Method Article

طريقة الزراعة المشتركة ثلاثية الأبعاد لدراسة التفاعلات غير المباشرة بين أنواع الخلايا المختلفة عبر غشاء قاعدي معاد تشكيله

DOI:

10.3791/70027

⸱

April 17th, 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry, Memorial University of Newfoundland, 2Beatrice Hunter Cancer Research Institute, 3Grupo Multidisciplinar de Oncología Traslacional & University Research Institute for Health Sciences (IUNICS), Health Research Institute of the Balearic Islands (IdISBa) & University of the Balearic Islands, 4Ciber Fisiopatología Obesidad y Nutrición (CB06/03), Instituto Salud Carlos III, 5Department of Biomedical Sciences, Ontario Veterinary College, University of Guelph

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

توضح هذه المقالة طريقة بسيطة للزراعة المشتركة ثلاثية الأبعاد لنوعين من الخلايا مفصولين بواسطة غشاء قاعدي معاد تشكيله، والذي يتطلب معدات متخصصة قليلة ويمكن تحليله بسهولة باستخدام مجموعة متنوعة من التقنيات التجريبية.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الزراعة المشتركة ثلاثية الأبعاد (ثلاثية الأبعاد) هي تقنية تتطور بسرعة للباحثين الذين يسعون لدراسة تفاعلات الخلية بين الخلايا بدقة باستخدام تجارب في المختبر . يتم معالجة حدود زراعة الخلايا أحادية الطبقة، بما في ذلك التفاعلات المحدودة بين البيئة الخلوية وخارج الخلية وشكل الخلية المضطرب، من خلال محاكاة البيئة الخلوية داخل الجسم . باستخدام سقالة لتوفير الدعم البنيوي وتشمل مكونات مصفوفة خارج الخلية نشطة بيولوجيا، تظهر الثقافات ثلاثية الأبعاد سلوكيات وأشكال أكثر توافقا مع الأنسجة. دمج أنواع متعددة من الخلايا في هذا النوع من البيئة ثلاثية الأبعاد يسمح بدراسة تفاعلات الخلية مع الخلايا داخل نظام نموذج المحاكاة الحيوية. ظهرت مجموعة واسعة من تقنيات الثقافة المشتركة ثلاثية الأبعاد، لكل منها مزاياها وتحدياتها. غالبا ما تتطلب هذه التقنيات معدات متخصصة، أو إعدادا معقدا، أو معرفة تقنية محددة. كما توجد بعض الطرق المعيارية لدراسة التفاعلات غير المباشرة بين خلية النوعين من الخلايا مفصولين بواسطة غشاء قاعدي معاد تشكيله. هنا، نصف طريقة زراعة ثلاثية الأبعاد تتطلب فقط مهارات تقنية أساسية وتستخدم مواد أكثر تطبيقا لإعادة التفاعل غير المباشر بين الخلايا والخلية بنجاح عبر الغشاء القاعدي. طبقة أحادية من الخلايا مغطاة بطبقة من المصفوفة خارج الخلية على شكل ماتريجيل، ويتم زرع نوع خلية ثان فوقها. يتم الحفاظ على الزراعة المشتركة الناتجة لمدة خمسة أيام، وعندها يتم تحليل الخلايا بحثا عن تغيرات شكلية عن طريق التألق المناعي أو استخراجها من الزراعة المشتركة لإجراء تحليلات جينومية أو نسخية أو بروتيومية أكثر تفصيلا. يعد هذا البروتوكول مثاليا لدراسة تأثير التواصل بين الخلايا والخلايا على سلوك الخلية عندما يحظر الاتصال الجسدي من قبل الغشاء القاعدي. مع استمرار الباحثين في اختيار المزيد من طرق زراعة الخلايا ذات الصلة بالجسم الحي ، أصبح من الضروري اتباع نهج مبسط لتجنب الحواجز العالية أمام الدخول.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

زراعة الخلايا في المختبر هي تقنية بحثية قوية وسريعة ومستخدمة على نطاق واسع. على الرغم من أن طرق زراعة الخلايا التقليدية قوية، إلا أنها تختلف كثيرا عن البيئة الحية. تؤدي الطبيعة المكانية المقيدة لزراعة الخلايا أحادية الطبقة إلى تغييرات في التعبير الجيني والشكل والكيمياء الحيوية 1,2,3. تعالج تقنيات الزراعة ثلاثية الأبعاد (ثلاثية الأبعاد) هذا التفاوت، حيث تزرع الخلايا في هيكل يحاكي المصفوفة خارج الخلية (ECM) الموجودة في الأعضاء والأنسجة. في الزراعة ثلاثية الأبعاد، تظهر الخلايا شكلا وسلوكا مشابها لما يرى في الجسم الحي 4,5. ومع ذلك، فإن الزراعة ثلاثية الأبعاد وحدها لا تعيد تلخيص المكونات العديدة لبيئة دقيقة في الجسم الحي لأنها تفتقر إلى مساهمات من أنواع الخلايا الأخرى6.

