مقالة منهجية

التصور الفوري لتأثير الوسائط الغذائية على تطور الأغشية الحيوية لسودوموناس أيرجينوزا باستخدام نظام ميكروفلويديك

DOI:

10.3791/69997

⸱

مايو 15, 2026

 ,  , 
1School of Mechanical, Aerospace and Civil Engineering, University of Sheffield, 2School of Chemical, Materials and Biological Engineering, University of Sheffield

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يقيم هذا البروتوكول تأثير تركيبات الوسائط الغذائية الغنية (TSB) والبسيطة (FAB) على تطور الأغشية الحيوية لPseudomonas aeruginosa PAO1 وPA14 في بيئة تدفق مستقرة في قناة دقيقة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تعد البكتيريا الممرضة سودوموناس أيرجينوزا سببا رئيسيا للعديد من العدوى المرضية، وقد أدت مقاومتها المتزايدة للمضادات الميكروبية إلى شكلها تهديدا كبيرا للصحة العامة. تقدم هذه المقالة بروتوكولا شاملا يوضح استخدام نظام ميكروفلويديك لتصوير وتكميم تطور الأغشية الحيوية في سلالين رئيسيين من P. aeruginosa ، PAO1 وPA14. تستخدم الطريقة صفائح ميكروقنوات شفافة بصريا متعددة القنوات لتعريض المزارع البكتيرية لتدفق مستمر وثابت من الوسط، بما في ذلك مرق الصويا التريبتي (TSB) أو المرق اللاهوائي المعدل (FAB) بتركيزات مصادر كربون مختلفة، مما يحاكي الظروف الموجودة في البيئات السريرية. على مدى فترة 24 ساعة، يلتقط التصوير الآلي في الوقت الحقيقي نمو ونضج الأغشية الحيوية على شكل تغطية مساحة سطح الأغشية الحيوية، وسمكها، وخشونة السطح بطريقة قابلة للتكرار عالية. الهدف التجريبي هو استخدام النتائج لإثبات أن تكوين الغشاء الحيوي لكلا السلالتين يتأثر بشكل كبير بتغيرات في تركيب وسط المغذيات. هدف هذا البروتوكول المرئي هو توفير طريقة للباحثين لدراسة ديناميكيات الأغشية الحيوية تحت ظروف تدفق سطحي مستقر، ويمكن الاستفادة من الرؤى المستفادة لتطوير استراتيجيات بديلة غير مضادة للميكروبات للقضاء على أغشية P. aeruginosa في المراحل المبكرة من الأغشية الحيوية في البيئات المرضية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هدف هذه الطريقة هو مراقبة تأثير وسطين مختلفين من الثقافة، وهما مرق الصويا التريبتي (TSB) والمرق اللاهوائي المعدل (FAB)، على نمو الأغشية الحيوية لسلالين من Pseudomonas aeruginosa ، وهما PAO1 وPA14. على الرغم من أن P. aeruginosa PAO1 وPA14 هما سلالات مرجعية شائعة في المختبر، إلا أن سلالة PA14 تصيب نسبة أكبر من المضيفين من النباتات إلى اللافقاريات1. مرق المغذيات TSB هو وسط زراعة عام يحتوي على 2.5 جرام/لتر من الجلوكوز كمصدر للكربون، وقادر على زراعة مجموعة واسعة من البكتيريا بفضل تركيبه من الكازين وببتونات الصويا للنيتروجين العضوي وإمداد السكر الطبيعي، بالإضافة إلى كلوريد الصوديوم للحفاظ على التوازن الأسموزي2. أما وسط FAB الأدنى، فعلى النقيض من ذلك، يتم صياغته بتركيزات قليلة (تقليل 50 ضعفا) من مصدر كربون واحد، عند مستويات 0.05 جم/لتر لاستكشاف متطلبات نمو البكتيريا اللاهوائية. تعرض كل من اندفاعات PAO1 وPA14 لتدفق طبقي أحادي الاتجاه، مما أدى إلى إجهاد قص منخفض للجدار يبلغ 0.01 باسكال. غالبا ما توجد قيمة إجهاد القص هذه في المواقع التي استعمرتها P. aeruginosa، بما في ذلك القصبات الهوائية لدى مرضى التليف الكيسي والجهاز الهضمي. تم قياس نمو الأغشية الحيوية على مدى 24 ساعة من خلال تقييم نسبة تغطية مساحة السطح للغشاء الحيوي في الوقت الحقيقي، والسمك، والمتوسط الحسابي لخشونة السطح.

تعد أغشية P. aeruginosa مسؤولة عن نسبة كبيرة من العدوى الجراحية وتعد السبب الرئيسي للوفاة لدى الأشخاص المصابين بالتليف الكيسي 3,4,5. أهملت التحقيقات السابقة حول تأثير مستويات مصادر الكربون على تطور الأغشية الحيوية البكتيرية الدور الحاسم للتدفق الهيدروديناميكي أثناء تطور الأغشية الحيوية، واستخدمت قيم إجهاد القص التي لا تمثل مواقع عدوى P. aeruginosa، أو أجرت فقط تحليلات حركية وشكلية للأغشية الحيوية بعد التجربة 6,7. يتم معالجة هذه القيود بهذه الطريقة باستخدام التصوير اللحظي لتطور الأغشاء الحيوي، تحت ظروف تدفق مستقرة ضمن قناة ميكروفلويدية تحاكي بيئات فسيولوجية موجودة لدى مرضى التليف الكيسي.

تقدم هذه الطريقة مزايا كبيرة مقارنة بالتقنيات البديلة المستخدمة لدراسة تطور الأغشية الحيوية. يضمن تطبيق التصوير اللحظي خلال فترة نمو الأغشية الحيوية التي تستمر 24 ساعة أن الفيلم الحيوي المتطور لا يتأثر، حيث لا حاجة لتجفيف أو تغييرات كيميائية، مما يتجنب تغييرات في تركيبه وينتج نتائج أكثر تمثيلا من الطرق التي تتطلب معالجة العينة. بالإضافة إلى ذلك، من خلال تطبيق ظروف تدفق هيدروديناميكية مستقرة وتغيير تركيزات مصدر الكربون على مقدار كبير، يكرر هذا الإجراء بشكل أكثر دقة البيئات الفسيولوجية الموجودة في مواقع عدوى P. aeruginosa المستنجرية. وهذا يجعلها طريقة أكثر تمثيلا مقارنة بتلك التي تستخدم اختبارات ثابتة، مثل ألواح الميكروتيتر ذات 96 بئر أو الكوبونات، التي تفشل في التقاط التأثير الحاسم لتدفق السوائل على تطور الأغشية الحيوية 9,10,11.

تم اختيار الجهاز الميكروفلويديك المستخدم تحديدا لأن أبعاده تشبه أجزاء من الرئة مثل القصيبات الهوائية والشعب الهوائية12. علاوة على ذلك، تعد عدوى P. aeruginosa مصدر قلق كبير للمرضى الذين يعانون من جروح حروق شديدة، حيث يمكن أن تتقلب مستويات الجلوكوز بشكل كبير عن النطاق الطبيعيللمريض 13,14.

