مقالة منهجية

تجارب صبغ المناعة واختراق الصبغة لتعريف بروتينات الوصلة الحاجز ذات الطيات الأساسية في ظهارة جنين ذبابة الفاكهة

DOI:

10.3791/69986

⸱

فبراير 27, 2026

 ,  ,  , 
1Department of Biology, Case Western Reserve University, 2Admissions Counselor, Case Western Reserve University

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

توضح هذه البروتوكولات كيفية توصيف تنظيم ووظيفة الإغلاق لوصلات القطع الصوفية المطوية في الظهارة الجنينية الضابطة والطفرة في ذبابة الفاكهة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الغرض من هذه البروتوكولات هو تقييم تنظيم ووظيفة الحاجز لوصلات الإنتان المطوية (pSJs) في الأنسجة الظهارية المشتقة من الجلد الخارجي لأجنة ذبابة الفاكهة. يشكل pSJ حاجزا عائقا على الغشية الجانبية للأنسجة الخارجية الجلدية بما في ذلك البشرة والغدد اللعابية والقصبة الهوائية والأمعاء الخلفية، وهو مشابه وظيفيا للوصلة الضيقة في أنسجة الفقاريات. في ذبابة الفاكهة، تم تحديد 30 بروتينا ضرورية لتكوين pSJs. تتمركز بروتينات pSJ الأساسية في البداية على طول الغشية الجانبية لكنها تصبح غنية بقوة عند المنطقة الجانبية القمية من الوصلة القاعدية مباشرة على نقطة الالتصاق، بحلول المرحلة 16 من تكوين الجنين. بحلول المرحلة الخامسة عشرة المتأخرة من تكوين الأجنة، تمتلك هذه الأنسجة وصلة انسداد وظيفية كاملة. ستصف هذه الورقة بروتوكولات التلوين المناعي ونفاذية الصبغة التي يمكن استخدامها لفحص تنظيم ووظيفة pSJ في الأجنة المسيطرة والطفرات. يمكن استخدام هذه البروتوكولات بنجاح لإثبات وظيفة الإغلاق لجماهير pSJ، ولاختبار ما إذا كان جين مجهول يشفر مكونا أساسيا في الوصلة الاتصالية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وظيفة أساسية للأنسجة الظهارية هي تقسيم المناطق المميزة داخل الكائن الحي. إن خلق هذه البيئات المميزة أمر ضروري لوظيفة الأعضاء ولحماية الكائن الحي من التهديدات الخارجية. الوصلة الانسدادية التي تتكون بين خلايا الظهارة مسؤولة عن إنشاء والحفاظ على هذه البيئات من خلال منع تدفق المواد المذاب شبه الخلوية بين الجانبين القمي والقاعدي لتلك الظهارة 1,2. في الكائنات الفقارية، يشار إلى الوصلة المغلقة باسم الوصلة الضيقة، بينما يشار إليها باتصال الحاجز (SJ) في اللافقاريات مثل ذبابة الفاكهة الميلانوغاستر 1,3. هناك نوعان من الصلصانات في المفصليات يختلف بينهما توزيع الأنسجة والبنية الفائقة4. توجد وصلات التوتر المطوي (pSJs) في الأنسجة المشتقة من الجلد الخارجي مثل البشرة، الغدد اللعابية، القصبة الهوائية، والأمعاء الخلفية. تتميز من الناحية الفائقة البنية بمصفوفة سلمية من المواد الكثيفة الإلكترونية في الفضاء خارج الخلية بين الخلايا يقع في قاعدة نقطة التوصيل 3,5. على النقيض من ذلك، توجد وصلات الحصم الأملس (sSJ) في الأنسجة المشتقة من بطانة الجلد مثل أنابيب الأمعاء الوسطى وأنابيب المالبيغيان، ولا تظهر الحاجز الكثيف للإلكترونات بين الخلايا6.

حددت الدراسات الجينية في ذبابة الفاكهة 30 بروتينا ضروريا لبنية ووظيفة pSJ، وحددت بروتينات إضافية تقيم في الوصلة لكنها لا تبدو أن لها أي وظيفة في تكوينها أو صيانتها (تمت مراجعتهافي 7). ومن خلال هذه التحليلات، صنف العلماء بروتينات SJ إلى ثلاث فئات. توجد بروتينات الحمض النووي الجوعي الأساسية في الوصلة وتكون ضرورية لتأسيس وصيانة الوصلة. تم تحديد سبعة عشر بروتينا كبروتينات PSJ الأساسية، منها كوركل (كورا)، نيوركسين IV، مكمل ماكروغلوبولين مرتبط (Mcr)، كون-كون، وATPase ألفا 8,9,10,11,12. تم تحديد تسعة بروتينات كبروتينات pSJ مساعدة مطلوبة لتأسيس و/أو صيانة الوصل، لكنها لا تقيم بالضرورة في الوصلة المشتركة. تشمل هذه الفئة بروتينات مثل Rab5 وRab11 وVeled13,14. وأخيرا، تتمركز البروتينات المقيمة في pSJ لكنها قابلة للاستبدال لتأسيس وصيانة الوصل. من أمثلة الأعضاء الأربعة في هذه المجموعة: Discs Large وFasciclin III15,16.

