يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

يتيح التحليل الكمي للحساسات الحيوية المعتمدة على FRET في الأرابيدوبسيس ثاليانا القياس الحي للمحللات في المناطق تحت الخلوية

365 مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/70028

⸱

فبراير 24, 2026

 , 
1Department of Biology, Texas A&M University

في هذه المقالة

ملخص

نقدم بروتوكولا للتحليل الكمي للجزيئات أو الأيونات في أقسام الخلايا الحية تحت الخلوية باستخدام أجهزة استشعار نقل طاقة الرنين الفورستر (FRET). يشمل التصوير الموحد، ومعالجة الأقنعة الثنائية، والتحليل النسبي مع تطبيق الانحدار الخطي على الفوسفات في الأرابيدوبسيس ثاليانا (A. thaliana)، لكنه قابل للتطبيق بشكل واسع على المستشعرات الحيوية والكائنات الأخرى.

الملخص

توفر أجهزة الاستشعار الحيوية الفلورية نهجا غير جراحي ومتعدد الاستخدامات لمراقبة التغيرات الديناميكية في تركيزات المستقلبات أو الأيونات داخل الخلايا الحية. على وجه التحديد، تمكن أجهزة الاستشعار الحيوية المعتمدة على FRET من قياسات نسبية تبلغ عن مستويات التحليل تحت الخلوي مع استقلالها عن مستويات تعبير المستشعرات الحيوية. نحن نصف بروتوكولا شاملا وموحدا للتحليل الكمي النسبي لأجهزة الاستشعار الحيوية المعتمدة على FRET في النباتات. يوجه البروتوكول المستخدمين من خلال تحضير العينات الحية، والتقاط الصور الكونفوكالية للمتبرعين، وقنوات FRET والمستقبل، وتوليد الأقنعة الثنائية للمناطق تحت الخلوية المعنية، تليها تحليل البيانات النسبية المعتمد على الانحدار. النتيجة الأساسية هي قراءة نسبية مشتقة من الانحدار تتيح المقارنات الكمية بين الأنماط الجينية والأنسجة ومراحل النمو وظروف العلاج. باستخدام المستشعر البيولوجي cpFLIPPi-5.3m للفوسفات غير العضوي كمثال، نظهر قياس مستويات الفوسفات غير العضوية في جروز الأبلاستيد الخضراء في A. thaliana. هذا الإطار التحليلي قابل للتطبيق بشكل واسع على أجهزة الاستشعار الحيوية وأنظمة النماذج المعتمدة على FRET، مما يتيح قياسا دقيقا للمستقلبات والأيونات في الجسم الحي. تقدم هذه الاستراتيجية رؤى قابلة للقياس حول ديناميكيات المستقلبات والأيونات تحت الخلية، وتدعم المقارنات في بيئات تجريبية متنوعة.

المقدمة

مراقبة ديناميكيات المستقلبات والأيونات في خلايا النبات الحية أمر ضروري لفهم كيفية تنسيق المسارات الأيضية وشبكات الإشارات في الزمان والمكان لدعم النمو والتطور 1,2. تتغير مستويات مستقلبات الخلايا بسرعة استجابة للإشارات البيئية مثل توفر المغذيات، شدة الضوء، والإجهاد3. من بين هذه الموارد، يعد مستوى الفوسفات غير العضوي (Pi) مهما بشكل خاص مع أدوار رئيسية في نقل الطاقة، والإشارات، وتنظيم الأيض، ومع ذلك تظل ديناميكيات الخلايا تحت الخلوية صعبة القياس4.

يمكن للاختبارات اللونية القياسية والرنين المغناطيسي النووي للفوسفور-31، (³¹P)-NMR، تقدير Pi الكلي أو المقسم، لكنها تفتقر إلى دقة خلية واحدة وتتمتع بدقة زمنيةمحدودة 5,6. بينما توفر مطياف الأشعة السينية بنظام السينكروترون والتصوير الإشعاعي معلومات تحت الخلوية أو التدفق، إلا أنهما لا يستطيعان التمييز بشكل موثوق بين Pi والمستقلبات المفسفرة وغالبا ما يكونان غازيين. تقدم التحليلات الحركية غير المائية والمعتمدة على الإنزيمات تقديرات غير مباشرة ل Pi البترومي والسيتوسولي، ومع ذلك فإن هذه الأساليب تتطلب جهدا كبيرا وعرضة للتلوث 7,8. معا، تؤكد هذه القيود الحاجة إلى طرق غير مدمرة ذات دقة مكانية وزمنية عالية لمراقبة المستقلبات مثل Pi مثل التصوير الحي لأجهزة الاستشعار الحيوية المعتمدة على FRET.

