يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

توصيل بوليبلكس mRNA عبر الأنف عبر هباء رايلي المنفصل: طريقة في المختبر لترسيب الأنف والاختبار الوظيفي

744 مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/70000

⸱

يناير 20, 2026

 ,  , 
1GKT School of Medical Education, Faculty of Life Sciences and Medicine, King's College London, 2Genetics, Faculty of Life Sciences and Medicine, King's College London, 3Institute of Pharmaceutical Science, King's College London

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

يقدم هذا البروتوكول تفكك رايلي كعملية خفيفة لتحويل ناقلات mRNA غير الفيروسية. يتم تقييم الترسيب الإقليمي لمتجهات mRNA المهووسة بمحرك ألبرتا (AINI). يمثل تعبير بروتين الفلورة الخضراء (GFP) في خلايا الرئة البشرية الحفاظ على الوظائف الفيزيائية-الكيميائية والبيولوجية لناقلات mRNA بعد التهوية.

الملخص

يعد توصيل علاجات mRNA عبر الأنف استراتيجية واعدة للتطعيم وعلاج أمراض الجهاز التنفسي، حيث يوفر تنشيط مناعيا مباشرا في موقع دخول الممرض. ومع ذلك، فإن طرق التنفس الجوي التقليدية (مثل أجهزة التنشاخ فوق الصوتية أو عالية الضغط) تتلف ناقلات mRNA غير الفيروسية بسبب قوى القص المفرطة، مما يؤدي إلى فقدان mRNA لسلامته الهيكلية ونشاطه البيولوجي. تم استخدام مبخر الأنف من نوع رايلي لتحويل متجهات البولي إيثيلينيين (PEI)-mRNA بلطف إلى قطرات متجانسة. تم صياغة mRNA المشفر للبروتين الفلوري الأخضر (GFP) في متعددات الأقراص الكاتيونية وتم تصنيفها قبل وبعد التهوية. تشكل عملية تفكيك رايلي نفاثا دقيقا مستمرا من القطرات مع قص قليل، مما يحافظ على الخصائص الفيزيائية الكيميائية للجسيمات النانوية. تمت ملاحظة حجم الجسيمات المتسق، ومؤشر التشتت المنخفض، واستقرار جهد زيتا قبل وبعد التهوية، مما أكد أن الخصائص الفيزيائية والكيميائية لمتعددات الحمض النووي الريبي المتقاطع كانت محفوظة جيدا عبر تفكيك رايلي للهواء. باستخدام نموذج مدخل الأنف المثالي في ألبرتا (AINI) لممر الهواء الأنفي، تم توصيل هباء PEI-mRNA. تم ترسيب mRNA المهووس بشكل رئيسي في المناطق التوربينية. تم العثور على كسور ضئيلة في البلعوم الأنفي أو الأقسام المكافئة للرئة. بالإضافة إلى ذلك، تم تسليم بوليبلكس mRNA بعد الرذاذ بنجاح إلى خلايا الظهارة الرئية البشرية A549 وأنتجت تعبيرا واضحا لل GFP. يظهر هذا البروتوكول طريقة غير مدمرة لتوصيل mRNA عبر الأنف باستخدام رذاذ رايلي المنفصل. يحافظ بشكل فعال على الخصائص الفيزيائية-الكيميائية والوظائف البيولوجية لناقلات mRNA غير الفيروسية، حيث يقسم الطور المائي إلى قطرات بأحجام مناسبة لترسيب أنفي مستهدف. يكشف هذا البروتوكول عن نهج جديد لجعل mRNA بفعالية وتقييم ترسيب المنطقة في تجويف الأنف.

المقدمة

توصيل اللقاحات إلى الغشاء المخاطي الأنفي (بوابة الدخول للعديد من مسببات الأمراض التنفسية) يمكن أن يثير مناعة محلية قوية ويمنع العدوى من مصدرها. يؤكد نجاح لقاحات الإنفلونزا الأنفية والموافقة الأخيرة على لقاحات كوفيد-19 عبر الأنف فعالية المسار الأنفي في تحفيز كل من الاستجابات المناعية المخاطية والجهازية1. لذلك، يجذب توصيل لقاحات mRNA عن طريق الأنف اهتماما كبيرا كاستراتيجية للوقاية من العدوى الفيروسية التنفسية. ومع ذلك، فإن التحدي التقني الرئيسي هو تحويل متعددات ال mRNA الهشة إلى رذاذ قابل للاستنشاق دون التأثير على استقرارها.