يلعب الاتصال المباشر (الاتصال بين الخلايا) والتفاعلات غير المباشرة بين الخلايا دورا رئيسيا في سلوك الخلايا في الجسم الحي 7,8. يتطلب إعادة تلخيص هذه التفاعلات نماذج زراعة ثلاثية الأبعاد، حيث يتم زراعة أنواع خلايا متعددة معا في بيئة ثلاثية الأبعاد. باستخدام هذه التقنيات، يمكن إنشاء بيئة نمو شبيهة بالحياة في المختبر، مما يحسن الصلة البيولوجيةللنتائج. ومع ذلك، كلما كانت البيئة المطلوبة لتجربة معينة أكثر تحديدا، زادت تعقيد المنهجية. هناك نقص في نظام نموذجي موحد يمكن استخدامه لدراسة تفاعلات الخلية بين الخلايا المفصولة بواسطة مصفوفة الغشاء القاعدي. وبالتالي، صمم هذا البروتوكول لمحاكاة التفاعلات بين الخلية والخلية التي تحدث عبر مصفوفة الغشاء القاعدي بطريقة قوية وقابلة للتكرار. مقتبسة من نموذج زراعة ثلاثي الأبعاد11 الذي تم تأسيسه سابقا، تستخدم التقنية طبقة من ماتريجيل، يشار إليها هنا باسم جل ECM، لفصل نوعين مختلفين من الخلايا في الزراعة مع السماح للعوامل المفرزة بالمرور من خلالها. تم تصميمه في الأصل لدراسة التأثير غير المباشر للخلايا الدهنية على خلايا سرطان الثدي الميزنشيمية، لكنه يمكن تعديله بسهولة لاستيعاب أنواع مختلفة من الخلايا. يجب النظر بعناية فيما إذا كانت هذه الطريقة مناسبة لتصميم تجريبي معين. هذه الطريقة لا تسمح بالتفاعل المباشر بين الخلية والخلية، ويجب أن تقتصر على النمذجة في الجسم الحي التي تتضمن اتصالا غير مباشر بين الخلايا عبر مصفوفة الغشاء القاعدي. على سبيل المثال، هذا النظام لن يكون مثاليا لنمذجة التفاعلات بين الخلايا التائية السامة للخلايا التائية وخلايا الورم، حيث تتفاعل عادة بشكل مباشر. بدلا من ذلك، فكر في سيناريوهات بيولوجية حيث يفصل الغشاء القاعدي نوعي الخلايا بشكل طبيعي. على سبيل المثال، يمكن تطبيق هذه الطريقة على دراسة التفاعلات بين خلايا الورم وخلايا البطانة الوعائية قبل الدخول إلى الداخل داخل الجسم.

طريقة بديلة شائعة للزراعة المشتركة ثلاثية الأبعاد تشمل استخدام شرائح ميكروفلويديكس المتخصصة، أو "عضو على شريحة (OoC)". أنظمة OoC قوية ويمكن تخصيصها لتناسب التجارب الفردية، لكنها تتطلب وقتا وموارد كبيرة مخصصة لتصميم الرقائق، اختيار المواد، معدات الطرفيات، التحسين، وجمع البيانات12،13. بالإضافة إلى ذلك، لا توجد حاليا مادة أو طريقة قياسية يمكنها توفير الإشارات البيولوجية والفيزيائية لمصفوفة الغشاء القاعدي دون التداخل مع تدفق الميكروفلويديك14. وبالتالي، فإن تطبيق تقنية OoC في دراسات تفاعلات الخلية مع الخلايا عبر الغشاء القاعدي يطرح تحديات إضافية. تسعى الطريقة الموضحة في هذا البروتوكول إلى تقديم بديل موحد يحافظ على الصلة البيولوجية وسهولة الوصول.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوضح هذا البروتوكول (الشكل 1A) نظام زراعة ثلاثية الأبعاد يهدف إلى إعادة تلخيص تفاعلات الخلية مع الخلايا عبر مصفوفة الغشاء القاعدي. يمكن التحليل اللاحق باستخدام المجهر الكونفوكلي (الشكل 1B) أو عن طريق استخراج الخلايا من داخل الزراعة المشتركة (الشكل 1C). باستخدام بناء 'ساندويتش'، حيث يتم وضع طبقة من جل ECM بين مجموعتين من الخلايا، لا يتطلب البروتوكول جهازا متخصصا ويمكن تنفيذه بمعرفة أساسية بتقنيات زراعة الخلايا الحديثة.

1. 3D التحضير للثقافة المشتركة

ملاحظة: البروتوكول الموضح يقصد به أن يكون تطبيقا تمثيليا لطريقة الزراعة ثلاثية الأبعاد باستخدام الخلايا الدهنية 3T3-L1 وخلايا سرطان الثدي MDA-MB-231. سيتطلب استخدام أنواع الخلايا المختلفة تحسين كثافة بذور الخلايا واختبارا مسبقا لقطع هلام ECM لضمان الفعالية. يتناول هذا البروتوكول استخدام التحكم بدون الخلايا الدهنية والتحكم في الوسائط المشروطة. قد تكون هناك حاجة إلى المزيد من الضوابط حسب الهدف التجريبي.