تأسيس pSJ سليم وظيفيا هو عملية متعددة الخطوات تبدأ في منتصف التطور الجنيني عندما تعبر جميع بروتينات pSJ الأساسية بالكامل. بعض جينات pSJ الأساسية تعبر عن طريق الأم، لكنها جميعها تظهر تعبيرا زويغوطي قويا بحلول المرحلة12 17. في المرحلة 12، تتمركز بروتينات pSJ الأساسية على طول الغشاء الجانبي. خلال المراحل 13-16، يتم تداخل بروتينات pSJ الأساسية ثم إعادة تدويرها إلى الغشية الجانبية في منطقة pSJ. تتطلب هذه العملية بروتينات مساعدة ل pSJ، بما في ذلك Rab5 و Rab1114. بحلول المرحلة 16، تكون بروتينات pSJ الأساسية متمركزة بشكل محكم في منطقة pSJ على طول الغشاء الجانبي. تماشيا مع هذه الملاحظات، تحدث وظيفة الإغلاق الكاملة للوصلة في المرحلة المتأخرة 15 من تكوين الجنين12. يتم إثبات ذلك بشكل أفضل باستخدام اختبار نفاذية الصبغة. قبل تكوين الوصلة الفاصلة، يمكن لخرزة دكستران بقوة 10 كيلو دالتون موسومة بعلامة فلورية مثل الرودامين أن تمر عبر الفراغ شبه الخلوي بين الخلايا. إذا تم حقن الديكستران الموسوم في الهيموكويل، فإنه يتراكم بسرعة في تجويف الظهارة الأنبوبية مثل القصبة الهوائية، الغدة اللعابية، والأمعاء الخلفية. بعد أن يصبح ال pSJ مشدودا فسيولوجيا في نهاية المرحلة 15، يقتصر الديكسترون المحقون على الجانب القاعدي من الظهارة ولا يمكن أن يتراكم في التجويف (المجال القمي) لهذه الأعضاء.

تشترك بروتينات pSJ الأساسية في خاصية مميزة حيث يتطلب كل بروتين pSJ الأساسي وجود جميع بروتينات pSJ الأساسية الأخرى لتحديد الموقع الصحيح تحت الخلوي18,19. هذا الاعتماد المتبادل في تكوين pSJ هو سمة مميزة لبروتينات pSJ الأساسية وأساس البروتوكولات المقدمة في هذا المقال. تؤدي الطفرات في جينات pSJ الأساسية أو المساعدة إلى الموت الجنيني وتتميز بعدم توطين بروتينات pSJ الأساسية الأخرى على طول الغشاء الجانبي في الأجنة في المرحلة 16، بدلا من أن تكون موضعية بشكل محكم في المنطقة الجانبية القمية الطبيعية. على النقيض من ذلك، لا تؤدي الطفرات في جينات pSJ المقيمة إلى عدم توطين بروتينات pSJ الأساسية15. يظهر الاضطراب الوظيفي لجنة pSJ في الطفرات الجينية الأساسية والملحقة من خلال تراكم دكستران موسوم ب 10 كيلو دستون في تجويف القصبة الهوائية أو الغدد اللعابية أو الأمعاء الخلفية في الأجنة المتحولة في المرحلة 16 أو 17. وأخيرا، الميزة المميزة بين النواة وبروتين pSJ المساعد هي توطينهما تحت الخلوي. ترتبط بروتينات pSJ الأساسية ارتباطا وثيقا ب pSJ بمجرد تكوينها، في حين أن بروتينات pSJ المساعدة ضرورية لتجميع الوصلة لكنها لا تقيم بالضرورة في الوصلة. أفضل الأمثلة على بروتينات pSJ المساعدة هي Rab5 و Rab11. كلاهما بروتينات سيتوبلازم تساعد في نقل البضائع من غشاء البلازما إلى المراحل المبكرة وإعادة تدوير الإندوسومات ثم العودة إلى غشاء البلازما14. لتمييز ما إذا كان بروتين pSJ الجديد هو مكون أساسي أو بروتينا مساعدا، من المفيد عموما إنشاء جسم مضاد محدد أو التعبير عن بروتين مؤتلف مميز بالفلورية لتحديد مكان تواجد هذه البروتينات في نقاط مختلفة من عملية نضج pSJ.

الغرض من هذه البروتوكولات هو التمييز بشكل واضح بين بروتينات pSJ المحتملة الأساسية والملحقة عن البروتينات المقيمة في pSJ. كشفت عدة دراسات عن أدوار إضافية غير مسدودة لبروتينات pSJ أثناء التطور، بما في ذلك أدوار في التكوين الشكلي وقطبية البازل الحلقي 17,20,21,22. مع تزايد الاهتمام ببيولوجيا pSJ وتحديد المزيد من البروتينات المحتملة ل pSJ، ستساعد البروتوكولات البسيطة والسهلة التفسير المعروضة هنا الباحثين في توصيف وظائف تنظيم وانسداد pSJ بشكل صحيح. في الأدبيات، تم وصف العديد من الأساليب التجريبية الإضافية لتوصيف بروتينات pSJ، بما في ذلك استعادة التألق بعد التبييض الضوئي (FRAP) والمجهر الإلكتروني الناقل 6,23. على الرغم من أن هذه الأساليب غالبا ما تكون مفيدة جدا، فإن اختبار التلوين المناعي المعروض هنا يوفر تصورا سريعا لتحديد مواقع بروتين pSJ دون طرق فائقة البنية المكلفة ومستهلكة للوقت، بينما يقدم اختبار نفاذية الصبغة قراءة وظيفية لسلامة pSJ لا يمكن تحقيقه بالتصوير فقط. بالإضافة إلى ذلك، يمكن إجراء هذه الفحوصات باستخدام معدات مختبرية قياسية مثل مجهر فلوري عالي الجودة ونظام حقن دقيق بدائي. يجدر بالذكر أن هذه الاختبارات محسنة لتحليل أجنة المرحلة 16 من ذبابة الفاكهة وليست مناسبة لتقييم تنظيم أو وظيفة ذبابة الفاكهة الصلبية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. مرحلة الأجنة

