمهور في مستودع بيانات مندلي على: doi:10.17632/3z8fng2c8g.1

الشكل 1
الشكل 1: تأثير تكامل sRNA-mRNA على كفاءة الربط. (أ) اختبار smFRET لتلدين sRNA-mRNA. يؤدي اقتران القواعد بين sRNA الموسوم ب Alexa Fluor 555 ومجمع mRNA-Cy5-DNA المثبت إلى إشارة FRET عالية. تحتوي mRNA النموذجية على موقع ارتباط Hfq (AAC)4 (أزرق) وموقع ارتباط sRNA (S5، أحمر)، يليه خمسة نيوكليوتيدات ومنطقة هجينة RNA-DNA. تحتوي sRNA على موقع ربط الحافة (برتقالي). الألواح في (B-D) مرتبة حسب الشرط التجريبي (طول البذرة). (ب) حدث ارتباط sRNA ممثل على جزيء mRNA واحد. تظهر آثار شدة الفلورية من sRNA الموسوم ب Alexa Fluor 555 (مانح، أخضر) وحبل Cy5-DNA (المستقبل، الأحمر). كان Cy5 متحمسا مباشرة خلال أول وآخر عشرة إطارات من التسجيل. (ج) مخططات الراستية التي تصور 50 جزيء mRNA ممثل مرتبطة ب sRNA-Hfq. يمثل كل شريط أفقي تفاعلا واحدا بين sRNA-mRNA. (د) مخططات مخططات كفاءة FRET للتفاعلات بين mRNA وsRNA تحتوي على 4 bp (N = 416 mRNA)، 5 bp (N = 513 mRNA)، 8 bp (N = 191 mRNA)، أو 10 bp (N = 105 mRNAs) مناطق تكميلية. تم حساب كفاءة FRET من شدة المتبرع والمستقبل المصحح للقاعدة وبسبب التسرب لأحداث الارتباط الفردية على فترات 0.1 ثانية. تظهر التركيبات الغاوسية (الأزرق) كأنها تشير إلى الفئة السائدة من FRET ولم تستخدم لحساب قيم E_FRET. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 2
الشكل 2: تأثير طول الربط بنمط Hfq على تفاعلات sRNA-mRNA. منطقة اقتران القواعد في جميع الأنواع طولها 5 وحدات إطالة. (أ) مخططات النقطية تظهر 50 mRNA ممثلة مرتبطة بمركبات sRNA-Hfq. كل شريط أفقي يمثل تفاعلا واحدا. توضح الرسوم التوضيحية أعلاه تصاميم RNA المقابلة مع تغييرات في عدد تكرارات (AAC) في mRNA وطول منطقة ارتباط الحافة في sRNA (SR = "الحافة القصيرة"). التلوين كما في الشكل 1A. (ب) مخططات التشتت لأعمار ربط sRNA-mRNA. كل نقطة تمثل حدث ربط واحد. متوسط العمر (خط أفقي أحمر): 7.5 ثانية ل mRNA-AAN4 + sRNA (N = 188 mRNA)، 18 ثانية ل mRNA-AAN6 + sRNA (N = 142 mRNA)، 1.9 ثانية ل mRNA-AAN4 + sRNA-SR (N = 85 mRNA)، و3 ثوان ل mRNA-AAN6 + sRNA-SR (N = 149 mRNA). (ج) رسم بياني شريطي يوضح نسبة أحداث الربط التي تقل عن 10 ثوان. تمثل أشرطة الخطأ الانحراف المعياري من مجموعتين بيانات مستقلتين. تحليل إحصائي بواسطة ANOVA أحادي الاتجاه مع اختبار توكي بعد الوقوع للمقارنات المتعددة. p < 0.001، ****p < 0.0001؛ NS، غير مهم. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 3
الشكل 3: تأثير طول الفاصل بين مواقع ارتباط Hfq و sRNA على تفاعلات sRNA-mRNA. منطقة اقتران القواعد في جميع الأنواع طولها 5 وحدات إطالة. (أ) مخططات نقطية تصور 50 mRNA ممثلة مرتبطة بمركب sRNA-Hfq. يمثل كل شريط أفقي حدث ربط واحد. توضح الرسوم البيانية أعلاه تصميم الحمض النووي الريبي المقابل. N15 = فاصل 15 nt من التسلسل العشوائي. التلوين كما في الشكل 1A. (ب) مخططات التشتت لأعمار ربط sRNA-mRNA. كل نقطة تمثل حدث ربط واحد. متوسط العمر (الخط الأفقي الأحمر): 7.5 ثانية ل mRNA-AAN4 + sRNA (N = 188 mRNA) و47 ثانية ل mRNA-AAN4-N15 + sRNA (N = 289 mRNA). (ج) رسم بياني شريطي يوضح نسبة أحداث الربط التي تقل عن 10 ثوان. تمثل أشرطة الخطأ الانحراف المعياري من مجموعتين بيانات مستقلتين. تحليل إحصائي بواسطة اختبار t غير مرتبط. **p < 0.01. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل الإضافي 1: تنقية الإشريكية القولونية Hfq. تحليل SDS-PAGE لتعبير وتنقية Hfq. (الأعلى) عينات تم جمعها أثناء التنقية على عمود تقارب Ni2+ (HiTrap)، بما في ذلك قبل الحث، وبعد الحث، والحبيبات، والليزات، والحمل، والتدفق عبر الجسم، وكسور الغسيل، وكسور القمم المائلة. (الأسفل) SDS-PAGE للكسور القصوى بعد كروماتوغرافيا استبعاد الحجم على عمود Superdex 200 بتقنية HiLoad 16/600. تشير إلى أشكال أحادية (~11 كيلو دالتون) وهيكسساميري (~66 كيلو دالتون) من Hfq. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

