تحليل طفرات مستقبلات عامل نمو البشرة في الخلايا النادرة المنتشرة باستخدام نظام عزل الخلايا وجهاز PCR الرقمي للقطرات

Yoon-Tae Kang; Srikanth Perike; Adam Corner; Elizabeth Dreskin; Nathan Knapp

doi:10.3791/70016

مقالة منهجية

تحليل طفرات مستقبلات عامل نمو البشرة في الخلايا النادرة المنتشرة باستخدام نظام عزل الخلايا وجهاز PCR الرقمي للقطرات

DOI:

10.3791/70016

⸱

يونيو 23, 2026

Yoon-Tae Kang¹ , Srikanth Perike¹ , Adam Corner¹ , Elizabeth Dreskin¹ , Nathan Knapp¹

¹Bio-Rad Laboratories

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا نقدم بروتوكولا لتوضيح عزل الخلايا السرطانية النادرة من عينة مصطنعة تحتوي على دم كامل ومخروطة في خلايا سرطان الرئة. يستخدم البروتوكول منصة عزل الخلايا شبه آلية وخالية من العلامات. يتم تحليل الخلايا المغنية لاحقا للكشف عن طفرات مستقبلات عامل النمو البشري باستخدام PCR الرقمي بالقطرات.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تعد الطفرات الموجودة في جين عامل نمو البشرة (EGFR) ضرورية لتحديد أكثر العلاجات فعالية لمرضى سرطان الرئة. يمكن أن تأخذ الفحوصات الروتينية لطفرات EGFR شكل خزعات من الأورام أو تحليل CTDNA من بلازما مرضى سرطان الرئة. على الرغم من أن فحص عينات الدم من مرضى سرطان الرئة يجرى بشكل روتيني لتوفير رؤية حول وجود أو عودة سرطان الرئة عبر كشف الحمض النووي المعتمد (ctDNA أو CTC)، إلا أنه عادة لا يتضمن التحليل الجزيئي اللاحق للخلايا الملتقطة بذلك. يمكن أن يوفر اكتشاف الطفرات الفردية داخل جين EGFR الموجودة داخل خلايا الورم النادرة (CTCs) رؤى إضافية حول فعالية العلاجات المستهدفة وعلاوة على ذلك، توقعات المرضى، خاصة في سرطان الرئة غير صغير الخلايا (NSCLC). للأسف، فإن ندرة مثل هذه الخلايا الورمية المتداولة وغياب الإجراءات المبسطة لفحص معلوماتها الجينومية يشكلان تحديا كبيرا في الاكتشاف.

هدف هذا البروتوكول هو توضيح الإمكانات الواقعية لالتقاط CTCs من الدم الكامل وتقييم محتواها الجزيئي باستخدام ddPCR. تم استخدام منصة عزل الخلايا شبه آلية تعتمد على الحجم لالتقاط الخلايا الورمية المتداولة، والتي تم استعادتها لاحقا للتحليل الجزيئي لاحقا. لتحديد وجود طفرات محددة في EGFR داخل الحمض النووي الجينومي للخلايا الملتقطة بذلك، تم إجراء ddPCR باستخدام اختبارات EGFR pT790M وEGFR pL858R.

تم إثراء خطين منفصلين لسرطان الرئة (A549 وH1975) بنشاط من الدم الكامل، وتم إجراء قياس دقيق للطفرات الموجودة داخل خطوط الخلايا H1975 باستخدام ddPCR.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

مع استمرار البحث الترجمي حول قيمة الخزعات السائلة، والمنشورات الحديثة التي توضح بشكل خاص القيمة السريرية لمراقبة CTDNA في اختيار العلاج¹، بدأت خزعات السوائل في مرحلة النضج. توفر الخزعات السائلة طريقة بديلة وأقل توغلا لمراقبة السرطان والتشخيص مقارنة بطرق خزعة الأنسجة التقليدية. ركزت أبحاث واسعة على الحمض النووي المجزأ الموجود في الدم (DNA خال من الخلية، cfDNA)، وبشكل خاص على الحيز الفرعي المشتق من الورم، والمعروف باسم DNA الورم المتداول (ctDNA). تمت دراسة ctDNA بشكل مكثف خلال العقدين الماضيين وأثبت أنه يحتوي على طفرات جينية خاصة بالورم مثل SNVs والمتغيرات الهيكلية، بالإضافة إلى علامات المثيلة ونمط شظايا مميز عند مقارنته ب cfDNA غير الورمي. تستخدم هذه الخصائص المحددة للحمض النووي الكونترولندي الآن لمراقبة الحالة الجزيئية لمرضى السرطان عبر الكشف المبكر، والاستجابة للعلاج، وتقليل المرض المتبقي (MRD)، ومقاومة حالة العلاج. وبالمثل، تطورت خلايا الورم الدورية (CTCs)، التي تنفصل عن موقع الورم الأساسي إلى الأوعية الدموية، مؤخرا كعلامات حيوية واعدة أظهرت وجودها وكميتها في الدم ارتباطا وثيقا بتطور المرض وإمكانية عودته. بينما اعتمدت الدراسات الأولية المبكرة على CTCs بشكل رئيسي على تعبير وتعداد علامات البروتين^2،كان هناك تقدم ملموس في دراسة CTCs على المستوى الجزيئي بما في ذلك اكتشاف الطفرات الجينومية في مستقبل الإستروجين 1 (ESR1) لسرطان الثدي، وجين عامل نمو البشرة (EGFR) لأنواع مختلفة من السرطانات.