  1. زراعة الخلايا وتحضير المحلول
    1. الحصول على وإنشاء زراعة لسلاسل خلايا سرطان الثدي 3T3-L1 ما قبل الدهون وMDA-MB-231. نمو وصيانة جميع الخلايا بشكل مستقل باستخدام تقنية المعقمة في خزانة أمان بيولوجية من الفئة الثانية وطرق زراعة الخلايا الملتصقة بالمعايير15. حافظ على خلايا 3T3-L1 في وسط النسر المعدل (DMEM) من دولبيكو مع 10٪ (v/v) مصل العجول حديثي الولادة (NBCS) و1٪ بنسلين-ستريبتوميسين (10,000 U/mL). حافظ على خلايا MDA-MB-231 في RPMI 1640 مع 10٪ مصل البقري الجنيني (FBS) و1٪ بنسلين-ستربتوميسين (10,000 وحدة حركة/مل).
      ملاحظة: لا تسمح أبدا بتجاوز تلاقي الخلايا 3T3-L1 عند 80٪ أثناء الصيانة، ولا تستخدم المزارع التي تتجاوزرقم الممر العشرين.
    2. الحصول على أو تحضير محلول مخزوني مكون من محلول ملحي مخزن الفوسفات 1x (PBS) مع 137 ملليمولار NaCl، 2.7 ملليمولار KCl، 10 ملليمولار Na2HPO4، 1.8 ملليمولار KH2PO4، pH 7.4.
    3. حضر 50 مل من محلول الغسيل PBS-جلايسين بإضافة 0.375 جرام من الجليسين إلى 50 مل من PBS للحصول على تركيز نهائي للجلايسين 100 ملليمتر. احتفظ بالمحلول على حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 12 شهرا.
    4. جهز 10 مل من مخزن النفاذية بإضافة 50 ميكرولتر من ترايتون X-100 إلى 9.5 مل من PBS. املأ حتى 10 مل للحصول على تركيز نهائي 0.5٪ (v/v) ترايتون X-100. خزن عند 4 درجات مئوية واستخدم خلال شهر واحد.
    5. جهز 50 مل من محلول التألق المناعي (IF) بإضافة 50 ميكروغرام من ألبومين مصل البقر (BSA)، و100 ميكرولتر من ترايتون X-100، و25 ميكرولتر من Tween-20 إلى 45 مل من PBS. املأ حتى 50 مل للحصول على تركيز نهائي 0.1٪ (مع الحمض الحيوي)، 0.2٪ (مع الفتحة) ترايتون X-100، و0.05٪ (الحص/الفتح) Tween-20. خزن عند 4 درجات مئوية واستخدم خلال شهر واحد.
    6. جهز 10 مل من محلول العزل عن طريق إضافة 1 مل من مصل الحيوانات إلى 9 مل من محلول IF للحصول على تركيز نهائي 10٪ من المصل. خزن عند 4 درجات مئوية واستخدم خلال شهر واحد.
      ملاحظة: تعتمد هوية نوع المصل على نوع العائل للأجسام المضادة الفلورية الثانوية المستخدمة (انظر 2.2.4).
    7. إذابة جل ECM (تركيز البروتين الكلي ~9-9.5 ملغ/مل) عند 4 درجات مئوية خلال الليل. جهز 500 ميكرولتر أليكوت في أنابيب طرد مركزي دقيقة بسعة 1.5 مل وتخزينها عند -20 درجة مئوية.
      ملاحظة: جل ECM متغير للغاية ويجب التحقق منه لتحفيز السلوك المتوقع في كل نوع من الخلايا. قد تتطلب أنواع الخلايا المختلفة تركيزات بروتينية مختلفة أو صلابة مصفوفة.
      ملاحظة: استخدم دائما رؤوس وأوطاف الماصة المبردة مسبقا عند التعامل مع جل ECM لتجنب البلمرة في درجة حرارة الغرفة. دائما حافظ على جل ECM على التجميد أثناء التعامل.
  2. تمايز الخلايا الدهنية
    1. زرع 50,000 إلى 80,000 خلية دهنية 3T3-L1 في 0.5 مل من وسط نمو قياسي في بئرين من شريحة حجرة بأربع آبار. ستستخدم الآبار الفارغة للتحكم في الوسائط بدون دهون ووسائل تكييف.
      ملاحظة: مزرعة خلايا الانزلاق الحجرة معرضة للاضطرابات الميكانيكية. تجنب شفط الوسائط بالفراغ واستخدم تقنية التوصيل اللطيفة باستخدام الماصات اليدوية.
    2. زرع 50,000 إلى 80,000 خلية دهنية أولية من 3T3-L1 في 0.5 مل من وسط نمو قياسي في بئر واحد من صفيحة زراعة نسيج مكونة من 24 بئرا. سيستخدم هذا لجمع الوسائط المكيفة للتحكم في الوسائط المشرطة.
    3. دع كلتا الثقافتين تصل إلى التقاء 100٪ خلال 24 ساعة.
    4. ابدأ تكوين الدهون عن طريق استبدال وسط النمو بوسط بدء تكوين الدهن، يتكون من DMEM مدعوم ب 10٪ FBS، و0.5 mM 3-isobutyl-1-methylxantine (IBMX)، و1 ميكرومولار ديكساميثازون. حضن الخلايا لمدة 48 ساعة عند 37 درجة مئوية في حاضنة بتركيزثاني أكسيد الكربون 5٪.
    5. بعد 48 ساعة، استبدل الوسط المستهلك بوسط تطور التكوين الدهني الطازج، المكون من DMEM مع 10٪ FBS و10 ميكروغرام/مل من الأنسولين. احتضن الخلايا لمدة 48 ساعة أخرى عند 37 درجة مئوية في حاضنة تحتوي على ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪.
    6. قبل الاستمرار في الزراعة المشتركة ثلاثية الأبعاد، تأكد بصريا من وجود قطرات الدهون في >60٪ من الخلايا. إذا كان تراكم قطرات الدهون بطيئا، استبدل وسط التقدم ب DMEM مع 10٪ FBS وراقب محتوى الدهون كل 24 ساعة.
  3. التراكب والصيانة للثقافة ثلاثية الأبعاد
    1. قم بإذابة جل ECM عند 4 درجات مئوية خلال الليل قبل الاستمرار في وضع التداخل.