تعد أجهزة الاستشعار الحيوية المشفرة وراثيا المعتمدة على FRET أدوات قوية لتحليلات داخل الجسم الحي لديناميكيات الأيونات والمستقلبات داخل الخلية. أظهرت الدراسات المبكرة فائدة هذه الحساسات الحيوية في مراقبة تركيزات الجلوكوز والسكروز وATP داخل الخلايا 9,10,11. وقد وسعت التطورات الحديثة هذا النهج ليشمل مراقبة الكالسيوم، والنترات، والفوسفات، والأكسجين، وحمض الأبسيسيك، والجيبريلين، مما يوفر رؤى قيمة حول تنظيم المغذيات والهرمونات 12,13,14,15,16.

cpFLIPPi-5.3m هو مستشعر باي حيوي قائم على FRET، محسن لمراقبة مستويات باي تحت الخلية في خلايا النبات17. يتكون هذا المستشعر البيولوجي من بروتين ارتباط ب Pi ببكتيري السيانو، محاط بمتبرع FRET (eCFP، بروتين فلوري سيان معزز) ومستقبل FRET (cpVenus، وهو نوع معدل من بروتين الزهرة الأصفر الفلوري)، ويخضع لتغير شكلي عند ارتباط باي. يغير هذا التغيير إشارة التألق المشتقة من FRET المعتمدة على Pi والتي تلتقط عبر التصوير الكونفوكلي بحيث تؤدي زيادة تركيز Pi إلى انخفاض نسبة FRET/المتبرع. يتم إجراء تحليل النسبة المعتمدة على باي أثناء معالجة الصور بعد المعالجة بمقارنة شدة انبعاثات المستقبل والمانح18.

يتطلب تحليل FRET الكمي النسبي في أنسجة النباتات الحية تصحيحا للنزيف الطيفي والإثارة المتقاطع للفلوروفورات المانحة (CFP) والمستقبل (cpVenus) على التوالي18. يحدث النزيف الداخلي عندما يتم اكتشاف انبعاث CFP في قناة FRET، بينما ينتج الإثارة المتبادلة نتيجة إثارة cpVenus أثناء إثارة CFP. قد تختلف هذه التشويهات الطيفية عبر الخلايا والمناطق تحت الخلية، خصوصا في أنسجة النباتات المصبوغة، وبالتالي تعقد قياسات النسب القياسية. للحصول على انبعاث FRET مصحح أو معسن، يتم طرح مساهمات النزيف عبر الإثارة والإثارة المتقاطع من إشارة FRET الخام كما يلي:

انبعاث فريت محسس = انبعاث فريت خام - تسرب - إثارة متقاطع

يتم تحديد عوامل التصحيح للنزيف عبر الإثارة المتقاطع عن طريق تصوير النباتات التي تعبر عن CFP أو cpVenus بشكل فردي في نفس المواقع الخلوية وتحت الخلوية مع المستشعرالحيوي 18. ثم يتم حساب انبعاث FRET الحساس كما يلي:

انبعاث FRET المحسس = انبعاث FRET الخام - (انبعاث CFP × عامل تصحيح التسريب عبر النزيف) - (انبعاث كوكب Venus × عامل تصحيح الإثارة المتقاطعة)

تبلغ نسبة انبعاث FRET المحسس إلى انبعاث المتبرع (نسبة FRET) عن تغيرات نسبية في تركيز الليغاند وتكون مستقلة عن مستويات تعبير المستشعر الحيوي19.

تم استهداف المستشعر الحيوي cpFLIPPi-5.3m بنجاح إلى أقسام تحت خلوية مميزة من A. thaliana وأنواع أخرى، مما أتاح تصور ديناميكيات Pi 18,20,21,22. كشف هذا المستشعر البيولوجي عن تباين في توزيع ونقل باي السيتوسولي بين الأنسجة، وربط تقلبات باي البضيضية بنشاط الناقل وأداء التمثيل الضوئي20,21. نظرا لأن المستشعر البيولوجي يبلغ عن التغيرات ضمن نطاق ديناميكي محدد، يتطلب التفسير أن يشمل النطاق مستويات Pi في الجسم الحي تحت ظروف تصوير مستقرة. يمكن أن يؤثر الإضاءة غير المتساوية أو انخفاض كبير في مستشعرات الأحياء على قياسات النسب، مما يبرز أهمية إعدادات الاكتساب الموحدة والتحكم السلبي المناسب مثل حساس التحكم غير الحساس Piرقم 20. عندما يكون تباين نسبة FRET بين مناطق الاهتمام (ROIs) ضئيلا، قد لا يكون تحليل الانحدار مناسبا، وينصح بتجميع متوسطات العائد على الاستثمار.

في هذا المقال، نقدم بروتوكولا مفصلا للتحليل النسبي الكمي ل cpFLIPPi-5.3m في A. thaliana، بما في ذلك التصوير الكونفوكلي، وتقسيم الصور باستخدام الأقنعة الثنائية، وحسابات نسبة FRET للمراقبة الديناميكية ل Pi في الخلايا الحية. توفر هذه الطريقة سير عمل قابل للتكرار لتحليل إشارات المستشعرات الحيوية المعتمدة على FRET، مع تحليل بيانات النسبة المئوية باستخدام الانحدار الخطي والمقارنات الإحصائية عبر ظروف التجريب. تظهر البيانات الممثلة باستخدام تراكم ستروما باي الخضراء المعدلة في pht2؛ 1، متحول ناقل Pi من الأبلاستيد الخضراء يعبر عن حساس cpFLIPPi-5.3m 21,23. سيساعد هذا البروتوكول الباحثين في تطبيق التصوير النسبي المعتمد على FRET على أنظمة تجريبية أخرى من خلال تفصيل تصحيحات الطيف للحساسات الحيوية، وإعدادات التصوير، وخطوات التحليل الكمي. من خلال توحيد اكتساب الصور والتحليل القائم على الانحدار ضمن سياقات تجريبية محددة، يدعم سير العمل المقارنة المتسقة لاستجابات FRET عبر العينات التي تم تحليلها تحت ظروف مطابقة. وهو مناسب لأولئك الذين يسعون لقياس التغيرات السريعة والخاصة بكل قسم في مستويات التحليل في أنسجة النباتات الحية، بما في ذلك الطفرات أو الخطوط المعدلة وراثيا التي تغير نقل أو أيض المستقلبات. سيسهل هذا النهج الموحد إمكانية تكرار دراسات التصوير الكمي للخلايا الحية في علم الأحياء النباتي. بالإضافة إلى الاستشعار الحيوي الموضع بباي الموضعي بالبلاستيدات الخضراء الموضح هنا، يمكن تكييف الاستراتيجية التحليلية مع أجهزة الاستشعار البيولوجية المبنية على FRET وأنسجة خاصة بكائنات بشرط تحديد قياسات المعايرة والتحكم الخاصة بالمستشعرات الحيوية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