تعد طفرات EGFR ضرورية لتحديد المرض والتوقعات المرضية، وكذلك في تحديد أكثر العلاجات فعالية لمرضى سرطان الرئة³. يمكن أن تأخذ الفحوصات الروتينية لطفرات EGFR شكل خزعات من الأورام الصلبة عند التشخيص أو التقدم أو مؤخرا، أخذ عينات من CTDNA من بلازما مرضى مرضى سرطان رئة انتكاس أو مقاوم للعلاج⁴. ومع ذلك، وعلى عكس الأساليب القائمة على ctDNA، فإن تحليل المواد الجينومية المشتقة من CTC يتيح تقييما مباشرا لخلايا الورم السليمة وملفات الطفرات الخاصة بها. إلى جانب دراسات MRD في ctDNA، يمكن أن يوفر اكتشاف الطفرات في جين EGFR لسرطانات CTC النادرة فهما إضافيا لفعالية أنظمة العلاج وعلاوة على ذلك، توقعات المرضى، خاصة في سرطان الرئة غير صغير الخلايا (NSCLC). ندرة مراكز CTC وغياب بروتوكولات مبسطة تستخدم أدوات سهلة الاستخدام للعيادات تشكل عقبة خطيرة أمام التبني الأوسع. يبرز هذا القيد الحاجة إلى سير عمل موحد وسهل الوصول يتيح كل من عزل CTC الفعال والتحليل الجزيئي في مرحلة لاحقة. لذلك، فإن هدف هذه الدراسة هو تقديم سير عمل قابل للتكرار لإثراء الخلايا الورمية المنتشرة والكشف اللاحق عن طفرات EGFR باستخدام الجمع بين عزل الخلايا ونهج PCR الرقمي.

يمكن لنظام عزل خلايا جينيسيس مع شرائح التقاط الخلايا الميكروفلويدية التقاط CTCs في عملية شبه آلية ذات قابلية بقاء عالية وكفاءة التقاط عالية، وذلك بناء على حجمها الأكبر وقابليتها للتشوه المنخفضة مقارنة بمجموعة خلايا الدم البيضاء والحمراء الأولية ^5,6. يمكن بعد ذلك استعادة CTCs المحتجز من شرائح التقاط الخلايا الميكروفلويدية عن طريق التدفق العكسي من الشريحة لمزيد من التحليل الجينومي في المراحل اللاحقة. لتحديد وجود طفرات محددة ل EGFR داخل الحمض النووي الجينومي للخلايا الملتقطة بذلك، تم إجراء ddPCR على الحمض النووي الجينومي المستخرج من CTC باستخدام اختبارات EGFR T790M و L858R.

يستخدم هذا البروتوكول، الذي يستخدم عينة CTC نموذجية واختبارات ddPCR المتاحة تجاريا، ليمثل نقطة دخول للكشف المستهدف عن الطفرات المرتبطة بالسرطان في CTCs. يوفر هذا البروتوكول نهجا عمليا للكشف عن الطفرات المرتبطة بالسرطان في الخلايا الورمية المنتشرة وقد يدعم المزيد من الأبحاث في تطبيقات الخزعة السائلة.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بيان أخلاقي:

تم الحصول على عينات دم من مصادر معتمدة للاستخدام البحثي، وتم الحصول على موافقة مكتوبة مستنيرة من جميع المتبرعين قبل جمع العينات. تمت مراجعة جميع البروتوكولات التجريبية المتعلقة بعينات دم بشرية والموافقة عليها من قبل مجلس المراجعة المؤسسية لبائع دم، ديسكفري لايف ساينسز (ألاباما، الولايات المتحدة). تم إجراء جميع الإجراءات المتعلقة بعينات دم بشرية وفقا للمعايير الأخلاقية للجنة البحث المؤسسي وإعلان هلسنكي.

1. إثراء الخلايا السرطانية باستخدام نظام عزل الخلايا شبه الآلي

ملاحظة: يصف هذا القسم إثراء خلايا الورم المتداولة (CTCs) باستخدام منصة عزل الخلايا شبه الآلي، تليها اكتشاف طفرات EGFR بواسطة PCR رقمي بالقطرات. يستخدم نموذج CTC لإثبات الجدوى، وينصح بالتحقق من صحة الاختبار قبل التطبيق السريري. تم استخدام خطين من سرطان الرئة غير صغير الخلايا (NSCLC): NCI-H1975 (طفرات EGFR L858R/T790M) وA549 (نوع EGFR البري)، والتي كانت تعمل كضابط سلبي للكشف عن الطفرات.