التنفس الهوائي الكاسر في رايلي يقدم خيارا لطيفا من خلال العمل على مبدأ فيزيائي مختلف. في جهاز تفكيك رايلي، يجبر تيار سائل مضغوط على المرور عبر فتحة ميكروسباية لتشكيل نفاثة دقيقة مستمرة. تتحلل النفاثة بشكل طبيعي إلى قطرات بحجم موحد بسبب عدم استقرار بلاتو-رايلي2. يتسبب التوتر السطحي في تفكك عمود السائل عند طول موجي مميز يقارب ضعف قطر الفوهة. على عكس الاستنساخ بالموجات فوق الصوتية، فإن هذه العملية لا تسبب تقريبا قصا مضطربا؛ تتكون القطرات طبيعيا من عدم الاستقرار الذاتي للنفاثة، وليس من قوى التحطيم الخارجية. نتيجة لذلك، تتعرض تركيبات الجسيمات النانوية لإجهاد طفيف جدا. لقد ثبت أن استخدام تفكيك رايلي يمكن أن يتحول إلى رذاذ mRNA لجسيمات الدهون النانوية (LNP) دون تغيير كبير في حجمها أو شحنة سطحها أو كفاءة التغليف قبل ما بعد الرش 3,4,5. في هذه الطريقة، يبقى PEI-mRNA سليما ووظيفيا بعد التهوية، على عكس التدهور الذي يلاحظ مع تقنيات الاستنباط الأكثر قسوة.

ميزة أخرى لتفكيك رايلي هي التحكم في حجم القطرات. القطرات الناتجة كبيرة نسبيا (في حدود 20-30 ميكرومتر). حجم القطرة هذا مثالي للتوصيل الأنفي: الجزيئات التي يبلغ قطرها >10 ميكرومتر في القطر الهوائي تميل إلى الترسب في الأنف والمجاري الهوائية العليا بدلا من الانجراف إلى الرئتين. من خلال إنتاج قطرات تتجاوز هذا الحد في الغالب، يستهدف ريلي بشكل طبيعي ترسيب التجويف الأنفي. يتم تعزيز الاستهداف بشكل أكبر باستخدام نموذج مدخل الأنف المثالي في ألبرتا (AINI) لتحسين تقنيات الإدارة. AINI هو نسخة طبق الأصل مطبوعة ثلاثية الأبعاد من مجرى الهواء الأنفي ويتنبأ بدقة بأنماط ترسيب الرش في الجسم الحي 6. باستخدام هذا النموذج، وجد أن الرش بزاوية 45° في فتحة الأنف يزيد بشكل كبير من ترسيب التوربينات7. زاوية الإدارة تؤثر بشكل كبير على نمط الترسيب7. الترسيب في المناطق غير المستهدفة مثل البلعوم الأنفي أو الرئتين أمر غير مرغوب فيه، لأنه قد يسبب تهيج الحلق، أو سوء التذوق،أو آثارا جانبية جهازية. في هذا البروتوكول، تم تكرار هذه الظروف (زاوية رش 45° وتحكم في تدفق الهواء الشهيق) لتعظيم ترسيب التوربينات لجهاز mRNA3. تظهر البيانات السابقة أن أكثر من نصف كتلة mRNA المسجلة يمكن تركيزها في منطقة القريض تحت ظروف مثالية، بينما يصل <10٪ إلى البلعوم الأنفي أو أكثرمن 3. من المتوقع أن يحسن هذا التوصيل المستهدف فعالية اللقاح من خلال تركيز الجرعة في مواقع المناعة الحثية (التي تتميز بالأوعية الدموية وغنية بخلايا المناعة، وفي الوقت نفسه يقلل من الترسيب خارج الهدف الذي قد يؤدي إلى هدر أو آثار جانبية).

في هذه المقالة بالطرق، تم وصف الإجراء التجريبي لتحويل mRNA عبر تفكيك رايلي بالتفصيل، مع تقييم الترسبات الإقليمية في نموذج AINI، وتقييم النشاط البيولوجي لل mRNA الترسيب في المختبر. يستخدم mRNA المراسل الذي يشفر GFP لتصوير نتائج النقل في الخلايا البشرية. يتم اختيار HEK293T الخلايا لاختبار وظيفة المجمعات الهوائية. لتعزيز امتصاص الخلايا لل mRNA المهووس في المختبر، يتم تفرع mRNA مع PEI لتكوين متعددات PEI-mRNA قبل إضافتها إلى الخلايا. PEI هو عامل نقل بوليمر كاتيوني يمكنه تحسين كفاءة توصيل mRNA، وقد تم استخدام نسبة مولية N:P (نيتروجين: فوسفات) 24:1 هنا بناء على تحسين سابق لتوصيل الجينات. يستخدم PEI فقط لخطوة التحقق من صحة زراعة الخلايا في هذه الدراسة وليس جزءا من توصيل الهباء الجوي إلى الأنف الفعلي (في الجسم الحي يعتمد المرء على LNP-mRNA فقط، لكن في زراعة الخلايا، يساعد ذلك في تعظيم التعبير الجيني للكشف).