بينما يستخدم هذا البروتوكول نوعين من P. aeruginosa، فإن الطريقة تنطبق أيضا على التحقيقات في التطور المبكر لبكتيريا أخرى تسبب عدوى أو تستعمر مناطق تحت ظروف مشابهة. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أيضا دراسة تركيبات وسط المغذيات الأخرى وكذلك ظروف التدفق (مثل التدفقات النابضة والمتذبذبة، أو قيم القص الأعلى للجدار) باستخدام نفس المنهجية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. تنظيف الأواني الزجاجية

  1. اغمر زجاجتين زجاجيتين بسعة 200 مل للاستخدام كوسائط وأجار، وثلاث زجاجات زجاجية سعة 1 لتر في حمام حمض الهيدروكلوريك (HCl) بنسبة 10٪ لمدة تقارب 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    تحذير: حمض الهيدروكلوريك يسبب التآكل. قم بجميع التعامل مع الحمض باستخدام غطاء بخار كيميائي مع ارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة (معطف المختبر، القفازات، وحماية العين).
  2. بعد ذلك، أزل الأواني الزجاجية من حوض HCl وشطفها مرتين بماء الصنبور ومرة بالماء المقطر (dH2O).

2. تحضير وسائط مرق الصويا التريبتيك

  1. جهز محلول TSB، ووزن 6 جرام/200 مل من مسحوق TSB باستخدام قارب وزن نظيف، وتوازن دقيق.
    ملاحظة: تركيب مسحوق TSB المستخدم كالتالي: ديكستروز (2.5 ج∙لتر-1)، فوسفات ثنائي البوتاسيوم (2.5 ج∙لتر-1)، هضم البنكرياس للكازين (17 جرام-1)، الهضم البابوي لدقيق الصويا (3.0 ج∙لتر-1)، وكلوريد الصوديوم (5.0 ج∙لتر-1).
  2. قس 200 مل من dH2O باستخدام أسطوانة قياس واسكبها في إحدى زجاجات الزجاج التي تم تنظيفها سابقا.
  3. أضف 6 جرام من TSB إلى زجاجة زجاجية نظيفة تحتوي على 200 مل من dH2O، ثم أغلق الزجاجة بإحكام وامزج لمدة حوالي دقيقتين لإذابة البودرة، مما يتكون وسط محلول TSB.
  4. محلول الأوتوكلاف TSB لمدة 15–20 دقيقة عند درجة حرارة 121 درجة مئوية وضغط 1.5 atm، لتعقيم المحلول.
    ملاحظة: (نقطة التوقف) يمكن تخزين محلول TSB في درجة حرارة الغرفة (حوالي 20 درجة مئوية) بين الاستخدامات واستخدامه في تجارب مستقبلية.

3. تحضير وسط مرق لاهوائي دقيق

  1. جهز محلول معدني أثر في وسائط FAB.
    1. استخدم قوارب وزن منفصلة ونظيفة وملعقة، وميزان دقيق عند وزن الكتل بين 0.5–210 جرام، وميزان تحليلي عند وزن الكتل بين 0.001–0.5 جم. قس المكونات التالية وكمياتها: CaSO 4.2H 2O (200 mg∙L-1)، FeSO4.7H 2O(200 mg∙L-1)، MnSO4. H2O (20 mg∙L-1)، CuSO 4.5H2O (20 mg∙L-1)، ZnSO4.7H 2O (20 mg∙L-1)، CoSO4.7H 2O (10 mg∙L-1)، NaMoO4. H2O (10 mg∙L-1)، و H3BO3 (5 mg∙L-1) 7,9.
    2. أضف كل مكون إلى زجاجة زجاجية نظيفة بسعة 1 لتر تحتوي على 1 لتر من dH2O وامزج جيدا مع dH2O.
    3. أضف 1 مل من الخليط إلى كل من الزجاجتين المعقمة المتبقيتين بسعة 1 لتر مع 1 لتر من dH2O وامزجه جيدا.
  2. حضر 20 ملليمولار من FAB المكملة بسترات الصوديوم للزراعة الليلية
    1. قياس المكونات التالية وكمياتها باستخدام قوارب وزن منفصلة ونظيفة وملعقة وميزان، وتوازن دقيق عند وزن الكتل بين 0.5-200 جم، وتوازن تحليلي عند وزن الكتل بين 0.001-0.5 جم، وتوازن تحليلي عند وزن الكتل بين 0.001-0.5 جم، KH2PO4 (3 g∙L-1)، NaCl (3 g∙L-1)، MgCl2 (93 mg∙L-1) وكالكلوريزون2 (11 ملغ∙L-1) 7,9.
    2. أضف جميع المكونات إلى إحدى زجاجات الزجاج المعقمة المتبقية بسعة 1 لتر تحتوي على 1 لتر من dH2O مع 1 مل من محلول المعادن النزرة.
    3. اخلط جيدا.
  3. حضر 0.3 ملليمولار FAB المكملة بالجلوكوز لنمو الأغشاء الحيوي.
    1. استبدل 20 ملليمول من سترات الصوديوم ب 0.3 ملليمول من الجلوكوز. استخدم نفس المكونات والكتل المذكورة في الخطوة 3.2.1.
    2. في زجاجة الزجاج المتبقية المنظفة بسعة 1 لتر، أضف مكونات الجلوكوز FAB بسعة 0.3 ملليمولإلى 1 مل من محلول المحلول المعدني النزري مع 1 مل من محلول المعادن النزرة وامزج جيدا.
  4. استخدم المعقم لمدة 15-20 دقيقة عند درجة حرارة بخار 121 درجة مئوية وضغط 1.5 درجة جو، لتعقيم الوسط.
    ملاحظة: (نقطة توقف) يمكن تخزين محلول وسط التصنيع في درجة حرارة الغرفة (حوالي 20 درجة مئوية) بين الاستخدامات واستخدامه في تجارب مستقبلية.

4. تحضير الأجار TSB

  1. قم بقياس 8 جرام/200 مل من الأجار TS باستخدام الميزان الدقيق وقوارب الوزن المغسولة والملعقة اليدوية.
  2. قس 1 جرام لكل 200 مل من الأجار عبر الدرجة البكتيرية، على قارب وزن منفصل، باستخدام نفس الميزان الدقق.
  3. باستخدام أسطوانة قياس، قس 200 مل من dH2O وصببه في الزجاجة الزجاجية النهائية التي تم تنظيفها سابقا.
  4. صب كلا مكوني الأجار في 200 مل من dH2O وامزج جيدا.
  5. يتم تعقيم الوسط لمدة 15–20 دقيقة عند درجة حرارة 121 درجة مئوية وضغط 1.5 درجة مئوية، لتعقيم الوسط.
    ملاحظة: (نقطة توقف) يمكن تخزين أجار TSB في درجة حرارة الغرفة (حوالي 20 درجة مئوية) بين الاستخدامات ويتطلب إعادة تسخينه قبل استخدامه في التجارب المستقبلية.