عينة دم
1. تأكد من الحصول على موافقة مستنيرة من المتبرعين بالدم أو المرضى قبل جمع الدم. الحصول على موافقة مجلس المراجعة المؤسسية (IRB)، عند الحاجة، للأبحاث التي تشمل عينات بشرية، بما في ذلك الدم.
2. لاختبار الجدوى، احصل على عينة دم من^{بائع طرف ثالث} معتمد للاستخدام البحثي فقط.
3. جمع الدم المحيطي من أنابيب حمض الإيثيلين ديامين رباعي الأسيتيك (EDTA) ومعالجة العينة عبر بروتوكول Genesis Enrichment خلال 48 ساعة.
  ملاحظة. للتحليل اللاحق وبروتوكول Genesis Enrichment، يوصى باستخدام أنابيب EDTA. يمكن استخدام أنبوب ستريك وأنبوب EDTA للتلوين المناعي على الشريحة باستخدام بروتوكولات التعداد الجينيسيسي (مباشر/غير مباشر).
4. تخزين عينات الدم المجمعة في أنابيب EDTA عند 2–8 درجات مئوية حتى الاستخدام. لعزل خلايا جينيسيس، لا حاجة للعلاج المسبق ويمكن استخدام دم كامل يصل إلى 10 مل لبروتوكول الإثباء.
نموذج عينة CTC/تحضير العينة السريرية
1. تحضير محلول خلوي بتركيز بين 100–1,000 خلية في وسط زراعة الخلايا المناسب بسعة 10 ميكرولتر أو محلول ملحي مخزن الفوسفات (PBS). تخطي هذه الخطوة إذا كانت العينات السريرية قيد الاستخدام.
  ملاحظة: تركيزات الارتفاع المستخدمة في هذه الدراسة أعلى من مستويات CTC السريرية المعتادة وهي مخصصة فقط لأغراض عرض الطريقة.
2. أضف 10 ميكرولتر من محلول مخزون الخلايا إلى ما يصل إلى 10 مل من الدم الكامل من معطح سليم لتحضير نموذج CTC. بالنسبة للعينات السريرية، لا تدرج أي خلايا سرطانية في عينات دم المرضى الكاملة.
3. اخلط عينة الدم مع حجم متساو من PBS (1x) وحرك بلطف على جهاز هزاز دم في درجة حرارة الغرفة حتى الاستخدام. إذا تجاوز التخزين ساعة واحدة، خزن عند 4 درجات مئوية.
إثراء CTC
1. شغل نظام عزل خلايا جينيسيس وانتظر تهيئة النظام. قد يستغرق هذا حتى 5 دقائق.
2. ضع جرة النفايات في مكانها عند قاعدة فتحات المحطة وربط أنبوب جرة النفايات ببرطمان النفايات.
3. اضغط الأنبوب في صمام الضغط حتى تشعر أنه ينقر في مكانه، ثم قم بتوصيل أنبوب نظام جينيسيس بمخرج برطمان النفايات.
4. قم بإجراء اختبار ذاتي بالضغط على "ابدأ" من الشاشة الرئيسية ولمس زر 'الاختبار الذاتي' على الشاشة.
5. عند اكتمال الاختبار الذاتي، اختر 'إثراء مجموعة 2.0' من خيارات اختيار البروتوكولات.
6. اتبع التعليمات على الشاشة، املأ حقول إدخال البيانات المطلوبة وأكمل إجراء التهيئة والتجميع. التحضير الناجح باستخدام 70٪ إيثانول و1x PBS يعطي أفضل أداء في التقاط الخلايا واستعادتها لاستخراج الحمض النووي. يستغرق التحضير حوالي 20 دقيقة لإكماله.
7. تأكد من اختيار برنامج الإثراء الصحيح (إثراء المجموعات 2.0) وأن جميع وصلات الأنابيب وأماكن الانزلاق مؤمنة بشكل صحيح قبل بدء التشغيل. تجنب إدخال فقاعات الهواء أثناء تحميل العينة، لأن ذلك قد يؤثر على اتساق التدفق وكفاءة الالتقاط.
8. قم بتوزيع عينة النموذج المعدة من الخطوة 1.2.3 (نموذج عينة CTC/تحضير العينة السريرية) بلطف إلى قمع المدخل واستمر في بروتوكول الإثراء بالضغط على 'استئناف' على شاشة النظام.
9. عند اكتمال التقاط CTC، سيطلب نظام عزل الخلايا شبه الآلي من المستخدم إزالة جرة النفايات وإعادة تركيب خزان التمهيد.