المناقشة

تؤسس هذه الدراسة اختبارا جزيئيا واحدا الحد الأدنى لتحليل كيفية تحديد ميزات تسلسل الحمض النووي الريبي المحددة لكفاءة التلدين الهوائي sRNA-mRNA الذي يوساط بواسطة Hfq. من خلال تغيير طول البذرة، وقوة ربط الزخارف ب Hfq، والتباعد بين وحدات الربط، قمنا بقياس كيفية مساهمة كل معلمة في استقرار الدوبلكس بدقة جزيء واحد. على عكس قياسات المجموعات التي تبلغ عن التأثيرات المتوسطة حسب السكان، فإن هذا النهج يحل بشكل مباشر أحداث الارتباط والتفكك الفردية، مما يمكن من قياس التباين الحركي والتفاعلات العابرة. تظهر نتائجنا أن حتى مناطق البذور القصيرة يمكن أن تتفاعل مؤقتة، بينما تنتج البذور الأطول دوبلكس مستقر مع أعمار مطولة. تتوافق هذه النتائج مع بيانات التكوين والجسم السابقة التي تظهر أن مناطق البذور الطبيعية في sRNA البكتيرية عادة ما تمتد عبر 6-12 نيوكليوتيد ونادرا ما تشكل دوبلكس مكمل بالكامل 21,22,23.

كما وجدنا أن كل من رموز ربط mRNA و sRNA ب Hfq تؤثر بقوة على استقرار الدوبلكس. تمديد نمط الحمض النووي الريبي المغناطيسي على mRNA زاد من عمر الربط، بينما أدى تقصير موقع ارتباط الحافة إلى فقدان استقرارها بشكل ملحوظ. يدعم هذا نموذجا تعاونيا حيث يثبت وجه Hfq البعيد زخارف mRNA الغنية بالأدينوسين، ويستعين الحافة sRNA الغنية باليوريدين لتعزيز محاذاة فعالة للمناطق التكميلية 9,17. على عكس الاختبارات الجينية أو المعتمدة على المبلغ، التي تكتشف عادة النتائج التنظيمية المنتجة فقط، يفصل هذا النظام كميا بين استقرار الارتباط والتأثيرات اللاحقة، مما يسمح بمقارنة مباشرة لكيفية تعديل ميزات التسلسل الفردية لعمر التفاعل الفيزيائي. يكون نمط ربط الحافة القوي مهما بشكل خاص عندما تكون هناك حاجة لإعادة ترتيب هيكلية لاقتران sRNA-mRNA، لأنه يعزز احتفاظ الحمض النووي الريبي على Hfq17. يعتقد أيضا أن الحافة تعزز المسح الجانبي لشبكات mRNA بواسطة مجمعات sRNA-Hfq16، وهي خاصية قد تكون مهمة بشكل خاص عندما تكون المواقع المستهدفة بعيدة عن منطقة ارتباط Hfq. تدعم نتائجنا مع فاصل 15-NT بين مواقع الربط هذا الرأي، مما يوضح أن المرونة الإضافية بين البذرة ونمط Hfq تعزز استقرار الاقتران، ربما عن طريق تقليل القيود الستيريكية أثناء تبادل الخيوط.

بعيدا عن الأنظمة الطبيعية، فإن النتائج ذات صلة بتصميم sRNA الصناعي أو الهندسي. تركز معظم استراتيجيات التصميم الحالية على تحسين منطقة البذور أو السقالة العامة 23,24,25، لكن بياناتنا تبرز محددات إضافية مثل التباعد بين نمط ربط Hfq والمنطقة المستهدفة. نظرا لأن ميزات التسلسل تقدم بطريقة مضبوطة ومعيارية، يوفر الاختبار إطارا تجريبيا منهجيا لاختبار قواعد التصميم. يمكن لهذا المبدأ أن يوجه بناء مستقبلي للحمض النووي الريبي الاصطناعي مع تحسين كفاءة تنظيمية.