ملاحظة: خطوط الأرابيدوبسيس المعدلة وراثيا تعبر عن cpFLIPPi-5.3m و cpFLIPPi-null (المتغيرات السيتوزوليكية والبلاستيدية) تم توليدها سابقا17، 18، و pht2؛ تم الحصول على 1-1 (CS19883) من مركز الموارد البيولوجية أرابيدوبسيس، وسط MS، ونظارات تغطية، وبيرفلوروديكالين، ومجهر كونفوكالي، وهدف غمر زيت 40x (فتحة عددية 1.3)، وليزر الإثارة (CFP/445 نانومتر و cpVenus/515 نانومتر أو أطوال موجية مناسبة للجهاز)، ومرشحات انبعاث ل CFP، cpVenus/FRET، ومستقبل cpVenus، أو كاشاف الكاميرات أو الكواشف، ومحطة عمل تحليل الصور، FIJI24 وExcel.

1 . تحضير العينة

  1. توليد خطوط A. thaliana المعدلة وراثيا
    1. استنساخ مستشعر cpFLIPPi-5.3m، والتحكم في التحكم غير الحساس لباي (cpFLIPPi-Null)، والمتبرع فقط (CFP)، والمستقبل فقط (cpVenus) إلى متجهات تعبير النبات17.
    2. للحصول على تعبير مستقر، قم بتحويل نباتات A. thaliana في خلفية الطفرة sgs3-13 عبر غسيل زهري Agrobacterium tumefaciens ، واحصد بذور T1، واختر المحولات على صفائح أجار موراشيجي وسكوغ (MS) 0.5x تحتوي على عامل الاختيار المناسب، مثل الفوسفينوثريسين (10 ميكروغرام/مل).
    3. قم بتعقيم بذور A. thaliana التي تعبر عن الحساسات الحيوية عن طريق غمرها في 70٪ إيثانول لمدة دقيقة واحدة، ثم انقله إلى 50٪ مبيض لمدة دقيقة، ثم اشطفه 6-10 مرات بماء معقم.
      تحذير: الإيثانول والمبيض هما مهيجان ويجب التعامل معهما أثناء ارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة. قم بتعقيم البذور في غطاء أبخرة كيميائي أو منطقة جيدة التهوية لتجنب استنشاق الأبخرة وعدم خلط المبيض والإيثانول مباشرة. التخلص من محاليل النفايات وفقا لإرشادات السلامة الكيميائية المؤسسية.
    4. قم بتدرج البذور عند درجة حرارة 4 درجات مئوية في الظلام لمدة 2-3 أيام لمزامنة الإنبات، ثم نقل البذور إلى وسط متصلب-أجار أو سائل 0.5x MS يحتوي على 0.25٪ سكروز وتركيز باي المطلوب (250 ميكرومول) للتصميم التجريبي. أضف عامل الاختيار عند اختيار المحولات.
    5. الألواح الناقلة إلى غرفة نمو محكمة مضبوطة على 21°C، 16 ساعة ضوء: 8 ساعات ضوئية مظلمة، 120 ميكرومول·م⁻²·ثانية⁻·ثانية شدة ضوء، و~60٪ رطوبة نسبية. ازرع الشتلات لمدة 4-7 أيام لتصوير الجذور أو نقل الشتلات إلى التربة لمدة 21 يوما لتصوير الأوراق.
    6. عند اختبار معالجات باي، انقل الشتلات إلى وسط باي المرغوب (مثلا، 250 ميكرومولار باي لباي مملأ؛ 10 ميكرومولار باي لنقص باي) والحفاظ على المعالجة لفترة محددة (مثلا 48 ساعة لحرمان باي الحاد).
    7. إذا أمكن، قم بفحص النباتات للتعبير الكافي عن المستشعر عن طريق تصوير فلورة المانح أو المستقبل (الإثارة منخفضة الشدة) باستخدام مجهر ستيريو فلوري (تكبير 7-10 أضعاف).
    8. قيم الخطوط في نفس الخلفية الجينية التي تعبر عن cpFLIPPi-null كعناصر تحكم غير حساسة للرابطة.