  1. قم بدمج الذباب الذكري والأنثوي السليمين من الأنماط الجينية المناسبة (انظر جدول المواد كمثال) ووضعهم في أقفاص جمع الأجنة مع أطباق عصير التفاح الطازج المدهونة بمعجون الخميرة. دع الذباب يتأقلم مع أقفاص جمع البيض ليوم أو يومين قبل بدء جمع الأجنة.
  2. اجمع الأجنة على أطباق عصير التفاح ودعها تتطور إلى المرحلة 16 (~13 ساعة بعد وضع البيض (AEL) إلى 16 ساعة AEL عند 25 درجة مئوية). دع البالغين يضع البيض المخصب لمدة ساعة إلى ساعتين على أطباق عصير التفاح، ثم أخرج الطبق من قفص جمع البيض، ثم قم بتعتيقها إلى 13-16 AEL عند 25 درجة مئوية. بدلا من ذلك، جمع الأجنة طوال الليل عند درجة حرارة 25 درجة مئوية ثم اختيار الأجنة من المرحلة 16 قبل التثبيت أو أثناء التصوير بعد التثبيت والتلوين المناعي.
    ملاحظة: يمكن تقييم مرحلة الأجنة من خلال شكل الأمعاء، والذي يمكن رؤيته بسهولة من خلال التألق الذاتي في طيف الأشعة فوق البنفسجية (أي قناة DAPI). في الأجنة في المرحلة 16، تظهر الأمعاء كثلاثة بيضاوي متوازي طويل عمودي على محور الجسم الطويل (الشكل 1H).

2. تثبيت وتلوين المناعة للأجنة

  1. قم بتجميع سلة جمع الأجنة باستخدام شبكة نايلون (شبكة 120 مم). غط الفتحة وخيوط السلة بشبكة النايلون، ثم ثبت الغطاء بالبرغي.
  2. أزيل الأجنة بلطف من طبق عصير التفاح باستخدام فرشاة طلاء ومحلول غسل الأجنة. اسكب خليط الأجنة في سلة جمع الأجنة واشطف الأجنة بالماء المقطر.
    ملاحظة: كن حذرا من توجيه الماء إلى داخل سلة جمع الأجنة وتجنب رش الأجنة على جوانب السلة، مما قد يؤدي إلى فقدان الأجنة بسبب الالتصاق.
  3. قم بإزالة الأجنة عن طريق غمر سلة جمع الأجنة والأجنة في صينية تحتوي على 50٪ مبيض تجاري (تركيز نهائي من 3.75٪ هيبوكلوريت الصوديوم). حرك الأجنة في المبيض وابقها مغمورة لمدة 3-5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. أخرج السلة من المبيض وشطف الأجنة بالماء المقطر، مع توجيه تدفق الماء مرة أخرى إلى داخل السلة.
  4. جهز قارورة تثبيت بإضافة أحجام متساوية من محلول بارافورمالديهيد طازج بنسبة 4٪ وهبتان إلى قارورة وميض بسعة 20 مل. قم بصنع محلول بارافورمالديهايد عن طريق إذابة الكمية المناسبة من بارافورمالديهايد في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) ساخن (~90 °م) في غطاء بخار كيميائي. لتسريع عملية الذوبان، أضف 10 ميكرولتر من 14 نيوتن هيدروكسيد الصوديوم (لكل 10 مل من PBS) إلى التثبيت حتى يدخل الفورمالديهايد في المحلول، ثم أضف 10 ميكرولتر من حمض الهيدروكلوريك 14 نينوتن لإعادة الرقم الهيدروجيني إلى الحياد.
    تحذير: ارتد دائما معطف مختبر ونظارات وقفازات عند التعامل مع البارافورمالديهايد والهيبتان، واستخدم فقط تحت غطاء بخار كيميائي. البارافورمالديهايد مادة مسرطنة وتآكل، بينما الهيبتان شديد الاشتعال ومهيج للجلد والعين.
  5. فك سلة جمع الأجنة واغمس شبكة النايلون مع الأجنة المتقطعة في الهيبتان. ستنفصل الأجنة عن النايلون وتستقر عند الواجهة بين الهيبتان (الطبقة العليا) والطبقة الثابتة (الطبقة السفلية). قم بإصلاح الأجنة بهز قارورة التثبيت على جهاز هزاز منصة بسرعة 240 دورة في الدقيقة لمدة 20 دقيقة.
  6. أزل التثبيت من قارورة التثبيت باستخدام ماصة باستور في غطاء بخار كيميائي. تخلص من المحلول في حاوية نفايات كيميائية خطرة معتمدة. أضف كمية متساوية من الميثانول، وأغلق غرفة التثبيت، وهز الحجرة بقوة لمدة 5-10 ثوان. الأجنة الثابتة ستتمزق من غلاف الفيتيليين وتغوص إلى قاع الميثانول (الطبقة السفلية). ستبقى أظرف فيتلين وأي أجنة لم تمزق من غلاف الفيتلين عند الواجهة وسيتم إزالتها في الخطوة 2.7.
    تحذير: ارتد دائما معطف مختبر ونظارات واقية وقفازات عند التعامل مع الميثانول، لأنه سام وقابل للاشتعال.
  7. قم بإزالة الهيبتان باستخدام ماصة باستور وتخلص منها في حاوية نفايات كيميائية خطرة معتمدة. ثم أزل معظم الميثانول، تاركا الأجنة في بركة صغيرة من الميثانول، وتخلص من الميثانول في النفايات الكيميائية الخطرة. أضف 5 مل من الميثانول، ثم حرك الأجنة، ودعها تستقر. أزل معظم الميثانول مرة أخرى وكرر هذه العملية مرتين إضافيتين.
  8. انقل الأجنة في الميثانول إلى أنبوب زراعة زجاجي بسعة 0.8 مل. أزل الميثانول وأضف 750 مل من محلول الكتلة (PBS بالإضافة إلى 1٪ مصل حمار عادي و0.1٪ Triton X-100). اغسل الأجنة 3 مرات في PBS، ثم حضنها في محلول مكعب لمدة 30 دقيقة على درجة حرارة الغرفة مع خلط لطيف على منصة هزازة.
  9. اغسل الأجنة مرة أخرى في PBS ثم أضف كتلة مع الأجسام المضادة الأولية. استخدم الأجسام المضادة ضد بروتين pSJ الأساسي (مثل Coracle) وبروتين اتصال الالتصاق (مثل E cadherin). حضن الأجنة في الجسم المضاد الأولي طوال الليل عند درجة حرارة 4 درجات مئوية أو لمدة 3-4 ساعات في درجة حرارة الغرفة مع خلط لطيف على جهاز هزاز على منصة الهوز.
  10. قم بإزالة الكتلة التي تحتوي على الأجسام المضادة الأولية وشطف الأجنة ثلاث مرات في PBS. أضف بلوك واغسل الأجنة لمدة 30 دقيقة على درجة حرارة الغرفة على منصة هزازة.
  11. شطف الأجنة مرة أخرى في PBS، ثم أضف محلول الحظر والأجسام المضادة الثانوية الموسومة فلورية الخاصة بالأجسام المضادة الأولية المستخدمة في الخطوة 2.9. حضن الأجنة في درجة حرارة الغرفة لمدة 3-4 ساعات أو طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
  12. أزل الكتلة مع الأجسام المضادة الثانوية وشطف الأجنة ثلاث مرات في PBS. أضف بلوك واغسل الأجنة لمدة 30 دقيقة على درجة حرارة الغرفة على منصة هزازة.
  13. اشطف الأجنة مرة أخرى في PBS، ثم انقلها إلى شريحة مجهر باستخدام ماصة باستور. امسح فائض PBS باستخدام شرائط صغيرة من ورق واتمان، مع الحرص على عدم لمس الأجنة. غط الأجنة بوسائط تركيب (متوفرة تجاريا أو مصنوعة من 90٪ جليسرول، 10٪ M Tris، pH 8.0، مع 0.5٪ n-propyl galate كعامل مضاد للتلاشي). غطيه بزجاج تغطية بحجم مناسب 1.5، وأغلقي الحواف بطلاء الأظافر.