      ملاحظة: لتجنب تأثيرات التباين بين الدفعات، ينصح باستخدام نفس كمية جل ECM لجميع التجارب ضمن دراسة واحدة.
    2. بعد التمايز الناجح ل 3T3-L1s، إزالة وسط الزراعة المستهلكة، تاركا عازما صغيرا ~50 ميكرولتر من الوسط.
    3. أضف بعناية 110 ميكرولتر من جل ECM إلى كل بئر يحتوي على الخلايا الدهنية في شريحة الحجرة، مع الحرص على عدم إزعاج طبقة الخلايا الدهنية الأحادية.
      ملاحظة: جل ECM يتجمد بسرعة عند درجة حرارة الغرفة. لتجنب بلمرة المصفوفات المبكرة، احتفظ دائما بجل ECM على الثلج واستخدم الأطراف المبردة مسبقا عند -20 درجة مئوية.
    4. أضف 110 ميكرولتر من جل ECM إلى بئر التحكم الخالي من الخلايا الدهنية الفارغ. لضمان توزيع متساو من الماتريجيل، أضف القطرات في زوايا البئر ووسط البئر. استخدم طرف الماصة لنشر المادة بلطف على سطح الزراعة دون كشط.
    5. حضن السلايد لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية للسماح لهلام ECM بالبلمرة.
    6. خلال هذه الخطوة الحضانة، يتم جمع وعدد خلايا MDA-MB-231
      اختياري: راجع الخطوة 1.4 لمزيد من التفاصيل حول وضع العلامات الفلورية على هذه المناطق.
    7. جهز معلقا مخففا لخلايا MDA-MB-231 عند 30,000 خلية/مل في وسط نمو الثدي يحتوي على 2٪ جل ECM (v/v).
      ملاحظة: تختلف كثافة البذر المثلى للخلايا بين أنواع الخلايا ويجب تحسينها قبل التجربة. ملاحظة: وسط نمو الثدي هو وسط زراعة خلوية متوفر تجاريا محسن لخلايا الظهارة الثديية. يحتوي على 0.4٪ مستخلص الغدة النخامية البقرية، و10 نانوغرام/مل عامل نمو البشرة (الإنسان المؤتلف)، و5 ميكروغرام/مل إنسولين (إنسولين مؤتلف)، و0.5 ميكروغرام/مل هيدروكورتيزون. يجب اختيار وسط الزراعة المشتركة بعناية ليناسب احتياجات كلا نوعي الخلايا.
    8. بعد أن يبلمر جل ECM، أضف بلطف 450 ميكرولتر من تعليق MDA-MB-231 إلى كل بئر. ينتج عن ذلك إجمالي عدد الخلايا 13,500 خلية في البئر.
      ملاحظة: وجود تراكب غير متساو لتعليق الخلية فوق الجل هو احتمال في هذه الخطوة. قيم جوانب الحجرة بصريا واضغط بلطف على جميع جوانب الحجرة لتوزيعها بشكل متساو.
    9. أضف إلى مزرعة الخلايا الدهنية على صفيحة 24 بئرا، أضف 450 ميكرولتر من وسط نمو الثدي الذي يحتوي على 2٪ جل ECM (v/v). احصد وغير الوسائط كل 48 ساعة.
    10. حافظ على الثقافة المشتركة لمدة لا تتجاوز 5 أيام، مع تغييرات إعلامية كل 48 ساعة.
      ملاحظة: امتنع عن شفط الفراغ واستخدم التوصيل اللطيف بالماصات. انفصال جل ECM هو مشكلة محتملة قد تظهر أثناء صيانة الزراعة المشتركة.
    11. للتحكم الجيد فقط في الوسائط المحالية، قام بتخفيفة التخزين الدهني المحصودة (من الخطوة 1.3.9) بتعديل الوسائط المحالفة 1:1 مع وسائط جديدة قبل استبدال وسائط الزراعة المشتركة المستهلكة في اليومين الثاني والرابع.
      ملاحظة: في هذه المرحلة، تنتهي فترة الزراعة المشتركة ويجب تحليلها إما عن طريق تثبيت وتلوين الثقافات لتحديد شكل الأشكال وتعبير العلامات (انظر القسم 2) أو باستخراج الخلايا من بيئة الزراعة المشتركة وتحضير الخلايا للتحليل لاحقا (انظر القسم 3).
  4. وضع العلامات على الخلايا الفلورية (اختياري)
    ملاحظة: يمكن إجراء وسم الخلايا المتراكبة قبل الخطوة 1.3.7 للمساعدة في تحديد الخلايا المتراكبة أثناء التقاط صور التألق المناعي.
    1. تحضير محلول مخزون بحجم 5 ملليموتر من كربوكسي فلوريسين دي أسيتات سوكسنيميديل إستر (CFSE) عن طريق إذابة 10 ملغ من CFSE في 4.22 مل من DMSO. تخزين في 500 ميكرولتر أليكوات عند -20 درجة مئوية، محمية من الضوء.
    2. بعد عد الخلايا من الخطوة 1.3.6، اغسل الخلايا مرة واحدة ب 5 مل من PBS. أعد تعليق الحبيبة الناتجة في 1x PBS إلى تركيز نهائي يبلغ 1,000,000 خلية/مل.
    3. أضف 1 ميكرولتر من 5 مللي مولار CFSE لكل مل من تعليق الخلية لتحقيق تركيز عمل نهائي يبلغ 5 ميكرومتر. حضن تعليق الخلية لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، محميا من الضوء.
    4. قم بتبريد صبغة CFSE بإضافة 5 مجلدات من وسط الزراعة. حضن لمدة 5 دقائق إضافية في درجة حرارة الغرفة.
    5. استخدم خلايا الحبيبات واغسله مرتين باستخدام PBS لإزالة بقايا CFSE. أعد تعليق الخلايا في وسط نمو الثدي المسبق التسخين. حضن لمدة 10 دقائق إضافية في درجة حرارة الغرفة لضمان عدم بقاء صبغة.
    6. الخلايا الموسومة بالفلورية كما هو موضح في الخطوة 1.3.7. يمكن تنفيذ بقية البروتوكول كما هو موضح.

