مقالة منهجية

استراتيجية متكاملة للميكروبليت وHPTLC لتحديد وتحليل الفينولات والفلافونولات الكلية في مستخلصات قشور الحمضيات

DOI:

10.3791/70034

⸱

مايو 8, 2026

 ,  ,  ,  , 
1Laboratorio de Fitoquímica (LAFIT), Escuela de Química, Universidad Nacional (UNA), 2Herbario Juvenal Valerio, Escuela de Ciencias Ambientales, Universidad Nacional (UNA), 3Laboratorio de Productos Naturales y Ensayos Biológicos (LAPRONEB), Escuela de Química, Universidad Nacional (UNA)

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تقدم هذه الدراسة نهجا مشتركا بين AlCl₃/Folin–Ciocalteu لتحليل وقياس كمية الفلافونولات/5-هيدروكسي فلافونات والمركبات الفينولية في قشور الحمضيات، مدعوما بتحليل الألواح الدقيقة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تساهم المركبات الفينولية والفلافونويدات بشكل كبير في النشاط المضاد للأكسدة والقيمة الوظيفية للمنتجات الثانوية الحمضية. ومع ذلك، فإن اختبارات الألوان التقليدية، رغم استخدامها الواسع، تفتقر إلى الفصل الكروماتوغرافي وقد تتأثر بالتداخلات الكيميائية. يقدم هذا البروتوكول سير عمل تحليلي متكامل يجمع بين اختبارات الميكرولوح المطيعية الضوئية مع الكروماتوغرافيا عالية الأداء للطبقة الرقيقة (HPTLC) لتحديد وتحليل المحتوى الفينولي الكلي (TPC) والفلافونولات الكلية بالإضافة إلى محتوى 5-هيدروكسي فلافونات (TFHC) في مستخلصات قشور الحمضيات. تم تقييم مستخلصات الإيثانول من قشور الجير (Citrus aurantifolia) واليوسفي (Citrus reticulata) باستخدام اختبارات فولين–تشوكالتيو (FC) وكلوريد الألمنيوم (AlCl₃) في صيغة ميكرولوح بسعة 96 بئر، تلاها تحليل HPTLC باستخدام مرحلتين متحركتين متسلسلتين واشتقاق مزدوج بعد الكروماتوغرافيا. أظهرت قياسات الألواح الدقيقة قيم TPC تبلغ 74.2 ملمول/غ للجير و72.8 ملمول/غ لليوسفي، بينما كانت قيم TFHC 15.5 ملمول/جم و6.0 ملمول/جم على التوالي. فصل HPTLC حل أربعة نطاقات فينولية في الجير وستة في اليوسفي. تم تصور شريطين جيريين بشكل انتقائي بعد اشتقاق AlCl₃، متوافقين مع الفلافونولز أو 5-هيدروكسي فلافونات. بلغ مجموع الضرائب الفينولية التي قدرها HPTLC 22.0 و20.8 ملليمول/جم للمادة الجافة للجير واليوسفي على التوالي، بينما بلغ TFHC 13.4 ملليمول/جم في الجير ولم يكتشف في اليوسفي. تظهر هذه النتائج أن اختبارات الألواح الدقيقة توفر تقديرا سريعا وحساسا للمحتوى الكلي، بينما يعزز HPTLC الانتقائية من خلال فصل المركبات واشتقاق المجموعات الوظيفية الخاصة. تتيح الاستراتيجية المشتركة الفحص عالي الإنتاجية يتبعه تأكيد كروماتوغرافي، مما يوفر منصة عملية وقابلة للتكرار لتوصيف الخصائص الكيميائية النباتية المعقدة للنباتات.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