بينما يتيح هذا النهج التحليل الكمي والقابل للتكرار لتفاعلات RNA-RNA، إلا أنه يعاني أيضا من بعض القيود. يفحص الاختبار المناطق المكملة بالكامل، بينما تحتوي معظم التفاعلات الفسيولوجية بين sRNA-mRNA على عدم تطابق وانتوءات يمكن أن تؤثر على التعرف والتنظيم. تقيس الطريقة أعمار ارتباط sRNA-mRNA لكنها لا تعالج مباشرة النتائج التنظيمية لاحقا، مثل تثبيط الترجمة أو تحلل mRNA. قد تشمل التعديلات المستقبلية لهذا الاختبار مناطق بذور غير متطابقة، ومحتوى GC متنوع، أو ريبوسومات وديغرادوسومات لدراسة كيفية تشكيل هذه العوامل حركية الارتباط بشكل منهجي.

الإفصاحات

لا يوجد تضارب مصالح لدى المؤلفين.

شكر وتقدير

نشكر البروفيسورة سارة وودسون على تسهيل الوصول إلى أجهزة الجزيء الواحد. تم تمويل هذه الدراسة من قبل المركز الوطني للعلوم في بولندا (2022/46/E/NZ1/00462 إلى EMM)، ومنحة تركيب EMBO (IG 5730-2024 إلى EMM).

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
0.45 μ مرشح mميليبورHABG04700
عمود Hi-Trap بحجم 5 ملل  سيتيفاGE17-0408-01
الأسيتون ميرك270725درجة HPLC
أكريلاميد: محلول بيس-أكريلاميدميركA2792-100ML
ALEXA555 NHS سوكسنيميديل إسترثيرمو فيشرA20009
مرشحات Amicon Ultra Centrifugal (NMWL، 3 كيلو دالتون)ميركUFC900308
كلوريد الأمونيومميرك1330-500G
الأمبيسيلينميركA9518-5G
رابطة محترفي التنسلينيجال كيميكاولزK054.1 
بيتا-ميركابتوإيثانولميركM3148-500ML
بيو-بي إس إيهميركA8549-10MG
أعمدة Bio-Spin مع Bio-Gel P-30راد سيرة ذاتية7326231للتنقي الموسوم بالحمض النووي الريبي
الكاتالازميركC9322
CTPلينيجال كيميكاولزK057.4 
إستر CY3 HNSسيتيفاPA13105
إستر السكرينيميديل من Cy5 NHSسيتيفاPA15101
DDTثيرمو فيشرR0861
دي كلوروديميثيل سيلانميرك440272
أوليغومرات الحمض النووي (الحبل) وهي رابطة أمينية 5&برايم؛ C6 ؛العلم الحراريلا يوجد
دنايز Iثيرمو ساينتفيك18047019
EDCالعلم الحراريPG82079
EDTAميركED2SS-1KG
كاميرا EMCCD  أندور
الإيثانولميرك1085430250
الجلوكوزميركD9434-1KG
أكسيداز الجلوكوزميركG2133-50KU
الجلسرولميركG5516-1L
GMPميركG8377
GTPلينيجال كيميكاولزK056.4 
HCLميرك1.00318
الهيكسانثيرمو فيشر045652.M1
عمود استثناء حجم Superdex 200 في HiLoad 16/60سيتيفاGE28-9893-35
IPTGميرك420322-1GM
KClميركP9541-1KG
KOHميرك484016-1KG
كلوريد ماجينسيمميركM8266-1KG
الميثانول  ميرك34885-Mدرجة HPLC
نيوترافيدينثيرمو فيشر31000
كبريتات النيكلميرك1067261000
نيكولميركP8925-1G
بوليميراز Q5NEBM0491Sيستخدم في إنتاج قالب النسخ في المختبر
RNase Aالعلم الحراريEN0531
RNasin PlusبروميغاN2611
أسيتات الصوديومميركS7545-100G
كلوريد الصوديومسيغما-ألدرتشS3014-1KG
سبيرميدينميرك لايف ساينسS2626
قاعدة تريسثيرمو ساينتفيك17926
ترولوكسميرك238813-1G
اليورياميركتحت 1250-5 كجم
UTPلينيجال كيميكاولزK055.3 