يسلط هذا البروتوكول الضوء على نهج جديد لتوصيل لقاح mRNA عبر الأنف يعالج مشكلة استقرار رنا mRNA المتساقط. تم تطبيق تفكك رايلي مؤخرا فقط على توصيل الأحماض النووية في بعض الدراسات3،4،5،9، ويوفر هذا العمل دليلا منهجيا مفصلا لتطبيق هذه التقنية. باتباع هذا الإجراء خطوة بخطوة، يمكن للباحثين إعادة إنتاج الهباء الجوي اللطيف لحاملات mRNA النانوية وتقييم خصائص ترسبها ونقلها. قسم البروتوكول أدناه منظم إلى أجزاء متسلسلة: (1) صياغة PEI-mRNA؛ (2) توصيف الجسيمات النانوية (الحجم وجهد الزيتا) قبل وبعد التهوية؛ (3) تشغيل جهاز تفكيك رايلي وإجراء ترسيب الأنف AINI. تلاحظ الاعتبارات الرئيسية للنجاح، مثل الحفاظ على ظروف خالية من RNase ومحاذاة الجهاز بشكل صحيح. تشمل النتائج والنقاشات النتائج التمثيلية، ومزايا الطريقة مقارنة بالطرق التقليدية، والتطبيقات المحتملة (مثل لقاحات الأنف للإنفلونزا أو كوفيد-19 10,11,12)، بالإضافة إلى القيود ونصائح لحل المشكلات. تهدف هذه المنهجية الشاملة إلى تمكين تجارب توصيل mRNA عبر الأنف القابلة للتكرار وتسريع تطوير لقاحات الحمض النووي الريبي المخاطي الخالي من الإبر.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

ملاحظة: خطوط خلايا HEK293T وA549 في وسط كامل يتكون من وسط النسر المعدل (DMEM) من دولبيكو مع 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) و2٪ بنسلين-ستريبتوميسين قبل نقل PEI-mRNA. يمر الخطين الخلويتين تقريبا كل 48 ساعة عند الوصول إلى الالتقاء البعض. خلايا البذور بكثافة 40,000 خلية لكل سم² وزراعة لمدة ~48 ساعة. إزالة وسط الزراعة وغسل الخلايا بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) مباشرة قبل النقل لإزالة المصل المتبقي وتوحيد ظروف النقل. قم بعمل جميع قوارير زراعة الخلايا وألواح 24 بئرا وأنابيب PBS وماصات وماصات قبل الاستخدام.

1. صياغة PEI-mRNA

  1. تكوين مركبات PEI-mRNA (للنقل الصناعي في المختبر )
    ملاحظة: هذه الخطوة مطلوبة فقط إذا تم استخدام PEI لتعزيز النقل في زراعة الخلايا.
    1. احسب الكمية المطلوبة من PEI للنسبة المولية N:P المطلوبة.
      ملاحظة: يستخدم N:P = 24 (أي 24 مول من الأمين موجبة الشحنة لكل مول من الفوسفات سالبة الشحنة على mRNA)؛ وكمية 10 ميكروغرام mRNA ستتطلب ~31 ميكروغرام PEI لتكوين PEI-mRNA عند هذه النسبة N/P.
    2. حضر محلول PEI مخفف (مثلا، مخزون 1 ملغ/مل في الماء) ويستخدم بتعقيم الجسم.
    3. قم بتخفيف ال mRNA إلى تركيز مناسب (مثلا 0.2 ميكروغرام/ميكرولتر).
    4. أضف محلول PEI إلى محلول mRNA أثناء الخلط بلطف (لا تقم بدوامة).
      ملاحظة: قد يكون الخليط في أنبوب صغير؛ استخدم الماصة للأعلى والأسفل بحذر أو حرك الأنبوب للخلط.
    5. حضانة في درجة حرارة الغرفة لمدة ~20 دقيقة للسماح بالارتباط الكهروستاتيكي بين PEI وmRNA.
      ملاحظة: إذا لم تستخدم PEI، يمكن أن يتم تحويل الرذاذ العاري إلى رذاذ مباشر. حسن PEI الإضافي بشكل كبير من التعبير الجيني في خلايا A549، لكنه اختياري وقد لا يستخدم للولادة الفعلية في الجسم بسبب اعتبارات السمية.