قشور الحمضيات هي منتج ثانوي لصناعة العصائر وقد أظهرت وجود مركبات وظيفية مثل مضادات الأكسدة1. وقد استخدمت كأطعمة واقية للأعصاب2، ومضادات للالتهابات، ومستحضرات تجميلية مضادة لحب الشباب3، ومضافات غذائية4. تنسب العديد من هذه الأنشطة الحيوية إلى الفلافونويدات5، والمركبات الفينولية6. تم تحديد طرق عامة لتقدير إجمالي كمية الفلافونويدات والفينولات في الأدبيات7، وأكثرها شيوعا هو فولين-تشوكالتيو للمحتوى الفينولي الكلي (TPC)8، وكلوريد الألمنيوم لمركبات الفلافونويدات الكلية (TFC)9 باستخدام القياس الطيفي الضوئي. تم نشر طريقة فولين-تشوكالتو لأول مرة في عام 192710، استنادا إلى تعديل لتفاعل فولين-دينيس11، وكلاهما يعتمد على تفاعل أكسدة اختزالية لمركبات فوسفوتونغستيك-فوسفوموليبديك. تقيس طريقة فولين-تشوكالتو القدرة الاختزالية للمركبات الفينولية12. تم اقتراح اختبار كلوريد الألمنيوم والفلافونويد لأول مرة في عام 1960، بناء على مجمعات بين الروابط المعدنية والفلافونويد13.

كلا الاختبارين الطيفي الضوئي هما أدوات مفيدة لتقدير ومقارنة المحتوى الكلي للمركبات النباتية الموجودة عادة في المواد النباتية. ومع ذلك، فهي تخضع لقيود مختلفة. على سبيل المثال، تنشأ بعض القيود من استخدام المعيارالخارجي رقم 14، حيث يفترض عموما أن الطبيعة الكيميائية للمعيار لا تؤثر بشكل كبير على استجابة الإشارة. في الواقع، يصعب التحقق من هذا الافتراض، لأن امتصاص الضرس يعتمد على عوامل مثل الاقتران وميزات بنيوية أخرى يصعب توحيدها في المنتجات الطبيعية. على سبيل المثال، قام أبل وآخرون15 بتقييم TPC من أحد عشر نوعا من البلوط وطوروا ما يسمى ب "المعيار الذاتي"، حيث أبلغوا عن فروقات تزيد عن 50٪ في منحدرات منحنيات المعايرة. الاستخدام الذاتي القياسي هو استراتيجية تهدف إلى تمثيل نفس الخليط التركيبي من المركبات الموجود في العينة، مما يوفر تطابقا أوضح مع المحتوى الفينولي الكلي الفعلي (TPC) في العينة16. توفر المعايير الذاتية أيضا بعض المعلومات حول النسبة بين المجموعات التفاعلية والوزن الجزيئي المتوسط؛ ومع ذلك، فهي مرهقة وصعبة التوحيد القياسي.

تم تقييم اختبار مركبات الفلافونويد الكلية المعتمد على مركب كلوريد الألمنيوم بشكل نقدي في دراسات حديثة17,18، والتي خلصت إلى أن AlCl₃ يشكل تحديدا مركبات مع مجموعتين فرعيتين من الفلافونويدات: الفلافونولات و5-هيدروكسي فلافونات. عادة، تظهر الفلافونولات أقصى امتصاص حوالي 440 نانومتر، بينما تمتص 5-هيدروكسي فلافونات بالقرب من 415 نانومتر. بالإضافة إلى ذلك، قد تظهر بعض الفلافونويدات امتصاصا جوهريا ضمن نطاق 415–440 نانومتر حتى في غياب الاشتقاق، وتختلف زيادة الامتصاص عند التعقيد بين المركبات الفردية. علاوة على ذلك، كلا الاختبارين اللونيين يفتقران إلى الفصل وبالتالي لا يمكنهما التمييز بين المكونات الفينولية المختلفة؛ بينما قد تكون هذه الميزة مفيدة لتقدير المحتوى الكلي، إلا أنها تؤدي إلى تحديد محدود. تسلط هذه الاعتبارات الضوء على الحاجة إلى استراتيجية تحليلية تحل المكونات الفردية قبل الكشف اللوني، مما يميز استجابات الفحص الحقيقية عن التداخلات الطيفية أو الكيميائية.