المراجع

  1. Alquethamy, S., Lalaouna, D., Tree, J. J. What makes a small RNA work. Nucleic Acids Res. 53 (12), 563(2025).
  2. Prévost, K., Desnoyers, G., Jacques, J. F., Lavoie, F., Massé, E. Small RNA-induced mRNA degradation achieved through both translation block and activated cleavage. Genes Dev. 25 (4), 385-394 (2011).
  3. Massé, E., Escorcia, F. E., Gottesman, S. Coupled degradation of a small regulatory RNA and its mRNA targets in Escherichia coli. Genes Dev. 17 (19), 2374-2383 (2003).
  4. Panja, S., Woodson, S. A. Hexamer to monomer equilibrium of E. coli Hfq in solution and its impact on RNA annealing. J Mol Biol. 417 (5), 406-412 (2012).
  5. Sauter, C., Basquin, J., Suck, D. Sm-like proteins in eubacteria:the crystal structure of the Hfq protein from Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 31 (14), 4091-4098 (2003).
  6. Andrade, J. M., Pobre, V., Matos, A. M., Arraiano, C. M. The crucial role of PNPase in the degradation of small RNAs that are not associated with Hfq. RNA. 18 (4), 844-856 (2012).
  7. Panja, S., Schu, D. J., Woodson, S. A. Conserved arginines on the rim of Hfq catalyze base pair formation and exchange. Nucleic Acids Res. 41 (15), 7536-7546 (2013).
  8. Soper, T. J., Woodson, S. A. The rpoS mRNA leader recruits Hfq to facilitate annealing with DsrA sRNA. RNA. 14 (9), 1907-1917 (2008).
  9. Updegrove, T. B., Zhang, A., Storz, G. Hfq:the flexible RNA matchmaker. Curr Opin Microbiol. 30, 133-138 (2016).
  10. Moon, K., Gottesman, S. Competition among Hfq-binding small RNAs in Escherichia coli. Mol Microbiol. 82 (6), 1545-1562 (2011).
  11. Hussein, R., Lim, H. N. Disruption of small RNA signaling caused by competition for Hfq. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (3), 1110-1115 (2011).
  12. Papenfort, K., et al. SigmaE-dependent small RNAs of Salmonella respond to membrane stress by accelerating global omp mRNA decay. Mol Microbiol. 62 (6), 1674-1688 (2006).
  13. Wagner, E. G. H. Cycling of RNAs on Hfq. RNA Biol. 10 (4), 619-626 (2013).
  14. Roca, J., Santiago-Frangos, A., Woodson, S. A. Diversity of bacterial small RNAs drives competitive strategies for a mutual chaperone. Nat Commun. 13, 2449(2022).
  15. Tree, J. J., et al. Identification of bacteriophage-encoded anti-sRNAs in pathogenic Escherichia coli. Mol Cell. 55 (2), 199-213 (2014).
  16. Małecka, E. M., Woodson, S. A. RNA compaction and iterative scanning for small RNA targets by the Hfq chaperone. Nat Commun. 15, 2069(2024).
  17. Małecka, E. M., Woodson, S. A. Stepwise sRNA targeting of structured bacterial mRNAs leads to abortive annealing. Mol Cell. 81 (9), 1988-1999.e4 (2021).
  18. Reuter, J. S., Mathews, D. H. RNAstructure: software for RNA secondary structure prediction and analysis. BMC Bioinformatics. 11, 129(2010).
  19. Rasnik, I., McKinney, S. A., Ha, T. Nonblinking and long-lasting single-molecule fluorescence imaging. Nat Methods. 3 (11), 891-893 (2006).
  20. Hua, B., et al. An improved surface passivation method for single-molecule studies. Nat Methods. 11 (12), 1233-1236 (2014).
  21. Kawamoto, H., Koide, Y., Morita, T., Aiba, H. Base-pairing requirement for RNA silencing by a bacterial small RNA and acceleration of duplex formation by Hfq. Mol Microbiol. 61 (4), 1013-1022 (2006).
  22. Bandyra, K. J., et al. The seed region of a small RNA drives the controlled destruction of the target mRNA by the endoribonuclease RNase E. Mol Cell. 47 (6), 943-953 (2012).
  23. Brück, M., et al. A library-based approach allows systematic and rapid evaluation of seed region length and reveals design rules for synthetic bacterial small RNAs. iScience. 27 (9), (2024).
  24. Han, K., Kim, K. S., Bak, G., Park, H., Lee, Y. Recognition and discrimination of target mRNAs by Sib RNAs, a cis-encoded sRNA family. Nucleic Acids Res. 38 (17), 5851-5866 (2010).
  25. Sharma, V., Yamamura, A., Yokobayashi, Y. Engineering artificial small RNAs for conditional gene silencing in Escherichia coli. ACS Synth Biol. 1 (1), 6-13 (2012).

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

التهجين بوساطة Hfqالتفاعل بين sRNA وmRNAاستقرار ازدواج RNAمرافق RNAديناميكيات RNA-RNAالحمض النووي الريبي الصغير البكتيريتباعد الزخارف
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.