2 . التصوير الكونفوكلي

  1. بالنسبة للجذور، ضع الشتلات في وسط نموها/ماء معقم على شريحة زجاجية. ضع طبقة صغيرة بلطف لتسطيح الجذور دون ضغط. الصورة فورا.
  2. بالنسبة للأوراق، قم بإزالة الورقة المستهدفة (مثلا الورقة الثالثة أو الرابعة في نباتات عمرها 21 يوما)، وضع السطح المحوري في شريحة منزلقة.
  3. قم بتسريب 10-15 ميكرولتر من البرفلوروديكالين لتنظيف المساحات الهوائية إذا لزم الأمر، ووضع طبقة برفق مع وزن زجاجي صغير لتسطيح العينة. الصورة فورا.
  4. استخدم هدفا عالي الحمض النووي المناسب للخلايا الحية (مثلا، 40× / 1.2-1.3 NA). استخدم نفس الهدف لجميع العينات للحفاظ على قابلية المقارنة.
  5. باستخدام برنامج Metamorph، قم بضبط قنوات الإثارة والانبعاث والتقاط الصور (الشكل 1).
    ملاحظة: لالتقاط انبعاث المانح (CFP): يمكن استخدام الإثارة عند ~445 نانومتر (أو خط CFP مناسب للأجهزة) وجمع انبعاث المتبرع (مثل 470-500 نانومتر من نطاق المرور). على سبيل المثال، تم استخدام إثارة ليزر 445 نانومتر عند 70٪ (الشكل 1A) مع زمن تعريض 1000 مللي ثانية (الشكل 1B) لالتقاط انبعاث CFP. لالتقاط انبعاث المستقبل الحساس (FRET): الإثارة عند طول موجة المانح (445 نانومتر) وجمع نطاق انبعاث المستقبل (مثل 530-560 نانومتر). لالتقاط قناة المستقبل المباشر: الإثارة عند الإثارة المستقبلية (مثلا، 500-515 نانومتر) وجمع نفس نطاق انبعاث المستقبل كما في FRET.
  6. احصل على الصور بالتسلسل: التقاط تحفيز المتبرع/انبعاث المتبرع، الإثارة المتبرعة/انبعاث FRET، ثم استثارة المستقبل/انبعاث المستقبل. حافظ على وقت التصوير لكل حقل قصيرا للحد من التبييض الضوئي (500-1000 مللي ثانية).
    ملاحظة: لكل موقع خلوي (سيتوسول الجذر، السيتوسول الميزوفيل الورقي، الجرومات الخضراء)، حدد القدرة المثلى للليزر، وكسب الكاشف، ووقت التعريض (الشكل 1) بحيث تكون شدة البكسل المتوسطة فوق الخلفية المحلية ولكن أقل من تشبع الكاشف. حافظ على إعدادات التقاط متطابقة لقنوات الإثارة المشتقة من المتبرع (المتبرع وFRET) في موقع معين. تعتمد معايير التصوير على العينة، المجهر، مصدر الضوء، ونظام الكشف، ولذلك يجب تحديدها تجريبيا، مع تقييم وتوثيق النطاقات المقبولة من خلال تحليل الانحدار كما هو موضح في هذا البروتوكول. برنامج التقاط الصور المستخدم هنا هو النسخة 7 من Metamorph.
  7. استخدم نفس حساسية الكاشف (على سبيل المثال، هنا، كسب 2.4x وتم استخدام إزاحة صفرية) عبر جميع الصور لموقع الهدف. إذا استخدمت عدة كواشف، قم بتوصيف الاستجابات الطيفية لكل كاشف ووثقها.
  8. احصل على صور تحكم لكل نسيج/نمط جيني يثير اهتمامه.
    1. صور نسيج من النوع البري غير المتحول لتحديد التألق الذاتي في الخلفية لكل قناة.
    2. نباتات الصور تعبر عن متبرع فقط (CFP) والمستقبل فقط (cpVenus) في نفس إعدادات الالتقاط لكل موقع لاستخلاص معاملات تصحيح الطيف (النزيف عبر الإثارة المتقاطعة). التقط صورا من عدة أفراد (≥6-8) بمجموعة من شدات الانبعاث.