على الرغم من هذه القيود، تظل هذه الاختبارات أدوات قيمة للفحص العام للمركبات الفينولية النشطة بيولوجيا في مستخلصات النباتات والفواكه19. لتقييم التداخلات المحتملة، يمثل استخدام طريقة كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة عالية الأداء (HPTLC)، التي تم الكشف عنها باستخدام كواشفي فولين-تشوكالتيو وAlCl₃، نهجا فعالا. يتيح الفصل الكروماتوغرافي اكتشاف المواد المتداخلة ذات نطاقات امتصاص موجودة مسبقا قبل التعقيد، بينما يسمح التوثيق الفوتوغرافي بتحليل متزامن لعظمى امتصاص متعدد. بالإضافة إلى ذلك، يقدم تحليل HPTLC عدة مزايا مقارنة بالتقنيات الكروماتوغرافية الأكثر شمولا مثل HPLC–MS/MS، بما في ذلك استهلاك أقل للمذيبات، ووقت تحليل أقصر بسبب المعالجة المتزامنة لعدة عينات (حتى 18 في كل لوحة)20، وتسهيل تفسير الخلطات المعقدة بفضل انتقائية الاشتقاق بعد الكروماتوغرافي21.

في هذا العمل، نقدم بروتوكولا متكاملا لتحديد المركبات المحددة التي تحتوي على المحتوى الكلي للبولي فينولي (TPC) والفلافونولات الكلية بالإضافة إلى 5-هيدروكسي فلافونات (TFHC) في مستخلصات قشور الحمضيات باستخدام فصل كروماتوغرافي عالي الأداء للطبقة الرقيقة (HPTLC)، إلى جانب تقدير عام للمحتوى بناء على اختبار الميكرولوين اللوني. يتم إجراء القياس الكروماتوغرافي المستوي للمركبات الفينولية باستخدام كاشف فولين–تشيوكالتيو، بينما يستخدم اشتقاق كلوريد الألمنيوم حصريا للتعرف الكروماتوغرافي على الأشرطة المقابلة للفلافونولات و5-هيدروكسي فلافونات. في هذا النهج، يعتمد تحديد TFHC على استجابة فولين–تشوكالتيو للمركبات المحللة والكروماتوغرافيا والمعرفة كيميائيا، بدلا من التعقيد في كلوريد الألمنيوم للقياس. يتيح تحليل HPTLC الفصل والرؤية الخاصة بالمركبات، مما يسمح بتحديد المكونات الفينولية الفردية واكتشاف التداخلات الطيفية المحتملة. بالإضافة إلى ذلك، تم تقديم طريقة مطيعية بصرية تعتمد على الميكرولوح لتقدير سريع لإجمالي TPC وTFHC، مما يوفر أداة فحص مكملة عالية الإنتاجية لمصفوفات النباتات المعقدة.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. تحضير قشور الفواكه

  1. أزل حوالي 50 جراما من القشور من كل فاكهة، وافصلها عن الجزء الصالح للأكل. بالنسبة لنتائجنا التمثيلية، تم شراء اليوسفي من متجر محلي (مستورد من تشيلي، من نوع إيزابلين)، وتم جمع الليمون من شجرة بالقرب من سان خوسيه، كوستاريكا (عينة قسيمة JVR-16434).
  2. ضع القشور في كيس بلاستيكي بزيبلوك وقم بتجميده على درجة حرارة -20 درجة مئوية لمدة لا تقل عن ساعتين.
  3. انقل القشور المجمدة إلى مجفف تجميد مبرد مسبقا، وأبق الأكياس مفتوحة، وطبق التفريغ (0.1 ملي بار) طوال الليل حتى يجف تماما.
  4. قم بطحن كل مادة مجففة إلى حوالي 0.1 مم باستخدام مطحنة شفرات.

2. الاستخراج

  1. وزن حوالي 100 ملغ من قشر الحمضيات الجاف المطحون (الليمون أو اليوسفي) وضعه في أنبوب زجاجي بحجم 15 مل.
  2. أضف 3 مل من الإيثانول بنسبة 60٪ إلى الأنبوب.
  3. قم بسونيك الخليط في حمام فوق صوتي لمدة 10 دقائق عند 40 درجة مئوية لتعطيل خلايا النبات وتسهيل الإفراز الكيميائي النباتي.
  4. قم بعمل الطرد المركزي للعينة عند 850 × جرام لمدة 10 دقائق.
  5. انقل المادة الفائقة الإيثانولية بعناية إلى قارورة حجمية بحجم 10 مل باستخدام ماصة باستور، لتجنب اضطراب الرواسب.
  6. أضف 3 مل إضافية من الإيثانول بنسبة 60٪ إلى الأنبوب الذي يحتوي على بقايا المادة الصلبة الرطبة.
  7. كرر خطوات التصويب الصوتي والطرد المركزي الموضحة أعلاه في الخطوتين 2.3 و2.4.
  8. انقل المادة الفائقة إلى نفس القارورة الحجمية وامزجها مع المستخلص السابق.
  9. قم بإجراء استخراج ثالث بتكرار الخطوات السابقة (2.6–2.8).
  10. قم بتحمض المستخلص المدمج (≈9 مل) بقطرتين من 0.1 مول/لتر HCl (لزيادة استقرار الأنثوسيانينات والمركبات الفينولية الأخرى) ورفع الحجم إلى 10 مل باستخدام الميثانول.
  11. قم بتنفيذ هذه العملية ثلاث مرات لكل عينة.