2. توصيف الجسيمات النانوية (الحجم وإمكانات الزيتا)

ملاحظة: قم بإعداد معلمات القياس في البرنامج واحفظها كطريقة قبل استخدام المحلل لقياس الحجم أو جهد زيتا. إعداد الطريقة مطلوب لتشغيل الآلة، وتعتمد المعايير على بيئة القياس، والكوفيت المستخدم، وخصائص العينة.

  1. تشتت الضوء الديناميكي (DLS) قبل التهوية
    1. باستخدام محلل حجم الجسيمات، يتم تحميل عينة مخففة من التركيبة في كوفيت حجم قابل للتخلص (مثلا، 500 ميكرولتر عند 0.2 ميكروغرام/ميكرولتر).
    2. شغل المحلل وافتح برنامج13 على الكمبيوتر المتصل.
    3. انقر على زر القياس في أعلى النافذة.
    4. انقر على أيقونة الملف الزرقاء في أعلى النافذة لاختيار طريقة الحجم المعين مسبقا.
    5. أعد تسمية البروتوكول ليطابق اسم العينة.
    6. اضغط على زر غطاء المحلل لفتح الحجرة.
    7. أدخل الكوفيت في الحجرة.
    8. انقر على زر التشغيل الأخضر في أعلى نافذة البرنامج. انتظر حتى يكتمل القياس13.
    9. انقر على زر التحليل في أعلى نافذة البرنامج، ثم اضغط على زر الحجم في صفحةالنتائج 13.
    10. احصل على متوسط القطر الهيدروديناميكي (متوسط Z) ومؤشر التشتت المتعدد (PDI) من جدول الإحصاءات.
    11. اضغط على زر غطاء المحلل لفتح الحجرة، أزل الكوفيت، وأغلق الغطاء.
    12. تخلص من الكوفيت وشطف المبخر بماء خال من RNAase وبإيثانول 70٪ v/v لتعقيم وتسهيل التجفيف بين قياسات الحجم.
      ملاحظة: بالنسبة لمبخرة رايلي، تأكد من عدم بقاء ترسبات أو بقايا ملح في الفوهة، لأن هذه قد تؤثر على أداء الرش.
  2. جهد زيتا قبل التهواء الجوي
    1. استخدم نفس الجهاز (أو محلل جهد زيتا)، وتحميل عينة مخففة من التركيبة في خلية شعرية مطوية (مثلا، 700 ميكرولتر عند 0.2 ميكروغرام/ميكرولتر).
    2. شغل المحلل وافتح برنامج13 على الكمبيوتر المتصل.
    3. انقر على زر القياس في أعلى النافذة.
    4. انقر على أيقونة الملف الزرقاء في أعلى النافذة لاختيار طريقة زيتا المضبوطة مسبقا.
    5. أعد تسمية البروتوكول ليطابق اسم العينة.
    6. اضغط على زر غطاء المحلل لفتح الحجرة.
    7. أدخل الكوفيت في الحجرة.
    8. انقر على زر التشغيل الأخضر في أعلى نافذة البرنامج. انتظر الجهاز الذي يعمل13.
    9. انقر على زر التحليل في أعلى نافذة البرنامج، ثم اضغط على زر زيتا في صفحةالنتائج 13.
    10. احصل على جهد زيتا (شحنة السطح) من خلال النظر إلى جدول الإحصائيات.
    11. اضغط على زر الغطاء في المحلل لفتح الحجرة، أخرج العينة، وأغلق الغطاء.
    12. اشطف الكوفيت والمبخر بماء خال من RNAase وبإيثانول بنسبة 70٪ v/v لتعقيم وتسهيل التجفيف بين قياسات جهد زيتا.
      ملاحظة: بالنسبة لمبخرة رايلي، تأكد من عدم بقاء ترسبات أو بقايا ملح في الفوهة، لأن هذه قد تؤثر على أداء الرش.