3. التصوير وتحليل البيانات للأجنة المصبوغة بالمناعة

  1. للحصول على أفضل النتائج، صور الأجنة على مجهر كونفوكال بهدف غمر زيت 40x. استخدم الأجنة الضابطة لضبط شدة الليزر والكسب على الكونفوكال لتحقيق إشارة فلورية قوية دون تشبع أي بكسل. تحديد الأجنة في المرحلة 16 المفضلة (أي تلك التي لا تعبر عن GFP المشفر بالتوازن لتحديد الأجنة الطفرية) باستخدام مورفولوجيا الأمعاء الوسطى. ركز الفحص على الغدة اللعابية أو الأمعاء الخلفية لأن هذه الأعضاء مستقطبة ولها أغشية جانبية طويلة مثالية لتمييز وصلة الالتصاقات والصلب الصلب وسطح الجانب المتبقي. صورة في موضع z تشمل أكبر قطر ممكن لتجويف الغدة اللعابية أو الأمعاء الخلفية لمراقبة الغشاء الجانبي الكامل للخلية الظهارية.
    ملاحظة: المثال المعروض في الشكل 1C تم تصويره على مجهر كونفوكال مع عدسة غمر زيت HC PL APO 40x/1.3 CS2 بشدة ليزر 1.59 وكسب 3.3 لليزر 561 نانومتر، وشدة ليزر 2.0 وكسب 21.7 لليزر 638 نانومتر (انظر جدول المواد).
  2. تخيل نسيجا مستقطبا في ما لا يقل عن 20 جنينا ضابطا وأجنينا متحورا في المرحلة 16. سجل فقط البيانات من الأجنة التي يكون فيها مؤشر وصلة الالتصاق موضع محكم في المنطقة الجانبية القمية من الغشاء لضمان تثبيت الجنين وصبغه بشكل مناسب. بعد ذلك، سجل توزيع علامة pSJ على طول الغشاء الجانبي. في الأجنة من المرحلة البرية 16، ابحث عن إثراء قوي لبروتينات pSJ على طول ~10-15٪ من الغشية الجانبية القاعدي مباشرة إلى نقطة الالتصاق.
    ملاحظة: عدم تحديد موقع حتى 10-20٪ من بروتين pSJ على طول الغشاء الجانبي هو دليل على وجود عيب في تنظيم pSJ. عيوب تنظيم pSJ تكون شديدة الاختراق في جميع الأجنة الطافرة الأساسية والملحقة، لذا يجب أن تتوقع رؤية 75-100٪ من الأجنة الطفرة تظهر بروتينا غير محلي بوضوح.