10. افصل أنبوب نظام جينيسيس من وعاء النفايات واطلق 4 مل من مخزن التخفيف إلى خزان التمهيد.
11. قم بتوصيل محول التدفق العكسي بخزان التمهيدي وإعادة توصيله بأنابيب نظام جينيسيس. اضغط على استئناف على الشاشة لمتابعة بروتوكول الإثراء. هذا يطلق الخلايا الملتقطة في شريحة الميكروفلويدية إلى قمع السحب عن طريق تطبيق تدفق عكسي.
12. اجمع الخلايا المستردة عن طريق توصيل أنابيب من قمع السحب إلى أنبوب إيبندورف بسعة 5.0 مل. تأكد من جمع جميع العينات المائية في قمع المدخل، الذي غالبا ما يتجاوز 4 مل.
13. قم بعمل طرد كهربائي على العينة المستخرجة على 600 جرام لمدة 5 دقائق لإزالة الخلايا الملتقطة قبل تحلل الخلية.
14. قم بإزالة المادة الفائقة بعناية وتابع بروتوكول استخراج الحمض النووي (القسم 1.4).
استخراج الحمض النووي
تحذير: DNAzol BD ضار إذا لامس الجلد أو تم تناوله. تجنب ملامسة الجلد والعينين. استخدمها فقط في بيئة غطاء بخار كيميائي ولا تتنفس أي رذاذ أو بخار أو رذاذ. في حال ملامسة الجلد، اغسله بالماء فورا.
1. أضف 1 مل من DNAzol BD مباشرة إلى الأنبوب من الخطوة 1.3.14.
2. انقل حجم العينة بالكامل إلى أنبوب ميكرو جنتريفيوج جديد من نوع Eppendorf DNA Lobind بسعة 1.5 مل واهز بقوة.
3. حضن الأنبوب في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. قم بتدوير الأنبوب بقوة وحضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة لا تقل عن 4 دقائق.
4. تأكد من الخلط الكامل أثناء التحليل وخطوات الترسيب لتعظيم استرداد الحمض النووي. قد يشمل العلاج الاختياري باستخدام RNase إذا كان تلوث الحمض النووي الريبي مصدر قلق.
5. أضف 400 ميكرولتر من الأيزوبروبانول إلى خليط عينات تحليل الخلايا BD-cell من DNAzol مباشرة.
6. قم بطرد المركزي في الأنبوب بوزن 10,000 جرام لمدة 6 دقائق لترسيب الحمض النووي.
7. بعد الطرد المركزي، قم بإزالة المادة الفائقة وإضافة 0.5 مل من DNAzol BD بلطف إلى الحمض النووي المثقوب.
8. اجعل الأنبوب يشبه الدوامة حتى تتفرق الحبيبات بالكامل.
9. قم بطرد مركزي بالخليط عند 10,000 جرام لمدة 5 دقائق.
10. قم بإزالة المادة الفائقة واغسل حبيبات الحمض النووي عن طريق المضغ 1 مل من الإيثانول بنسبة 75٪.
11. كرر الخطوات من 9 إلى 10 ليصبح المجموع غسلتين.
12. قم بإزالة أي بقايا إيثانول في أسفل الأنبوب باستخدام ميكروبيبت.
  ملاحظة: تأكد من أن الحبيبة لا تجف تماما.
13. أضف 20 ميكرولتر من الماء منزوع الأيونات الخالي من DNase-/RNase (DI) لإذابة الحمض النووي من عينات CTC.
14. قم بقياس الحمض النووي مزدوج السلسلة (dsDNA) في العينة باستخدام مجموعات ومنصات اختبار الكمية dsDNA، مثل مجموعة اختبار الحساسية عالية الكيوبت 1x dsDNA أو تحليل الحمض النووي عالي الحساسية للتحليل الحيوي.
15. تخزين عينات الحمض النووي المستخرجة عند 4 درجات مئوية أو -20 درجة مئوية لمنع التحلل.
  نقطة التوقف: يمكن تخزين عينات الحمض النووي المستخرجة عند -20 درجة مئوية للتخزين قصير الأمد أو عند -80 درجة مئوية للتخزين طويل الأمد قبل الانتقال إلى التحليلات اللاحقة.