3. تفكك رايلي والرذاذ والترسيب الأنفي

  1. إعداد الرذاذ وAINI
    1. قم بتجميع جهاز ريلي لتفكيك الأنف ونموذج مدخل الأنف المثالي من ألبرتا (AINI).
      ملاحظة: يتكون نموذج AINI من مقاطع مجوفة تمثل تشريحيا تتوافق مع مناطق مختلفة من تجويف الأنف البشري (مثل دهليز الأنف، منطقة القرينة، منطقة الشم، البلعوم الأنفي).
    2. تأكد من أن جميع مكونات AINI نظيفة وجافة قبل الاستخدام (البقايا قد تؤثر على نتائج الترسب). نظفه بغسل الماء منزوع الأيوناتثم بالإيثانول أو مذيب عضوي.
    3. قم بتوصيل جهاز AINI بجهاز التصادم من الجيل القادم (NGI) متصل بمضخة تفريغ عند مخرجه لسحب تدفق الهواء عبر الممرات الأنفية.
    4. اضبط معدل التدفق إلى 7.5 لتر/دقيقة - وهو تدفق يمثل شهيق أنفي بطيء وعميق في بالغ6. استخدم مقياس تدفق معاير (أو جهاز قياس الدوران) مثبت على منفذ الحث في NGI. اضبط المضخة حتى يظهر مقياس التدفق 7.5 لتر/دقيقة.
      ملاحظة: استخدم مقياس تدفق الهواء عند معدل التدفق المطلوب للاختبار.
    5. حافظ على تدفق الهواء هذا طوال مدة الرش. استخدم Parafilm لتثبيت الجهاز بشكل صحيح على AINI.
  2. تموضع المبخر
    1. أدخل فوهة مبخر تفكيك رايلي في مدخل فتحة الأنف AINI (قسم المدهو) بزاوية 45°.
    2. ثبت المبخاخ بحيث لا يتحرك أثناء التشغيل (جميع التوصيلات، أقسام النماذج، الأنابيب إلى الضخ) محكمة الإغلاق.
  3. تحميل العينة
    1. اخلط تعليق PEI-mRNA المحضر بلطف لضمان التجانس (تجنب تكوين فقاعات).
    2. اسحب العينة إلى خزان الرذاذ.
      ملاحظة: اعتمادا على تصميم الجهاز، قد يتطلب ذلك ملء محقنة أو رأس ماصة يثبت على جهاز التبخير.
    3. حمل العينة في الجهاز.
      ملاحظة: على سبيل المثال، قم بإزالة غطاء مركزي أو حجرة في جهاز التبخير، ثم استخدم العينة بماصة، ثم أعد تجميع الجهاز بأمان. تأكد من عدم وجود تسريبات وأن الجهاز مجهز بشكل صحيح إذا لزم الأمر.
  4. توليد الهباء الجوي
    1. شغل تدفق الهواء (7.5 لتر/دقيقة عبر AINI) لمضخة الهواء قبل أو في نفس وقت بدء الرش، حسب تعليمات الجهاز.
    2. فعل جهاز التفكيك رايلي لبدء التبوي.
      ملاحظة: بالنسبة لجهاز التبخير اليدوي الذي يعمل بالحقنة، اضغط على مكبس الحقنة بثبات لدفع السائل عبر الفتحة. رش حجم العينة بالكامل في محاولة واحدة متواصلة إذا أمكن. يجب ضغط المكبس بسلاسة لتوليد ضغط تشغيل مستقر، لأن التركيبة تتحول إلى رذاذ فقط بعد الضغط المرتفع وتعرضها لمعدل قص الجدار داخل الفتحة الدقيقة14. الحركات السريعة للمكبس تغير الضغط وبالتالي تغير معدل القص وزمن التعرض للقص14.
    3. تأكد من بقاء معدل التدفق عند 7.5 لتر/دقيقة طوال الوقت. يجب أن تنتقل قطرات الهباء الجوي عبر نموذج الممر الأنفي وتترسب في مناطق مختلفة حسب أحجامها الديناميكية الهوائية.
    4. أوقف مضخة الهواء بسرعة لمنع القطرات المترسبة بالفعل من الانزلاق أو الجفاف بشكل غير متساو.
  5. جمع عينات من AINI
    1. قم بتفكيك نموذج AINI بعناية إلى أجزائه التشريحية الفردية لجمع الجسيمات النانوية الترسبة من كل منطقة.
      ملاحظة: قبل التفكيك، قم بتحديد أو وضع علامة على الاتجاه لتتبع الأقسام.
    2. جمع الترسبات من ستة حجرات: (1) جهاز المبختر، (2) مقطع المداخل الأنفي، (3) قسم القرينة، (4) منطقة الشم، (5) قسم اللعوم الأنفي، و(6) أي التقاط في الأسفل (مثل مراحل NGI ملحق أو مرشح نهائي يمثل الجزء المخترق للرئة)
    3. لكل حجرة، استخدم حجما مقاسيا من وسط زراعة الخلايا لغسل المادة المترسبة.
      ملاحظة: على سبيل المثال، لجمع ترسيب التوربينات، قم بفصل قسم التوربينات وشطف أسطحه الداخلية جيدا ب 5 مل من وسط النسر المعدل (DMEM) من دولبيكو، باستخدام ماصة قابلة للتخلص منها. اغسل جميع الأسطح بلطف، ثم صب الشطفة في أنبوب طرد مركزي بحجم 15 مل محمل علامة (استخدم قمع للمساعدة في النقل). أثناء الشطف، كان يثبت الجزء أفقيا أو مائلا قليلا لضمان التلامس الداخلي الكامل مع منع تسرب السائل. كرر نفس الطريقة للدهلي، والشم، والبلعوم الأنفي، وأي أقسام أخرى، باستخدام 5 مل من DMEM طازج لكل منها وجمعها في أنابيب منفصلة معنونة.
    4. استرجع أي عينة متبقية من جهاز الرذاذ.
      ملاحظة: بالنسبة للحقنة من نوع الحقنة، اشطف الحقنة والفوهة في أنبوب.
    5. استرجاع السائل من مراحل NGI (مصطدم متسلسل) إذا كان AINI متصلا ب NGI لاحتجاز أي جزيئات دقيقة (مثل شطف المراحل ب DMEM).
    6. غطي الأنبوب بالسائل المجمع.
      ملاحظة: تجنب فقدان القطرات على أسطح الطاولة أو عن طريق التبخر.
  6. التعامل بعد التحصيل
    1. مباشرة بعد الجمع، وضعت عينات PEI-mRNA بشكل منفصل على الخلايا للنقل.
      ملاحظة: يمكن ترك عينات PEI-mRNA في الثلاجة لمدة ~1-2 ساعة (حتى 6 ساعات كحد أقصى) قبل استخدامها في النقل الكهربائي. يتم سحب حجم معين (أقصى 1 مل) من كل عينة مجمعة من PEI-mRNA لتوصيف المتجهات بعد التهوية (أي قياسات DLS وزيتا).
  7. تنظيف الجهاز
    1. نظف المبخر ونموذج AINI جيدا بعد كل عملية لتجنب التلوث المتبادل في التجارب اللاحقة.
    2. اشطف جميع أقسام AINI وأجزاء المبخر بماء منزوع الأيونات لإزالة الوسائط والجسيمات النانوية، ثم ب 70٪ إيثانول لتعقيم وتسهيل التجفيف.
      ملاحظة: إذا كان الجهاز أو الطراز يحتوي على فتحات صغيرة، قم بغسلها بحقنة.
    3. جفف جميع الأجزاء حتى تهوى تماما (أو ضعها في خزانة تجفيف على حرارة منخفضة) قبل إعادة التجميع. بالنسبة لجهاز ريلي، تأكد من عدم بقاء ترسبات أو بقايا ملح في الفوهة، حيث يمكن أن تؤثر على أداء الرذاذ.