3 . معالجة الصور

  1. افتح الصور الخام لقنوات المتبرع (المشار إليها ب CC لتحفيز/انبعاث المتبرع)، وFRET (المشار إليها باسم CY لإثارة المتبرع/انبعاث المستقبل)، والمستقبل (المشار إليها باسم YY لتحفيز/انبعاث المستقبل) في برامج التحليل مثل FIJI أو ImageJ. (الشكل 2).
  2. تحديد متوسط كثافة الخلفية لكل قناة عن طريق أخذ عينات من عدة (5-10) عائد على الاستثمار في مواقع متكافئة من نباتات غير محولة تم تصويرها بنفس الإعدادات. اطرح متوسط قيمة الخلفية من كل صورة قناة مقابلة.
  3. الخطوات التي يجب اتباعها في فيجي
    1. انقر على تحليل التبويب> وضبط القياسات > اختر متوسط القيمة الرمادية. قس شدة الخلفية باختيار عائد عائد معين أو متوسط للصورة الكاملة.
    2. انقر على تبويب تحليل> قياس. احفظ القيم في جدول بيانات Excel واحسب متوسط قيم الخلفية لكل قناة. حدد عتبة صورة المتبرع (CFP) لتحديد الحد المكاني للحساس الحيوي (عادة ما يكون المتبرع لديه أدنى إشارة). حول صورة المتبرع ذات العتبة إلى قناع ثنائي (الشكل 3 أ).
    3. انقر على صورة التبويب> وضبط> العتبة.
    4. ستفتح نافذة للعتبة. اختر طريقة أقصى إنتروبيا للعتبة. حدد الحد المكاني، وفي هذه الحالة، ستروما البلاستيدات الخضراء، وطبق العتبة. هذا ينتج صورة ثنائية بالأبيض والأسود (الشكل 3 B).
    5. انقر على تبويب الرياضيات> قسمة> أدخل القيمة 255. الصورة ستصبح بيضاء بالكامل. احفظ صورة القناع الثنائي هذه كملف .tiff.
    6. ضرب القناع الثنائي بجميع الصور الثلاث التي طرحت من الخلفية لإنشاء صور مقنعة للتحليل (الشكل 3C).
    7. افتح ملف القناع الثنائي في FIJI.
    8. انقر على تبويب Tab Process> Math>Multiply.
    9. اختر القناع الثنائي كواحدة من الصور وصورة CC المقطوعة من الخلفية كصورة أخرى.
    10. كرر الخطوات ل CY و YY.
    11. ارسم عائد المؤشرات على الصور المقنعة المناسبة للبنية قيد الدراسة (خلية كاملة، رذاذ سيتوسول، سترمال بلاستيد مخضر). لكل عائد على الاستثمار، استخرج متوسط شدة البكسل لقنوات المانح، وFRET، والمستقبل المباشر. حفظ بيانات العائد على الاستثمار (اسم الصورة، الإحداثيات، حالة التجريب، معرف التكرار) للتحليل الإحصائي لاحقا.
    12. افتح صور CC وCY وYY.
    13. انقر على تبويب الرياضيات> اطرح> أدخل متوسط قيمة الخلفية. بدلا من ذلك، يمكن القيام بذلك قبل حساب FRET الحساس في Excel.
    14. افتح ملف CC المقنع.
    15. انقر على تبويب عملية > حاسبة الصورة. ضرب CC بملف صورة CC المقنع. سيفتح هذا ملف صورة جديد بحجم 32 بت.
    16. اسحب العائد على الاستثمار باستخدام أدوات FIJI المناسبة في شريط المهام الرئيسي. على سبيل المثال، هنا يتم اختيار الستروما الخضراء باستخدام أداة ROI "البيضاوي". أضف العائد على الاستثمار إلى مدير العائد (ctrl+T). اختر 5-10 عائد على الاستثمار لكل صورة. افحص "عرض الكل". يمكن تخزين هذه العائد على الاستثمار كملف ميتا منفصل (الشكل 3D). لا تغلق مدير العائد على الاستثمار.
    17. انقر على تحليل التبويب> وحدد القياسات> اختر متوسط القيمة الرمادية.
    18. انقر على "قياس" في مدير العائد على الاستثمار.
    19. ستظهر متوسط قيم البكسل للعائد على المؤشرات المختارة كقائمة في نافذة منفصلة.
    20. انسخ هذه البيانات إلى Excel. لا تغلق مدير العائد على الاستثمار.
    21. كرر ضرب ملف CC المقنع بصور CY و YY للحصول على قياسات لنفس العائد على الاستثمار باستخدام مدير العائد على الاستثمار في كل قناة على حدة. تخزين القيم في إكسل.

