Method Article

سير عمل للتصوير الحي والتحليل الكمي لشبكات الأنابيب الدقيقة غير المركزية في بويضات ذبابة الفاكهة

DOI:

10.3791/69983

⸱

June 26th, 2026

 ,  , 
1iNOVA4Health, NOVA Medical School, Faculdade de Ciências Médicas, Universidade NOVA de Lisboa

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا، نقدم بروتوكولا يجمع بين التصوير الحي وأدوات التحليل الآلي لتحليل ديناميكيات الأنابيب الدقيقة في بويضة ذبابة الفاكهة . يتيح هذا السير من قياس سلوك الأنابيب الدقيقة بكفاءة وإمكانية إعادة إنتاجها، بما في ذلك النمو والاتجاه والسرعة والتنظيم المكاني، ويمكن تكييفه مع أنواع الخلايا الأخرى عند التحسين.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هيكل الخلايا الميكروتيوبول (MT) ضروري للعديد من وظائف الخلية، بما في ذلك شكل الخلية، قطبيتها، الهجرة، والانقسام. بينما تعمل الجساتير المركزية كمركز تنظيم رئيسي للمتناتلين المغناطيسي (MTOC) في الخلايا الحيوانية المنقسمة، تعتمد العديد من الخلايا المتمايزة، بما في ذلك بويضات ذبابة الفاكهة ، على مسارات المركز لتجميع شبكات الميثوسومات. على عكس المعرفة الواسعة بتنظيم التوتر المغناطيسي في الخلايا المتكاثرة، لا يعرف الكثير عن كيفية تجميع شبكات التصنيع المغناطيسي بدون مركزات. توفر بويضات ذبابة الفاكهة نموذجا قويا لدراسة تنظيم وديناميكيات التصلب العضلي الصدمي. ومع ذلك، فإن شبكة التصوير الموسيقي الكثيفة لديهم تتحدى التصوير التقليدي. يتيح التصوير الحي التصور في الوقت الحقيقي لنمو واتجاه التصوير المغناطيسي، ومع ذلك تبقى طرق التحليل الموحدة محدودة. هنا، نقدم بروتوكولا قائما على التصوير الحي لتحليل ديناميكيات نمو التصلب المغناطيسي في بويضات ذبابة الفاكهة باستخدام بروتين الارتباط النهائي 1 (EB1)-بروتين فلوري أخضر (GFP)، وهو بروتين تتبع فائز يحدد مواقع بلمرة الميكروفونات النشطة. يتيح المجهر الكونفوكلي عالي الدقة من Airyscan اكتشاف مذنبات EB1، بينما توفر الماكروز المخصصة في فيجي وسكريبتات بايثون قياسا مبسطا وقابلا لإعادة إنتاج كثافة المذنبات وسرعتها وطولها واتجاهها. قمنا بالتحقق من صحة هذه الطريقة من خلال مقارنة بويضات التحكم مع تلك التي خضعت لإزالة بوليمر الميكروبوتولات الناتجة عن البرد، بالإضافة إلى طفرات باترونين (CAMSAP في البشر)، وهي مثبت متلازمة محفوظ للأنابيب الدقيقة ناقص الطرف ومكون أساسي في مراكز تنظيم الأنابيب الدقيقة غير المركزية (ncMTOC)، كأداة تحكم إيجابية لديناميكيات الميكروبوتولات المتضررة. كشفت تحليلاتنا عن ديناميكيات MT الخاصة بالمنطقة، بما في ذلك الإثراء الأمامي لمذنبات EB1 وتحيزات الاتجاه المميزة، وأكدت حساسية سير العمل لاكتشاف الاضطرابات الطفيفة في نمو MT. يوفر هذا النهج إطارا موثوقا وسهل الاستخدام لدراسة سلوك الميثوتاثي في البويضات. يتيح البروتوكول خطوة بخطوة دراسة منظمات الميثوتل العضلي في هذا السياق وقد يكون قابلا للتكيف مع أنواع الخلايا المتمايزة الأخرى، مثل الخلايا العصبية وخلايا الظهارة، مع تحسين مناسب. وبشكل أوسع، يدعم الدراسات الميكانيكية والشاشات الجينية التي تفحص كيف تشكل بنى التركيب المغناطيسي المتنوعة التي تكمن وراء الوظائف الخلوية المتخصصة.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعد الهيكل الخلوي للأنابيب الدقيقة (MT) مكونا أساسيا في الخلية حقيقية النواة، ويلعب أدوارا أساسية في تحديد والحفاظ على شكل الخلية وقطبيتها وانقسامها. السلوك الديناميكي لبوليمرات MT، الذي يتميز بالنمو والانكماش، ضروري للعديد من العمليات القائمة على MT 1,2. يعتمد تجميع مصفوفات MT المختلفة على العمل المشترك لمراكز تنظيم الأنابيب الدقيقة (MTOCs)، التي تنبع منها الأنابيب الدقيقة، ونشاط بروتينات تنظيمية متنوعة للأنابيب الدقيقة التي تتحكم في استقرار واتجاه وديناميكيات MT 1,2,3. أفضل MTOC دراسة هو الجزر، الذي يولد مصفوفات شعاعية من الميتوسوم الميتروزي مهمة لتنظيم شكل الخلية وقطبيتها في الطور التداخل ولتجميع المغزل المنشلي في الانقسام 4،5. ومع ذلك، عند الخروج أو التمايز الانقسامي، كما في الخلايا العصبية والخلايا الظهارية، غالبا ما يخفف نشاط MTOC المركزي، وفي الحالات القصوى، مثل البويضات، يمكن استبعاده 6,7. يرتبط هذا غالبا بإعادة تشكيل هيكل خلوي MT حسب نوع الخلية، مع تعيين وظيفة MTOC لمواقع خلويةأخرى 2،3،8، والتي يشار إليها عادة باسم MTOCs غير المركزية (ncMTOCs). بينما تم إحراز تقدم كبير في توضيح تنظيم الميتوزيكس في الخلايا المنضلية، لا يعرف الكثير نسبيا عن كيفية تكوين التوزيعات العصبية العصبية (MT) واستقرارها وترتيبها المكاني في الخلايا الحيوانية التي تخرج من الانقسام أو تخضع للتمايز2. ومن الجدير بالذكر أنه في الكائنات الحية، معظم الخلايا غير قابلة للانقسام؛ لقد خرجوا من دورة الخلية و/أو تمايزوا. لذلك، من الضروري فهم كيفية تجميع وتنظيم هيكل خلوي MT في هذه السياقات. هذه المعرفة ضرورية لاكتشاف كيفية إنشاء هياكل MT المميزة لدعم الوظائف الخلوية المتخصصة.

توفر بويضة ذبابة الفاكهة الميلانوغاستر نظاما قويا لدراسة تنظيم ووظيفة التصلب العضلي العضلي. في المراحل المتوسطة من تكوين البويضات، يتم تخفيف نشاط الجري المركزي9، وتنتج التوزيعات المئوية من NCMTOCs المتمركزة في قشرة البويضة الأمامية الجانبية (الشكل 1B). تعد شبكة MT هذه ضرورية لتحديد مواقع mRNA الأم، والبروتينات، والعضيات، والتي تعتبر بدورها حاسمة لتحديد محاور الأجنة المستقبلية وتطورها10,11. أظهرت أبحاثها السابقة أن ncMTOCs في البويضة تتكون من بروتين MT ناقص الطرف Patronin، الذي يشكل مركبا مع بروتين Shot، المرتبط بهيكل خلوي الأكتين القشري. تم اقتراح أن ينمو الميتوسينات من شظايا قصيرة من ميتوناتيس مولدة بواسطة إنزيمات القطع مثل الكاتانين، والتي يمكن أن تعمل كبذور لبلمرة MT12. تم اقتراح آليات مماثلة في خلايا متمايزة أخرى، مثل الخلايا العصبية13، حيث يقل النشاط المركزي. ومع ذلك، فإن الآليات التي ينتج بها القطع شبكات MT معقدة، مثل تلك الموجودة في البويضة، لا تزال غير مفهومة جيدا. لا يزال من غير الواضح ما إذا كانت ال MTs في هذه السياقات تتشكل أساسا من خلال إعادة ترتيب قائم على القطع أو من خلال التواء النووي المؤقت لل MT. تعقيد شبكة MT للبويضات يجعلها نظاما مثاليا لدراسة كيفية توليد وتنظيم MT خارج السياق المركزي المعروف. ومن الجدير بالذكر أن هذا يشكل تحديا للتصوير والتحليل: فالشبكة الكثيفة للميكروفونات داخل الخلية تجعل من الصعب تحديد الميكروفونات الفردية باستخدام طرق التلوين المناعي التقليدية أو التصوير الثابت 2,14.

لقد حسن التصوير الحي بشكل كبير القدرة على دراسة شبكات التصوير المغناطيسي المغناطيسي، حيث يسمح بتصور أحداث بلمرة الميكروفونات المغناطيسية في الوقت الحقيقي، مما يوفر رؤى رئيسية حول ديناميكيات واتجاه نمو الميكروفونات. وقد حللت دراسات سابقة ديناميكيات نمو المونثوتراث في البويضات بنجاح باستخدام التصوير الحي لمؤشرات الطرف الزائد 14,15,16. ومع ذلك، في كثير من الحالات، يتم وصف إجراءات تحليل الصور المستخدمة لقياس ديناميكيات MT بشكل موجز فقط، أو تعتمد على تطبيقات مخصصة أو خاصة بالمختبر، أو لا تتوفر للجمهور، مما يحد من قابلية التكرار والتبني الأوسع. تبني طريقتنا على هذه الأساليب السابقة من خلال توفير خط تحليل موثق بالكامل، متاح بشكل مفتوح، وسهل الاستخدام، يتيح القياس الموحد لمعلمات نمو MT عبر مجموعات البيانات والظروف التجريبية. في هذا البروتوكول، يتم تصوير ديناميكيات MT في منتصف تكوين البويضات، عندما يتم تنظيم الهيكل الخلوي للMT بواسطة شبكات MT غير مركزية. يتم تصور ال MTs النامية باستخدام EB1-GFP، وهو بروتين تتبع MT بجانب الطرف17,18، ويتم الحصول عليها باستخدام المجهر الكونفوكالي بالليزر مع كاشف مصفوفة في وضع السرعة العالية. تكمن جدة نهجنا في تحليل الصور: خط أنابيب موثق بالكامل وسهل الاستخدام خطوة بخطوة يتطلب من المستخدمين اختيار مناطق الاهتمام فقط. يتم تسهيل معالجة الصور وقياسها بواسطة ماكروز فيجي المخصصة وسكريبتات بايثون، مما يتيح اكتشافا فعالا وقابلا لإعادة إنتاج مذنبات EB1 واستخراج المعلمات، بما في ذلك اتجاه النمو، والسرعة، والتنظيم المكاني. يوفر هذا الإطار أداة موحدة وسهلة الوصول لمقارنة ديناميكيات MT عبر ظروف التجريب.