3. إجمالي محتوى الفلافونولات و5-هيدروكسي فلافونات (TFHC) بواسطة القياس الطيفي للصفيحات الدقيقة

  1. جهز محلول مخزون الكيرسيتين (100 ميكروغرام/مل) أو معيار فلافونويد مكافئ.
    1. ازن 10 ملغ من الكيرسيتين باستخدام توازن بدقة 0.1 ملغ.
    2. قم بإذابة الكيرسيتين في حوالي 5 مل من الإيثانول بنسبة 95٪ وانقل المحلول إلى قارورة حجمية بحجم 10 مل تحمل اسم المحلول الأصلي.
    3. اشطف الكأس مرتين ب 2 مل من الإيثانول بنسبة 95٪ وأضف الشطف إلى القارورة.
    4. ارفع الحجم إلى العلامة مع 60٪ إيثانول.
    5. تحضير المحاليل القياسية (10–100 ميكروغرام/مل) ومحلول فراغ في أنابيب الطرد المركزي الدقيق بسعة 1.5 مل وفقا للجدول 1.
    6. تأكد من أن جميع العينات والمعايير تقع ضمن نطاق امتصاص من 0.2–0.8، مع تعديل التركيزات إذا لزم الأمر.
    7. جهز تخطيط الميكروبليت عن طريق صرف 60 ميكرولتر من الفراغ أو العينة أو المعيار في كل بئر وفقا للشكل 1. قم بإجراء ثلاث نسخ لكل عينة أو معيار.
    8. توزيع المحاليل المائية التي تحتوي على 2٪ كلوريد الألمنيوم، 5٪ أسيتات الصوديوم، و80٪ ميثانول في خزانات منفصلة من المواد الكيميائية.
      ملاحظة: تعامل مع محاليل كلوريد الألمنيوم والميثانول بعناية. محاليل كلوريد الألمنيوم مهيجة، والميثانول سام عن طريق الابتلاع والاستنشاق وامتصاص الجلد. تجنب التواصل البشري والبصري وارتد معدات الحماية الشخصية المناسبة
    9. باستخدام ماصة متعددة القنوات ذات 8 قنوات، أضف 10 ميكرولتر من محلول AlCl₃، و10 ميكرولتر من محلول أسيتات الصوديوم، و200 ميكرولتر من 80٪ ميثانول إلى كل بئر.
    10. اهز الطبق بكثافة متوسطة لمدة 10 ثوان ثم احتضنه في الظلام لمدة 30 دقيقة.
    11. قس الامتصاص عند 415 نانومتر. إذا لم يكن هناك هز متوفر، قم بخلط يدويا مع ميكروبايبت قبل الحضانة (الشكل 2).
    12. تقوم باستيفاء قيم امتصاص العينة من منحنى المعايرة وتطبيق عوامل التخفيف والحجمية وتصحيح الكتلة حسب الحاجة.

الجدول 1: كميات معايير الكيرسيتين لمنحنى معايرة إجمالي الفلافونولات ومحتوى 5-هيدروكسي فلافونات (TFHC). يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.

figure-protocol-1
الشكل 1: تخطيط الصفائح الدقيقة لتحليل الصفائح الدقيقة الكلية للفلافونولات ومحتوى 5-هيدروكسي فلافونات (TFHC). (أ) مخطط الصفيحة الدقيقة. (ب) برنامج تخطيط الجيل الخامس للبرمجيات. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-protocol-2
الشكل 2: إعداد برنامج الميكروبليت لتحليل محتوى الفلافونولات الكلية و5-هيدروكسي فلافونات. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