4. التحليل النسبي

  1. افتح Microsoft Excel لتنفيذ العمليات التالية (الشكل 4).
  2. حساب معاملات التصحيح.
    1. لكل موقع خلوي، ارسم شدة قناة FRET (محور Y) من النباتات المانحة فقط مقابل شدات المانح (محور X). تناسب الانحدار الخطي. الميل هو معامل تسرب المانح (المشار إليه ب a).
    2. كرر ذلك برسم شدة قناة FRET من محطات المستقبل فقط (محور Y) مقابل شدات المستقبل المباشر (محور X). الميل هو معامل الإثارة المتقاطع للمستقبل (المعين ب b).
    3. استخدم ≥15-20 عائد على الاستثمار من عدة محطات للحصول على معاملات قوية. بالنسبة لستروما الأصفر الصبغي، يتم اختيار 50-60 بلاستيدات خضراء.
  3. احسب معدل التردد السريع الحساس لكل عائد استثمار كالتالي
    FRET الحساس = FRET خام - ( متبرع ×) - (b × المستقبل)
    حيث a و b هما معاملات محددة للموقع مشتقة أعلاه (الشكل 4).
  4. تم تحسيس مخطط FRET (محور Y) مقابل شدة قنوات المانح (محور X) لعائد المؤشرات المجمع. إذا ضبطت انحدارا خطيا، سيوفر Excel توافقا في التنسيق y = mx + c، حيث y تمثل شدات FRET الحساسة، وx لشدات المانح، وc للتقاطع y، وm لميل الانحدار. لاحظ R² للانحدارات الملاءمة. عادة ما يتراوح R² بين 0.8-1، مما يمثل ملاءمة جيدة (الشكل 4).
  5. لقياسات السيتوسوليك والسترومال، احسب واستخدم ميل FRET/المانح (FRET الحساس ÷ المتبرع) كقراءة نسبية ويشار إليها أيضا بنسبة FRET.
    ملاحظة: خطأ الملاءمة للانحدار يمثل الخطأ القياسي للميل (استخدم دالة LINEST في إكسل). استخدم الانتقاء حسب الموقع بشكل متسق عبر العينات والأنماط الجينية التي تهمك. يؤكد تطبيق الانحدار الخطي على بيانات من عدة عائدات استثمار ومحطات مستقلة أن نسبة FRET مستقلة عن وفرة المستشعرات.
  6. المعايرة، والتحكم، وتمييز التأثيرات غير المحددة.
    1. استخدم cpFLIPPi-null (المتغير غير الحساس للليغاند) المعبر عنه بالتوازي ومعالجته بنفس الطريقة لتمييز التغيرات غير المحددة المحتملة في نسبة FRET (الرقم الهيدروجيني، القوة الأيونية، الفيزياء الضوئية) عن التغيرات الخاصة ب Pi.
    2. جمع بيانات على مستوى العائد على الاستثمار مع الحقول: النمط الجيني، الحجرة، معرف النبات المكرر، معرف العائد على الاستثمار، المتبرع، المستقبل، FRET الخام، FRET المحسن، نسبة التركيب (حسب الاقتضاء). حافظ على شدة القوة.
    3. للمقارنات السكانية، استخدم المنحدرات المشتقة من الانحدار كإحصائيات أولية؛ أبلغ عن الانحدارات ± SE ونسبة الخطأ النسبي.
    4. تطبيق الإحصاءات الاستدلالية المناسبة (مثل اختبار t للطالب أو ANOVA) على معلمات مشتقة من الانحدار. استخدم اختبارات غير معلمية إذا كانت التوزيعات تنتهك الطبيعية. صحح عدة مقارنات عند الاقتضاء.
  7. قائمة التحقق من مراقبة الجودة (قبل قبول البيانات)
    1. تأكد من أن جميع القنوات الثلاث لكل صورة أقل من تشبع الكاشف ولديها نسبة إشارة إلى ضوضاء كافية (>2-10x خلفية).
    2. تأكيد أن عناصر التحكم المفردة للفلوروفور المتبرع والمستقبل تم تصويرها في بيئات متطابقة وأعطيت علاقات خطية لاشتقاق معاملي التصحيح a و b.
    3. تأكد من دقة تسجيل الصورة وأن الأقنعة تحدد بشكل صحيح المناطق التي تحتوي على أجهزة الاستشعار الحيوية.
    4. أكد أن cpFLIPPi-null control يظهر نقيبا متوقعا في حساسية Pi.
  8. مقاييس مراقبة الجودة التمثيلية للمساعدة في استبعاد الصور
    1. معدل التشبع: أقل من 1-2٪ من البكسلات تصل إلى أقصى شدة (65,535) للصور ذات 16 بت.
    2. مستوى الخلفية: يتراوح متوسط شدة المرض في المناطق الخالية من الخلايا بين ~50-200 وحدة.
    3. نطاق شدة البكسل: الشدة المتوسطة أعلى بكثير من الخلفية لكنها تبقى تحت التشبع (~2,000-20,000 وحدة).
    4. نسبة الإشارة إلى الضوضاء (SNR): يجب أن تتجاوز القيم 2-10.

5. اختبار إحصائي للفرق بين منحدرين انحداريين

  1. تحديد ما إذا كان هناك ميلان (منحدران مشتق من الانحدار أو نسبة FRET من نوعين جينيين أو معالجتين) يختلفان بشكل ملحوظ25.
  2. احسب إحصائية الاختبار ودرجات الحرية كما يلي
    figure-protocol-1
    مع درجات الحرية df = n1 + n2 - 4. m1 و m2 يتوافقان مع الانحدارات الناتجة عن الانحدار الخطي، وsb1 و sb2 يشيران إلى الخطأ المعياري لكل ميل (مستمدعا من LINEST أو مخرجات الانحدار)، وn1 و n 2 هما أحجام العينة (عدد العائد على الاستثمارات المستخدمة لتناسب كل انحدار).
  3. احصل على قيمة p ذات ذيلين ل t مع df (مثلا، استخدم جدول توزيع t، أو آلة حاسبةإلكترونية 26). عند استخدام الحاسبة الإلكترونية (الشكل 5C)، أدخل sb1 و s b2 و n1 و n2 التي تم الحصول عليها في الخطوة السابقة لحساب قيمة p وإحصائيات الاختبار.
  4. التفسير سيكون رفض الفرضية الصفرية (حيث أن الانحدارات ليست مختلفة بشكل ملحوظ) إذا كان p < α (مثلا، α = 0.05). التقرير b1، b2، sb1، sb2، t، df، و p.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