4. تصوير الخلايا

ملاحظة: بعد النقل، أزل وسط النقل واستبداله بوسط جديد كامل لإنهاء التعرض. زراعة الخلايا لمدة 48 ساعة للسماح بالتعبير الرسمي واستعادة الخلية. عند ~80٪ من التلاصق، ثبت الخلايا ب 4٪ فورمالديهيد لمدة 8 دقائق، ثم صبغ النوى ب 4',6-دياميدينو-2-فينيل ليندول (DAPI؛ 300 نانومال) لمدة 5 دقائق تليها غسل PBS مرتين قبل التصوير.

  1. تصوير الفلورة
    1. استخدم مجهر فلوري مع مجموعات مرشحات ل DAPI وGFP.
    2. ابدأ بالقناة الزرقاء (طول موجة الإثارة = 385 نانومتر، طول موجة الانبعاث = 477.5 نانومتر) لرؤية النوى الملطخة ب DAPI.
    3. التحول إلى القناة الخضراء (طول موجة الإثارة = 488 نانومتر، طول موجة الانبعاث = 525 نانومتر) لرؤية الخلايا الموجبة ل GFP.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

وباعتبارها مخطوطة تركز على الطرق، فإن النتائج التفصيلية ليست الهدف الأساسي؛ ومع ذلك، تعرض نتائج تمثيلية لتوضيح النتائج المتوقعة لكل جزء من البروتوكول. تظهر الأشكال المذكورة أدناه بيانات أمثلة (مثل الرسوم البيانية أو الصور) التي تدعم صحة الطريقة، لكن لا يتم تضمين تحليلات كمية جديدة تتجاوز العرض.