في هذا المخطوطة، نطبق هذه الطريقة لمقارنة نمو الميثوسوتا في الخلايا الضابطة والخلايا التي تم إزالة بلمرتها بالمعالجة الباردة. يخدم هذا البروتوكول ودعم الدراسات المستقبلية التي تهدف إلى تحليل دور البروتينات المرشحة في تنظيم الميثورات.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. جينات الذبابة

ملاحظة: لرؤية MTS في البويضة، يستخدم هذا البروتوكول جينا متحولا متاحا للجمهور (جدول المواد) يعبر عن بروتين تتبع MT زائد الطرف EB1 الموسوم بعلامة GFP (البروتين الفلوري الأخضر)رقم 19. يرتبط EB1-GFP تحديدا بالأطراف المتزايدة من MTS، ويظهر ك"مذنبات" فلورية تتحرك على اتجاه البلمرة 17,18. يتيح ذلك تصور وقياس ديناميكيات نمو البويضة14,20، بما في ذلك توجيه النمو، والسرعة، والتوزيع المكاني داخل البويضة 14,20.

  1. حافظ على جميع سلالات الذباب على وسط دقيق الذرة-آجار القياسي عند 25 درجة مئوية باستخدام تقنيات تربية ذبابة الفاكهة القياسية.
  2. تقاطعوا بين 8–12 ذبابا من الإناث العذراء الحاملة لجين UAS-RNAi متحول يستهدف التعبير عن بروتين محل اهتمام، إلى 5 ذكور من النمط الجيني matα4-Gal4-VP16؛ EB1-GFP.
    ملاحظة: لتبسيط التهجينات الجينية، قم بتوليد مخزون ذبابي عن طريق عبور خط V32-Gal4 (الإدخال على الكروموسوم الثاني) مع خط EB1-GFP (إدخال الكروموسوم الثالث). نظرا لأن EB1-GFP تحت سيطرة منشط UASp، فإن محرك V32-Gal4 يحفز تعبير EB1-GFP وكذلك أي جين منقل UAS-RNAi يتم إدخاله في الهزاجات اللاحقة إذا رغب في ذلك.
  3. بعد فقس نسل F1، اختر 10–15 ذبابة أنثى من النمط الجيني المرغوب (أقل من أسبوع).
  4. انقل الإناث، مع 2-3 ذكور، إلى قارورة طازجة تحتوي على كمية صغيرة من معجون الخميرة على سطح الطعام. يحفز معجون الخميرة تكوين الأويضات ويعزز تطور غرفة البيض. وجود الذكور يضمن التزاوج، مما يعزز أيضا نضج البويضات ووضع البيض. حافظ على حرارة الذباب عند 25 درجة مئوية لمدة يومين.
    ملاحظة: لدراسة دور الجينات المحددة في ديناميكيات MT، يمكن تحقيق تقليل البروتين باستخدام نظام UAS/GAL421، مع محرك الأم matα4-Gal4-VP16 المعروف أيضا باسم V32-Gal4؛ جدول المواد)، الذي يبدأ تعبير Gal4 في الخط الجرثوي من الحالات 3–4 من تكوين النباتات. كما ذكر أعلاه، هذا المحرك يحفز التعبير عن بنى EB1-GFP وكذلك تراكيب UAS-RNAi، مما يتيح استنزاف البروتينات المهمة فقط بعد مرحلة الجراماريوم. تتجاوز هذه الاستراتيجية الوظائف المبكرة المحتملة للبروتينات المستهدفة خلال الانقسامات الانقسامية الأولية وتحديد البويضات. عند إجراء مثل هذه التجارب، يجب تجهيز الذباب كما هو موضح سابقا.

2. تشريح المبيض

  1. تخدير الإناث F1 باستخدام CO₂ على وسادة ذبابة عادية واختيار أنثى واحدة للتشريح.
  2. انقل الأنثى المختارة مباشرة إلى طبق زجاجي مقاس 35 مم (بسماكة زجاجية 0.13–0.15 مم) وضع قطرة من زيت التصوير فوق الذبابة.
  3. ضع الذبابة مواجها للأسفل للأعلى (الأجنحة متجهة للأسفل). باستخدام زوج واحد من الملقط، أمسك الصدر السفلي بلطف بملقط، وباستخدام زوج ثان من الملقط، اضغط قليلا من الجلد البطني من الطرف الخلفي للبطن.
  4. استخرج الجهاز التناسلي بلطف عن طريق سحبه بعناية من خلال الفتحة.
  5. عزل المبايض ثم المبيض الفردية عن طريق تمريرها بلطف عبر الزيت باستخدام الملقط. عند التلاعب بالمبايض، امسكها دائما بجانب غرف البويضات القديمة (المراحل 13–14) لتجنب إتلاف المراحل الوسطى الأكثر هشاشة (المراحل 6–9)، وهي المراحل التي تهم التصوير (الشكل 1A,B).
  6. أمسك الطرف الأمامي للمبيض، حيث يوجد الجراماريوم وحجرة البويضات في المرحلة المبكرة (الشكل 1A,B). طبقي شد بطيء وثابت لفصل المبايض الفردية. أثناء السحب، تظهر غرف بويض في مراحل نمو مختلفة. يمكن تكرار هذه العملية عدة مرات لكل مبيض لعزل المبيض الإضافي22 (انظر الفيديو للتوضيح).
    ملاحظة: بالنسبة للبويضات التي تعرضت للعلاج البارد لإزالة البوليمر من الميثونا، أجريت التشريحات كما هو موضح سابقا، ولكن باستخدام محلول BRB-80 بدلا من زيت التصوير. ثم تم نقل المبايض المفصلة إلى أنابيب دقيقة تحتوي على BRB-80 وحضنتها على الثلج لمدة 15 دقيقةو23 دقيقة. بعد الحضانة، تم نقل المبايض إلى طبق زجاجي قاع مع زيت تصوير، واستؤنف البروتوكول من الخطوة 3.1.

3. التصوير الحي

  1. ضع الطبق ذو القاع الزجاجي على منصة المجهر باستخدام حامل الشريحة المناسب.
  2. اختر غرف البيض من المرحلة 7 أو 8 للتصوير.
    ملاحظة: يمكن تحديد غرف البيض في هذه المراحل بناء على حجم البويضة وموقعها النووي. البويضة أكبر بوضوح من خلايا الممرضة الفردية وتشغل حوالي ثلث (المرحلة 7) إلى نصف (المرحلة 8) من غرفة البويضات. تقع نواة البويضة في القشرة الأمامية للبويضة، بجوار خلايا الممرضة24.
  3. تجنب تصوير غرف البويضات التي تظهر انقطاعا في الطبقة الخارجية لخلايا الجريبات أو علامات تلف أخرى، والتي قد تشير إلى اضطراب ميكانيكي ناتج عن الملقط. للحصول على أفضل جودة للصورة، استخدم نظام تصوير كونفوكالي سريع بنسبة إشارة إلى ضوضاء عالية (SNR) مع هدف 63x (1.40 NA، غمر زيت). تأكد من أنك تتبع معايير أخذ عينات Nyquist-Shannon.
  4. ضبط التركيز وحدد التعريض المناسب، حيث قد يختلف حسب تركيب EB1 المستخدم (مثل المحفزات المختلفة أو العلامات الفلورية) ونظام المجهر. يجب أن تكون الإشارة ساطعة بما يكفي لتتبع ديناميكيات المذنبات، ولكن دون أن تكون مشبعة أو محجوبة بالفلورة الخلفية.
  5. اضبط ليزر 488 نانومتر لتحفيز فلوروفور GFP (10٪ طاقة ليزر؛ كسب الكاشف = 750 فولت). اختر نافذة انبعاث مناسبة بطول 500–550 نانومتر أو مجموعة مرشح معادلة لفلوروفور GFP.
  6. احصل على أفلام تايم لابس مدتها لا تقل عن 4 دقائق، باستخدام فترة إطارات 500 مللي ثانية (2 إطار/ثانية) للحصول على بيانات كافية لتتبع نهايات MT الفردية بالإضافة إلى نهاياتها. (الفيديو التكميلي 1 يوضح اكتساب تايم لابس تمثيلي مناسب لتحليل تتبع MT لاحقا).
  7. يعالج الصور المكتسبة باستخدام معالجة كاشف المصفوفة في برنامج اقتناء المجهر باستخدام قوة مرشح المعالجة الافتراضية.
    ملاحظة: بمجرد غمر المبايض في زيت التصوير، تبقى المبايض المقسمة صالحة حتى 90 دقيقة. خلال هذه الفترة، يمكن تصوير غرف البيض دون علامات واضحة على التدهور. بعد هذه الفترة، يجب تشريح أنثى جديدة، وتحضير غرف بويض جديدة للتصوير20.

4. معالجة الصور

قم بتنفيذ سير العمل التالي لتوليد مخططات وإحصائيات لقياس المعلمات المختلفة المرتبطة بديناميكيات MT. نفذ كل خطوة إما تلقائيا عبر ماكرو/سكريبت أو يدويا باتباع البروتوكول (الشكل 2). جميع الماكروز في فيجي، وسكريبتات التتبع، وكود التحليل ببايثون المستخدمة في هذا السير تقدم كملفات ترميز تكميلية من 1 إلى 7.