2. التوهج المناعي

  1. التثبيت
    ملاحظة: لتجنب إزالة بلمرة جل ECM وفقدان العينات أثناء الغسيل، اترك جميع الكواشف لتتوازن مع درجة حرارة الغرفة لمدة ~30 دقيقة قبل الاستخدام.
    1. بعد 5 أيام من الزراعة المشتركة، استبدل الوسائط ب 500 ميكرولتر من PBS.
      ملاحظة: يمكن تنفيذ الخطوات من 2.1.2 إلى 2.3.7 في ظروف غير معقمة.
    2. قم بإزالة PBS واستبدله ب 2٪ بارافورمالديهيد (PFA) في PBS (طازج) في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.
      ملاحظة: جل ECM حساس لPFA وقد يؤدي إلى انفصال طبقة الجل.
      تحذير: يتحلل PFA إلى الفورمالديهايد مع مرور الوقت. تجنب استنشاق الأبخرة، وتأكد من التهوية الكافية، وارتد دائما معدات الحماية الشخصية المناسبة (مثل القفازات، معطف المختبر، واقي العين) عند التعامل مع PFA.
    3. قم بإزالة PFA واغسل الآبار بمحلول غسيل PBS-Glycine سعة 500 ميكرولتر لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع تحريك لطيف.
      ملاحظة: استخدام غسول PBS-Glycine ضروري لمنع الألدهيدات الحرة من إنتاج التألق الخلفي. لا تغسل في PBS بدون جليسين.
    4. كرر الخطوة 2.1.3 مرتين ليصبح المجموع ثلاث غسولات. راجع 2.1.5 لشروط التخزين، وتخطى إلى الخطوة 2.2.2 إذا لم تكن هناك حاجة لذلك.
    5. في هذه المرحلة، يمكن إيقاف البروتوكول لمدة تصل إلى أسبوع، ويمكن تخزين الشريحة عند 4 درجات مئوية. لتخزين الشريحة، املأ جميع الآبار ب 1 مل من PBS، وأغلق غطاء شريحة الحجرة بشريط رفيع من البارافيلم. ضع السلايد بشكل مسطح في وعاء مقاوم للضوء، فوق منديل رقيق مبلل لضمان عدم جفاف الزرعات.
  2. صبغة الأجسام المضادة
    1. ارفع شرائح التخزين مسبقا إلى درجة حرارة الغرفة، وأزل PBS، واغسل الآبار ب 500 ميكرولتر من PBS الطازج لمدة 15 دقيقة مع تحريك لطيف. تجاوز هذه الخطوة إذا استمريت مباشرة من الخطوة 2.1.4.
    2. نفي الخلايا بمحلول نفاذي 500 ميكرولتر لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة دون تحريك.
    3. غسل الآبار ب 500 ميكرولتر من PBS، مع 15 دقيقة من التحريك الخفيف. كرر ذلك مرتين ليصبح المجموع 3 غسولات.
    4. أضف 500 ميكرولتر من الحاجز الحاجز إلى كل بئر وحضن لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة مع تحريك لطيف.
      ملاحظة: تأكد من أن نوع المصدر للمصل في المخزن الحاجز يطابق نوع المضيف للأجسام المضادة الثانوية. في هذا البروتوكول، نستخدم مصل الحمار والأجسام المضادة الثانوية للحمار.
    5. تخفيف الأجسام المضادة الأولية ذات الاهتمام في محلول الصيام المتقطع، وفقا لتوصيات الشركة المصنعة. أزل المحلول الحاجز وأضف 300 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة المخفف إلى كل بئر.
    6. أغلق غطاء شريحة الحجرة بطبقة بارافيلم وضع الشريحة في حاوية مقاومة للضوء. حضن الحوض طوال الليل عند درجة حرارة 4 درجات مئوية مع تحريك لطيف.
    7. غسل الآبار ب 500 ميكرولتر من محلول IF، مع 15 دقيقة من التحريك اللطيف. كرر ذلك مرتين ليصبح المجموع 3 غسولات.
    8. قم بتخفيف الأجسام المضادة الثانوية الموسومة بالفلورسنت المناسبة في مخزن الصيام الصامت، وفقا لتوصيات الشركة المصنعة. أضف 300 ميكرولتر من تخفيف الأجسام المضادة الثانوية إلى كل بئر وحضنه لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة مع تحريك لطيف.
      ملاحظة: تجنب التعرض المطول للضوء بعد هذه الخطوة للحد من التبييض الضوئي.
    9. كرر الخطوة 2.2.7.
    10. قم بتخفيف محلول مخزن بحجم 300 ميكرومولار من 4',6-دياميدينو-2-فينيل إندول (DAPI) بحجم 1:800 في PBS. أضف 300 ميكرولتر إلى كل بئر وحضن لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، مع تحريك لطيف.
    11. اغسل الخلايا ب 500 ميكرولتر من PBS لمدة 5 دقائق مع تحريك لطيف. كرر مرة واحدة.
  3. تركيب الشريحة
    1. قم بإزالة أكبر قدر ممكن من بقية PBS دون إزعاج الثقافات. استبدل الغطاء وافصل الحجرة عن شريحة الزجاج باستخدام الأداة التي توفرها شركة تصنيع شرائح الحجرة.
    2. باستخدام منديل دقيق، امسح حواف الشريحة لإزالة بقية PBS دون الإخلال بجل ECM.
    3. قم بأنبوب السيليكون بأنبوب حول حواف السلايد باستخدام حقنة وإبرة 18 جالون. اترك 3 دقائق حتى يتماسك السيليكون.
    4. أثناء تثبيت السيليكون، أضف 1-2 قطرة من وسائط تثبيت مضاد التصبغ إلى كل بئر. تجنب الفقاعات. إذا تكونت فقاعات، استخدم الماصة لإزالتها بعناية دون الإلحاق بالضرر بالزراعة.
    5. بعد أن يثبت السيليكون، أنزل غطاء زجاجي بزاوية ضحلة بلطف قليلا. استخدم الملقط أو رأس الماصة لطرد فقاعات الهواء أثناء خفض غطاء الغطاء. استخدم ضغطا لطيفا لتجنب تحطيم غطاء الدرج.
    6. ضع الشريحة في وعاء مقاوم للضوء في درجة حرارة الغرفة واتركها تستقر طوال الليل. يمكن بعد ذلك تخزين الشريحة عند 4 درجات مئوية، ويتوقف البروتوكول لمدة تصل إلى أسبوع.
      ملاحظة (اختياري): لإغلاق الشرائح بشكل أفضل، ضع طلاء أظافر شفاف على حواف الغطاء بعد ساعة من الانزلاق الغطائي.
    7. شرائح الصور باستخدام مجهر فلوري كونفوكالي بتكبير 10-20x. التقاط خمسة مجالات رؤية عشوائية لتقليل انحياز المشغل.