التصوير الكونفوكلي

باستخدام المجهر الكونفوكلي وبرنامج Metamorph، تم الحصول على قنوات منفصلة لرؤية إشارات المتبرع والمستقبل FRET في أنسجة أوراق A.thaliana من النوع البري (WT) وpht2؛ 1 طفرة ناقلة باي من البلاستيدات الخضراء (الشكل 2). تظهر الصور الممثلة تحديد مواقع واضحة تحت الخلية لحساس باي الحيوي، حيث يمكن تمييز البلاستيدات الخضراء بسهولة ليس فقط داخل الخلايا الفردية بل أيضا بين أنواع الأنسجة المخ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يوفر هذا البروتوكول نهجا موحدا لقياس المستقلبات أو الأيونات في الخلايا الحية باستخدام حساسات حيوية قائمة على FRET. تشمل المزايا الرئيسية قياس النسبة غير الجراحية وقابلية التطبيق على عدة أقسام تحت خلوية17،20،21،22. استخدام الأقنعة الثنائية والانحدار الخطي يحسن الدقة وقابلية التكرار. بينما تم إثبات هنا للباي تحت الخلوي في A. thaliana، فإن الإطار قابل للت...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يصرح المؤلفون بعدم وجود تضارب مصالح مرتبط بهذا العمل.

شكر وتقدير

نشكر مساهمات أعضاء مختبر W.K.V. السابقين، الذين دعمت جهودهم تطوير هذا البروتوكول. تم تقديم الدعم المالي من وزارة الطاقة الأمريكية، مكتب العلوم، برنامج تكنولوجيا التصوير الحيوي (DE-SC0014037) وعلوم الطاقة الأساسية (DE-FG02-04ER15559). تم دعم A.S.R. جزئيا من تمويل معهد هاغلر للدراسات المتقدمة، جامعة تكساس A&M.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
هدف غمر الزيت 40X أوليمبوسhttps://www.edmundoptics.in/p/olympus-uplxapo-40x-oil-immersion-objective/55558/?srsltid=AfmBOoo0cqmgz7SoQ3ZCUvlJn_LeA37O42aX5BbFqF76k40CwQLNVn4Pعدسة موضوعية للتصوير  
نظارات الغطاء / الغطاءVWR48393-081غطاء لوضع العينات
فيجي (ImageJ)المصدر المفتوح2.9.0برنامج تحليل الصور
مجهر أوليمبوس IX81 المقلوبأوليمبوسhttp://www.olympusconfocal.com/brochures/pdfs/ix81.pdfنظام التصوير الكونفوكالي
كاميرا iXon3 897 EMCCD  تكنولوجيا أندورhttps://andor.oxinst.com/products/ixon-emccd-camera-series/ixon-life-897جزء من نظام التصوير الكونفوكالي
برنامج ميتامورف V7الأجهزة الجزيئية. شركة ذات مسؤولية محدودةالإصدار 7محطة عمل تحليل الصور
مايكروسوفت إكسل مجموعة مايكروسوفتالإصدار 16.68برامج تحليل البيانات
موراشيغي & سكوغ (MS) متوسط  كيسونMSP11-10LTوسط نمو النبات
بيرفلوروديكالين (أكروس عضوي)أكروس أورجانيكسP9900-25Gوسيط التصوير
الفوسفينوثريسينسيغما77182-82-2المضاد الحيوي
غرفة نمو النباتكونفيرونالعرفغرفة النمو
وحدة الكونفوكال الدوارة لقرص يوكوغاوا CSU-X1يوكوغاواhttps://www.yokogawa.com/solutions/products-and-services/life-science/spinning-disk-confocal/csu-x1-confocal-scanner-unit/جزء من نظام التصوير الكونفوكالي