2. تحليل طفرات EGFR باستخدام ddPCR

يعد PCR الرقمي طريقة مناسبة للكشف عن الطفرات النادرة ذات الحساسية والدقة العالية. عادة ما تتضمن اختبارات كشف طفرات ddPCR المقدمة في أنبوب واحد مسبارا موسوم ب FAM يستهدف أليلا متحورا ومسبارا ثانيا موسوم ب HEX يستهدف أليلا من النوع البري.

إعداد التفاعل وتوليد القطرات
1. إذابة اختبار ddPCR Supermix واختبارات ddPCR لاكتشاف الطفرات على الثلج.
2. قم بتدوير كل أنبوب لضمان تجانس المحتويات، حيث قد يتكون تدرج تركيز أثناء التخزين عند -20 درجة مئوية.
3. قم بعمل طرد مركزي لفترة وجيزة إلى محتويات الرواسب في قاع الأنبوب ووضع الأنبوب على الثلج.
4. تحضير عينات الحمض النووي المستخرجة بالتركيز المطلوب قبل تحضير خليط التفاعل وفقا للوصفة في الجدول 1.
5. اصنع خلطا مسبقا يحتوي على خليط فائق، واختبارات وإنزيمات تقييد، بالإضافة إلى ماء لجميع العينات المطلوبة للاختبار، وأضف الحمض النووي للعينة بشكل فردي كمكون تفاعل أخير. تأكد من أن التركيز النهائي لعينات الحمض النووي هو 50 fg–100 ng.
  ملاحظة: ينصح بتجزئة الحمض النووي بواسطة الهضم التقييدي قبل تكوين القطرات لتحسين الدقة، وتقليل اللزوجة، وتعزيز سهولة الوصول إلى القالب. يوصى بهضم مباشر باستخدام 2–5 وحدة من إنزيم التقييد أثناء إعداد ddPCR. لاختبارات طفرات نقطة EGFR (T790M/L858R)، ينصح باستخدام MseI؛ راجع أوراق بيانات الاختبار للحصول على الإنزيمات المتوافقة قبل التخصيص. تتوفر أوراق البيانات للتحميل للاختبارات الفردية من بوابة الاختبارات الرقمية Bio-Rad (اختبارات Bio-Rad Droplet الرقمية PCR | المنزل)
6. جهز جهاز تحكم سلبي لبئر واحد على الأقل، يحتوي فقط على قالب بري بتركيز مشابه لتركيز العينات المجهولة.
7. قم بعمل دوامة لأنابيب التفاعل لخلطها جيدا ثم قم بالطرد المركزي لفترة وجيزة لترسيب جميع العينات إلى قاع كل أنبوب تفاعل. اترك أنابيب التفاعل تتوازن عند درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقتين.
8. تحميل 20 ميكرولتر من كل خليط تفاعل في بئر عينات من خرطوشة ميكروفلويدية (خرطوشة DG8) تليها 75 ميكرولتر من زيت توليد القطرات للمجسات في آبار الزيت.
9. غط الخرطوشة بحشية وضعها في مولد قطرات QX200.
10. اضغط الزر الموجود في أعلى مولد القطرات لإغلاق الغطاء. عندما يغلق الغطاء، يبدأ توليد القطرات تلقائيا. تجمع هذه العملية العينات والزيت داخل القنوات الدقيقة لخرطوشة الميكروفلويديك لإنتاج مستحلب بحجم ~20,000 نانولتر لكل عينة.
تضخيم PCR (ظروف الدورة الحرارية)
1. برنامج ظروف الدورة الحرارية على جهاز التدوير الحراري كما هو موصى به في الجدول 2
2. عند اكتمال توليد القطرات، تكون جميع الأضواء على الجهاز خضراء صلبة. افتح الجهاز بالضغط على زر مولد القطرات مرة أخرى وقم بإزالة حامل الخرطوشة والخرطوشة.
3. قم بإزالة الحشية ذات الاستخدام الواحد واسحب 45 ميكرولتر من القطرات من الخرطوشة، مع الحرص على ضمان زاوية طفيفة على طرف الماصة لمنع تمزق القطرات.
4. قم بتوزيع القطرات في ألواح ddPCR 96-Well وختم اللوح بختم حرارة لوحة PCR باستخدام مادة PX1 PCR Plate Plate.
5. بعد إغلاق صفيحة 96 بئر تحتوي على قطرات، انقل لوح 96 بئر بعناية إلى جهاز التدوير الحراري الذي تم إعداده في الخطوة 2.2.1 وابدأ الدورة الحرارية.
قراءة قطرات وتحليل البيانات
1. شغل جهاز ddPCR Droplet Reader (قارئ قطرات QX200 أو قارئ قطرات QX600) وجهاز كمبيوتر متصل يتم تثبيت وتكوين برنامج QX Manager.
2. بمجرد اكتمال خطوة الدورة الحرارية، انقل لوحة ال 96 بئر مغلقة إلى جهاز قارئ قطرات.
3. افتح برنامج QX Manager لتكوين تخطيط لوحة جديد بناء على التصميم التجريبي. انقر على تبويب 'إضافة لوحة' وسيفعل البرنامج زر تكوين اللوحة. انقر على 'تكوين اللوحة' لتعيين تفاصيل العينة لللوحة.
4. املأ تفاصيل اللوحة ومعلومات البئر، اختر الآبار، حدد حالة العينة، نوع التجربة، اسم الهدف، نوع الهدف، والمرجع: ch1 ل FAM والch2 للون HEX.
5. انقر على 'تطبيق' لتحميل البئر، وبعد الانتهاء، اختر 'موافق'.
6. عندما يكتمل تخطيط اللوحة لجميع العينات، اختر 'تشغيل' لبدء عملية قراءة القطرات.
7. عند جمع البيانات، اختر عينات في محدد البئر تحت 'تحليل' وحدد العتبة المناسبة لاختبار ddPCR لاكتشاف الطفرات لتمييز الإشارات الطفرية عن الإشارات البرية.
8. بالنسبة لاختبارات الطفرات المزدوجة مثل تلك المستخدمة في هذا البروتوكول، يمكن ضبط العتبات تلقائيا باستخدام الإعدادات الافتراضية لبرنامج مدير QX (راجع إلى الشكل في النتائج).
9. بدلا من ذلك، يمكن ضبط العتبات يدويا باستخدام طرق التصويب أو الحبل، لضمان أن العتبات أو حدود الحبل تفصل بين المجموعات الموجبة والسالبة ويتم وضعها بناء على مواقع العناقيد التي تحددها عناصر التحكم الإيجابية والسلبية في كل تشغيل.
  ملاحظة: يجب تحديد العتبات بشكل متسق عبر العينات داخل دفعة باستخدام ضوابط إيجابية وسالبية لضمان استدعاء الطفرات القابلة للتكرار.
10. التركيز المبلغ عنه هو أرقام النسخ لكل ميكرولتر من التفاعل النهائي 1x ddPCR.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

عزل نظام عزل خلايا جينيسيس مع شرائح التقاط الخلايا الميكروفلويدية عزل متوسط 84٪ من الخلايا السرطانية المتصاعدة في عينات الدم بتركيز من 25–250 خلية·^مل-1 (الشكل 3A). تظهر هذه الكفاءة العالية في الالتقاط فعالية خطوة الإثراء في عزل الخلايا الورمية النادرة المتداولة عن عينات الدم الكاملة. أظهر التلوين المناعي الاختياري للخلايا التي تم التقاطها في شرائح التقاط الخلايا الميكروفلويدية باستخدام بروتوكول التعداد النظامي تحديد الخلايا النادرة باستخدام جسمين مضادين إيجابيين ضد السيتوكيراتين، وDAPI لتحديد الخلايا النواة، وجسما مضادا سلبيا واحدا ضد CD45 يعبر عنه في معظم خلايا الدم البيضاء لكنه عادة لا يعبر عنه في CTCs (الشكل 3B). يؤكد نمط التلوين هذا النجاح في تحديد خلايا الورم المنتشرة مع استبعاد خلايا الدم البيضاء الخلفية.