  1. معالجة الصور المبدئية - الخطوة 1
    تعد الخطوات التالية الصور الخام ذات التداخل المؤقت عن طريق تصحيح التبييض الضوئي وتقليل الضوضاء الخلفية، لضمان استقرار الإشارة أثناء التتبع. أولا، يتم تعزيز رؤية EB1 باستخدام مرشح فرق الغاوسيين (DoG)، الذي يعمل كمرشح تمرير نطاق مكاني. عن طريق طرح صورة ضبابية بشدة من صورة ضبابية خفيفة، تقوم هذه العملية بكبح الضباب السيتوبلازمي منخفض التردد وضوضاء البكسل عالية التردد مع عزل الإشارة المحدودة للحيود لمذنبات EB1. ثانيا، يتم تطبيق مرشح تدرج زمني لتعزيز رؤوس التيار المغناطيسي المتزايدة تحديدا. يتم إعادة تقسيم مكدس الصور لتعيين البعد الزمني إلى محور Y المكاني. ثم يطبق الالتفاف أحادي البعد مع نواة [-1 0 1] لحساب المشتقة الزمنية لكل بكسل، مما يبرز الحافة الأمامية للمذنبات المتحركة حيث تزداد الشدة بسرعة أكبر. ثم يعاد تقطيع المكدس إلى أبعاده الأصلية، ويدمج في صورة مركبة، ويصدر للتحليل.
    ملاحظة: يمكن تنفيذ هذه الخطوة دفعة واحدة لجميع الملفات في المجلد عن طريق سحب ملف الماكرو File1.Step1_MTs_macro.ijm (ملف الترميز التكميلي 1) إلى فيجي وتشغيل الماكرو.
    1. تثبيت الإضافة المتطلب (إعداد لمرة واحدة)
      1. أطلق فيجي. انتقل إلى الإضافات > التثبيت في شريط القوائم.
      2. في متصفح الملفات، اختر ملف File_7_Kalman_Stack_Filter_Compiled.jar (ملف الترميز التكميلي رقم 7) المرفق مع هذا البروتوكول.
      3. عند طلب حفظ الإضافة، تأكد من أن الوجهة هي مجلد الإضافات الافتراضي داخل مجلد تثبيت فيجي الخاص بك واضغط على حفظ.
      4. أعد تشغيل فيجي لإكمال التثبيت.
        ملاحظة: هذه النسخة المجمعة من الإضافة مطابقة للنسخة المدمجة في فيجي، لكنها تزيل الحاجة إلى تثبيت مستقل لمجموعة تطوير جافا (JDK)، مما يبسط عملية الإعداد.
    2. تصحيح التبييض وإزالة التفكير:
      1. افتح فيجي، ثم افتح كل ملف باستخدام إضافة Bio-Formats importer
      2. تعويض تدهور الفلورة مع مرور الوقت من خلال تشغيل إضافة تصحيح التبييض، باستخدام تصحيح التبييض بنسبة بسيطة (الخلفية = 0).
      3. شغل مرشح كالمان المجمع (acquisition_noise = 0.1؛ الانحياز = 0.7) لقمع ضوضاء الفوتونات العشوائية مع الحفاظ على ديناميكيات الإشارة الحقيقية مع مرور الوقت
      4. قم بقص بعد زمن الصورة الناتج لتقليل وقت المعالجة إذا رغبت في ذلك.
        ملاحظة: تولد هذه الخطوات صورة غير مزينة، تظهر لاحقا كقناة 1 في نهاية الخطوة 1 (4.1.5) (الشكل 3A). يوصى باستبعاد أول 5 إلى 10 إطارات (نقاط زمنية)، حيث أن نافذة التدحرج في مرشح كالمان تقوم بتصفية جزئية فقط لهذه الإطارات الأولية.
    3. فرق تعزيز الميزات بين الغاوسيين (DoG):
      1. قم بنسخ الصورة من 4.1.2.4 مرتين (انقر بزر الفأرة الأيمن على الصورة ثم اضغط على النسخة).
      2. تطبيق إضافة Gaussian Blur على نسخة واحدة باستخدام سيغما منخفض (σ = 1).
      3. قم بتطبيق إضافة Gaussian Blur على النسخة الأخرى باستخدام سيغما عالية (σ = 8).
      4. افتح حاسبة الصورة الإضافية واطرح صورة السيغما العالية من صورة السيغما المنخفضة (= منخفض – عالي) لعزل التفاصيل الدقيقة.
      5. قم بإزالة الخلفية باستخدام > الرياضيات في فيجي وطرح واختيار قيمة (عتبة DoG = 100) للحفاظ على الإشارة الحقيقية فقط إذا لزم الأمر.
        ملاحظة: تولد هذه الخطوات صورة فارق في غاوسي، والتي تظهر لاحقا كقناة 2 في نهاية الخطوة 1 (4.1.5) (الشكل 3B).
    4. تعزيز إشارة EB1-GFP:
      1. اختر الصورة من 4.1.2.4 واستخدم إضافة Reslice مع الإعدادات: الأعلى، بدون استيفاء.
      2. استخدم إضافة Convolve ثنائية الأبعاد مع نواة [–1 0 1] لتعزيز نصائح MT.
      3. استخدم إضافة Reslice مرة أخرى بنفس الإعدادات لاستعادة أبعاد الصورة الأصلية.
      4. ملاحظة: هذه الخطوات ستولد صورة بإشارة EB1-GFP محسنة. ستظهر هذه الصورة لاحقا كقناة 3 في نهاية الخطوة 1 (4.1.5) (الشكل 3C).
      5. دمج القنوات وتصدير الصورة:
        1. ادمج صورة MT EB1-GFP (4.1.2.4) مع صورة فرق Gaussians (4.1.3.5) وصورة تعزيز إشارة EB1-GFP (4.1.4.3) باستخدام إضافة Merge Channels. تأكد من وضع الصورة المراد استخدامها لمزيد من التحليل على القناة 3 أثناء عملية الدمج.
        2. احفظ الملف الناتج كملف .tif، باستخدام تنسيق التسمية: "filename"_processed.tif. تأكد من أن الصورة المستخدمة في التحليل اللاحق تنتهي ب _processed.tif
  2. مناطق الاهتمام (ROI) - الخطوة 2
    في هذه الخطوة، سيتم تحديد ثلاثة عائد على المؤشرات على طول المحور الأمامي الخلفي للبويضة: الأمامي (ROI1)، الأوسط (ROI2)، والخلفي (ROI3). قم بإجراء هذا التقسيم المكاني لتمكين تحليل ديناميكيات MT عبر مناطق مختلفة من البويضة.
    ملاحظة: يمكن تشغيل هذه الخطوة الثانية لكل "اسم ملف"_processed.tif عن طريق سحب ملف الماكرو File_2_Step2_MTs_macro.ijm (ملف الترميز الإضافي 2) إلى فيجي والضغط على تشغيل. سيطلب الماكرو من المستخدم رسم مستطيل في البويضة يدويا. المنطقة الأقرب إلى بداية المضلع (النقرة الأولى) تتوافق مع أول عائد على الاستثمار. سيتم تقسيم المنطقة المستطيلة المختارة تلقائيا إلى عائد على الاستثمار المستطيل المتساوي. إذا لم يتم حفظ أي عائد استثمار، ستعمل الخطوات التالية في الصورة الكاملة.
    1. تعريف العائد على الاستثمار:
      1. افتح الملف المستهدف عبر الإضافات → Bio-Formats → Bio-Formats Importer.
      2. استخدم أداة المضلعات لرسم منطقة اهتمام تمتد عبر المنطقة المطلوبة.
      3. أضف المنطقة المحددة إلى مدير العائد على الاستثمار (اضغط على زر T).
      4. كرر الخطوة 4.2.1 لمعرفة عدد العائد على الاستثمار الذي تحتاجه.
    2. القياس ومساحة التصدير:
      1. اختر أول عائد استثمار
      2. شغل Analyze → Measure، وحفظ قيمة المنطقة كملف بعنوان "filename"_processed_RoiArea.csv
        ملاحظة: يجب أن يتطابق اسم الملف مع اسم الصورة الأصلي وينتهي ب: _processed_RoiArea.csv
      3. استخدم مدير العائد على الاستثمار لحفظ العائد على الاستثمار. استخدم نفس اسم الملف مع. امتداد العائد على الاستثمار لعائد استثمار واحد، أو امتداد .zip لعدة عائد على الاستثمار.
  3. اكتشاف وتتبع مذنبات EB1-GFP - الخطوة 3
    استخدم إضافة TrackMateرقم 25 لاكتشاف مذنبات EB1-GFP وتتبع حركتها مع مرور الوقت.
    ملاحظة: يمكن تطبيق STEP 3 على كل "اسم ملف"_processed.tif عن طريق سحب ملف الماكرو File_3_Step3_MTs_macro_tracking.py (ملف الترميز الإضافي 3) إلى فيجي والضغط على RUN. ثم اختر مجلدا ليتم معالجته. سيتم تحميل العائد على المؤشرات تلقائيا، وسيتم إجراء التحليل لكل ملف، لتوليد مخرجات نقاط ومسارات مقابلة للخلفية. قبل المعالجة الدفعية، ينصح بتحليل 2–3 صور تمثيلية للتحقق بصريا من أن إعدادات الكاشف والمتتبع الافتراضية مناسبة لحجم المذنبات وديناميكيتها. إذا كانت الإعدادات مناسبة، يمكن للمستخدم ضبط المعلمات ذات الصلة لتتبع رؤوس EB1 بدقة، مما يقلل من السلبيات الكاذبة والإيجابيات الكاذبة.
    1. افتح الملف المستهدف عبر الإضافات → Bio-Formats → Bio-Formats Importer
    2. افتح إضافة TrackMate. اختر نعم إذا طلب مني تبديل T و Z.
    3. اختر كاشف السجل. اضبط قطر الجسيمات إلى 0.5 ميكرومتر (قم بالضبط حسب الحاجة)
    4. اضبط عتبة الجودة على 30 (قم بالتعديل حسب الحاجة). فعل كل من تحديد الموقع الفرعي للبكسل والمعالجة المسبقة باستخدام مرشح وسيط.
    5. أزل أي ترشيح إضافي للبقع. اختر طريقة تتبع كالمان
    6. اضبط نصف قطر البحث الأولي إلى 0.5، ونصف قطر البحث 0.7، وأقصى فجوة إطارات 2 (قم بالضبط حسب الحاجة - نصف قطر البحث الأولي يزرع المتتبع، ونصف قطر البحث يتحكم في مدى تحرك النقطة بين الإطارات، وأقصى فجوة إطار تسمح باختفاء قصير في المسار).
    7. تجاوز تصفية المسارات التي ستظهر. بمجرد اكتمال المسار، اذهب إلى Spots → Export to CSV، واسم الملف: "filename"_ROI01_spots.csv
    8. ملاحظة: يجب أن تعكس تسمية الملفات عدد العائد على الاستثمار التي تم تحليلها. إذا تم استخدام عدة عائد على الاستثمار، احفظ كل ملف إخراج مع معرف مقابل، مثل _ROI01 أو _ROI02 أو غيرها.
  4. تصور البيانات والتحليل الكمي - الخطوة 4
    استخدم سكريبتات بايثون لمعالجة بيانات التتبع وحساب المعلمات الرئيسية، بما في ذلك عدد المذنب، السرعة، العمر الافتراضي، الاتساق الزاوي، والاتجاه. تولد هذه السكربتات جداول ملخصة (ملفات CSV)، ومخططات، وتحليلات إحصائية لدعم التحليل الكمي لديناميكيات MT (الشكل 4).
    1. إعداد بيئة البرمجيات:
      1. تثبيت توزيعة بايثون (3.12). تأكد من تثبيت مكتبات بايثون الخارجية التالية (عبر تثبيت pip pandas numpy matplotlib seaborn ipython statsmodels notebook): Pandas و NumPy (لمعالجة هياكل البيانات والحوسبة العددية)، SciPy وStatsmodels (تحديدا scipy.stats، للإحصاءات الدائرية واختبار الفرضيات)، Matplotlib وSeaborn (لإنشاء مخططات الورود ومخططات الشريط الإحصائي)، IPython (لأدوات العرض داخل الدفتر الملاحظ)، ودفتر جوبيتر (لاستخدام الدفتر).
      2. ضع وحدات التحليل المخصصة (File_5_MTModule1.py و File_6_MTModule2.py – ملفات الترميز التكميلية 5 و6) في الدليل الجذري بجانب دفتر التحليل (ملف 4_Step4_MTs_results.ipynb – ملف الترميز التكميلي 4).
      3. افتح دفتر Jupyter بتشغيل الأمر "jupyter notebook" في محطة بايثون وتحميل ملف 4_Step4_MTs_results.ipynb – ملف الترميز الإضافي 4.
    2. بيانات الإدخال وتعريف المعلمات:
      1. املأ قاعدة البيانات لربط النسخ البيولوجية ببياناتهم الوصفية التجريبية.
      2. قدم ما يلي لكل تجربة: اسم الأساس: سلسلة المعرف الفريدة الموجودة في أسماء الملفات، الحالة: مجموعة التجارب (مثل "التحكم"، "معالج"), زاوية التصحيح: الزاوية المطلوبة لمحاذاة العائد على الاستثمار مع المحور البيولوجي (مثلا، الأمامي = 0°).
      3. ضبط المعايير: تصدير تنسيق الصورة ومؤشر DPI، ألوان الرسم، وحجم الصندوق الافتراضي للحسابات الزاوية
      4. اضبط معلمات تصفية البيانات لاستبعاد المسارات القصيرة: الحد الأدنى لطول المسار: يتم التخلص من المسارات الأقصر من هذه الفترة
    3. تنفيذ خط أنابيب التحليل:
      1. اقرأ ونفذ جميع خلايا الكود لمعالجة بيانات التتبع الخام. يقوم السكربت بتكرار عبر قائمة قاعدة البيانات لتنفيذ الخطوات الإجرائية التالية:
        1. حدد جميع ملفات CSV الخاصة بعائد الاستثمار المرتبطة بكل اسم أساسي.
        2. تصفية المسارات بناء على الحد الأدنى للطول (يتم الاحتفاظ فقط بالمسارات التي تستمر لأكثر من 3 إطارات)، وتحسب السرعات اللحظية، وتحسب الإزاحة الكلية، وتطبق تصحيح الزاوية المرجعية على جميع المسارات.
        3. تطبيع عدد المذنبات حسب منطقة العائد على الاستثمار (محملة من البيانات الوصفية) لحساب كثافة المذنبات.
      2. تجميع البيانات المعالجة في مجموعة بيانات رئيسية (df_all) وحساب الإحصائيات الملخصة العامة (متوسط السرعة، مدة المسار، وطول متجه الاتساق الزاوي) لكل عائد على الاستثمار.
      3. نفذ دالة make_combined_rose_panel لإنشاء مخططات ورود مجمعة. هذا يخلق مقارنة جانبية بين التوزيعات الزاوية لجميع العائد على الاستثمار ضمن كل حالة تجريبية. نفذ create_comprehensive_analysis_plots_enhanced لإنشاء مخططات شريطية للمقاييس القياسية.
      4. نفذ دالة run_angle_analysis_pipeline لإجراء تحليل اتجاه محدد:
        1. صنف المسارات إلى صناديق توجيه باستخدام استراتيجيتين: التقسيم الأساسي (4 صناديق بعرض 90°: شمال/أمامي، شرق/يمين، جنوب/خلفي، غرب/يسار) وتقسيم أمام/خلفي (صندوقين بزاوية 180° أمامية مقابل خلفية).
        2. احسب نسبة المسارات التي تتحرك في كل اتجاه محدد لكل بويضة.
    4. التحليل الإحصائي وتوليد المخرجات:
      1. كرر المسار عبر مقاييس قياسية محددة: متوسط عدد المذنب لكل إطار لكل مساحة، متوسط مدة مسار المذنب، ومتوسط سرعة المذنب. لكل مقياس، يؤدي:
        1. قم بإجراء اختبارات Kruskal-Wallis أو Mann-Whitney U للمقارنات المستقلة عبر ظروف التجريب.
        2. قم بإجراء اختبارات فريدمان أو ويلكوكسون لتقييم الاتساق عبر العائد على الاستثمار.
        3. قم بإجراء اختبارات فريدمان وويلكوكسون لتصنيف التوقيع (باستخدام طريقة برات) لتقييم تفضيلات التوجه (مثل الشمال مقابل الجنوب) ضمن كل عائد استثمار.
        4. تصدير النتائج التالية إلى دليل النتائج : ملفات CSV الملخصة (metrics_table.csv، track_table.csv، roi_metrics.csv)، التقارير الإحصائية (مثل متوسط velocity_mwu.csv المذنب)، والمخططات (ملفات PNG عالية الدقة).
          ملاحظة: يمكن تنفيذ الخطوة 4 فقط بلغة بايثون. افتح File_4_Step4_MTs_results.ipynb واقرأ ونفذ جميع الخلايا. تحتوي كل خلية على تعليمات للتنفيذ والنتيجة المتوقعة المعنية.