4. التحضير لحقن الصبغة

  1. اصنع محلول صبغة جديد عن طريق إذابة 10 كيلو دالتون ديكستران الموسوم بالرودامين إلى 1 ملغ/مل في فوسفات الصوديوم 0.5 مل، ودرجة الحموضة 7.5، و5 ملليمولار من كلوريد البوتاسيوم.
  2. اسحب أنبوب شعري (1.0 مم OD × 0.5 مم ID مع الألياف) إلى إبرة زجاجية باستخدام أداة سحب الإبر.
    ملاحظة: أجهزة سحب الإبر فريدة من نوعها وغالبا ما تختلف إعدادات الإبر المثالية من يوم لآخر. الإبر الجيدة لها تدرج تدريجي نحو نقطة حادة ويجب أن تقع بين الأشكال الموضحة في الشكل 2A. الإبرة على اليسار أطول وقد تنثني عند دفعها إلى داخل الجنين. يمكن تصحيح ذلك بإعادة كسر الإبرة بعيدا عن النقطة. الإبرة على اليمين جيدة لكنها ستكون ذات قطر أكبر عند كسرها في البداية وقد تدفع كمية زائدة من السائل إلى الجنين. إذا حدث ذلك، قم بتغيير إبرة جديدة ذات نقطة أدق. من الأفضل سحب عدة إبر في نفس الوقت عندما تخلق ظروف جهاز سحب الإبر إبر ذات الشكل الصحيح. يمكن تخزين الإبر الزائدة في وعاء مغلق مع قطعة من الرغوة أو شريط لاصق لتثبيت الإبر بشكل مستقل.
  3. ضع الإبرة في حامل الإبرة على جهاز تحكم دقيق. رتب جهاز التلاعب الدقيق بجانب مجهر مقلوب (الشكل 2F). وجه الإبرة بالقرب من الانزلاق المجهر قدر الإمكان وخفضها بحيث تكون في نفس مستوى z مع جانب الشريحة.
  4. اكسر طرف الإبرة بضرب جانب شريحة المجهر. ارفع الإبرة فوق مستوى الشريحة وأزلها للتحميل.
  5. املأ أنبوب الشعيرات الدموية بالصبغة باستخدام أصغر رأس ماصة متاح (طرف P2 أو P10) أو عن طريق العمل الشعيري بوضع الطرف الخلفي للإبرة في أنبوب طرد مركزي دقيق بسعة 1.5 مل مع الصبغة.
  6. أعد تحميل الإبرة المملوءة في حامل الإبر واختبر تدفق الدكستران عن طريق حقن قطعة في قطرة من زيت الهالوكربون على سطح شريحة المجهر.
    ملاحظة: الإبرة المكسورة جيدا لن تتسرب دون إضافة ضغط، ويمكن تعديل معدل التدفق حسب مقدار الضغط المطبق على المكبس في الحقنة.

5. تركيب الأجنة وحقن الصبغة

  1. اختر الأجنة في المرحلة 16 أو 17 (التحكم والطفر) باستخدام شكل الأمعاء الوسطى كعلامة للمرحلة.
  2. أنشئ خطا متبعدا على طبق عصير التفاح باستخدام غطاء سماكة 22 × 22 # 2. اصطف حوالي 25 جنينا مرحليا على طبق عصير التفاح بحيث تلامس نهاياتها الخلفية الخط والسطح البطني متجه للأعلى.
  3. ضع قطعة من الشريط اللاصق مزدوج الوجه على غطاء 22 × 22 #2. المس الشريط على خط الجنين وفرك الغطاء بخفة لنقل الأجنة من اللوحة إلى الشريط ذو الجانبين على الغطاء (الشكل 2B).
  4. قم بتثبيت غطاء الغطاء على شريحة المجهر عن طريق إضافة قطرة من زيت الهالوكربون إلى الشريحة واستخدام الحركة الشعرية لخلق رابطة. وجه غطاء الغطاء أقرب إلى جانب المنزلق المقابل لأي جزء متجمد. جفف الأجنة لمدة 3-5 دقائق في وعاء مجفف أو في الهواء على طاولة المختبر لمدة 10-15 دقيقة (الشكل 2C-E). غط الأجنة بالكامل بزيت الهالوكربون.
    ملاحظة: الأجنة ستكون أقل انتفاخا قليلا بعد الجفاف لكنها لن تكون مرتخية بشدة. تركت الأجنة الموضحة في الشكل 2E لتجف في الهواء لمدة 15 دقيقة في غرفة ذات رطوبة نسبية 42٪ عند 21.2 درجة مئوية.
  5. قم بتركيب الشريحة مع الأجنة على المجهر المقلوب بحيث تكون الأجنة متجهة للأعلى (بعيدا عن الهدف). قم بمحاذاة جهاز التحكم الدقيق بحيث تكون الإبرة موجهة للطرف الخلفي للأجنة بزاوية أقرب ما تكون موازية للأجنة (الشكل 2G). اضبط محور z في جهاز التلاعب الدقيق بحيث يكون طرف الإبرة محاذاة مع منتصف الجنين (على طول المحور الظهري-البطني).
  6. حقن الأجنة عن طريق تحريك المرحلة بسرعة إلى داخل الإبرة بحيث يدخل طرف الإبرة إلى الهيموكويل الخاص بالجنين. حقن كمية صغيرة من الصبغة (~0.2-0.5 نانولتر) باستخدام حقنة بسعة 10 أو 25 أو 50 مل. اسحب الإبرة بسرعة، وانقل المرحلة إلى الجنين التالي، وكرر العملية. حقن أكبر عدد ممكن من الأجنة خلال 10 دقائق.
    ملاحظة: من المهم أن تدخل الإبرة حوالي 25٪ من الطريق داخل الجنين حتى لا يتم حقن الصبغة مباشرة في الفراغ المحيطي الذي يمتد مع تجويف الأمعاء الأمامية والخلفية. يجب أن يبدو أن الصبغة المحقونة "تنتفخ" الجنين، مما يجعله يبدو أكثر انتفاخا. الحقن الزائد يؤدي إلى خروج فقاعة من الصبغة مع الهيموليمف من موقع الحقن ويجب تجنبه.
  7. أضف المزيد من زيت الهالوكربون وغط الأجنة بغطاء 22 × 22 #2. يشكل زيت الهالوكربون الإضافي طبقة أكثر انتظاما بين الغطاء الجانبي، مما يمنع سحق الأجنة.