5. زراعة طبق بتري سودوموناس إيروجينوزا

  1. اذيب الأجار في الميكروويف لمدة تقارب 5 دقائق، أو حتى يصبح المحلول سائلا.
  2. افتح وتعقيم سطح خزانة الأمان من الفئة الثانية بمحلول إيثانول بنسبة 70٪، جاهزة للاستخدام. قم بجميع الخطوات أدناه في هذا القسم ضمن خزانة السلامة من الفئة الثانية.
  3. قس 25 مل من محلول الأجار في قارورة بحجم 50 مل واسكبها في طبق بتري بسمك 90 مم، وانتظر حتى يتماسك الأجار.
  4. استرجع مخزون P . aeruginosa PAO1 وPA14 المجمد من فريزر بدرجة -80 درجة مئوية. ضع المخزون في الحاضنة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة تقارب 5 دقائق أو حتى تذوب المحتويات تماما.
  5. اغمس حلقة التلقيح داخل أي من مخزونات P. aeruginosa المذابة وانشر العينة عبر الأجار.
  6. كرر الخطوة 5.5 لسلالة P. aeruginosa الأخرى، مما يخلق نبتتين منفصلتين من أطباق P. aeruginosa ، واحدة بسلالة PAO1 والأخرى بسلالة PA14.
  7. ضع علامة على كل طبق بترى بسلالة P. aeruginosa بداخله، وتاريخ الإحياء، والأحرف الأولى، ثم وضعها في الحاضنة لمدة 16–18 ساعة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية.
    ملاحظة: (نقطة توقف) يمكن تخزين أطباق بتري PAO1 وPA14 على درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 4 أسابيع واستخدامها في تجارب مستقبلية.

6. مخزونات الجليسيرول من Pseudomonas aeruginosa PAO1 وPA14

  1. افتح وقم بتعقيم خزانة أمان من الفئة الثانية للاستخدام، واختر ثمانية قوارير بسعة 50 مل لاحتواء الزراعة الليلية.
  2. باستخدام وسط TSB وcitrate الصوديوم FAB المصنع سابقا (القسم 3)، صب 5 مل من وسط TSB في أربعة من القوارير الثمانية، ووسط فاب الصوديوم البسيط في الأربعة المتبقية.
  3. باستخدام أطباق بتري التي تم حضنها سابقا وحلقة تلقيح، قم بلمس خمس مستعمرات منفصلة في طبق P. aeruginosa PAO1 Petri وانتقل إلى إحدى قوارير TSB. كرر ذلك لوسط فاب سترات الصوديوم وطبق بيتري من نوع P. aeruginosa PA14.
  4. اغمر حلقة تلقيح نظيفة مباشرة في القوارير الأربعة المتبقية من TSB وسيترات الصوديوم FAB، مكونة عناصر تحكم.
  5. حضن جميع القوارير الثمانية في حاضنة هزة لمدة 16–18 ساعة عند 200 دورة في الدقيقة و37 درجة مئوية مع وضع علامة واضحة على العلامة.
  6. استرجع قوارير الزرعة، وتأكد من أن القوارير التي تم تطعيمها ب P. aeruginosa عكرة، وأن تلك المستخدمة كأدوات تحكمية تبقى سليمة.
  7. قم بطرد المركزي على القوارير الأربعة الملقحة ب P. aeruginosa بحرارة 4000 × جرام لمدة 5 دقائق عند 20 درجة مئوية لفصل P. aeruginosa عن وسط الثقافة. تأكد من أن جهاز الطرد المركزي متوازن.
  8. تجاهل المادة الفائقة وأعد تعليق حبيبة P. aeruginosa بعد الطرد المركزي باستخدام 1 مل من المحلول يحتوي على 15٪ جلسرول، مع 150 ميكرولتر جليسرول و850 ميكرولتر من وسط FAB طازج من TSB أو سترات الصوديوم.
  9. انقل المزارع المعلقة إلى قوارير بحجم 1 مل وضعها في الفريزر بدرجة حرارة -80 درجة مئوية.
    ملاحظة: (نقطة توقف) يمكن تخزين مخزونات الجلسرول عند -80 درجة مئوية للتخزين طويل الأمد واستخدامها في التجارب المستقبلية.

7. قياس الكثافة البصرية للثقافات الليلية

  1. كرر الخطوات 6.1–6.5، لقارورتين TSB متوسطة فقط، واحدة كضابط والأخرى بسلالة PAO1 P. aeruginosa .
  2. قم بتحويل 1 مل من وسط TSB إلى قارورة مقياس طيف بسعة 1 مل، داخل خزانة أمان من الفئة الثانية، وانقل 0.9 مل من وسط TSB إلى القارورة الثانية، مع إضافة 0.1 مل من الزراعة الليلية.
  3. قم بضبط مقياس الطيف على طول موجة ضوئية 600 نانومتر، وباستخدام قارورة مطياف TSB بسعة 1 مل لمعايرة الجهاز، قم بقياس الكثافة البصرية لقارورة التعليق بسعة 0.1 مل15.
    1. إذا لم يكن الامتصاص المقاس 0.1، أعد حساب حجم التعليق المطلوب.
      ملاحظة: يمكن حساب حجم التعليق المطلوب لتحقيق قراءة امتصاص 0.1 (V1) باستخدام قراءة امتصاص قارورة التعليق الأولية بمقدار 0.1 مل، C1، الامتصاص المطلوب الذي يتم تعديل التعليق عليه، C2، وحجم التعليق المركز الليلي المرغوب فيه، V2:
      C1V1 = C2V2
      في المثال أعلاه، إذا كان C1 = 3.59، C2 = 0.1 و V2 = 10 مل، فإن حجم التعليق الليلي المطلوب سيكون 0.279 مل في محلول 10 مل.
  4. قس 10 مل من وسط TSB في قارورة 50 مل وأزل نفس حجم التعليق اللازم لإنشاء تعليق 10 مل 0.1 OD 600 نانومتر. باستخدام الزراعة الليلية، أضف حجم التعليق المحسوب والدوامة لمدة حوالي 5 ثوان للخلط.
  5. انقل 1 مل من نظام التعليق المعدل بسعة 10 مل إلى قارورة مقياس الطيف وأعد قياس الامتصاص لضمان أنها 0.1.
  6. كرر الشرح أعلاه 7.1–7.5 لوسطاء PA14 وTSB ولكل من سلالات P. aeruginosa ووسط سيترات الصوديوم FAB.