5. التحليل الإحصائي:

ملاحظة: بسبب التوزيع غير الغاوسي لبيانات التتبع، تم استخدام اختبارات إحصائية غير بارامترية لجميع المقارنات.

  1. تقييم الفروق المستقلة بين الظروف التجريبية (مثل الضابط مقابل المعالج) باستخدام اختبار مان-ويتني U (لمجموعتين) أو اختبار كروسكال-واليس، يليه مقارنات مان-ويتني الزوجية بعد الوقوع (ل >مجموعتين)).
  2. قيم التفضيلات الاتجاهية ضمن نفس العائد على الاستثمار باستخدام اختبار فريدمان (الفرق العام) يليه اختبار ويلكوكسون لترتيب الموقع (زوجيا).
  3. التعامل مع الروابط ذات الفروق الصفرية باستخدام طريقة برات.
  4. أبلغ عن المقارنات الزوجية كقيم p غير مصححة للحفاظ على القوة الإحصائية. استخدم السكريبتات المقدمة للإبلاغ عن قيم p الخام والمعدلة، مع تعيين الدلالة عند 0.05. أبلغ عن جميع الإحصائيات الملخصة كمتوسط ± خطأ معياري للمتوسط (SEM) ما لم يذكر خلاف ذلك).

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم استخدام هذا البروتوكول بنجاح لتحليل ديناميكيات نمو وقطبية MT في بويضات ذبابة الفاكهة الميلانوغاستر في المراحل المتوسطة من تكوين البويضات، باستخدام EB1-GFP، وهو بروتين تتبع الطرف الزائد يحدد مواقع بلمرة MT النشطة 17,18. عند تصويرها بواسطة المجهر الكونفوكالي بالليزر الماسح، تظهر EB1-GFP كمذنبات لامعة ومتقطعة تتحرك في اتجاه نمو MT17,18 (الشكل 3A؛ فيديو إضافي 1). تتبع وقياس هذه المذنبات يسمح بتقييم دقيق لتكوين نواة واستطالة وتنظيم الميثوناتي داخل البويضة. باستخدام هذا البروتوكول في سير العمل، تم تقييم ديناميكيات التوتر المغناطيسي في البويضات الضابطة وفي الخلايا التي تعرضت لاضطراب تجريبي في شبكة التوزيعات المغناطيسية. على وجه التحديد، تمت مقارنة سلوك مذنب EB1 عبر ثلاث حالات: بويضات ضابطة غير معالجة، بويضات ضابطة معالجة باردة، وبويضاتمتغاير المعالجة باردة من نوع P أترونين 12,26. المعالجة الباردة تحفز إزالة بوليمر الميثونا، مما يسمح بتقييم نمو الميثوناتي أثناء التعافي. تم تضمين بويضات متحولة p.الأترونين غير المتجانسة (+/patr05252) كأداة تحكم إيجابية لديناميكيات التصلب المغناطيسي الضعيفة. الباترونين هو مثبت MT محفوظناقص الطرف 27، وهو مكون أساسي من NCMTOCs في البويضات12 والأنسجة الأخرى2. أظهرت أبحاث سابقة أن طفرات الباترونين التي خضعت لإزالة بوليمر MT أظهرت انخفاضا كبيرا في عدد مذنبات EB1 بعد إعادة النمو12. لذا، سمح تضمين طفرات الباترونين غير المتغاير بالتحقق من صحة الطريقة مقابل خلفية معروفة تعاني من عيوب نمو الميتروجين. تم تصوير بويضات المرحلة 7-8 عندما يتم تخفيف الجسيمات المركزية وتوليد البويضات الدقيقة عبر مسارات الصدز.