6. التصوير وتحليل البيانات

  1. قم بإجراء تصوير إما على مجهر مركب فلوري أو مجهر كونفوكال (أهداف هوائية بحجم 10x أو 20x كافية لتحقيق نتائج لا لبس فيها). في القضيب الكونفوكي، سيكشف تصوير الديكسترون المعلم عبر حوالي ربع عمق (على طول المحور البطني الظهري) للجنين ما إذا كان الديكسترون الموسوم قد دخل تجويف القصبة الهوائية والأمعاء الخلفية (الأقسام الأعمق أو إعادة توجيه الأجنة مع السطح البطني في الأعلى ضروري لرؤية الغدد اللعابية).
    ملاحظة: تم التقاط الأمثلة المعروضة في الشكل 3 على مجهر كونفوكال مع عدسة جافة HC PL APO 10x/0.4 CS2 بجفة ليزر 2.0 وكسب 13.6 للليزر 561 نانومتر. تم الحصول على 24 شريحة z بحجم خطوة z 2.4 نانومتر (انظر جدول المواد).
  2. اترك الجنين المحقون يتقدم في العمر لمدة 10 دقائق ثم فحص تجويف القصبة الهوائية أو الغدة اللعابية أو الأمعاء الخلفية بحثا عن تراكم الديكستران الموسوم. سجل النمط الجيني والمرحلة لكل جنين وما إذا كان هناك تراكم للدكستران الموسوم في أي عضو أنبوبي. لاحظ أي أجنة يكون فيها الفضاء المحيطي ملطخة بقوة بالصبغة، حيث قد تمثل أجنة تم حقنها عن غير قصد في ذلك الفضاء.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تستخدم البروتوكولات المعروضة هنا لدراسة تنظيم ووظيفة الخلايا الربينية في أنسجة الجلد الخارجي في أجنة ذبابة الفاكهة في المرحلة 16. هذه البروتوكولات تنطبق فقط على ال pSJ ولا يمكن استخدامها لاستجواب sSJs. الطفرة في الجين التي تؤدي إلى فشل في تحديد مواقع بروتينات pSJ الأخرى في منطقة pSJ في الأجنة من المرحلة 16 وخلق وصلة مسدودة في المرحلة 16 تكون إما في جين pSJ الأساسي أو في جين pSJ المساعد. الفرق الرئيسي بين الاثنين هو ما إذا كان البروتين المشفر متمركزا تحت الخلوي في pSJ بمجرد تكوين وصلة وظي...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نقدم هنا بروتوكولا لتحديد بروتينات pSJ الأساسية والملحقة باستخدام اختبارين بسيطين نسبيا يمكن تحقيقهما في مختبرات ذات مجهر فلوري محدود العناصر. يفحص الاختبار الأول التنظيم الجزيئي لفصيل الصعوبة في الظهارة المستقطبة الناضجة باستخدام التصوير الكونفوكلي للأجنة المتحولة الثابتة. يختبر الاختبار الثاني سلامة وظيفة الانسداد في pSJ عن طريق حقن جزيئات ديكستران موسومة بالصبغة بقوة 10 كيلو دالتون في الأجنة الحية في المرحلة 16. بساطة هذه البروتوكولات وحقيقة أن وجود خلل في تنظيم ووظيفة pSJ يحدد تماما ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لا يوجد لدى المؤلفين تضارب مصالح للكشف عنها.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر مركز بلومينغتون لمخزون ذبابة الفاكهة على المخزون الذبابي المستخدم في هذه الدراسة. نشكر بنك الدراسات التطورية للهجناء على الأجسام المضادة المستخدمة في الدراسة. ونشكر أيضا قسم الأحياء في جامعة كيس ويسترن ريزيرف على استخدام المجهر الفلوري لايكا MZ10F المجسم الفلوري لتحديد وتصنيف الأجنة للتشريح، ومجهر DMi8 المقلوب للأشعة لتجارب حقن الصبغة. نشكر هيلين سالز، أستاذة علم الوراثة وعلوم الجينوم في كلية الطب بجامعة CWRU على توفير جهاز التلاعب الدقيق وسحب عدة إبر مستخدمة في تجربة حقن الصبغة التي عرضت في هذه الدراسة. وقد تم دعم هذا المشروع بمنحة من المؤسسة الوطنية للعلوم (IOS 2111069) ل REW.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
أنبوب شعري للبرز (بورو 1 × 0.5/ألياف)FHC30-30-1
المجهر الكونفوكاللايكاستيلاريس 5 
زجاج التغطية 22 × 22 بسماكة 2 للحقنفيشر ساينتيفك12-540-B
زجاج الغطاء 22 × 30 بسماكة 1.5 للتصويركورنينغ2980-233
أنبوب الزراعة لصبغ المناعة (6 × 50 مم) فيشر ساينتيفك14-958-A
قفص جمع الأجنةجينيسي ساينتيفك59-100
المجهر الفلوري المجسملايكاMZ10 F