8. عدد الخلايا القابل للحياة

  1. نقل dH2O إلى طبق بتري مربع داخل خزانة أمان من الفئة الثانية واستخدم ماصة متعددة القنوات لنقل 180 ميكرو لتر إلى الأعمدة 2–9 من لوحة بوليسترين شفافة ب 96 بئر16.
  2. انقل تعليق 0.1 OD 600 بسعة 10 مل إلى طبق بيتري مربع منفصل، وباستخدام الماصة متعددة القنوات، نقل 200 ميكرولتر من التعليق إلى العمود 1 من صفيحة البوليسترين ذات 96 بئر.
  3. نقل أكثر من 20 ميكرولتر من التعليق باستخدام الماصة متعددة القنوات من العمود 1 من صفيحة البوليسترين ذات 96 بئر إلى القناة 2، ثم نقل 20 ميكرولتر من التعليق المخفف في القناة 2 إلى القناة 3، وتكرار ذلك إلى القناة التاسعة، مما يخلق تخفيفات تعليق من 10-1 إلى 10-8.
  4. انقل 50 مل من الأجار TS (القسم 4 والخطوة 5.1)، في خزانة أمان من الفئة الثانية باستخدام قارورة، إلى طبق بيتري مربع واتركه حتى يصبح الأجار عكرا.
  5. نقل 10 ميكرولتر من كل بئر على طول الأعمدة 2–9 إلى طبق بتري الأجار TS في تشكيل أعمدة، باستخدام ماصة متعددة القنوات، لضمان عدم تلامس الأعمدة بعضها البعض.
  6. حضن TS أجار لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية، بعد الانتظار حتى تستقر التخفيفات المنقولة.
  7. حساب وحدات تكوين المستعمرة (CFU) لكل ملليلتر (ملليتر) بتحديد ما إذا كان طبق بتري قابلا للعد (بين 30 و300 مستعمرة).
  8. تحديد عامل التخفيف لنظام التعليق البالغ 10 مل المستخدم؛ في هذه الحالة، تم تخفيف نظام التعليق إلى 1/10 (0.1 OD 600).
  9. احسب عوامل التخفيف الفردية لكل عمود مطلي. هذا هو مقدار التعليق المخفف المضاف إلى كل عمود مقسوما على الحجم الكلي للعمود بعد إضافة التعليق. في حالة العمود 2 من صفيحة 96 بئر (العمود 1 من طبق بيتري)، 20 ميكرولتر/200 ميكرولتر = 1/10.
  10. احسب عامل التخفيف الكلي على التوالي عن طريق ضرب عوامل التخفيف الفردية لكل عمود معا.
    ملاحظة: في هذه الحالة، بما أن 20 ميكرولتر تم نقله من كل عمود إلى آخر، مما جعل الحجم الكلي لكل عمود بئر 200 ميكرولتر، كان كل تخفيف متسلسلة فردي 1/10. ليصبح إجمالي تخفيف السلسلة 1 × 10-8.
  11. حدد عامل تخفيف الطلاء أثناء نقل التخفيف من صفيحة 96 بئر إلى طبق بتري. لتحديد CFU/mL، اقسم حجم كل عمود مطلي (10 ميكرولتر) على 1 مل. في هذه الحالة: figure-protocol-1.
  12. تحديد عامل التخفيف النهائي عن طريق ضرب عامل تخفيف التعليق الأصلي (0.1) في عامل التخفيف التسلسلي الكلي (1 × 10-8) وعامل تخفيف الطلاء (figure-protocol-2).
  13. احسب CFU∙mL-1 في العينة الأصلية، وضرب CFU على اللوح في معكوس عامل التخفيف النهائي.
    ملاحظة: في هذه الحالة، إذا تم احتساب 200 وحدة CFU، فهذا يعني تنفيذ 200 × 1/1 × 10-8 ، مما يجعل CFU/ml هو 2 ×10 10 CFU∙mL-1 17.