3. جمع الزراعة المشتركة للتحليل اللاحق

ملاحظة: جمع الخلايا أو الجزيئات الحيوية لا يتوافق مع التألق المناعي. يوصى بزراعة الزراعة المشتركة المخصصة لتحليلات أخرى لاحقة في أطباق زراعة قياسية ب24 بئرا باستخدام نفس تركيزات وأحجام الخلايا الموضحة في القسمين 1 و2.

  1. استخراج الخلايا
    1. أزل الوسائط المستهلكة واغسل الآبار بلطف باستخدام PBS البارد جدا. كرر ذلك مرة واحدة ليصبح مجموع غسلتين.
    2. باستخدام رأس ماصة عريض السبطانة، أضف 1 مل من محلول استعادة الخلايا الباردة جدا، والذي يشار إليه هنا بمحلول الاسترداد. استخدم الماصة بلطف للأعلى والأسفل لتعطيل طبقة جل ECM. انقل السائل إلى أنبوب طرد مركزي دقيق بسعة 1.5 مل.
      ملاحظة: محلول استعادة الخلايا هو محلول غير إنزيمي متوفر تجاريا مصمم لتحرير الخلايا المدمجة في جل ECM بلطف. إنه تركيب خاص وقد يكون غير متوافق مع بعض أنواع الخلايا. كبديل، يمكن النظر في إزالة البلمرة الإنزيمية لجل ECM باستخدام بروتينات لطيفة مثل ديسباز أو أكيوتاز. سيتطلب ذلك حضانة بمعدل 37 درجة مئوية مع تحسين وقت الحضانة.
    3. أضف 250 ميكرولتر من محلول الاسترداد البارد الجليدي إلى كل بئر لجمع أي خلايا متبقية. انتقل إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق المقابل.
    4. قلب الأنابيب 4-5 مرات لخلطها.
    5. انقل الأنابيب إلى الثلج وحضن لمدة 60 دقيقة مع تحريك لطيف. كل 10 دقائق، قم بقلب الأنابيب 2-3 مرات لمنع ترسيب محتويات الأنبوب.
    6. أنابيب الطرد المركزي عند 300 × g لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية
    7. تحقق من وجود حبيبة خلوية مرئية. أزل السوبرناتانت بعناية وأضف 1 مل من البارد المثلج 1x PBS. الطرد المركزي عند 300 × جرام لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. كرر ذلك مرة واحدة ليصبح مجموع غسلتين. توقع أن تحتوي الحبيبة على 80-90٪ من الخلايا التي تم بذرها في البداية، مع بقاء نسب كل نوع من الخلايا ثابتة.
      ملاحظة: في هذه المرحلة، يمكن تحلل حبيبات الخلية لجمع البروتين أو الأحماض النووية. يمكن تخزين الحبيبات المتحللة عند -80 درجة مئوية، ويمكن إيقاف البروتوكول لمدة 3 أشهر. Lysis غير متوافق مع 3.2.
  2. تحضير نظام التعليق أحادي الخلية
    1. أعد تعليق الحبيبات في 200 ميكرولتر من 0.25٪ تريبسين-إيدتا. ثم حضن على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 3-4 دقائق.
    2. أضف 600 ميكرولتر من وسط النمو الكامل لتبريد هضم التربسين.
    3. الطرد المركزي عند حرارة 300 × جرام لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. أزل المادة الفائقة وأضف 500 ميكرولتر من PBS بدرجة حرارة الغرفة.
    4. الطرد المركزي عند حرارة 300 × جرام لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. كرر ذلك مرة واحدة ليصبح مجموع غسلتين.
    5. أعد تعليق الحبيبات في 80 ميكرولتر من PBS مع 0.04٪ BSA، مع تعليق فلتر باستخدام مصفاة خلية بحجم 40 ميكرومتر.
    6. تخفيف 5 ميكرولتر من التعليق في 5 ميكرولتر من اللون الأزرق التريباني. عد الخلايا وقيم القدرة على البقاء على جهاز قياس الدم. الخلايا جاهزة الآن للتحليل اللاحق.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لإثبات فعالية هذا البروتوكول في دراسة تأثيرات تفاعلات الخلية مع الخلايا عبر الغشاء القاعدي، تم إعادة استخدام الشكل 2 والشكل 3 من منشور سابق (Pallegar وآخرون 16) كنتائج تمثيلية. الشكل 4 والشكل 5 هما بيانات جديدة تم إنشاؤها لإثبات قدرة هذا البروتوكول على التكيف مع الخلايا غير سرطانية الثدي والقدرة على استخراج الخلايا من بيئة الزراعة المشتركة لاستخد...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يبرز غياب التفاعلات المعقدة بين الخلايا في الزراعة التقليدية للخلايا الحاجة إلى نماذج محسنة للأعضاء والأنسجة لدراسة استجابات الأدوية وتطور المرض بدقة أكبر. ساهم تطوير أنظمة الزراعة المشتركة ثلاثية الأبعاد في سد هذه الفجوة من خلال السماح بدراسة عواقب تفاعلات الخلايا والخلايا دون الحاجة إلى دراسات حية 9,12. ومع ذلك، يمكن أن تكون العديد من هذه الطرق معقدة ميكانيكيا، وتتطلب موارد ووقتا وخبرة تقنية كبيرة، لإعداد