حجم القطرات ونمط الترسب:
حافظ مبخر تفكيك رايلي على الخصائص الفسيفوكيميائية لمتقلبات mRNA، مع اختلافات طفيفة بين قياسات ما قبل وبعد التهوية كما هو مو...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

في هذا البروتوكول، قبل تهوية التركيبة، يتم تفرع mRNA مع PEI لتعزيز امتصاص الخلايا. يعمل هذا كبديل لتوصيل LNP-mRNA أثناء التحقق الصناعي 10,15. يحافظ PEI-mRNA على معظم وظائف صيغ LNP، بما في ذلك الخصائص البيولوجية والوظيفية المهمة10. ترتبط مجموعات الأمين الموجبة في PEI بالرنا الريبي الريبي سالب الشحنة من خلال تفاعلات كهروستاتيكية، مكونة تجمعات نانوية أصغر من 200 نانومتر. مكثفات PEI-mRNA مستقرة بما يك...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

أقر المؤلفان بالدعم المالي من زمالة كينغز للأبحاث الجامعية (KURF) وصندوق فرص الطلاب المقدم من كلية كينغز لندن.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
أنابيب الطرد المركزي بسعة 50 ملشركة سيغما-ألدريتش المحدودةCLS430829-500EA
50– 1000 μ أطراف ماصة Lشركة سيغما-ألدريتش المحدودةZ740031-1000EA
خط خلية A549مجموعة ثقافة الأنواع الأمريكيةATCC CRM-CCL-185
مقياس تدفق الهواءلا يوجدلا يوجديمكن استخدام عداد تدفق الهواء العام.
نموذج مدخل الأنف المثالي في ألبرتا (AINI)شركة TSI (عبر كوبلي ساينتيفيك، المملكة المتحدة)0001-01-8540
شريط مؤشر المعقمشركة سيغما-ألدريتش المحدودةZ744090
DAPIشركة سيغما-ألدريتش المحدودةD1306
DMEM (المتوسط المعدل من دولبيكو)جيبكو، ثيرمو فيشر ساينتيفك11966025
كحول الإيثيلي، نقيشركة سيغما-ألدريتش المحدودة32221-Mتم الشراء عبر ميرك
مصل الأبقار الجنيني (FBS)جيبكو، ثيرمو فيشر ساينتيفكA5256701
الفورمالديهايدشركة سيغما-ألدريتش المحدودةF8775
HEK293T خط الخليةمجموعة ثقافة الأنواع الأمريكيةATCC CRL-3216
خزانة السلامة الحيوية Heraeus HERAsafe HS 12هيرايوسلا يوجد
الجيل القادم من التأثيرMSPs، قسم من TSI0170-01-1000هذا المنتج مدرج أيضا في كتالوج كوبلي، رقم الجزء 5201.
كاميرا نيكون DS-Qi2 أحادية اللوننيكونلا يوجد
أطباق متعددة معالجة بزراعة الخلايا النونكثيرمو فيشر العلمي142475
Nunc EasYFlask المعالج بزجاجات الخلاياثيرمو فيشر العلمي156340
بارافيلمشركة سيغما-ألدريتش المحدودةP7793-1EA
البنسلين-ستريبتوميسين (10,000 U/mL)جيبكو، ثيرمو فيشر ساينتيفك15140148
أقراص محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS)ثيرمو فيشر العلمي18912014
هيدروكلوريد بولي إيثيلينيمينشركة سيغما-ألدريتش المحدودة764965-1Gتم الشراء عبر SLS
رذر الأنف النفاث رايليريسيكا بي في إنشيديمحول بخاخ أنف ناعم
RNAse الماء الحرثيرمو فيشر العلميJ60610. EQC
مقاسات كوفيتمالفرن بلانالياليكالZEN0040
الخلية الدموية المطويةمالفرن بلانالياليكالDTS1070
زيتاسايزر برومالفرن بلانالياليكالزيتاسايزر برو
برنامج Zetasizer Ultra-Pro ZS Xplorerمالفرن بلانالياليكاللا يوجد