9. إعداد نظام الميكروفلويديك والتجربة

  1. قم بتلقيح 5 مل من وسط الزراعة مع كل سلالة من P. aeruginosa لتكوين مزرعة ليلية وحضن لمدة 16–18 ساعة عند 37 درجة مئوية.
  2. قم بإعداد نظام الميكروفلويديك والبرمجيات المرتبطة به.
    1. فعل مكونات نظام الميكروفلويديك بالترتيب التالي: مزود الطاقة، وحدة تحكم نظام الميكروفلويد، كاميرا CMOS، سخانات الحواف، المجهر، الكمبيوتر، والشاشات المرتبطة بها.
    2. قم بتفعيل برنامج الميكروفلويديك وبدء واجهة وحدة التحكم المصاحبة عن طريق إدخال الباركود المرتبط باللوحة متعددة القنوات 0–2 باسكال بقيمة 48 بئر عند الطلب، الموجود على جانب اللوحة متعددة القنوات.
  3. قم بإجراء تلقيح بئر الصفائح متعددة القنوات في P. aeruginosa .
    1. اضبط الكثافة البصرية لزراعة الليلة إلى 0.1 OD600.
    2. نقل 50 ميكرولتر من نظام تعليق 0.1 OD 600 إلى بئر المخرج لكل من القنوات الست بالتوازي داخل خزانة أمان من الفئة الثانية.
      ملاحظة: تم تشغيل ست قنوات بالتوازي في أي وقت لتعظيم احتمال التعرف على النتائج الشاذة.
    3. استبدال غطاء اللوحة متعدد القنوات ذو 48 بئر ونقله إلى المرحلة المتحركة الموجودة داخل حاضنة النظام وتثبيته.
  4. اضبط إجراء تلقيح قنوات الصفائح متعددة القنوات من P. aeruginosa .
    1. زرع قنوات الميكروفلويديك باستخدام وحدة التحكم في نظام الميكروفلويديك باختيار: أعمدة يدوية > 1–4 > السائل: TSB عند 37 درجة مئوية > قص أقصى (باسكال): 0.1 (1 داين∙سم-2 = 0.1 باسكال) واختيار بئر مخرج لمخطط ألواح متعدد القنوات بمعدل 0–2 باسكال ببئر 48.
    2. اختر زر الإجهاض لإيقاف التدفق بعد 2–4 ثوان واترك اللوح لمدة 30 دقيقة، لضمان تثبيت الخلايا على ركيزة القناة قبل بدء التدفق المستمر.
      ملاحظة: مدة 30 دقيقة تسمح للقوة الجاذبية بالمساعدة في التصاق بكتيريا P. aeruginosa العوالق بجدار القناة السفلية. تختلف هذه الفترة حسب نوع البكتيريا ونوع وسط المغذيات.
    3. قم بإزالة اللوحة متعددة القنوات من مرحلة الحاضنة المتحركة وانقل 1 مل من TSB الطازج إلى بئر السحب لكل من القنوات الست في خزانة الأمان من الفئة الثانية.
    4. انقل اللوحة متعددة القنوات إلى المرحلة المتحركة داخل الحاضنة وتثبيتها في مكانها.
  5. قم بإعداد AutoRun.
    1. تأكد من أن التدفق المستخدم طوال تجارب 24 ساعة مرتبط بمكان وجود P. aeruginosa في الطبيعة، من خلال التنقل إلى إجهاد القص اليدوي > : 0.01 باسكال، وتسجيل معدل تدفق الحجم (μL⋅h-1) المعروض. تأكد من أن هذه القيمة للصفيحة ذات القناة الدقيقة ذات 48 بئر هي 8.2 ميكرولتر⋅ ساعة واحدة.
    2. حول معدل تدفق الحجم إلى m3∙s-1، وحساب مساحة المقطع العرضي للقناة (m2)، وحدد سرعة التدفق عند إجهاد القص الهيدروديناميكي بقيمة 0.01 باسكال.
      ملاحظة: باستخدام وإعادة ترتيب معادلة معدل تدفق حجم السائل، يمكن حساب سرعة السائل عبر القناة:
      figure-protocol-3
      حيث U هي سرعة السائل (m∙s-1) وA هي مساحة المقطع العرضي للقنوات الدقيقة (m2) للقنوات في الصفيحة متعددة القنوات.
    3. احسب رقم رينولدز التدفق باستخدام الكثافة والρ واللزوجة الديناميكية μ لوسط TSB، وتأكد من وجود أغشية P. aeruginosa الحيوية ضمن نطاق تدفق السوائل. لجهد القص الهيدروديناميكي بقيمة 0.01 باسكال، تأكد من أن رقم رينولد هو 0.0117 و0.0165 لوسائط TSB وFAB على التوالي. إذا كانت خارج هذا النطاق، تحقق من أن ظروف السائل مضبوطة على TSB.
      figure-protocol-4
      حيث Dh هو القطر الهيدروليكي للقناة الدقيقة المستخدمة، يتم الحصول عليه باستخدام:
      figure-protocol-5
      حيث تمثل w و h العرض (m) والارتفاع (m) للقناة الدقيقة المستخدمة.
    4. احسب طول تطور السائل لضمان تطور تدفق السائل داخل منطقة التقاط الصورة بالكامل.
      ملاحظة: يمكن حساب طول تطوير السائل الطبقي عبر قناة باستخدام رقم رينولدز Re وقطر الهيدروليكي للقنوات Dh:
      L dev = 0.06ReDh
    5. قم بإعداد التشغيل التلقائي: تعديل التشغيل التلقائي > البروتوكول إعداد > مدة الزمن: 24 ساعة، مع تكرار 1 وإجهاد قص 0.01 Pa. حفظ البروتوكول.
    6. أنشئ تسلسلا جديدا في تبويب إعداد التسلسل عن طريق تطبيق البروتوكول الجديد مع تكرار واحد على القنوات من 1 إلى 6 واختر السائل: TSB عند 37 درجة مئوية. احفظ هذا التسلسل.
  6. قم بإعداد التقاط الصور باستخدام نافذة الاستحواذ متعدد الأبعاد .
    1. اختر اكتساب متعدد الأبعاد باستخدام برنامج النظام، ثم زر البث المباشر (أسفل يسار نافذة الاكتساب متعدد الأبعاد ). تنقل في مرحلة المجهر لعرض القنوات من 1 إلى 6 باستخدام زر العرض المباشر وتكبير الكاميرا من 5× إلى 40× على شاشة المجهر اللمسية، مع عرض قناة واحدة في مجال رؤية الكاميرا في كل مرة.
    2. جهز الكاميرا لالتقاط الصورة: > الجمع متعدد الأبعاد . الحفظ: اختر دليلا للصور التي سيتم حفظها > تايم لابس: المدة: 24 ساعة، نفس مدة التدفق الهيدروديناميكي > الفترة الزمنية: الوقت بين كل صورة ملتقطة، مضبوطة على 10 دقائق.
    3. أدخل إعدادات الكاميرا باختيار الطول الموجي > الإضاءة: الحقل الساطع 50٪ الكاميرا 50٪: أبيض وأسود > التعريض التلقائي: كل اكتساب > الاكتساب: كل نقطة زمنية > التركيز التلقائي: أبدا.
    4. تحديد مواقع الكاميرا لالتقاط صور الفيلم الحيوي عن طريق ضبط التكبير إلى 20×، مما ينتج مجال رؤية بأبعاد 665.6 ميكرومتر × 665.6 ميكرومتر، ثم انتقل إلى منتصف منطقة مشاهدة القناة، حيث سيتم نقش رقم القناة في المركز.
    5. أضف موقع المرحلة بحيث تلتقطه الكاميرا، ثم انتقل إلى المسرح ، وسم الموقع، واختر زر الإضافة لإضافته إلى المجلد.
      1. كرر ذلك للنقاط الأعلى 0.9984 مم ونقاط الأسفل 3.0016 مم من مدخل منطقة مشاهدة القناة، حيث يمثل الموقع النقطة الوسطى في مجال رؤية الكاميرا.
        ملاحظة: تم اختيار هذه المواقع لتوفير تمثيلات لنمو الأغشية الحيوية على طول منطقة المشاهدة، مع ضمان تطور التدفق الكامل داخلها. ينتج عن ذلك التقاط ثلاث صور لكل قناة صغيرة، وفي هذه الحالة، مما يؤدي إلى التقاط 18 صورة كل 10 دقائق.
  7. أداء تجربة
    1. في نافذة وحدة التحكم في النظام، اختر التشغيل التلقائي > تشغيل الإعداد > التسلسل: اختر تسلسل 0.01 Pa الذي تم إنشاؤه، ثم اختر البدء.
    2. مباشرة بعد ذلك، انتقل إلى نافذة الاستحواذ متعدد الأبعاد > Acquire. يبدأ هذا جمع 18 صورة كل 10 دقائق خلال العملية التجريبية التي استمرت 24 ساعة، مما ينتج 2610 صورة عند انتهاء التجربة.
      ملاحظة: تم إعادة إنتاج القسم أعلاه عبر ست قنوات ميكروية إضافية بطول حوالي 48 ساعة بعد التجربة الأولية بظروف متطابقة.

10. تراكم المكدس Z

  1. في نهاية كل تجربة تجريبية، اختر ثلاث قنوات واحصل على مجموعات z من ثلاثة أقسام على طولها بتكبير 40× عن طريق فتح > Main: إلغاء تحديد جميع الخيارات ما عدا 'سلسلة Z'.
  2. انتقل إلى سلسلة Z بعد اختيار قسم على قناة ضمن الاستحواذ متعدد الأبعاد ، وقم بتغيير > الإعدادات التفاعلية: زيادة: 0.5 وقم بإلغاء تحديد مربعي العلامة معا.
  3. استخدم مقبض تركيز المجهر وقم بتدويره حتى يصبح الفيلم الحيوي خارج التركيز، وأدخل مسافة z باختيار تعيين "إعادة من الأعلى إلى التيار". كرر هذا الإجراء، لكن بتدوير مقبض التركيز في الاتجاه المعاكس واختيار تعيين Bottom To Current. هذا يمنح المجهر مدى لالتقاط المكدس z.
  4. اختر مجلدا داخل نافذة الحفظ لحفظ ال z-stack واختر Acquire في أسفل يمين النافذة لبدء عملية الاستحواذ.