4. المحتوى الكلي متعدد الفينول (TPC) بواسطة القياس الطيفي للصفيحات الدقيقة

  1. جهز منحنى قياسي لحمض الجاليك (0.000–0.120 ملغ/مل).
    1. يزن حوالي 0.0123 جرام من حمض الجاليك (نقاء 98٪) باستخدام ميزان تحليلي ويذيبه في ماء مقطر.
    2. انقل المحلول إلى قارورة حجمية بحجم 10 مل، اشطفها مرتين، واملأها حتى العلامة بالماء المقطر للحصول على محلول المخزون.
    3. جهز محلول يعمل عن طريق تخفيف 1 مل من محلول المخزن إلى 10 مل باستخدام ماء مقطر.
    4. إعداد معايير المعايرة عن طريق تخفيف محلول العمل بشكل أكبر وفقا للجدول 2.
    5. عدل التركيزات إذا انخفضت قيم الامتصاص خارج نطاق 0.2–0.8.
    6. تحضير كاشف فولين–تشوكالتيو العامل عن طريق تخفيف المادة التجارية بنسبة 1:14 بالماء المقطر.
      ملاحظة: كاشف فولين–تشوكالتيو ومحاليل حمض الهيدروكلوريك تآكل. تجنب الرش والاتصال المباشر. قم بالتعامل مع الكواشف في غطاء بخار.
    7. مبطنة 30 ميكرولتر من كل عينة، قياسية، أو فارغة في لوحة دقيقة بسعة 96 بئر وفقا للتخطيط في الشكل 3A، باستخدام ثلاث نسخ لكل عينة.
    8. أضف 215 ميكرولتر من كاشف فولين–تشوكالتيو العامل إلى كل بئر باستخدام ماصة متعددة القنوات.
    9. أضف 50 ميكرولتر من محلول كربونات الصوديوم بنسبة 20٪ إلى كل بئر وامزجه جيدا مع ميكروبايبت.
    10. حضن اللوح لمدة 20 دقيقة عند 40 درجة مئوية مع التحريك (الشكل 3B).
    11. قس الامتصاص عند 755 نانومتر.

الجدول 2: كميات معايير حمض الغاليك لمنحنى معايرة المحتوى الفينولي الكلي (TPC). يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.

figure-protocol-3
الشكل 3: تخطيط الصفائح الدقيقة وإعداد البرمجيات لتحليل الصفائح الدقيقة للمحتوى الفينولي الكلي (TPC). (أ) التخطيط. (ب) برنامج برمجي. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

5. الظروف العامة المستخدمة لتحليل الكروماتوغرافيا عالية الأداء للطبقات الرقيقة

  1. المنحنيات القياسية
    1. تحضير محاليل مخزون من الكيرسيتين وحمض الجاليك (100 ميكروغرام/مل لكل منهما) كما هو موضح أعلاه في القسمين 3 والقسم 4.
    2. طبق حمض الجاليك على ستة مسارات بأحجام 2، 4، 6، 8، 10، و12 ميكرولتر.
    3. ضع 5 ميكرولتر من حمض الجاليك والكويرسيتين بشكل منفصل على مسارات منفصلة للتحديد.
  2. تصميم اللوحة:
    1. استخدم لوحة TLC من جل السيليكا بحجم 10 × 20 سم بحجم 60 F₅₄ بالألمنيوم كطور ثابت.
    2. اضبط معايير التطبيق كما يلي: الموضع Y 7.0 مم، طول الشريط 6.0 مم، الموضع الأول X 14.0 مم، المسافة بين المسارات 9.4 مم.
    3. ضع 10 ميكرولتر من كل مستخلص لكل شريط باستخدام النيتروجين كغاز رش.
    4. اضبط مسافة المذيب الأمامية على 70 مم.
  3. تطور اللوحة:
    1. طور صفائح في حجرة يدوية تحتوي على 40 مل من الطور المتحرك، وترك 10 دقائق للتشبع باستخدام ورق المرشح الذي يلامس الطور المتحرك وجدار الحجرة لمساعدة أبخرة الطور المتنقل على تشبع غلاف الغرفة.
    2. تطوير الألواح باستخدام MP1 أو MP2، مع تنفيذ تطوير مزدوج عند التوصية. المرحلة المتنقلة 1 (MP1)، التي تتكون من أسيتات الإيثيلي: حمض الفورميك: حمض الخليك: الماء (100:11:11:26); وMP2 مصنوع من تولوين: أسيتات الإيثيل: حمض الفورميك (5:4:1).
      ملاحظة: طور صفائح HPTLC داخل غطاء بخار. مكونات الطور المتحرك (أسيتات الإيثيل، التولوين، حمض الفورميك، وحمض الخليك) متطايرة، بينما التولوين وأسيتات الإيثيل قابلان للاشتعال بشدة. تجنب استنشاق البخار وتجنب مصادر الاشتعال.
    3. اترك الأطباق لتجف في درجة حرارة الغرفة.
  4. الاشتقاق
    1. ألواح الرش بمادة فولين–تشوكالتيو (300 ميكرولتر من الكواشف + 600 ميكرولتر من 50٪ إيثانول)، تجف لفترة وجيزة باستخدام مسدس حراري، ثم ترش ب 1 مل من كربونات الصوديوم 10٪ في 50٪ إيثانول.
    2. بشكل منفصل، رش ألواح أخرى بكلوريد ألمنيوم بنسبة 1٪ في 50٪ إيثانول.
  5. تضع ألواح الحرارة بشكل موحد باستخدام مسدس الحرارة حتى يستقر تطور اللون وتجف الصفائح تماما.