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المؤلفون لا يفرضون أي تضارب مصالح.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تمويل تطوير هذه الطريقة جزئيا من قبل جمعية أبحاث السرطان. تلقت GRK الدعم من خلال تمويل من منحة كارول آن كول للدراسات العليا التابعة لجمعية السرطان الكندية من خلال برنامج تدريب أبحاث السرطان في معهد بياتريس هانتر لأبحاث السرطان. حظي PMMB بدعم من منحة برنامج MOBILITAS (2024) من معهد أبحاث الصحة في جزر البليار (IdISBa). تم إنشاء الشكل 1 باستخدام BioRender.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
لوحة زراعة نسيج البئر 24كورنينغ3524
زجاج غطاء 24 × 60 ممألتيدنت ساينتيفك170-C2460
4٪ بارافورمالديهيد في PBSإنفيتروجينJ61899. AKتم تخفيفه إلى 2٪ في 1x PBS
شرائح الزراعة ذات الحجرة الأربع جيشفالكون354114
أليكسا فلور 647 أفيني بيور فاب فريجمنت حمار مضاد للماعز IgG (H+L)مختبرات جاكسون للأبحاث المناعية المحدودة.705-607-003
مقياس الهيماسيتوميتر الساطعهاوسر العلمي3120
مجموعة انتشار CFSE من CellTraceإنفيتروجينC34570
حل استعادة الخلاياكورنينغ354253
DAPIشركة سيغما-ألدرتش كنداD9542
جسم مضاد ثانوي ممتص عبر الفئران IgG (H+L) من نوع Donkey Anti-Mouse IgG، DyLight 594إنفيتروجينSA5-10168
الأجسام المضادة الثانوية عالية الامتصاص المتقاطع من نوع Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)، أليكسا فلور 647إنفيتروجينA31573
DMEM/F-12، لا يوجد فينول أحمرجيبكو21041025
وسط النسر المعدل، عالي الجلوكوز، بيروفاتجيبكو11995-065
مصل البقر الجنني، أصل كنداجيبكو12483-020
مصفاة فلومي للخلايا، 40 وميكرو؛ Mبيل-آرت136800040
نافذة وباب السيليكون المتقدم من GE، شفافهينكل إنترناشونال2811093
مضاد ZO-1 متعدد النسيال للماعزسانتاكروز للتكنولوجيا الحيويةSC8146الجسم المضاد الأولي، تم إيقافه
فأر وحيد النسيلة المضادة ZO-1سانتاكروز للتكنولوجيا الحيويةSC33725جسم مضاد أولي بديل ليحل محل SC8416 مضاد ZO-1 المتوقف عن العمل
الوسط القاعدي لخلايا ظهارية الثدييةبروموسيلC-21210
ماتريجيل، خالي من الفينول الأحمر، عامل النمو منخفض، خالي من LDEVكورنينغ356231تركيز البروتين: 9-9.6 ملغ/مل
مضاد فيمنتين أحادي النسيلة للفأرشركة سيغما-ألدرتش كنداV2258الجسم المضاد الأولي
مصل العجل حديث الولادة، أصل نيوزيلنداجيبكو16010159
البنسلين-ستربتوميسينجيبكو15140-122
محلول ملحي مخزن بالفوسفات، درجة حموضة 7.4جيبكو10010023
تركيب برو لونغ الذهبي المضاد للتصبغإنفيتروجينP36934
فأر منقي ضد إي-كاديرينبكالوريوس العلوم الحيوية610181الجسم المضاد الأولي
رابيت متعدد النسيال مضاد كلودين 7 أبكامAB27487الجسم المضاد الأولي
RPMI 1640، الجلوتامينجيبكو11875-093
SupplementMixبروموسيلC-39115
صبغة تريبان الزرقاء (0.4٪)جيبكو15250-061
Trypsin 0.25٪-EDTAجيبكو25200056