زيت الهالوكربون (700)جينيسي ساينتيفك59-131
هيبتانفيشر ساينتيفكH350-4
مجهر الفلورة المقلوبلايكاDMi8
سلال شبكية لإزالة الأجنةجينيسي ساينتيفك46-101
الميثانولفيشر ساينتيفكA412-4
المعالج الدقيقناريشيغيMN151
شرائح المجهرفيشر ساينتيفك12-544-2
سحب الإبرآلات ديفيد كوبفالطراز 720
مصل الحمار العاديجاكسون إيمنو ريسيرش017-000-121
شبكة نايلون (120 ميكرومتر)جينيسي ساينتيفك57-102
عدسة الهدف HC PL FLUOTR 10X/0.32 PH 1لايكا11506537
عدسة الهدف HC PL APO 10x/0.40 CS2لايكا15506407
عدسة الهدف HC PL APO 40x/1.30 CS2لايكا15506358
ألواح بتري بحجم 60 × 15 ممكورنينغ351007
روكر المنصةغلوب ساينتفيكGTR-FS
الجسم المضاد الأولي (كوركل)DSHBC566.9
الجسم المضاد الأولي (كوركل)DSHBC615.16
الجسم المضاد الأولي (E cadherin)DSHBDCAD2
الجسم المضاد الأساسي (Mcr)مختبر الوارد، جامعة CWRUخنازير غينيا متعددة النسيلات
رودامين موسوم ب 10 كيلو دكستون ديكسترانالمجسات الجزيئيةD1824
الأجسام المضادة الثانوية (خنزير غينيا المضاد للحمار Cy3)جاكسون إيمنو ريسيرش706-165-148
الجسم المضاد الثانوي (مضاد للفأر الحمار Cy2)جاكسون إيمنو ريسيرش715-225-151
الجسم المضاد الثانوي (Cy5 مضاد للفئران الحمار)جاكسون إيمنو ريسيرش712-175-150
هز الطاولةنيو برونزويك العلميهز منصة C2
تيغوسبت (ميثيل 4-هيدروكسي بنزوات)TCIH0216
ترايتون X-100فيشر ساينتيفكBP151500
قوارير للتثبيت (قوارير 20 مل من WHEATON للوميض السائل)فيشر ساينتيفك03-341-73C
واتمان 3MM  ورقة الكروماتوغرافيافيشر ساينتيفك05-716-6H
<أسهم قوية>فلاي<النمط الجيني القوي>الكامل<رقم الأسهم القوي> <قوي>المصدر
كور4w*; P{neoFRT}43D cora4/CyO52232BDSC
W1118w[1118]5905BDSC
<قوي>حل<قوي>وصفة
10 مرات PBSاخلط 90 جرام من NaCl، و20 جرام من Na2HPO4، و8.3 جرام من NaH2PO4.H2O وdH20 إلى 1L. قم بتعقيم الفلتر. قم بتخفيفه إلى 1X باستخدام dH2O لخطوات الغسل في التصبغ المناعي.
حل 10٪ ترايتون X-100اخلط 1 مل من Triton X-100 مع 9 مل من dH2O على جهاز هزاز منصة حتى يذوب. خزن في درجة حرارة الغرفة.
50٪ مبيضاخلط 10 مل من المبيض التجاري (7.5٪ هيبوكلوريت الصوديوم) مع 10 مل من الماء قبل إزالة الأجنة.
أطباق عصير التفاحغلي 15 جرام من دروسوفيلا آجار في 725 مل dH2O. أضف 25 جرام سكر و250 مل من عصير التفاح وامزج حتى تمتزج. اترك المحلول يبرد إلى 55 درجة مئوية ثم أضف 1.3 جرام تيجوسبت وامزج بلطف. اسكبها في ألواح بتري بحجم 60 × 15 واتركها تبرد. المتجر عند 4 درجة مئوية.
حل الحجباخلط 9.8 مل من 1X PBS مع 100 ميكرو من 10٪ Triton X-100 و100 ul من Normal Donkey Serum في أنبوب مخروطي بحجم 15.
محلول غسل الأجنةاصنع محلول غسيل جنين 10X بخلط 70 جرام NaCl و2 مل Triton X-100 إلى 1 لتر من dH2O. قم بتخفيفه إلى 1X باستخدام dH2O لحل يعمل.
الإصلاحسخن 10 مل من 1X PBS في الميكروويف. أضف 0.4 ج  من بارافورمالديهيد والبيبت لخلطها. أضف 10 وحدة من 14 نيوتن NaOH إلى سرعة الذوبان. ضعها على كتلة حرارية بحرارة 90 درجة مئوية حتى تذوب. بمجرد عدم بقاء بارافورمالديهايد صلب، أضف 10 ميكرو من 14N HCL لضبط درجة الحموضة إلى الحياد. دائما ارتد معطف مختبر وقفازات ونظارات عند استخدام بارافورمالديهايد.
وسائط التركيباخلط 9 مل من الجلسرول و1 مل من 1M Tris base pH 8.0. أضف 0.05 جرام n-بروبيل-جالات،  اخلط وسخن حتى تذوب. أليكوت 0.5 مل في أنابيب إيبندورف. 
محلول رودامين ديكستراناصنع محلول صبغة طازج عن طريق إذابة ديكستران 10 كيلو دالتون الموسوم بالرودامين إلى 1 ملغ/مل في فوسفات الصوديوم 0.5M، ودرجة حموضة 7.5 و5 ملليمولار كلوريد البوتاسيوم.
معجون الخميرةاخلط 50 جرام من الخميرة التجارية (النجم الأحمر) مع رشة من السكروز وكمية كافية من الماء لصنع معجون كثيف. المتجر عند 4 درجة مئوية.