6. تطوير تحليل إجمالي الفلافونولات ومحتوى 5-هيدروكسي فلافونات (TFHC) والمحتوى الفينولي الكلي (TPC) باستخدام الكروماتوغرافيا ذات الطبقة الرقيقة عالية الأداء

  1. تطبيق العينات في المسارات الثلاثية مع مسارات مرجعية لحمض الجاليك والكويرسيتين (للتحديد، كما هو موضح في الخطوة 5.1.4).
  2. طور لوحة باستخدام MP1.
  3. قم بتطوير اللوحة مرة أخرى باستخدام MP2.
  4. اشتقاق الصفيحة باستخدام كاشف FC كما هو موضح سابقا.
  5. قم بتوثيق اللوحة باستخدام إضاءة بيضاء، بالإضافة إلى إضاءة UV بتردد 254 نانومتر و366 نانومتر.
  6. كرر الإجراء، مستبدلا الخطوة النهائية لاشتقاق AlCl3 ، كما هو موضح في الشكل 4.

figure-protocol-4
الشكل 4: خطوات VisionCats لتحليل TPC وTFHC بواسطة HPTLC. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

شروط الاستخراج
بروتوكول الاستخراج العام الموصوف هنا يستخدم 60٪ إيثانول، كما تم الإبلاغ سابقاعن 22٪. عند تعميم ذلك إلى مصادر نباتية أخرى، يمكن تحسين ظروف الاستخراج من حيث قطبية المذيب وعدد الدورات. تم تفصيل مبرر شامل لاختيار كل من المذيب وعدد الدورات في مكان آخر16. قد يسترشد اختيار المذيبات بناء على الأدبيات السابقة ومؤشرات الاستقطابية؛ بشكل عام، ينصح باستخدام خلطات هيدروكحولية من الإيثانول أو الميثانول، بالإضافة إلى الأسيتون. يمكن تقييم العدد الأمثل لدورات الاستخراج (n) بتقسيم حجم إجمالي ثابت يبلغ 10 مل إلى 1–5 دورات بحجم 10/نانومولتر، تليها تجميع المستخلصات السائلة. ثم تتم مقارنة كفاءة أرقام دورات الاستخراج المختلفة إحصائيا لتحديد الحالة التي تحقق أقصى امتصاص في اختبار TPC.