المراجع

  1. Akula, V. R., et al. Effect of heterologous intranasal incovacc(r) vaccination as a booster to two-dose intramuscular COVID-19 vaccination series: a randomized phase 3 clinical trial. Commun Med (Lond). 5 (1), 133(2025).
  2. Van Hoeve, W., et al. Breakup of diminutive Rayleigh jets. Phys Fluids. 22 (12), (2010).
  3. Li, H. Y., et al. Targeted nasal delivery of LNP-mRNAs aerosolised by Rayleigh breakup technology. Int J Pharm. 672, 125335(2025).
  4. He, P., et al. Rayleigh-based soft mist inhalers preserve mRNA-LNP integrity for pulmonary delivery. J Drug Deliv Sci Technol. 115, 107651(2026).
  5. Biesel, A., et al. Soft mist inhaler nebulization by Rayleigh-breakup largely preserves functional integrity of liposomal mRNA in respirable aerosols. Eur J Pharm Sci. 214, 107300(2025).
  6. Chen, J. Z., Finlay, W. H., Martin, A. In vitro regional deposition of nasal sprays in an idealized nasal inlet: comparison with in vivo gamma scintigraphy. Pharm Res. 39 (11), 3021-3028 (2022).
  7. Chen, J. Z., Kiaee, M., Martin, A. R., Finlay, W. H. In vitro assessment of an idealized nose for nasal spray testing: comparison with regional deposition in realistic nasal replicas. Int J Pharm. 582, 119341(2020).
  8. Hopke, P. K., Wang, Z. Fine Particles in Medicine and Pharmacy. Fine Particles in Medicine and Pharmacy. , Springer. US, Boston, MA. (2012).
  9. Wang, H., et al. Evaluation of Rayleigh jet atomizer for intranasal delivery of lipid nanoparticle-siRNA formulations: stability, deposition, and device performance. Int J Pharm. 683, 126084(2025).
  10. Moreno Herrero, J., et al. Compact polyethylenimine-complexed mRNA vaccines. Nat Nanotechnol. 20 (9), 1323-1331 (2025).
  11. Geall, A. J., et al. Non-viral delivery of self-amplifying RNA vaccines. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (36), 14604-14609 (2012).
  12. Xi, J., Lei, L. R., Zouzas, W., Si, X. A. Nasally inhaled therapeutics and vaccination for COVID-19: developments and challenges. MedComm. 2 (4), 569-586 (2021).
  13. Zetasizer Advance Series User Guide. , MAN0592-15-EN edn, Malvern Panalytical. (2023).
  14. Method of aerosolizing nanoparticle formulations. China patent. , CN116723892A (2023).
  15. Casper, J., et al. Polyethylenimine (PEI) in gene therapy: current status and clinical applications. J Control Release. 362, 667-691 (2023).
  16. Jin, Y., et al. A novel experimental approach to measure nebulized droplet deposition pattern and deposition fraction in an idealized mouth-to-throat model. Phys Fluids. 35 (8), (2023).
  17. Darquenne, C. Aerosol deposition in health and disease. J Aerosol Med Pulm Drug Deliv. 25 (3), 140-147 (2012).
  18. Liu, J., et al. Turbinate-homing IgA-secreting cells originate in the nasal lymphoid tissues. Nature. 632 (8025), 637-646 (2024).
  19. Debus, H., Baumhof, P., Probst, J., Kissel, T. Delivery of messenger RNA using poly(ethylene imine)-poly(ethylene glycol)-copolymer blends for polyplex formation: biophysical characterization and in vitro transfection properties. J Control Release. 148 (3), 334-343 (2010).
  20. Brandtzaeg, P. Potential of nasopharynx-associated lymphoid tissue for vaccine responses in the airways. Am J Respir Crit Care Med. 183 (12), 1595-1604 (2011).
  21. Foley, R. A., et al. Lipid nanoparticles for the delivery of CRISPR/Cas9 machinery to enable site-specific integration of CFTR and mutation-agnostic disease rescue. bioRxiv. , (2025).
  22. Hou, X., Zaks, T., Langer, R., Dong, Y. Lipid nanoparticles for mRNA delivery. Nat Rev Mater. 6 (12), 1078-1094 (2021).
  23. D'Angelo, I., et al. Hybrid lipid/polymer nanoparticles for pulmonary delivery of siRNA: development and fate upon in vitro deposition on the human epithelial airway barrier. J Aerosol Med Pulm Drug Deliv. 31 (3), 170-181 (2018).
  24. Movia, D., Bazou, D., Volkov, Y., Prina-Mello, A. Multilayered cultures of NSCLC cells grown at the air-liquid interface allow the efficacy testing of inhaled anti-cancer drugs. Sci Rep. 8 (1), 12920(2018).
  25. Waltl, E., Eckl-Dorna, J., Selb, R., Valenta, R., Niederberger, V. Characterisation and culture of primary human nasal epithelial cells and the influence of interferon-gamma. Clin Transl Allergy. 4 (2), P21(2014).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

توصيل الحمض النووي الريبوزي المرسال عن طريق الأنفالحمض النووي الريبوزي المرسال بولي إيثيلين إيمينخلايا A549مدخل الأنف ألبرتاتعبير GFPناقلات الحمض النووي الريبوزي المرسال غير الفيروسيةترانسفكشن الحمض النووي الريبوزي المرسال عبر الرذاذ
توصيل بوليبلكس mRNA عبر الأنف عبر هباء رايلي المنفصل: طريقة في المختبر لترسيب الأنف والاختبار الوظيفي
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.