11. تحليل الصور والبيانات بعد التجربة

  1. احصل على نسبة تغطية مساحة سطح الفيلم الحيوي.
    1. تحميل الصور التي تم الحصول عليها في برنامج النظام باختيار: أدوات التحليل > مراجعة البيانات متعددة الأبعاد > اختيار ملف أساسي > اختيار الدليل: انتقل إلى المجلد الذي يحتوي على الصور المحفوظة > عرض > الطول الموجي 1، وفي القسم المربع المركزي الذي يعرض أفقيا عدد الصور الملتقطة، انقر بزر الفأرة الأيمن على المربع الرمادي الصغير في الأعلى. الزاوية اليسرى.
    2. قم بتحميل صور كل قسم من القناة، واحدة تلو الأخرى، اختر موقع المسرح: اختر الموقع الذي ستعرضه > تحميل الصور. احفظ سلسلة الصور كملف TIFF.
    3. قم بتحديد عتبة الصورة باختيار عتبة الصورة > العتبة التلقائية للأجسام الداكنة التي تبرز الفيلم الحيوي، ثم وضع حدود للصورة باستخدام أداة المنطقة المستطيلة .
      ملاحظة: يمكن تحريك شريط التمرير على الجانب الأيسر من الصورة المحددة لأعلى أو أسفل لتعديل شدة العتبة للتمييز بشكل أفضل بين الفيلم الحيوي والخلفية. إذا كانت الصورة تحتوي على ظلال، قم بتحديد القسم الذي لا يبقى كذلك، حيث قد تكون الظلال قد تم تمييزها افتراضيا، مما يغير قيم القياس.
    4. احصل على بيانات حول نسبة تغطية مساحة السطح للغشاء الحيوي في الصورة خلال تجربة استمرت 24 ساعة عن طريق اختيار MM Standard > قياس > قياسات المنطقة في نافذة برنامج النظام لإنشاء جدول بيانات حول الفيلم الحيوي المميز داخل الإطار المستطيل، بما في ذلك نسبة مساحة العتبة. اختر فتح سجل لفتح وحفظ ملف سجل، واختر F9: بيانات السجل لإدخال البيانات في ملف السجل.
    5. افتح جدول بيانات، وباستخدام بيانات الفيلم الحيوي لمدة 24 ساعة لكل قسم قناة، أنشئ رسما بيانيا يوضح نسبة تغطية مساحة سطح الفيلم الحيوي خلال 24 ساعة.
  2. احصل على سمك الأغشية الحيوية ومتوسط خشونة السطح الحسابية.
    1. حفظ مكدس z-stack في فيجي (ImageJ) عن طريق سحب الملف المحفوظ إلى شريط التحكم في فيجي وتحويله إلى صورة 8-بت: Image > Type > 8-بت.
    2. زد التباين بين البيوغما وسطح القناة لتجنب أي ضوضاء غير مرغوب فيها: > الصورة > ضبط السطوع/التباين.
    3. قم بتحديد عتبة الصورة، مع تعيين قيمة بكسل البيوفيلم على 255 (أبيض) وقيمة بكسل الخلفية 0 (أسود): الصورة > ضبط العتبة >.
    4. حدد مقياس الصورة، تحليل > اضبط مقياس المسافة > بالبكسل: 2048 > المسافة المعروفة: 332.8 > نسبة العرض إلى البكسل: 1.0 > وحدة الطول: ميكرومتر.
      ملاحظة: المسافة المعروفة هي 332.8 ميكرومتر، حيث أن كاميرا هاماماتسو المستخدمة لها مجال رؤية 2048 × 2048 بكسل، حيث يبلغ حجم كل بكسل 6.5 ميكرومتر، وتم التقاط الصور بتكبير 40 ×.
    5. تحليل مكدس Z باستخدام ماكرومخصص 18 (الملف التكميلي 1) الذي يحسب ويجمع مساحة سطح الفيلم الحيوي على كل شريحة من المكدس z، ويستخدم قيم المقياس المدخل لحساب سمك السلسلة، مما يتيح إيجاد الحجم. بدلا من ذلك، اكتشف سمك الغلاف الحيوي عن طريق قسمة الحجم المحسوب على مساحة السطح.
    6. احصل على متوسط قيم خشونة السطح الحسابية للفيلم الحيوي من كل سلسلة z عن طريق تحميل إضافة SurfCharJ من ImageJ (وليس فيجي) وحفظها في مجلد الإضافات .
    7. قم برفع مكدس z إلى ImageJ عن طريق سحب المكدس المحفوظ إلى شريط التحكم وتحويله إلى صورة 32-بت: صورة > النوع: 32-بت.
    8. أنشئ مخطط سطحي، يوضح التغير في القيم الرمادية عبر سطح المكدس: تحليل ملف رسم > > المزيد: مخطط عالي الدقة. حول مخطط عالي الدقة إلى 32-بت.
    9. احصل على القيمة الحسابية المتوسطة لخشونة السطح عن طريق بدء إضافة SurfCharJ: الإضافات > SurfCharJ > حساب الخشونة: متوسط طول العينة (): 10.
      ملاحظة: تستخدم إضافة SurfCharJ القيم الرمادية المختلفة على سطح المكدس z لحساب متوسط خشونة السطح الحسابية. سيتم إنتاج جدول يحتوي على معلمات خشونة السطح، والمعامل الوحيد المهم هو الحساب المتوسط الخشونة السطحية، Ra. ستحتاج قيم الجدول إلى ميكرومتر من البكسلات.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوضح هذا القسم النتائج الممثلة عند تطبيق إجراء البروتوكول أعلاه. أجريت جميع التجارب باستخدام ثلاثة نسخ بيولوجية مستقلة على الأقل، كل منها يتكون من ست قنوات متوازية، وتعرض البيانات كمتوسط ± انحراف معياري. تمثل أشرطة الخطأ في جميع الرسوم البيانية الانحراف المعياري، كما هو معرف في أساطير الشكل.