تماشيا مع الملاحظات السابقة، تم اكتشاف أعلى كثافة لمذنبات EB1 في المنطقة الأمامية من البويضة، مع انخفاض تدريجي نحو الجزء الخلفي14,15 (الشكل 5B؛ الجدول 1؛ جداول تكميلية 1 و2). للتمييز بين أحداث بلمرة MT الحقيقية والإشارات الثابتة أو خارج المستوى، يميز هذا البروتوكول بين العدد الكلي لبؤر EB1-GFP المكتشفة والمجموعة الفرعية من البؤر المتحركة المتحركة. من المرجح أن يمثل النسبة الثابتة مذنباتا أو مذنباتا ثابتة تتحرك بشكل رئيسي في المستوى المحوري (الشكل 5A,B). أجريت تحليلات طول مسار MT وسرعة النمو حصريا على مذنبات EB1-GFP المتنقلة لتجنب تضمين إشارات ثابتة أو حركات محورية قد تتداخل مع تقدير طول المسار وسرعته. يتم عرض بؤر EB1-GFP الكلية والنسبة المتحركة في مخططات منفصلة للسماح بالمقارنة المباشرة بين الكشف الكلي والسلوك الديناميكي (الشكل 5A,B). في البويضات الضابطة، تم قياس البروتوكول 0.189 ± 0.02 مذنبات متحركة SEM EB1/μm2 (18.9 مذنبات EB1/100 ميكرومترمربع) في المنطقة الأمامية، تلاها 0.064 ± 0.02 SEM و0.043 ± 0.01 مذنبات متحركة SEM EB1/ميكرومتر2 في المناطق الوسطى والخلفية على التوالي (6.4 و4.3 مذنبات EB1/100 ميكرومتر2) (الشكل 5B؛ الجدول 1؛ جداول تكميلية 1 و2). كشفت دراسةسابقة 28 قست مذنبات EB1 في نفس مرحلة التطور 48.54 مذنبا EB1/100 ميكرومترمربع، وهو أعلى من القيم التي تم اكتشافها هنا للمذنبات المتحركة EB1-GFP. ومع ذلك، فإن القيم المقاسة متسقة عند الأخذ في الاعتبار العدد الإجمالي للمذنبات EB1-GFP التي تم اكتشافها (الشكل 5A؛ الجدول 1؛ جداول تكميلية 1 و2). قسم المواد والأساليب في تلك الدراسة لا يحدد عدد المكدسات z-stacks المستخدمة لتصوير البويضات. لذا من الممكن أن يكون أكثر من مجموعة z-stack قد تم تضمينها في التحليل، مما قد يكون ساهم في زيادة عدد مذنبات EB1-GFP التي تم اكتشافها. عامل آخر قد يؤثر على القيم المبلغ عنها هو منطقة البويضة المختارة لقياس المذنب. لو تم اختيار مناطق ذات اهتمام أقرب إلى القطب الأمامي، حيث تكون كثافة مذنب EB1 في الأعلى، فقد يكون هذا قد زاد متوسط كثافة المذنبات مقارنة بالقياسات المعروضة هنا. ومع ذلك، فإن النتائج التي تم الحصول عليها هنا من نفس الدرجة وتعكس باستمرار انخفاضا في كثافة مذنب EB1 نحو المنطقة الخلفية كما تم الإبلاغ عنهاسابقا 14,15.

بعد إعادة نمو المذنب المغناطيسي الناتج عن البرد، أظهرت بويضات الضابط أعداد مذنب EB1 مماثلة لعدد الضباط غير المعالجين، مما يشير إلى تعافي قوي من الميزان المغناطيسي. وعلى النقيض من ذلك، وبما يتوافق مع التقاريرالسابقة 12، أظهرت طفرات الباترونين انخفاضا كبيرا في عدد مذنبات EB1 المتحركة في المنطقة الأمامية (ROI1) مقارنة بكلا الضابطين (الشكل 5B؛ الجدول 1؛ جداول تكميلية 1 و2). على الرغم من أن أعداد المذنبات في المناطق الوسطى والخلفية (عائد المؤشرات 2 و3) كانت أيضا تجهت نحو الأسفل، إلا أن هذه الفروق لم تكن ذات دلالة إحصائية (الشكل 5B). كان الانخفاض الذي لوحظ هنا أقل وضوحا مما تم الإبلاغ عنه في اختبارات نوكودازول12. من المحتمل أن يعكس هذا استخدام طفرات باترونين غير متغاير الزيجوت حيث يكون هناك أليل واحد فقط متحور. بالإضافة إلى ذلك، قد لا يؤدي بروتوكول إزالة البلمرة الناتج عن البرد إلى إزالة جميع الميكروفونات المغناطيسية بالكامل، ومن المرجح أن تسمح الفترة بين إزالة الجليد والتصوير ببعض النواة وإعادة نمو المولوتراجين قبل جمع البيانات. على النقيض من ذلك، تجرى اختبارات النوكودازول فور تعطيل الكولسيميد باستخدام ليزر الأشعة فوق البنفسجية12. ومع ذلك، تظهر هذه النتائج أن هذا البروتوكول يمكنه اكتشاف التغيرات البيولوجية ذات الصلة والمنطقة في تنظيم MT. كما تتوافق مع إثراء NCMTOCs وباترونين، وهو مكون أساسي في NCMTOC، في مقدمة البويضة. قد يعكس الانخفاض الأضعف في أعداد المذنبات في المناطق الوسطى والخلفية أيضا استبعاد تطوري NCMTOCs وباترونين من القشرة الخلفية في هذه المراحل12.

كشف تحليل طول مسار EB1 في بويضات التحكم عن مسارات مذنبات أطول في المنطقة الأمامية من البويضة (0.613 ميكرومتر ± 0.04 SEM) ومذنبات أقصر في المناطق الوسطى والخلفية (0.463 ميكرومتر ± 0.04 SEM و0.488 ميكرومتر ± 0.05 SEM على التوالي) (الشكل 5C؛ الجدول 1؛ جداول تكميلية 1 و2). تتوافق هذه النتيجة مع البيانات السابقة التي تظهر أن القطبين المتأخرين يبقى لفترات أقصر عند القطب الخلفي مقارنة بالقطب الأمامي، مما يشير إلى أن القطبين المتأخرين في الكتلة الخلفية أقصر14. في البويضات الطفرة ذات الباترونين غير المتجانسة التي تم معالجتها ببرودة، كان طول مذنب EB1 أقل بشكل ملحوظ مقارنة بالمواد الضابطة المعالجة بالبرود في المناطق الأمامية والخلفية. لوحظ اتجاه مماثل غير ذو دلالة إحصائية في المنطقة الوسطى (الشكل 5C؛ الجدول 1؛ الجدولان الإضافيان 1 و2)، مما يشير إلى انخفاض جزئي في استقرار MT. عند جمع هذه النتائج معا، تدعم الدور المعروف لباترونين كمثبت للذرات الثانوية (الطرف السلبي) وتتوافق مع الملاحظات السابقة في الخلايا المزروعة بذبابة الفاكهة، حيث يؤدي فقدان الباترونين إلى أقصر مغازل MT12,27. تسلط هذه النتائج الضوء أيضا على حساسية هذا البروتوكول في اكتشاف الاضطرابات الدقيقة ولكن ذات المعنى البيولوجي في ديناميكيات التراتيل المغناطيسي.

عند قياس سرعة مذنب EB1 في البويضات المسيطرة، اكتشف التحليل سرعات متوسطة 0.208 ± 0.01 ميكرومتر/ثانية، 0.207 ± 0.01 ميكرومتر/ثانية، و0.202 ± 0.01 ميكرومتر/ثانية في المناطق الأمامية والوسطى والخلفية على التوالي (الشكل 5D؛ الجدول 1؛ جداول تكميلية 1 و2)، وهو ما يتوافق مع الأعمال السابقة14,15. أظهرت البويضات الضابطة انخفاضا طفيفا في سرعة نمو MT من المنطقة الأمامية إلى الخلفية. قد يعكس هذا إثراء NCMTOCs، إلى جانب بروتينات أخرى غير معروفة مرتبطة بالأنابيب الدقيقة (MAPs)، في المناطق الأمامية الجانبية، مما يسهل نمو وتمدد MT، مما يساهم في الانخفاض الخلفي الملحوظ. في البويضات المعالجة بالبرود، أظهرت طفرات الباترونين غير المتجانسة اتجاها غير ذو دلالة إحصائية نحو انخفاض طفيف في سرعة نمو المونثوناث مقارنة بالمجموعة الضابطة، رغم أن هذا الفرق لم يصل إلى دلالة إحصائية (الشكل 5D؛ الجدول 1؛ جداول تكميلية 1 و2). يتوافق هذا الاكتشاف مع الملاحظات السابقة في الخلايا الجذعية العصبية لذبابة الفاكهة التي تعبر عن طفرات باترونين29.

توطين ncMTOCs في المنطقة الأمامية الجانبية للبويضة، إلى جانب استبعادها من القشرة الخلفية، يؤدي إلى نمو معظم ال MTs مع تثبيت نهاياتها السالبية عند القشرة الأمامية الجانبية. وبالتالي، يتم إنشاء تدرج أمامي-خلفي للمتناوب داخل البويضة، مع انحياز معتدل في الاتجاه: 60٪ من العضلات العضلية تنمو نحو الخلف و40٪ نحوال 14 الأمامية. نجح بروتوكولنا في اكتشاف هذا التحيز في الخلايا المبيضة الضابطة عبر جميع مناطق البويضة (الشكل 5E). كان التحيز في توجه التصلب العضلي أكثر وضوحا في المنطقة الخلفية، كما تم الإبلاغ سابقاعن 14. ومن الجدير بالذكر أن هذا الإثراء الخلفي في تحيز الاتجاه فقد بعد العلاج البارد في بويضات الضابط وبطيضات الباترونين المتغاير (الشكل 5E,F). في البويضات الضابطة المعالجة بالبرد، تحول اتجاه الميثوناتي نحو النمو الأمامي في جميع المناطق. ظهر هذا التحول كاتجاه في المناطق الأمامية والوسطى وأصبح ذا دلالة إحصائية في المنطقة الخلفية (الشكل 5F). أحد التفسيرات المحتملة لهذا الفقدان للانحياز نحو الجانب الخلفي هو أنه، في الظروف المعالجة بالبرودة، قد تحتاج الميكروفونات الجديدة إلى وقت للارتباط ب MAPs، مثل البروتينات الحركية، التي تعزز استقرار MT و/أو الترابط المتقاطع. قد يؤثر تأخير تجنيد هذه العوامل على تعزيز المعالجين المتأخرين المتخصصين في الخلف. باختصار، يسمح هذا البروتوكول بتحليل حساس وكمي لنمو وطول وسرعة واتجاه MT داخل البويضات. يكتشف بشكل موثوق التغيرات ذات المعنى البيولوجي الخاص بالمنطقة في ديناميكيات ال MT، بما يتماشى مع الدراسات السابقة، ويظهر حساسية لحل الفروق الدقيقة في سلوك ال MT، كما يتضح من الملاحظات التي أجريت لدى طفراتالأترونين الp غير المتغاير الزيجوت.