مكنت اختبارات اكتشاف طفرات ddPCR من تحديد وتحليل طفرات EGFR في الخلايا السرطانية الغنية بذلك. أظهرت هذه الدراسة الكشف عن طفرات gDNA في الخلايا، والتي تم إثراؤها في البداية بمنصة Genesis، باستخدام اختبارات ddPCR واختبارات كشف الطفرات. أظهرت مخططات ddPCR (الشكل 4) لخطوط الخلايا السرطانية A549 (النوع البري من EGFR) وH1975 (L858R/T790M) للطفرتين المجربين من EGFR أن ddPCR يمكنه الكشف الحساس عن الطفرات الموجودة في خط الخلية H1975 بعد التوسع في الدم الكامل والتثريبه اللاحق عبر منصة جينيسيس. لوحظت إشارات طفرة إيجابية في خلايا H1975، بينما لم يتم اكتشاف أي إشارات طفرة في خلايا A549، مما يؤكد خصوصية الاختبار. أظهرت العينات التي تم تدميرها بخط الخلية الضابط A549 عدم وجود طفرات وقطرات تؤكد أن اكتشاف الطفرات عند L858R وT790M مرتبط تحديدا بخط خلية H1975. يمكن أن يوفر هذا العرض لعزل CTC على منصة Genesis تليها التحليل الجزيئي باستخدام ddPCR أداة تشخيصية جزيئية قوية لدراسات الخزعة السائلة والدراسات ما قبل السريرية باستخدام عينات سريرية لمراقبة تقدم المرض والعلاج الشخصي. بشكل عام، تظهر هذه النتائج أن تدفق الإثراء المزدوج وddPCR يمكنه اكتشاف وقياس طفرات EGFR بشكل موثوق في الخلايا الورمية المتداولة.

figure-results-1
الشكل 1: سير عمل الخزعة السائلة لتحليل طفرات الحمض النووي EGFR في سرطان الرئة. (أ) توضيح لتباين الأورام يظهر ملفات طفرات EGFR مختلفة تم اكتشافها باستخدام خزعة الأنسجة التقليدية وخلايا الورم المتداولة (CTCs) من الخزعة السائلة. (ب) سير العمل التخطيطي لتحليل طفرات الحمض النووي EGFR في الخلايا الورمية المتداولة باستخدام الخزعة السائلة. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-2
الشكل 2: عرض تنميط طفرات الحمض النووي EGFR باستخدام عينات مصطنعة. (أ) تحضير نموذج عينة CTC عن طريق تمرير خطوط خلايا سرطان الرئة ذات حالة طفرة EGFR المحددة إلى دم كامل من متبرع سليم. (ب) سير العمل الذي يوضح اكتشاف طفرات الحمض النووي بنظام EGFR في الخلايا الورمية المنتشرة باستخدام منصات تجارية متاحة. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-3
الشكل 3: عزل وتحديد الخلايا الورمية المتداولة بدون علامات وتعريف. (أ) كفاءة التقاط خطوط خلايا سرطان الرئة (A549 و H1975) التي ارتفعت في عينات دم كاملة من متبرعين أصحاء باستخدام منصة عزل الخلايا النادرة شبه الآلية. (ب) تلطيخ الخلايا الملتقطة بمناعة تظهر خلايا أورام إيجابية للسيتوكيراتين. شريط المقياس = 10 ميكرومتر. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-4
الشكل 4. تحليل طفرات EGFR باستخدام PCR رقمي قائم على القطرات. مخططات سعة ثنائية الأبعاد تظهر اكتشاف طفرات EGFR في الخلايا السرطانية الغنية بعد تحلل الخلية واستخراج الحمض النووي. تظهر خلايا A549 (النوع البري) غياب إشارات خاصة بالطفرات، بينما تظهر خلايا H1975 إشارات إيجابية لطفرات EGFR L858R وT790M. يتيح الاختبار الكشف الحساس وقياس تجمعات الحمض النووي الطفرة والأنواع البرية. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

المكون	الحجم لكل تفاعل (μl)	التركيز النهائي
2x ddPCR Supermix للمجسات (بدون dUTP)	10	1x
20x هدف/مسبار من النوع البري (HEX)	1	1x
إنزيم التقييد، مخفف (Msel)	1	2-5 U/تفاعل
عينة مستهدفة و/أو ماء خال من DNase (NTA)	المتغير	المتغير
الحجم الكلي	20	-

الجدول 1: إعداد التفاعل لاكتشاف طفرات PCR الرقمية المعتمدة على القطرات. تركيب وتركيزات الكواشف النهائية المستخدمة في اكتشاف طفرات EGFR النادرة في عينات الحمض النووي المشتقة من خلايا السرطان.

خطوة الدورة الحرارية*	درجة الحرارة	الزمن	معدل المنحدر	عدد الدورات
خطوة الدورة الحرارية*	(ºC)	الزمن	(ºC/ثانية)	عدد الدورات
تنشيط الإنزيمات	95	10 دقائق	2	1
إزالة الطبيعة	94	30 ثانية	2	40
التلدين/الامتداد	55	دقيقة واحدة	2	40
تعطيل الإنزيمات	98	10 دقائق	2	1
التبريد	4	30 دقيقة	2	1
الانتظار (اختياري)	4	∞ (لا نهائي)	1	1
استخدم غطاء مسخن مضبوطا على 105 درجة مئوية واضبط حجم العينة على 40 ميكرولتر لجهاز C1000 Touch Thermal Cycler مع وحدة تفاعل بئر بعمق 96.