المراجع

  1. Frommer, W. B., Davidson, M. W., Campbell, R. E. Genetically encoded biosensors based on engineered fluorescent proteins. Chem Soc Rev. 38 (10), 2833-2841 (2009).
  2. Okumoto, S., Jones, A., Frommer, W. B. Quantitative imaging with fluorescent biosensors. Annu Rev Plant Biol. 63, 663-706 (2012).
  3. Sweetlove, L. J., Fernie, A. R. The role of dynamic enzyme assemblies and substrate channelling in metabolic regulation. Nat Communications. 9 (1), 2136(2018).
  4. Plaxton, W. C., Tran, H. T. Metabolic adaptations of phosphate-starved plants. Plant Physiol. 156 (3), 1006-1015 (2011).
  5. Mimura, T. Regulation of phosphate transport and homeostasis in plant cells. Int. Rev. Cytol. 191, 149-200 (1999).
  6. Roberts, J. K., Wemmer, D., Ray, P. M., Jardetzky, O. Regulation of cytoplasmic and vacuolar pH in maize root tips under different experimental conditions. Plant Physiol. 69 (6), 1344-1347 (1982).
  7. Gerhardt, R., Heldt, H. W. Measurement of subcellular metabolite levels in leaves by fractionation of freeze-stopped material in nonaqueous media. Plant Physiol. 75, 542-547 (1984).
  8. Farquhar, G. D., Caemmerer, S. V., Berry, J. A. A biochemical model of photosynthetic CO2 assimilation in leaves of C3 species. Planta. 149 (1), 78-90 (1980).
  9. Deuschle, K., Chaudhuri, B., Okumoto, S., Lager, I., Lalonde, S., Frommer, W. B. Rapid metabolism of glucose detected with FRET glucose nanosensors in epidermal cells and intact roots of Arabidopsis RNA-silencing mutants. Plant Cell. 18 (9), 2314-2325 (2006).
  10. Fehr, M., Takanaga, H., Ehrhardt, D. W., Frommer, W. B. Evidence for high-capacity bidirectional glucose transport across the endoplasmic reticulum membrane by genetically encoded fluorescence resonance energy transfer nanosensors. Mol Cell Biol. 25 (24), 11102-11112 (2005).
  11. Imamura, H., Nhat, K. P. H., Togowa, H., Noji, H. Visualization of ATP levels inside single living cells with fluorescence resonance energy transfer-based genetically encoded indicators. Proc Natl Acad Sci USA. 106 (37), 15651-15656 (2009).
  12. Lanquar, V., Grossman, G., Vinkenborg, J. L., Merkx, M., Thomine, S., Frommer, W. B. Dynamic imaging of cytosolic zinc in Arabidopsis roots combining FRET sensors and RootChip technology. New Phytol. 202 (1), 198-208 (2014).
  13. Sadoine, M., De Michele, R., Župunski, M., Grossmann, G., Castro-Rodríguez, V. Monitoring nutrients in plants with genetically encoded sensors: achievements and perspectives. Plant Physiol. (1), 195-216 (2023).
  14. Tagliani, A. AuxSens, a FRET-based auxin biosensor. Mol Plant. 14 (7), 1051-1052 (2021).
  15. Rowe, J., Grangé-Guermente, M., Exposito-Rodriguez, M. Next-generation ABACUS biosensors reveal cellular ABA dynamics driving root growth at low aerial humidity. Nat Plants. 9 (7), 1103-1115 (2023).
  16. Rowe, J. H., Rizza, A., Jones, A. M. Quantifying Phytohormones in vivo with FRET Biosensors and the FRETENATOR Analysis Toolset. Meth Mol Biol. 2494, 239-253 (2022).
  17. Mukherjee, P., Banerjee, S., Wheeler, A., Ratliff, L. A., Irigoyen, S., Garcia, L. R., Lockless, S. W., Versaw, W. K. Live imaging of inorganic phosphate in plants with cellular and subcellular resolution. Plant Physiol. 167 (3), 628-638 (2015).
  18. Banerjee, S., Garcia, L. R., Versaw, W. K. Quantitative imaging of FRET-based sensors for cell and organelle-specifc analyses in plants. Microsc Microanal. 22, 300-310 (2016).
  19. Xia, Z., Liu, Y. Reliable and global measurement of fluorescence resonance energy transfer using fluorescence microscopes. Biophys J. 81 (4), 2395-2402 (2001).
  20. Sahu, A., Banerjee, S., Raju, A. S., Chiou, T., Garcia, L. R., Versaw, W. K. Spatial profiles of phosphate in roots indicate developmental control of uptake, recycling, and sequestration. Plant Physiol. 184 (4), 2064-2077 (2020).
  21. Raju, A. S., Kramer, D. M., Versaw, W. K. Genetically manipulated chloroplast stromal phosphate levels alter photosynthetic efficiency. Plant Physiol. 196 (1), 385-396 (2024).
  22. Zhang, S., Daniels, D. A., Ivanov, S., Jurgensen, L., Müller, L. M., Versaw, W. K., Harrison, M. J. A genetically encoded biosensor reveals spatiotemporal variation in cellular phosphate content in Brachypodium distachyon mycorrhizal roots. New Phytol. 234 (5), 1817-1831 (2022).
  23. Versaw, W. K., Harrison, M. J. A chloroplast phosphate transporter, PHT2;1, influences allocation of phosphate within the plant and phosphate-starvation responses. Plant Cell. 14 (8), 1751-1766 (2002).
  24. Schindelin, J., Carreras, I., Frise, E., Kaynig, V., Longair, M., Pietzsch, T., Preibisch, S., Rueden, C., Saalfeld, S., Schmid, B., Tinevez, J., White, D. J., Hartenstein, V., Eliceiri, K., Tomancak, P. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  25. Cohen, J. Applied multiple regression/correlation analysis for the behavioral sciences. , https://psycnet.apa.org/record/2002-18109-000 (2003).
  26. Soper, D. S. Significance of the difference between two slopes calculator. , https://www.danielsoper.com/statcalc (2025).
  27. Castellani, C. M., Torres-Ocampo, A. P., Breffke, J., White, A. B., Chambers, J. J., Stratton, M. M., Maresca, T. J. Live-cell FLIM-FRET using a commercially available system. Meth Cell Biol. 158, 63-89 (2020).
  28. Kanno, S., Cuyas, L., Javot, H., Bligny, R., Gout, E., Dartevelle, T., Hanchi, M., Nakanishi, T. M., Thibaud, M. C., Nussaume, L. Performance and limitations of phosphate quantification: guidelines for plant biologists. Plant and Cell Physiol. 57 (4), 690-706 (2016).
  29. Verma, A. K., Noumani, A., Yadav, A. K., Solanki, P. R. FRET based biosensor: principle applications recent advances and challenges. Diagnostics. 13 (8), 1375(2023).
  30. Banerjee, S., Versaw, W. K., Garcia, L. R. Imaging cellular inorganic phosphate in Caenorhabditis elegans using a genetically encoded FRET-based biosensor. PLoS One. 10 (10), e0141128(2015).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

FRET
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.