figure-results-1
الشكل 1: تكوين بويضة ذبابة الفاكهة الميلانوغاستر (أ) نظرة عامة على تكوين البويضات في مبيض ذبابة الفاكهة . يحتوي كل مبيض على 12–16 مبيض، تعمل كخط إنتاج للبيضات. يبدأ تكوين البويضات في الجرماريوم، حيث تنقسم 2–3 خلايا جذعية جرثومية بشكل غير متماثل، مما ينتج خلية جذعية وخلية ابنية تبدأ في التمايزي. تخضع هذه الخلايا لأربع انقسامات انقسامية لتشكيل كيس مكون من 16 خلية متصلة بقنوات حلقية. من هذه الخلايا، تتحول إحدى الخلايا إلى بويضة، بينما تعمل الأخرى كخلايا ممرضة، تدعم نمو وتطور البويضات حتى تصل إلى بويضة المرحلة 14 في الطرف الخلفي. (ب) مخطط المرحلة 9 غرفة بيض ذبابة الفاكهة . يتم توليد MT من ncMTOCs الموضعة في القشرة الأمامية الجانبية، والتي تستبعد من الجانب الخلفي للبويضة12. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-2
الشكل 2: مخطط سير عمل البروتوكول. نظرة عامة على الخطوات الرئيسية من تشريح المبايض والتصوير الحي إلى تتبع المذنبات والتحليل الكمي. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-3
الشكل 3: صور ممثلة ناتجة عن معالجة بويضات المرحلة 7–8. (A-E) تم تطبيق صور تمثيلية توضح سير عمل معالجة الصور في الخطوة 1 على بويضات المرحلة 7–8 من بويضات المعالجة، والتحكم في المعالجات الباردة، والبويضات المعالجة بالبرود غير المتجانسة في الباترونين05252 . القنوات هي صورة تمثيلية من عرض أقصى إطارين من فيلم تايم لابس مدته 150 إطارا يتم الحصول عليه بسرعة 0.5 ثانية لكل إطار. (أ) القناة 1، التي تتوافق مع توليد صورة خالية من الأضواش من البويضة المصورة المقابلة. (ب) القناة 2، التي تتوافق مع توليد اختلاف في صورة غاوسية. (ج) القناة 3، التي تتوافق مع توليد صورة تم فيها تعزيز إشارة مذنبات EB1-GFP لعرض أطراف المذنبات. (د) دمج القناتين 2 و3، مما يساعد على رؤية رؤوس المذنبات الناتجة من معالجة القناة 2. (E) مسارات مذنب EB1-GFP التي تولد من الفاصل الزمني C في FIJI باستخدام إضافة رمز Temporal Color لتوضيح ديناميكيات MT. يشير رمز الألوان إلى الإسقاط الزمني ل 20 إطارا (0.50 ثانية بين الإطارات). شريط المقياس = 10 ميكرومتر. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-4
الشكل 4: لقطة شاشة لقسم في دفتر جوبيتر STEP 4. الدفتر منظم بخلايا ماركداون توفر تعليمات توضيحية ذاتيا، تليها خلايا شيفرة تنتج نتائج وسجلات في الوقت الحقيقي. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-5
الشكل 5: تحليل ديناميكيات مذنبات EB1-GFP في بويضات المرحلة 7-8 الضابطة والمعالجة بالبرودة. تمثل البيانات متوسط ± SEM لكل عائد استثمار (ROI1–ROI3) للبويضات المعالجة بالبرد، والسيطرة على المعالجات الباردة، والبويضات المعالجة بالبرودة في الباترونين05252. تم الحصول على قياسات مذنب EB1-GFP من صور تايم لابس تمت معالجتها في FIJI؛ ما لم يذكر خلاف ذلك، كانت تجرى تحليلات على الصور المعالجة في القناة 3. تم تحليل إجمالي عدد مذنب EB1-GFP من صور القناة 2 (DoG Image). تم تقييم الدلالة الإحصائية باستخدام اختبار كروسكال–واليس تليها مقارنات مان–ويتني بعد التجربة، أو اختبار فريدمان تلاه اختبارات أزواج ويلكوكسون المتطابقة، حسب الاقتضاء (p < 0.05؛ p < 0.001؛ ص < 0.0001). (أ) مخطط نقاط التشتت يوضح متوسط عدد إجمالي أرقام مذنبات EB1-GFP. (ب) مخطط نقاط التشتت الذي يوضح متوسط عدد المذنبات المتحركة EB1-GFP. (ج) مخطط نقاط التشتت يوضح متوسط طول مسار مذنب EB1-GFP. (D) مخطط نقاط التشتت يوضح متوسط سرعة المذنب EB1-GFP. (ه) مخططات روز تظهر اتجاه مسارات EB1-GFP ضمن ROI1–ROI3 في الضابط (n = 14)، والمعالج البارد (n = 12)، والبويضات المعالجة بالبارد (n = 11) من باترونين05252. يتم تحديد متوسط نسبة كل مسار لكل بويضة، موجهة نحو الأمام (A) أو الخلفية (P)، لكل حالة وعائد على التأثير. (و) رسم بياني شريطي يوضح النسبة المئوية المئوية لزوايا مسار مذنب EB1-GFP الموجهة نحو الجانبين الأمامي والخلفي للبويضة. تم حساب النسب المئوية لكل بويضة وتمثل التوزيع النسبي لاتجاه المذنب داخل كل عائد على العائد. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

القياسعائد على الاستثمارالتحكم (n=14)المعالجة الباردة للتحكم (n=12)باترونين05252 تم علاجه بالماء البارد (N=11)
إجمالي عدد مذنب EB1-GFP (#/μm2)عائد الاستثمارات 1 (الأمامية)0.667 ± 0.180.691 ± 0.200.570 ± 0.17
ROI 2 (الوسط)0.394 ± 0.110.532 ± 0.150.400 ± 0.12
ROI 3 (خلفي)0.353 ± 0.090.561 ± 0.160.378 ± 0.11
رقم مذنب EB1-GFP المتحركة (#/μm2)عائد الاستثمارات 1 (الأمامية)0.189 ± 0.020.175 ± 0.030.099 ± 0.03
ROI 2 (الوسط)0.064 ± 0.020.091 ± 0.020.056 ± 0.02
ROI 3 (خلفي)0.043 ± 0.010.104 ± 0.030.047 ± 0.02
طول مسار مذنب EB1-GFP (ميكرومتر)عائد الاستثمارات 1 (الأمامية)0.613 ± 0.040.621 ± 0.030.478 ± 0.07
ROI 2 (الوسط)0.463 ± 0.040.535 ± 0.030.410 ± 0.05
ROI 3 (خلفي)0.488± 0.050.543 ± 0.040.393 ± 0.05
سرعة مذنب EB1-GFP (ميكرومتر/ثانية)عائد الاستثمارات 1 (الأمامية)0.208 ± 0.010.198 ± 0.010.188 ± 0.01
ROI 2 (الوسط)0.207 ± 0.010.199 ± 0.010.186 ± 0.01
ROI 3 (خلفي)0.202 ± 0.010.194 ± 0.010.177 ± 0.01

الجدول 1. ملخص قياسات مذنب EB1-GFP عبر المناطق الأمامية–الخلفية في البويضات التي تم تحليلها. تم الحصول على القياسات من بويضات المعالج بالبارد والتحكم والمعالج بالتحكم، والبويضات المعالجة بالبرودة المتغاير في الباترونين05252 . تم تعريف المناطق ذات الاهتمام بأنها ROI1 (أمامية)، ROI2 (الوسطى)، وROI3 (خلفية).

الجدول التكميلي 1. تحليل إحصائي لقياسات مذنب EB1-GFP بين الظروف التجريبية. تشير قيم P إلى اختلافات بين البويضات المعالجة، والمعالج البارد في الضابطة، والبويضات غير المتجانسة للمعالج بارد في الباترونين05252 لكل عائد على الاستثمار (ROI1-ROI3). تم إجراء مقارنات عالمية بين الحالات الثلاثة باستخدام اختبار كروسكال–واليس، تلاها مقارنات مان–ويتني بعد الحدوث زوجية.  يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف

الجدول الإضافي 2. مقارنة إحصائية لقياسات مذنب EB1-GFP بين العائد على المؤشرات ضمن كل حالة تجريبية. تشير قيم P إلى الفروقات بين ROI1 (الأمامي)، ROI2 (الأوسط) وROI3 (الخلفي) ضمن البويضات الضابطة، والضابطة المعالجة بالبرد، والباترونين05252 غير المتغاير الزيجوت. تم تقييم الفروق العامة بين العائد على الاستثمار في كل حالة باستخدام اختبار فريدمان. تم إجراء مقارنات زوجية بين العائد على الاستثمار لاحقا باستخدام اختبارات ويلكوكسون المزدوجة ذات الترتيب الموقع. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف

فيديو إضافي 1. تصوير تايم لابس لبروتين تتبع الطرف الزائد EB1-GFP في بويضة في مرحلة التحكم 7–8، مما يظهر اكتساب تمثيلي مناسب لتحليل تتبع MT لاحقا (مرتبط بالشكل 3). يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف

ملف الترميز الإضافي 1: File_1_Step1_MTs_macro.ijm. ماكرو Fiji/ImageJ لمعالجة الصور مسبقا. يقوم بأتمتة تصحيح التبييض الضوئي، وترشيح كالمان، وطرح الخلفية باستخدام مرشح فرق الغاوسيين (DoG). كما يطبق تحسينا للتدرج الزمني (التقسيم والالتفاف أحادي الأبعاد) لشحذ الحواف الأمامية لرؤوس MT لتحسين دقة التتبع. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف

ملف الترميز الإضافي 2: File_2_Step2_MTs_macro.ijm. ماكرو Fiji/ImageJ لتعريف منطقة الاهتمام شبه الآلي (ROI). يطلب من المستخدم تحديد حدود البويضة ويقسم الاختيار تلقائيا إلى مناطق متساوية المسافة (في مثالنا الثلاث مناطق: الأمامية، الوسطى، والخلفية) لتمكين الطبقات الإقليمية للتحليل. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف

ملف الترميز الإضافي 3: File_3_Step3_MTs_macro_tracking.py. سكريبت بايثون (يتم تنفيذه داخل Fiji/ImageJ) يقوم بتتبع مذنبات EB1 تلقائيا باستخدام Trackmate. يقوم بمعالجة الصور المسبقة بشكل دفعي، ويكتشف المذنبات باستخدام معلمات جودة محددة، ويربطها بمسارات، ويصدر بيانات الإحداثيات الخام كملفات CSV. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف

ملف الترميز الإضافي 4: File_4_Step4_MTs_results.ipynb. دفتر جوبيتر الذي يعمل كواجهة أساسية للتحليل الكمي. يقوم بتحميل بيانات التتبع الخام، وينفذ خط أنابيب التحليل، ويولد جميع المخرجات النهائية، بما في ذلك مخططات الورد، والجداول الملخصة الإحصائية، ومخططات المقارنة لكثافة المذنبات، سرعتها، وعمرها. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف

ملف الترميز الإضافي 5: File_5_MTModule1.py. وحدة بايثون مخصصة تحتوي على وظائف فائدة أساسية تستخدم لاستخراج البيانات والحسابات الهندسية الأساسية. تشمل هذه الدوال وظائف لإيجاد ملفات العائد على الاستثمار، وحساب السرعات اللحظية، وحساب الإزاحات الزاوية الأساسية. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف

ملف الترميز التكميلي 6: File_6_MTModule2.py. وحدة بايثون مخصصة تحتوي على وظائف تحليل وتصور متقدمة. يحتوي على خوارزميات لخط أنابيب تحليل الاتجاهات (التصنيف الكاردينالي مقابل المحوري)، والاختبارات الإحصائية المتينة (طريقة فريدمان/ويلكوكسون باستخدام طريقة برات)، وتوليد مخططات قطبية (وردية) بجودة النشر. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف

ملف الترميز التكميلي رقم 7: File_7_KalmanStackFilterCompiled.jar. يتطلب الأمر إضافة Java Kalman Filter المترجمة لفيجي/ImageJ لخطوات تقليل الضوضاء في ماكرو المعالجة المسبقة. تلغي هذه النسخة المستقلة الحاجة إلى مجموعة تطوير جافا منفصلة (JDK)، مما يبسط إعداد البرمجيات الخاصة بالمستخدم. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يطرح التصوير الحي لديناميكيات المونوثوث المغناطيسي في البويضات تحديات فريدة، حيث تتطلب مجموعات بيانات عالية الجودة وتحليلات كمية لاستخراج معلومات ذات معنى. بينما أبلغت دراسات سابقة عن طرق التصوير الحي 14,15,16، فإن خطوات تحليل الصور غالبا ما تكون مخصصة بشكل كبير، ولا توفر البروتوكولات تفاصيل كافية لإمكانية التكرار. وبالتالي، قد يواجه الباحثون الذين لا يملكون خبرة واسعة في التصوير أو الحوسبة عقبات في إعادة إنتاج هذه التحليلات. لمعالجة هذه التحديات، تم تطوير سير عمل مبسط، يجمع بين التصوير الحي عالي الدقة من Airyscan مع ماكروز وسكريبتات آلية سهلة الاستخدام. يتيح هذا المسار الكشف الفعال وتتبع مذنبات EB1، يليه تحليل كمي لاتجاه المضنبات الشعاعية السرعية والتنظيم المكاني. من خلال تقليل التدخل اليدوي وتقديم تعليمات واضحة خطوة بخطوة، يعزز سير العمل سهولة وتكرار تحليل ديناميكيات MT في البويضات.

تشريح المبيض وتحضير العينة هما خطوتان أولى حاسمتان. يجب تشريح البويضات بعناية لتجنب التلف الميكانيكي، ويجب تحديد مدة التصوير ب 90 دقيقة للحفاظ على الصلاحية20 دقيقة. اختيار المرحلة مهم: بعد منتصف تكوين البويضات، يزداد حجم البويضة ويتراكم صفار البيض في السيتوبلازم، مما يجعل تصور إشارة EB1 أكثر صعوبة بعد المرحلة 9. لذلك، لا ينصح بالتصوير بعد المرحلة 920. أيضا، للقياسات القابلة لإعادة الإنتاج، عندما يكون ممكنا، يفضل وجود بويضات بحجم مماثل، لأن ذلك يضمن أن المناطق المحددة محل الاهتمام تتوافق مع مواقع أمامية-خلفية مكافئة عبر العينات.

التحكم في درجة الحرارة ضروري لإمكانية التكرار. يجب الحفاظ على مخزونات الذباب في ظروف الزراعة القياسية (25 درجة مئوية) لدعم التطور الطبيعي والتعبير المتسق ل EB1-GFP، خاصة عند استخدام نظام GAL4/UAS الذي يكون حساسا لتقلبات درجة الحرارة. ثبات درجة الحرارة أثناء التصوير مهم بنفس القدر، حيث يمكن أن تؤثر التغيرات على ديناميكيات MT. على الرغم من أن غرفة تحكم في درجة الحرارة ليست مطلوبة، إلا أنه ينصح بتجنب تقلبات درجة الحرارة أثناء الاقتناء.

لالتقاط الصور، تم اختيار التصوير الكونفوكالي بكاشف المصفوفة بسبب حساسيته العالية وتحسين نسبة التشويش في النوبة، مما قلل من الحاجة إلى إزالة البكاء بعد الاكتساب. يجب استخدام أهداف فتحة عدسية رقمية عالية (بأعلى قدر ممكن) مع مطابقة معامل الانكسار المناسبة لتعظيم الدقة الجانبية والمحورية، وهو أمر حاسم لحل المذنبات الفردية في الشبكات الكثيفة. علاوة على ذلك، يجب اتباع معايير أخذ عيناتنيكويست-شانون 30 في XYZ والوقت لتجنب فقدان الدقة في تتبع المذنب. لا يقل أهمية عن الاختيار الدقيق لمستوى التصوير على طول محور z. التصوير العميق جدا يؤدي إلى فقدان الفلورة بسبب تشتت الضوء، بينما تقييد الاكتساب على سطح القشرة يفشل في التقاط الديناميكية الكاملة لمذنبات EB1. يتم الحصول على أكثر البيانات إفادة من موقع z الوسيط. يجب تجنب وجود بويضات تقع فيها النواة ضمن المستوى المختار، لأن الحجرة النووية تزيح جزءا كبيرا من السيتوبلازم وتفتقر إلى مسارات EB1، مما يقلل من عدد المذنبات القابلة للكشف.

على الرغم من تحسينه للتصوير الكونفوكالي المعتمد على كاشف المصفوفات، إلا أن خط التحليل هذا لا يعتمد على الأجهزة ومتوافق مع وسائل أخرى، مثل المجهر الكونفوكالي على القرص الدوار. ومع ذلك، يجب أن يكون المستخدمون على علم بأن الأنظمة ذات NA أو SNR أقل قد تتطلب تعديلات على معايير المعالجة المسبقة للماكرو (مثل تحمل الضوضاء/سيغما DoG) وقد تؤدي إلى انخفاض كثافة كشف المذنبات مقارنة بالقيم المقدمة في هذه الدراسة. ومع ذلك، رغم أن القيم المطلقة قد تختلف بين الأنظمة، إلا أن الاتجاهات النسبية التي لوحظت بين الظروف التجريبية وعائد المؤشرات كما هو متوقع ستظل قوية.

نظرا لبنية البويضة ثلاثية الأبعاد الكبيرة، يلتقط التصوير ثنائي الأبعاد فقط جزءا بصريا من شبكة MT. وبالتالي، قد تخرج المذنبات التي تتحرك بشكل حاد على محور z من المستوى البؤري، مما قد يؤدي إلى تقليل تقدير عمر المسار والسرعة المطلقة (حيث يتم قياس فقط مكون xy لمتجه السرعة). ومع ذلك، فإن التصوير الحجمي ثلاثي الأبعاد عالي السرعة للبويضة بأكملها سيتطلب مجالات رؤية أصغر، وأوقات تعريض أقل، وأوقات استجابة كاشف أسرع، مما يقلل من نسبة الضوضاء في الإشارة ويوزع وقت الاكتساب على عدة شرائح z، مما يؤثر على الدقة الزمنية المطلوبة لتتبع مذنبات EB1 السريعة. للتخفيف من المذنبات غير المتحركة والآثار خارج البؤرة، تم تطبيق مرشحات الالتفافية ومدة المسار الدنيا (باستثناء المسارات < 3 إطارات) لإزالة النقاط العابرة التي تعبر المستوى البؤري. علاوة على ذلك، وبما أن هذا القيد الهندسي ينطبق بشكل موحد عبر ظروف التجارب، فإن الفروق النسبية الملحوظة في كثافة المذنبات وسرعتها واتجاهها تبقى قوية. بينما تفضل التقنيات الناشئة مثل المجهر الضوئي أن تلتقط البنية ثلاثية الأبعاد الكاملة في نفس الوقت، إلا أنها ليست متوفرة على نطاق واسع بعد. ومع ذلك، فإن القيم المقاسة لجميع معلمات ديناميكا التوسعة التقنية تتوافق مع التقارير السابقة، مما يشير إلى أن هذا البروتوكول مناسب للتحقيق في ديناميكيات الديناميكا التقنية عبر إعدادات تجريبية مختلفة.

قبل استخدام الماكروز في هذا البروتوكول، ينصح بمعالجة الصور القليلة الأولى يدويا لضمان تحسين معلمات البرمجيات بشكل صحيح. عوامل مثل دقة التصوير، والتكبير، ونسبة الإشارة إلى الضوضاء، ومعدل الإطارات، وما إذا كانت البيانات ذات مستوى واحد أو مكدس z، يمكن أن تؤثر جميعها على دقة التتبع. تعديل المعلمات بشكل تكراري أثناء فحص المسارات الناتجة بصريا لتقليل الإيجابيات الكاذبة والسلبية الكاذبة. بمجرد التحسين، قم بتطبيق المعلمات بشكل متسق عبر مجموعات البيانات لضمان قابلية التكرار.