يعرض في الشكل 1 نمو سلالات PAO1 وPA14 عند 37 درجة مئوية في وسط TSB، وتحت إجهاد جدار هيدروديناميكي هيدروديناميكي بمقدار 0.01 باسكال خ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمكن الخطوات الحاسمة التي تشكل هذا البروتوكول مجتمعة تحليلا أكثر شمولا ودقة لتكوين الأغشية الحيوية مقارنة بالطرق البديلة والتقليدية. مكون رئيسي هو استخدام صفيحة ميكروقنالية ذات 48 بئرا، مع قنوات ميكروسية بأبعاد 350 ميكرومتر × 70 ميكرومتر × 4 مم (W × H × L). تحاكي هذه الأبعاد بشكل خاص ظروف التدفق والبيئات الدقيقة الموجودة في المستشفيات، مثل القسطرة البولية أو القصبات الهوائية الرئوية لدى مرضى التليف الكيسي 12,21,22,23.<...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يرغب المؤلفون في شكر كلية الهندسة الميكانيكية والفضائية والمدنية (MAC) في جامعة شيفيلد على التمويل.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
(NH4)2SO4أكروس أورجانيكس7783-20-2لوسيط FAB المعدل
لوحة ميكروقناة بقيمة 48 بئر 0-2 باسكال - غطاء زجاجيأنظمة الخلايا الدقيقة910-0047-5باكالقنوات الدقيقة لتدفق الوسائط ونمو الفيلم الحيوي
مع التصوير اللحظي
-80 & درجة؛ فريزر Cثيرمو فيشر العلمي1.16057E+15لتخزين مخزون الجلسرول حتى الاستخدام مرة أخرى
آغار، درجة بكتيرولوجيةأكروس أورجانيكس443570010بالنسبة لألواح الأجار - زراعة البكتيريا
التوازن التحليليVWRVWRI611-2297لقياس مكونات الوسائط المستخدمة
الأوتوكلافبريوركلاف4304لتعقيم أدوات الزجاج
BioFlux 1000HTأنا و إل بيوسيستمزhttps://il-biosystems.com/cell- Microsystems/device/bioflux-1000HT-
shear-flow-system/ 		لتجارب تدفق القناة الدقيقة ونمو الأغشية الحيوية
وحدة التحكم في BioFluxأنا و إل بيوسيستمزhttps://il-biosystems.com/cell-
أنظمة الميكروسيستم/الجهاز/BioFlux-1000HT- نظام تدفق القصة/ 		إعداد ومراقبة تدفق الوسائط ونمو الأغشية الحيوية داخل القنوات الدقيقة
برنامج مونتاج بيوفلوكسأنا و إل بيوسيستمزhttps://il-
biosystems.com/app/uploads/2025/01/Bi oFlux_Overview_.pdf		إعداد ومراقبة تدفق الوسائط ونمو الأغشية الحيوية داخل القنوات الدقيقة
CaCl2فيشر ساينتيفك10043-52-4لوسيط FAB المعدل
CaSO4.2H2OكيمكروزA1719بالنسبة لمحلول معدني أدنى بسعة 1 لتر
لوحة بوليسترين شفافة ب 96 بئركورنينغ، كوستارCLS7007بالنسبة للعدد القابل للحياة للخلايا
CoSO4.7H2Oسيغما-ألدرتش10026-24-1بالنسبة لمحلول معدني أدنى بسعة 1 لتر
CuSO4.5H2Oهانيويل209198-100Gبالنسبة لمحلول معدني أدنى بسعة 1 لتر
أنابيب إيبندورف 3810Xإبندورف30125150بالنسبة لمخزونات الجلسرول في P. aeruginosa
FeSO4.7H2Oشركة VWR الدولية المحدودة284005Eبالنسبة لمحلول معدني أدنى بسعة 1 لتر
فيجي (ImageJ)المعاهد الوطنية للصحةhttps://imagej.net/software/fiji/downloa
دي إس		معالجة صور Z-stack
الجلوكوزسيغما-ألدرتش50-99-7بالنسبة لوسط FAB معدل للجلوكوز
الجلسرولسيغما-ألدرتش56-81-5بالنسبة لمخزونات الجلسرول في P. aeruginosa
H3BO3فيشر ساينتيفك10043-35-3بالنسبة لمحلول معدني أدنى بسعة 1 لتر
كاميرا هاماماتسو أوركا-فلاش 4.0 موديل C11440-
42U		هاماماتسوC11440-42Uلتدفق القنوات الدقيقة ونمو الأغشية الحيوية
التجربة التصويرية الفورية
KH2PO4كواشف فيشر الحيوية7778-77-04لوسيط FAB المعدل
الروح الميثيليةسيغما-ألدرتش2857لتنظيف خزانة الأحياء الدقيقة قبل وبعد<بر/> الاستخدام
MgCl2سيغما-ألدرتشM8266-100Gلوسيط FAB المعدل
خزانة علم الأحياء الدقيقة الفئة الثانيةثيرمو فيشر العلمي42111226تنفيذ خطوات البروتوكول دون < > تلوث البكتيريا أو المرق أو الأجار
الحاضنة الصغيرةلابنت إنترناشونالSN03171014لإذابة PAO1 وPA14 بعد -80 ف؛ C فريزر و
لنمو صفيحة الأجار البكتيري الأولي لمدة 24 ساعة
MnSO4. H2Oسيغما-ألدرتش10034-96-5بالنسبة لمحلول معدني أدنى بسعة 1 لتر
Na2HPO4.2H2Oسيغما-ألدرتش10102-40-6لوسيط FAB المعدل
NaClسيغما-ألدرتشS5886-500Gلوسيط FAB المعدل
NaMoO4. H2Oسيغما-ألدرتش10102-40-6بالنسبة لمحلول معدني أدنى بسعة 1 لتر
توازن الدقةVWRVWRI611-2299لقياس مكونات الوسائط المستخدمة
الطرد المركزي المبردهيرايوس40289841فصل زراعة P. aeruginosa عن
الفائق لمخزونات الجلسرول
كوفيت شبه دقيقةمختبرات ألفاX72053لقياسات الكثافة البصرية
حاضنة الاهتزازINFORS بين الشوطينhttps://infors- ht.com/en/products/incubator- الاهتزاز/معيار موليترونللثقافات الحية
سترات الصوديومسيغما-ألدرتش71498-250Gبالنسبة لوسيول FAB المعدلة من سترات الصوديوم
حلقات التطعيم البلاستيكية المعقمةميكروسبيك15782105بالنسبة ل P. aeruginosa، يتم تقييع PAO1 وPA14 في صفائح الأجار وأنابيب الصقر
تربتيك صويا آجار، فيجيتونميليبور14432-500G-Fبالنسبة لألواح الأجار - زراعة البكتيريا
مرق الصويا التربتيكيسيغما-ألدرتشT8907وسائط الزراعة المجففة - 6 جرام/200 مل
موزع مياه من النوع الأولثيرمو فيشر العلميSN42103311للماء المضغوط
ZnSO4.7H2Oفيشر ساينتيفك7446-20-0بالنسبة لمحلول معدني أدنى بسعة 1 لتر