الجدول 2: ظروف الدورة الحرارية لتضخيم PCR الرقمي. معلمات الدورة الحرارية المستخدمة لتضخيم أهداف طفرات EGFR باستخدام جهاز تدوير حراري مزود بوحدة تفاعل بسعة 96 بئرا.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وجود خلايا الورم المتداولة في دم المرضى المصابين بالأورام الصلبة كان موضوع بحث لأكثر من 60 عاما،^وقد تم الاعتراف به كخزعة سائلة أولية منذ قبل إدراجها لأول مرة في المصطلح الجماعي في عام 2010^. ومع ذلك، فإن CTCs نادرة، ومن الصعب عزلها انتقائيا من الدم الكامل⁹. ومع ذلك، هناك العديد من الطرق لالتقاط وإثراء CTCs، كما هو موضح في المراجعات^{التالية 10,11}، التي تغطي الأساليب الفيزيائية/الميكروفلويدية بالإضافة إلى طرق اختيار علامات سطح الخلية. العديد من هذه الطرق تستغرق وقتا طويلا، تتطلب جهدا كبيرا، وغالبا ما تتطلب عدة خطوات أو أنظمة لتحقيق الانتقائية المطلوبة.

يعتمد التقاط CTCs من الدم الكامل في هذا البروتوكول على حجمها (> 8 ميكرومتر) وعدم وجود تشوه في خلفية خلايا الدم الحمراء والبيضاء الطبيعية الظاهرية التي تمر عبر مسام الميكروفلويدكس داخل شرائح التقاط الخلايا الميكروفلويدية. لذلك، فإن التحميل الصحيح للعينات، والتحضير الصحيح للانزلاق، ومنع الانسداد هي خطوات حاسمة للحفاظ على كفاءة الالتقاط واستعادة العينات.

لكي يكون سير العمل ناجحا، فإن إدارة عينات الدم هي العامل الأساسي؛ ضمان استخدام الدم الطازج لمعالجة العينات والحفاظ على ظروف النقل والتخزين الصحيحة لمنع تحلل الدم. تدهور خلايا الدم الحمراء أو خلايا الدم البيضاء سيؤثر على جودة التقاط CTC وحساسية الكشف عن أي متغيرات جينومية نادرة على التوالي. إذا لوحظ تحلل دموي أو تجلط أو تدهور مرئي للعينة، فلا ينبغي معالجة العينة، لأن هذه الظروف قد تقلل من استعادة CTC وحساسية اكتشاف الطفرات لاحقا.

نظرا لأن CTCs يمكن أن تكون بمستويات أقل من 1 CTC لكل 10 ملايين خلية دم بيضاء في الدم الكامل، فمن الضروري التقاط أكبر حجم ممكن للتثريب. يمكن لشرائح التقاط الخلايا الميكروفلويدية استيعاب 10 مل من الدم بمحاذاة أنابيب التقاط الدم القياسية مثل ستريك وEDTA، والتي عادة ما تحتفظ بكمية دم ~7.5–10 مل. سيؤثر انخفاض حجم الدم المجمع بشكل مباشر على حساسية التقاط CTC والكشف اللاحق عن متغيرات جينومية. الحصول على كميات تتجاوز هذا الروتين من المرضى الذين يخضعون للعلاج قد يكون تحديا سريريا وأخلاقيا. بعيدا عن زيادة الحجم بأكثر من 10 مل أو استخدام عينات تشخيصية لزيادة أعداد الخلايا البيضاء والكلمات،^فإن زيادة الحساسية مع الأحجام الأكبر تتجاوز نطاق منصة جينيسيس حاليا.

تم تنفيذ البروتوكول كما هو موضح في البيان القياسي القياسي ولكن مع حرص على ضمان جمع الدم الطازج، والخلط الشامل بين EDTA والدم عند الجمع، والتخزين الدقيق للدم المجمع قبل الاستخدام، مما يوضح إمكانية استخدام هذا البروتوكول في بيئة سريرية حيث تقدر الإجراءات الروتينية القياسية. ومع ذلك، وبما أن هذا البروتوكول تم إثباته باستخدام عينات مصطنعة، فإن التحقق من صحة المرضى السريريين مطلوب قبل التنفيذ الروتيني السريري.

تعتمد حساسية اكتشاف الطفرات داخل مجموعة CTC على وجود CTCs في عينة دم كاملة قياسية وكذلك على الكشف اللاحق عن الطفرات الجسدية داخل تلك المجموعة، والذي يعتمد على تكرار الطفرة في المجموعة الفرعية ل CTC. هذان العاملان المربكان سيقيدان في النهاية من الحساسية العامة لاكتشاف الطفرات في مجموعة CTC التي تم التقاطها؛ وكان لها تأثير أكبر في عينات الكشف المبكر مقارنة بالعينات في المراحل المتأخرة التي من المرجح أن تحتوي على أعداد أعلى من CTC وزيادة تجمعات CTC الحاملة للطفرات.