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Farquhar, M. G., Palade, G. E. Junctional complexes in various epithelia. J. Cell Biol. 17, 375-412 (1963).
  2. Lord, B. A., DiBona, D. R. Role of the septate junction in the regulation of paracellular transepithelial flow. J. Cell Biol. 71 (3), 967-972 (1976).
  3. Noirot-Timothée, C., Smith, D. S., Cayer, M. L., Noirot, C. Septate junctions in insects: comparison between intercellular and intramembranous structures. Tissue Cell. 10 (1), 125-136 (1978).
  4. Rouka, E., et al. The Drosophila septate junction beyond barrier function: review of the literature, prediction of human orthologs of SJ-related proteins and identification of protein domain families. Acta Physiol. 231 (1), e13527(2021).
  5. Poodry, C., Schneiderman, H. The ultrastructure of the developing leg of Drosophila melanogaster. Roux Arch. Dev. Biol. 166, 1-44 (1970).
  6. Tepass, U., Hartenstein, V. The development of cellular junctions in the Drosophila embryo. Dev. Biol. 161 (2), 563-596 (1994).
  7. Rice, C., De, O., Alhadyian, H., Hall, S., Ward, R. E. Expanding the junction: new insights into non-occluding roles for septate junction proteins during development. J. Dev. Biol. 9 (1), 11(2021).
  8. Baumgartner, S., et al. A Drosophila neurexin is required for septate junction and blood-nerve barrier formation and function. Cell. 87 (6), 1059-1068 (1996).
  9. Fehon, R. G., Dawson, I. A., Artavanis-Tsakonas, S. A Drosophila homologue of membrane-skeleton protein 4.1 is associated with septate junctions and is encoded by the coracle gene. Development. 120 (3), 545-557 (1994).
  10. Hall, S., et al. Macroglobulin complement-related (Mcr) encodes a protein required for septate junction organization and paracellular barrier function in Drosophila. Development. 141, 889-898 (2014).
  11. Nelson, K. S., Furuse, M., Beitel, G. J. The Drosophila claudin Kune-kune is required for septate junction organization and tracheal tube size control. Genetics. 185 (3), 831-839 (2010).
  12. Paul, S. M., Ternet, M., Salvaterra, P. M., Beitel, G. J. The Na⁺/K⁺-ATPase is required for septate junction function and epithelial tube-size control in the Drosophila tracheal system. Development. 130 (20), 4963-4974 (2003).
  13. Nilton, A., et al. coiled and crimpled are three Ly6-like proteins required for proper localization of septate junction components. Development. 137 (14), 2427-2437 (2010).
  14. Tiklova, K., Senti, K. A., Wang, S., Gräslund, A., Samakovlis, C. Epithelial septate junction assembly relies on melanotransferrin iron binding and endocytosis in Drosophila. Nat. Cell Biol. 12 (11), 1071-1077 (2010).
  15. Bilder, D., Schober, M., Perrimon, N. Integrated activity of PDZ protein complexes regulates epithelial polarity. Nat. Cell Biol. 5 (1), 53-58 (2003).
  16. Woods, D. F., Bryant, P. J. The discs-large tumor suppressor gene of Drosophila encodes a guanylate kinase homolog localized at septate junctions. Cell. 66 (3), 451-464 (1991).
  17. Hall, S., Ward, R. E. Septate junction proteins play essential roles in morphogenesis throughout embryonic development in Drosophila. G3 (Bethesda). 6 (8), 2375-2384 (2016).
  18. Genova, J. L., Fehon, R. G. Neuroglian, Gliotactin, and the Na⁺/K⁺-ATPase are essential for septate junction function in Drosophila. J. Cell Biol. 161 (5), 979-989 (2003).
  19. Ward, R. E., Lamb, R. S., Fehon, R. G. A conserved functional domain of Drosophila coracle is required for localization at the septate junction and has membrane-organizing activity. J. Cell Biol. 140 (6), 1463-1473 (1998).
  20. De, O., et al. Septate junction proteins are required for cell shape changes, actomyosin reorganization and cell adhesion during dorsal closure in Drosophila. Front. Cell Dev. Biol. 10, 947444(2022).
  21. Laprise, P., et al. The FERM protein Yurt is a negative regulatory component of the Crumbs complex that controls epithelial polarity and apical membrane size. Dev. Cell. 11 (3), 363-374 (2006).
  22. Laprise, P., et al. Neurexin IV and the Na⁺/K⁺-ATPase form a novel group of epithelial polarity proteins. Nature. 459 (7250), 1141-1145 (2009).
  23. Oshima, K., Fehon, R. G. Analysis of protein dynamics within the septate junction reveals a highly stable core protein complex that does not include the basolateral polarity protein Discs large. J. Cell Sci. 124 (Pt 16), 2861-2871 (2011).
  24. Hartenstein, V. Atlas of Drosophila Development. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1993).
  25. Lamb, R. S., Ward, R. E., Schweizer, L., Fehon, R. G. Drosophila coracle, a member of the protein 4.1 superfamily, has essential structural functions in septate junctions and developmental roles in epithelial cells. Mol. Biol. Cell. 9 (12), 3505-3519 (1998).
  26. Davis, M. J., Talbot, D., Jemc, J. Assay for blood-brain barrier integrity in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (151), e60233(2019).
  27. Laprise, P., et al. Epithelial polarity proteins regulate Drosophila tracheal tube size in parallel to the luminal matrix pathway. Curr. Biol. 20 (1), 55-61 (2010).
  28. Batz, T., Förster, D., Luschnig, S. The transmembrane protein macroglobulin complement-related is essential for septate junction formation and epithelial barrier function in Drosophila. Development. 141 (4), 899-908 (2014).
  29. Behr, M., Riedel, D., Schuh, R. The claudin-like Megatrachea is essential in septate junctions for epithelial barrier function in Drosophila. Dev. Cell. 5 (4), 611-620 (2003).
  30. Wu, V. M., et al. Sinuous is a Drosophila claudin required for septate junction organization and epithelial tube size control. J. Cell Biol. 164 (2), 313-323 (2004).
  31. Wu, V. M., et al. Drosophila Varicose, a member of a new subgroup of basolateral MAGUKs, is required for septate junctions and tracheal morphogenesis. Development. 134 (5), 999-1009 (2007).
  32. Jaspers, M. H., et al. The claudin Megatrachea protein complex. J. Biol. Chem. 287 (44), 36756-36765 (2012).
  33. Dietzl, G., et al. A genome-wide transgenic RNAi library for conditional gene inactivation in Drosophila. Nature. 448 (7150), 151-156 (2007).
  34. Zirin, J., et al. Large-scale transgenic Drosophila resource collections for loss- and gain-of-function studies. Genetics. 214 (4), 755-767 (2020).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Drosophila

مقالات ذات صلة