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Grace, A., Sahu, R., Owen, D. R., Dennis, V. A. Pseudomonas aeruginosa reference strains PAO1 and PA14: A genomic, phenotypic, and therapeutic review. Front Microbiol. 13, 1023523(2022).
  2. T8907 Tryptic Soy Broth. , Sigma-Aldrich. Available from: https://www.merckmillipore.com/deepweb/assets/sigmaaldrich/product/documents/275/615/t8907dat.pdf (2018).
  3. Donlan, R. M. Biofilms and device-associated infections. Emerg Infect Dis. 7 (2), 277-281 (2001).
  4. Pseudomonas Aeruginosa - Biofilm Formation, Infections and Treatments. , IntechOpen. (2021).
  5. Tuon, F. F., Dantas, L. R., Suss, P. H., Tasca Ribeiro, V. S. Pathogenesis of the Pseudomonas aeruginosa biofilm: A Review. Pathogens. 11 (3), 300(2022).
  6. She, P., et al. Effects of exogenous glucose on Pseudomonas aeruginosa biofilm formation and antibiotic resistance. MicrobiologyOpen. 8 (12), e933(2019).
  7. Klausen, M., et al. Biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa wild type, flagella and type IV pili mutants. Mol Microbiol. 48 (6), 1511-1524 (2003).
  8. Preda, V. G., Săndulescu, O. Communication is the key: biofilms, quorum sensing, formation and prevention. Discoveries (Craiova). 7 (3), e100(2019).
  9. Heydorn, A., et al. Quantification of biofilm structures by the novel computer program COMSTAT. Microbiology (Reading). 146 (Pt 10), 2395-2407 (2000).
  10. Seneviratne, C. J., Yip, J. W. Y., Chang, J. W. W., Zhang, C. F., Samaranayake, L. P. Effect of culture media and nutrients on biofilm growth kinetics of laboratory and clinical strains of Enterococcus faecalis. Arch Oral Biol. 58 (10), 1327-1334 (2013).
  11. Rajewska, M., Maciąg, T., Narajczyk, M., Jafra, S. Carbon source and substrate surface affect biofilm formation by the plant-associated bacterium Pseudomonas donghuensis P482. Int J Mol Sci. 25 (15), 8351(2024).
  12. Goswami, S., Dey, C. COVID-19 and SARS-CoV-2: The Science and Clinical Application of Conventional and Complementary Treatments. , CRC Press. Boca Raton. (2022).
  13. Jeschke, M. G. Clinical review: Glucose control in severely burned patients - current best practice. Crit Care. 17 (4), 232(2013).
  14. Badoiu, S. C., et al. Glucose metabolism in burns—What happens. Int J Mol Sci. 22 (10), 5159(2021).
  15. Wacogne, B., et al. Concentration vs. optical density of ESKAPEE bacteria: A method to determine the optimum measurement wavelength. Sensors. 24 (24), 8160(2024).
  16. Meyer, C. T., et al. A high-throughput and low-waste viability assay for microbes. Nat Microbiol. 8 (12), 2304-2314 (2023).
  17. Allen, T. Serial Dilution Problem Help. , The University of Vermont. Available from: https://www.uvm.edu/~btessman/calc/serhelp.html (2012).
  18. Blog Post: Loading and Measurement of Volumes in 3D Confocal Image Stacks with ImageJ. , VISIKOL. Available from: https://visikol.com/blog/2018/11/29/blog-post-loading-and-measurement-of-volumes-in-3d-confocal-image-stacks-with-imagej/ (2024).
  19. Kasetty, S., Katharios-Lanwermeyer, S., O'Toole, G. A., Nadell, C. D. Differential surface competition and biofilm invasion strategies of Pseudomonas aeruginosa PA14 and PAO1. J Bacteriol. 203 (22), e0026521(2021).
  20. Shen, Y. Role of biofilm roughness and hydrodynamic conditions in Legionella pneumophila adhesion to and detachment from simulated drinking water biofilms. Environ Sci Technol. 49 (7), 4274-4282 (2015).
  21. Sankari, A., Sharma, S. Cystic Fibrosis. , StatPearls Publishing. Treasure Island, FL. (2025).
  22. Cameron, K., Jarvis, K. Urinary Catheterisation for Adults Clinical Guideline. , Available from: https://www.rightdecisions.scot.nhs.uk/media/2210/urinary-catheterisation-adultsfinal.pdf (2022).
  23. IV access improvement project guidelines: choosing catheter sizes. , Children's Hospital of Philadelphia. Available from: https://www.chop.edu/clinical-pathway/iv-access-improvement-project-guidelines-choosing-catheter-sizes (2017).
  24. Casadevall, A., Fang, F. C. Reproducible science. Infect Immun. 78 (12), 4972-4975 (2010).
  25. Sutlief, A. L., et al. Live cell analysis of shear stress on Pseudomonas aeruginosa using an automated higher-throughput microfluidic system. J Vis Exp. (143), e58926(2019).
  26. Shear Flow BioFlux Plates. , Cell Microsystems. Available from: https://cellmicrosystems.com/wp-content/uploads/2024/09/BioFlux-Brochure_v6-Single-page.pdf (2024).
  27. Wijesinghe, G., et al. Influence of laboratory culture media on in vitro growth, adhesion, and biofilm formation of Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus. Med Princ Pract. 28, 28-35 (2019).
  28. Jahid, I. K., Lee, N. -Y., Kim, A., Ha, S. -D. Influence of glucose concentrations on biofilm formation, motility, exoprotease production, and quorum sensing in Aeromonas hydrophila. J Food Prot. 76 (2), 239-247 (2013).
  29. De Plano, L. M., Caratozzolo, M., Conoci, S., Guglielmino, S. P. P., Franco, D. Impact of nutrient starvation on biofilm formation in Pseudomonas aeruginosa: An analysis of growth, adhesion, and spatial distribution. Antibiotics. 13 (10), 987(2024).
  30. Tan, X., et al. Alkaline phosphatase LapA regulates quorum sensing-mediated virulence and biofilm formation in Pseudomonas aeruginosa PAO1 under phosphate depletion stress. Microbiol Spectr. 11 (6), e0206023(2023).
  31. Quan, K., et al. Water in bacterial biofilms: pores and channels, storage and transport functions. Crit Rev Microbiol. 48 (3), 283-302 (2022).
  32. Green, A. S. Modelling of peak-flow wall shear stress in major airways of the lung. J Biomech. 37 (5), 661-667 (2004).
  33. Lee, K., Han, J. Analysis of the urine flow characteristics inside catheters for intermittent catheter selection. Sci Rep. 14, 13273(2024).
  34. Wang, C., et al. Carbon starvation induces the expression of PprB-regulated genes in Pseudomonas aeruginosa. Appl Environ Microbiol. 85 (22), e01705-e01719 (2019).
  35. Sarinas, P. S. A., et al. Inspiratory flow rate and dynamic lung function in cystic fibrosis and chronic obstructive lung diseases. Chest. 114 (4), 988-992 (1998).
  36. Franca, M. J., Valero, D., Liu, X. Turbulence and Rivers. Treatise on Geomorphology. , Elsevier, Academic Press. (2022).
  37. Shroder, J. F. Treatise on Geomorphology. , Elsevier Science & Technology. San Diego. (2022).
  38. Narciso, D. A. C., Pereira, A., Dias, N. O., Melo, L. F., Martins, F. G. Characterization of biofilm structure and properties via processing of 2D optical coherence tomography images in BISCAP. Bioinformatics. 38 (6), 1708-1715 (2022).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

الفيديو قريباً

مقالات ذات صلة