أخيرا، يجب ملاحظة بعض القيود المتعلقة بالتفسير البيولوجي. يقوم EB1-GFP بتصنيف نهايات الميثوناتور المتزايدة بشكل انتقائي، وبالتالي يبلغ عن مواقع البلمرة النشطة لل MT بدلا من جميع أنواع الميكروفونات الميثوناتر. لا يتم اكتشاف الميكروفونات المستقرة وغير البلمرة الموجودة خلال فترة التصوير بهذه الطريقة. بينما يكون هذا القيد أقل تقييدا في بويضات منتصف تكوين البويضات، حيث تكون غالبية البويضات المتوسطة ديناميكية للغاية، يجب أخذه في الاعتبار عند تطبيق البروتوكول على أنواع الخلايا الأخرى التي لديها تجمعات متتالوتا مستقرة كبيرة، مثل الخلايا العصبية31.

في الختام، يتيح هذا السير من التحليل الكمي عالي الدقة لديناميكيات المونثوتا العضلية في بويضات ذبابة الفاكهة . من خلال دمج التشريح المحسن، والتصوير الحي بكاشف المصفوفات، وأدوات التحليل الآلي، يوفر طريقة صارمة لكنها متاحة للتحقيق في منظمات الميكروفونات الصدية في سياق الصد. على الرغم من التحقق من صحة هذا النهج بشكل أساسي في البويضات، إلا أن مبادئ هذا النهج قابلة للتكييف، عند التحسين، مع أنواع الخلايا الأخرى، بما في ذلك الخلايا غير المنقسمة مثل الخلايا العصبية والظهارة، مما يوفر منصة قابلة للتوسع للفحوصات الجينية والدراسات الميكانيكية لتنظيم العضلة العضلية.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المؤلفون لا يفرضون أي تضارب مصالح.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نحن ممتنون جدا لأنطوان غيشه (معهد جاك مونو، فرنسا) لتوفير خط الطيران UASp-EB1-GFP بسخاء. كما نشكر الدعم الفني والمساعدة من منشأة المجهر في كلية الطب بجامعة نوفا (NOVA)، بدعم من PPBI (POCI-01-0145-FEDER-022122)، ومنشأة الفلاي في كلية الطب في نوفا، بدعم من CONGENTO (LISBOA-01-0145-FEDER-022170). وقد تم دعم هذا العمل من خلال تمويل ممول ل A.P.M. (2024/158225/PEX)، ومن وحدة البحث UID/04462/2025: iNOVA4Health – برنامج الطب العابر، ومن قبل LS4FUTURE المختبر المرتبط (LA/P/0087/2020)، وجميعها مدعومة ماليا من مؤسسة علم التقنية (FCT) / وزارة التعليم، علم وصناعة المعلومات. يدعم برنامج A.P.M. عقد باحث مع FCT ضمن برنامج CEECIND/02842/2020، ويحظى J.C. بدعم من زمالة دكتوراه FCT (2023/03665/BD).

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Dumont #5 ForcepsFine Science Tools11252-20
EB1::GFPمن د. أنطوان جيشيه، CNRS، معهد جاك مونو، فرنساالنمط الوراثي: w; +/CyO; UASp-EB1::GFP/TM3
أطباق بتري ذات قاع زجاجيMatTekP35G-1.0-14-C
Matα4-Gal4-VP16مركز Bloomington Drosophila Stock Center7062النمط الوراثي: w[*]; P{w[+mC]=matalpha4-GAL-VP16}V2H
زيت 10S، VOLTALEFVWR Chemicals24627.188
طفرات Patroninمركز Bloomington Drosophila Stock Center16647النمط الوراثي: y[1] w[67c23]; P{y[+mDint2] w[+mC]=EPgy2}Patronin[EY05252]/CyO
w1118مركز Bloomington Drosophila Stock Center3605
Zeiss LSM 980 مع Airyscan 2Zeiss

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Goodson, H. V., Jonasson, E. M. Microtubules and microtubule-associated proteins. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 10 (6), a022608(2018).
  2. Akhmanova, A., Kapitein, L. C. Mechanisms of microtubule organization in differentiated animal cells. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 23 (8), 541-558 (2022).
  3. Sanchez, A. D., Feldman, J. L. Microtubule-organizing centers: from the centrosome to non-centrosomal sites. Current Opinion in Cell Biology. 44, 93-101 (2017).
  4. Loncarek, J., Bettencourt-Dias, M. Building the right centriole for each cell type. The Journal of Cell Biology. 217 (3), 823-835 (2018).
  5. Lattao, R., Kovács, L., Glover, D. M. The Centrioles, Centrosomes, Basal Bodies, and Cilia of Drosophila melanogaster. Genetics. 206 (1), 33-53 (2017).
  6. Manandhar, G., Schatten, H., Sutovsky, P. Centrosome reduction during gametogenesis and its significance. Biology of reproduction. 72 (1), 2-13 (2005).
  7. Kalbfuss, N., Gönczy, P. Towards understanding centriole elimination. Open biology. 13 (11), (2023).
  8. Muroyama, A., Lechler, T. Microtubule organization, dynamics and functions in differentiated cells. Development. 144 (17), 3012-3021 (2017).
  9. Pimenta-Marques, A., Bento, I., Lopes, C. A. M., Duarte, P., Jana, S. C., Bettencourt-Dias, M. A mechanism for the elimination of the female gamete centrosome in Drosophila melanogaster. Science. 353 (6294), aaf4866-aaf4866 (2016).
  10. Lasko, P. mRNA localization and translational control in Drosophila oogenesis. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 4 (10), (2012).
  11. Lee, J., Lee, S., Chen, C., Shim, H., Kim-Ha, J. Shot regulates the microtubule reorganization required for localization of axis-determining mRNAs during oogenesis. FEBS Letters. 590 (4), 431-444 (2016).
  12. Nashchekin, D., Fernandes, A. R., St Johnston, D. Patronin/Shot Cortical Foci Assemble the Noncentrosomal Microtubule Array that Specifies the Drosophila Anterior-Posterior Axis. Developmental Cell. 38 (1), 61-72 (2016).
  13. Kuo, Y. W., Howard, J. Cutting, Amplifying, and Aligning Microtubules with Severing Enzymes. Trends in cell biology. 31 (1), 50-61 (2021).
  14. Parton, R. M., et al. A PAR-1–dependent orientation gradient of dynamic microtubules directs posterior cargo transport in the Drosophila oocyte. Journal of Cell Biology. 194 (1), 121-135 (2011).
  15. Nieuwburg, R., et al. Localised dynactin protects growing microtubules to deliver oskar mRNA to the posterior cortex of the Drosophila oocyte. eLife. 6, (2017).
  16. Lu, W., Lakonishok, M., Gelfand, V. I. The dynamic duo of microtubule polymerase Mini spindles/XMAP215 and cytoplasmic dynein is essential for maintaining Drosophila oocyte fate. Proceedings of the National Academy of Sciences. 120 (39), e2303376120(2023).
  17. Komarova, Y., et al. Mammalian end binding proteins control persistent microtubule growth. The Journal of cell biology. 184 (5), 691-706 (2009).
  18. Rogers, S. L., Rogers, G. C., Sharp, D. J., Vale, R. D. Drosophila EB1 is important for proper assembly, dynamics, and positioning of the mitotic spindle. The Journal of cell biology. 158 (5), 873-884 (2002).
  19. Rebollo, E., Sampaio, P., Januschke, J., Llamazares, S., Varmark, H., González, C. Functionally Unequal Centrosomes Drive Spindle Orientation in Asymmetrically Dividing Drosophila Neural Stem Cells. Developmental Cell. 12 (3), 467-474 (2007).
  20. Legent, K., Tissot, N., Guichet, A. Visualizing microtubule networks during Drosophila oogenesis using fixed and live imaging. Drosophila Oogenesis: Methods and Protocols. , 99-112 (2015).
  21. Phelps, C. B., Brand, A. H. Ectopic gene expression in Drosophila using GAL4 system. Methods: A Companion to Methods in Enzymology. 14 (4), 367-379 (1998).
  22. Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. Preparing individual Drosophila egg chambers for live imaging. JoVE. (60), (2012).
  23. Januschke, J., Gervais, L., Gillet, L., Keryer, G., Bornens, M., Guichet, A. The centrosome-nucleus complex and microtubule organization in the Drosophila oocyte. Development. 133 (1), 129-139 (2006).
  24. Jia, D., Xu, Q., Xie, Q., Mio, W., Deng, W. M. Automatic stage identification of Drosophila egg chamber based on DAPI images. Scientific Reports. 6 (1), 18850(2016).
  25. Ershov, D., et al. TrackMate 7: integrating state-of-the-art segmentation algorithms into tracking pipelines. Nature methods. 19 (7), 829-832 (2022).
  26. Bellen, H. J., et al. The BDGP gene disruption project: Single transposon insertions associated with 40% of Drosophila genes. Genetics. 167 (2), 761-781 (2004).
  27. Goodwin, S. S., Vale, R. D. Patronin regulates the microtubule network by protecting microtubule minus ends. Cell. 143 (2), 263-274 (2010).
  28. Berisha, A. M., et al. Spatial activation of Kinesin-1 by Ensconsin shapes microtubule networks via ncMTOCs recruitment. bioRxiv. , Pre-print (2025).
  29. Gujar, M. R., et al. Patronin/CAMSAP promotes reactivation and regeneration of Drosophila quiescent neural stem cells. EMBO Reports. 24 (3), e56624(2023).
  30. Shannon, C. E. Communication in the Presence of Noise. Proceedings of the IRE. 37 (1), 10-21 (1949).
  31. van de Willige, D., Hoogenraad, C. C., Akhmanova, A., Hoogenraad choogenraad, C. C., Akhmanova aakhmanova, A. Microtubule plus-end tracking proteins in neuronal development. Cellular and Molecular Life Sciences. 73 (10), 2053-2077 (2016).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Developmental BiologyLive ImagingImage AnalysisMicrotubule DynamicsEB1 GFPOocyteDrosophila
Video Coming Soon

Related Articles