الدراسات الحالية للخزعة السائلة القائمة على الدم تميل بشدة نحو الحمض النووي الورمي المتداول في البلازما كمؤشر على وجود الورم. عادة ما يعتمد الكشف عن ctDNA على وجود علامات جينومية خاصة بالورم مثل SNVs، والمتغيرات الهيكلية، وMSI-H، والTMB، وCGP. CTCs كمؤشر حيوي أقل استخداما ومع ذلك بنفس القدر من الفعالية في الخزعة السائلة، معروفة بأنها تسقط في مجرى الدم من خلال نمو الأورام وربما الانتشار⁸. يركز تحليل CTCs بشكل أساسي على علامات سطح الخلية المستخدمة في التقاطها أو للتحقق بعد الالتقاط باستخدام لوحات أجسام مضادة معتمدة أو مخصصة مثل بان-سيتوكراتين، فيمنتين، PD-L1، EpCAM وغيرها. في المقابل، فإن التحليل الجزيئي لCTCs محدود في التبني بسبب تحديات إثراء والتقاط CTCs بشكل انتقائي من الدم الكامل متبوعا بتحليل دقيق لمجموعة CTC الفرعية. تستخدم الطريقة الحالية سير عمل موحد يشمل بروتوكولات معتمدة لالتقاط CTC، تليها التحليل الجزيئي باستخدام ddPCR مع اختبارات جاهزة للطفرات الجينومية المعروفة ذات الصلة المرضية في عينات دم كاملة مصطنعة. يعد هذا النهج مهما لأنه يتيح تحليل الطفرات مباشرة من خلايا CTC مخصبة، مكملا لطرق الخزعة السائلة المعتمدة على ctDNA في البلازما.

باستخدام النهج الحالي، يمكن التحقيق في CTCs النادرة التي تم التقاطها من حيث وجودها في الدم الكامل ووجود علامات جينومية ذات صلة مرضية في مجتمع CTC. أظهرت الدراسات قيمة تقييم كل من ملف ctDNA للمرضى المصابين بالسرطان وخزان CTC الذي يدور بالتوازي مع ctDNA¹³، مع توسيع تقييم كلا مصدري الطفرات المشهد الجزيئي العام للمرضى. وهذا يحمل إمكانية تطوير نماذج اختبار علم الأمراض ضمن نطاق البحث الانتقالي في البداية، ولكن في النهاية في بيئة سريرية. سيدمج النموذج الجديد وجود CTC كمؤشر على وجود أو تقدم السرطان والطفرات المرضية الموجودة داخل الخلايا التي تم التقاطها في CTC، مما قد يشير إلى توسع النسيلة أو المقاومة العلاجية¹⁴. الدلالة على ذلك هي أن تطور النقائل وتوسع النسخة، يليه مقاومة الأدوية اللاحقة، يمكن مراقبته معا على مستوى الحمض النووي العصبي ومستوى CTC، مما يؤثر مباشرة على اختيار العلاج في المراحل المتقدمة من السرطان.

قد تشمل التطبيقات المستقبلية تكييف هذا السير مع طفرات مرتبطة بالسرطان واختبار أدائه في عينات سريرية طولية.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يشكر المؤلفون أبيودون بودونرين، سينثيا شو، أجيثا كريستي-ديفيد، أندرو برانتنر وإيرييل بوسود على مساعدتهم في تجارب ddPCR، ومناولة خلايا السرطان، وتجارب عزل الخلايا السرطانية لهذه الدراسة.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
Genesis Cell Isolation System	Bio-Rad Laboratories	12019822	Instrument (يشار إليه باسم "نظام عزل الخلايا شبه الآلي")
QX200 Droplet Generator	Bio-Rad Laboratories	1864002	Instrument
QX200 Droplet Reader أو QX600 Droplet Reader	Bio-Rad Laboratories	1864003 أو 12013328	Instrument (يشار إليه باسم "جهاز قارئ القطيرات")
PX1 PCR Plate Sealer	Bio-Rad Laboratories	1814000	Instrument
C1000 Touch Thermal Cycler مع وحدة تفاعل 96 – بعمق	Bio-Rad Laboratories	1851197	Instrument
Qubit 4 Fluorometer	Thermo Fisher Scientific Inc.	Q33226	Instrument
Celselect Slides			Consumable (يشار إليه باسم Microfluidic Cell Capture Slides)
Celselect Slides Enrichment Kit 2.0	Bio-Rad Laboratories	17009455	Consumable
DNAzol BD	Molecular Research Center, Inc.	DN129	Reagent
MseI restriction enzyme	New England Biolabs	R0525S	Reagent
ddPCR Mutation Detection Assay: EGFR T790M	Bio-Rad Laboratories	Assay ID dHsaMDV2010019	Assay
ddPCR Mutation Detection Assay: EGFR L858R	Bio-Rad Laboratories	Assay ID dHsaMDV2010021	Assay
Qubit 1X dsDNA High Sensitivity Assay Kit	Invitrogen	Q33230	Assay kit
DG8 Cartridges for QX200 Droplet Generator	Bio-Rad Laboratories	1864008	Consumable
Droplet Generation Oil for Probes	Bio-Rad Laboratories	1863005	Consumable
Automated Droplet Generation Oil for Probes	Bio-Rad Laboratories	1864110	Consumable (optional)
ddPCR Supermix for Probes (بدون dUTP)	Bio-Rad Laboratories	1863023	Reagent
PCR Plate Heat Seal	Bio-Rad Laboratories	1814040	Pierceable foil seal
DNA LoBind Microcentrifuge Tube, 1.5 ml	Eppendorf	022431021	Consumable
ddPCR 96-Well Plates	Bio-Rad Laboratories	12001925	Consumable