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kapałczyńska, M., et al. 2D and 3D cell cultures - a comparison of different types of cancer cell cultures. Archives of medical science: AMS. 14 (4), 910-919 (2018).
  2. Birgersdotter, A., Sandberg, R., Ernberg, I. Gene expression perturbation in vitro--a growing case for three-dimensional (3D) culture systems. Seminars in Cancer Biology. 15 (5), 405-412 (2005).
  3. Petersen, O. W., Rønnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bissell, M. J. Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (19), 9064-9068 (1992).
  4. Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).
  5. Lagies, S., et al. Cells grown in three-dimensional spheroids mirror in vivo metabolic response of epithelial cells. Communications Biology. 3 (1), 246(2020).
  6. Egeblad, M., Nakasone, E. S., Werb, Z. Tumors as organs: complex tissues that interface with the entire organism. Developmental Cell. 18 (6), 884-901 (2010).
  7. Su, J., et al. Cell-cell communication: new insights and clinical implications. Signal Transduction and Targeted Therapy. 9 (1), 196(2024).
  8. Anderson, N. M., Simon, M. C. The tumor microenvironment. Current biology: CB. 30 (16), R921-R925 (2020).
  9. Abuwatfa, W. H., Pitt, W. G., Husseini, G. A. Scaffold-based 3D cell culture models in cancer research. Journal of Biomedical Science. 31 (1), 7(2024).
  10. Noel, G., et al. A primary human macrophage-enteroid co-culture model to investigate mucosal gut physiology and host-pathogen interactions. Scientific Reports. 7 (1), 45270(2017).
  11. Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H., Bissell, M. J. Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells. Nature Methods. 4 (4), 359-365 (2007).
  12. Leung, C. M., et al. A guide to the organ-on-a-chip. Nature Reviews Methods Primers. 2 (1), 33(2022).
  13. Srivastava, S. K., Foo, G. W., Aggarwal, N., Chang, M. W. Organ-on-chip technology: Opportunities and challenges. Biotechnology Notes. 5, 8-12 (2024).
  14. Gu, P., Xu, A. Interplay between adipose tissue and blood vessels in obesity and vascular dysfunction. Reviews in Endocrine & Metabolic Disorders. 14 (1), 49-58 (2013).
  15. Noel, V., Berry, M. D. Culture of Adherent Cancer Cell Lines. Cancer Cell Biology: Methods and Protocols. , 19-29 (2022).
  16. Pallegar, N. K., Garland, C. J., Mahendralingam, M., Viloria-Petit, A. M., Christian, S. L. A Novel 3-Dimensional Co-culture Method Reveals a Partial Mesenchymal to Epithelial Transition in Breast Cancer Cells Induced by Adipocytes. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 24 (1), 85-97 (2019).
  17. Martin, T. A., Ye, L., Sanders, A. J., Lane, J., Jiang, W. G. Cancer Invasion and Metastasis: Molecular and Cellular Perspective. Madame Curie Bioscience Database [Internet]. , https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK164700/ (2013).
  18. Ma, W., Tavakoli, T., Derby, E., Serebryakova, Y., Rao, M. S., Mattson, M. P. Cell-extracellular matrix interactions regulate neural differentiation of human embryonic stem cells. BMC developmental biology. 8, 90(2008).
  19. Kim, Y. J., Lee, H. S., Kim, D., Byun, H. K., Koom, W. S., Koh, W. Bilayer 3D co-culture platform inducing the differentiation of normal fibroblasts into cancer-associated fibroblast like cells: New in vitro source to obtain cancer-associated fibroblasts. Bioengineering & Translational Medicine. 10 (1), e10708(2024).
  20. Sourouni, M., et al. Establishment of a 3D co-culture model to investigate the role of primary fibroblasts in ductal carcinoma in situ of the breast. Cancer Reports. 6 (4), e1771(2023).
  21. Salimbeigi, G., Vrana, N. E., Ghaemmaghami, A. M., Huri, P. Y., McGuinness, G. B. Basement membrane properties and their recapitulation in organ-on-chip applications. Materials Today Bio. 15, 100301(2022).
  22. Xu, K., Buchsbaum, R. J. Isolation of mammary epithelial cells from three-dimensional mixed-cell spheroid co-culture. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (62), e3760(2012).
  23. Ooi, J. Y. Y., Tsang, Y. S., McMahon, L. P., Wong, L. Protocol for in vitro immunofluorescence staining in a Transwell co-culture system. STAR protocols. 6 (4), 104162(2025).
  24. Wallisch, S., et al. Protocol for establishing a coculture with fibroblasts and colorectal cancer organoids. STAR Protocols. 4 (3), 102481(2023).
  25. Ildiz, E. S., Gvozdenovic, A., Kovacs, W. J., Aceto, N. Travelling under pressure - hypoxia and shear stress in the metastatic journey. Clinical & Experimental Metastasis. 40 (5), 375-394 (2023).
  26. Vukicevic, S., Kleinman, H. K., Luyten, F. P., Roberts, A. B., Roche, N. S., Reddi, A. H. Identification of multiple active growth factors in basement membrane Matrigel suggests caution in interpretation of cellular activity related to extracellular matrix components. Experimental Cell Research. 202 (1), 1-8 (1992).
  27. Kozlowski, M. T., Crook, C. J., Ku, H. T. Towards organoid culture without Matrigel. Communications Biology. 4 (1), 1387(2021).
  28. Ahmad, Z., et al. Versatility of Hydrogels: From Synthetic Strategies, Classification, and Properties to Biomedical Applications. Gels. 8 (3), 167(2022).
  29. Jinka, R., Kapoor, R., Sistla, P. G., Raj, T. A., Pande, G. Alterations in Cell-Extracellular Matrix Interactions during Progression of Cancers. International Journal of Cell Biology. 2012, 219196(2012).
  30. Short, A. R., Czeisler, C., Stocker, B., Cole, S., Otero, J. J., Winter, J. O. Imaging Cell-Matrix Interactions in 3D Collagen Hydrogel Culture Systems. Macromolecular Bioscience. 17 (6), (2017).
  31. Zeng, F., Yang, W., Huang, J., Chen, Y., Chen, Y. Determination of the lowest concentrations of aldehyde fixatives for completely fixing various cellular structures by real-time imaging and quantification. Histochemistry and Cell Biology. 139 (5), 735-749 (2013).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Three Dimensional Co CultureBasement MembraneIndirect Cell InteractionsCell Cell CommunicationExtracellular MatrixBiomimetic ModelImmunofluorescence AnalysisMorphological ChangesIn Vitro Cell CultureMatrigel Scaffold
Video Coming Soon

Related Articles