قياس الميكروبليت وHPTLC
تعرض منحنيات المعايرة القياسية لكل من اختبار الصفائح الدقيقة وتحليل HPTLC في الشكل 5. لتحديد المحتوى الفينولي الكلي (TPC) باستخدام طريقة فولين-تشوكالتو الصفائح الدقيقة وللألواح المشتقة من نفس الكاشف، تم تحديد منحنيات معايرة باستخدام حمض الجاليك كمركب مرجعي. تم اختيار حمض الجاليك ليس فقط لأنه من أكثر المعايير استخداما لقياس TPC، بل أيضا لأنه يمكن إلزامه تحت نفس ظروف الطور المحمول المطبقة على عينات الجير واليوسفي. كما تم تقييم الكيرسيتين كمعيار محتمل لاختبار HPTLC؛ ومع ذلك، ثبت أنه غير مناسب لهذا النظام الكروماتوغرافي، لأنه كان يتزامن مع جبهة المذيب ولم يكن بالإمكان قياسه بشكل موثوق. ومع ذلك، تم تحديد TFHC باستخدام الكيرسيتين كمعيار مرجعي، حيث أن حمض الجاليك لا يشكل مركبا ملونا مع كلوريد الألمنيوم، نظرا لأنه ليس فلافونول ولا 5-هيدروكسي فلافون.

figure-results-1
الشكل 5: صفيحة HPTLC المكونة من الجير واليوسفي وحمض الجاليك والكويرسيتين تطورت بشكل متسلسل مع MP1 متبوعا MP2، واشتقت بشكل منفصل بكواشف كلوريد الألمنيوم (AlCl₃) وفولين-تشوكالتيو (FC). يظهر الملف الكروماتوغرافي بعد اشتقاق AlCl₃. الاختصارات: FC، اشتقاق فولين–تشوكالتيو؛ AlCl₃، اشتقاق كلوريد الألمنيوم؛ W، إضاءة الضوء الأبيض؛ 366، إضاءة UV عند 366 نانومتر. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

تعرض نتائج المحتوى الفينولي الكلي (TPC) وإجمالي محتوى الفلافونويد وحمض الهيدروكسي سيناميك (TFHC) في الجدول 3. كما هو متوقع، كانت قيم TFHC أقل بشكل ملحوظ من قيم TPC، حيث كانت أقل بحوالي خمسة أضعاف في عينات الجير وأقل بمقدار اثني عشر مرة في عينات اليوسفي.

الجدول 3: نتائج محتوى اليوسفي والجير الكلي للفينول باستخدام طريقة الميكروبلايت. الاختصارات: Abs: الامتصاص، CV: معامل التغير، DF: عامل التخفيف، GAE: مكافئات حمض غاليك، IR: تكرار مستقل، QE: مكافئات الكيرسيتين، Rep: تكرار، SD: انحراف معياري، TFHC: إجمالي الفلافونولات ومركبات 5-هيدروكسيفلافون، TPC: إجمالي المحتوى الفينولي، والمتوسط figure-results-2 . *تم الحساب بناء على المادة الجافة. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.

وبالمثل، تلخص النتائج المستخلصة من تحليل HPTLC في الجدول 4. الفصل الكروماتوغرافي يتيح تصور الأشرطة الفردية التي تتوافق مع مركبات مميزة. تم اكتشاف أربعة مكونات فينولية في عينات الجير وستة في عينات اليوسفي. لم تتطابق أي من هذه النطاقات مع عوامل الاحتفاظ بالمعايير المرجعية المستخدمة (حمض الغاليك والكويرسيتين)، وهو ما يتوافق مع التوقعات.

الجدول 4: كشفت نتائج المحتوى الفينولي الكلي والأشرطة المقابلة ل AlCl3 عن مركبات بواسطة HPTLC مشتقة من AlCl3. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.

كما يذكر الجدول 4 إجمالي المحتوى الفينولي المقدر من تحليل HPTLC، محسبا كمجموع المركبات الفردية التي تم اكتشافها كروماتوغرافيا (مماثل ل TPC). بالإضافة إلى ذلك، يتضمن الجدول المحتوى التراكمي للأشرطة المخصصة للفلافونولات أو 5-هيدروكسي فلافان (Rf = 0.46 و0.62 في الجير؛ لا يوجد أي شيء في اليوسفي). ظهرت هذه الأشرطة باللون الأصفر بعد الاشتقاق باستخدام AlCl₃ وأظهرت فلورة صفراء تحت إضاءة UV بقوة 366 نانومتر. ومع ذلك، لم يلاحظ أي تلوين مرئي قبل الاشتقاق، كما هو موضح في الشكل 5.

لتحليل HPTLC، يوفر اشتقاق فولين-تشوكالتيو (FC) اكتشافا شاملا للمركبات الفينولية، رغم حدوث تداخلات طفيفة. أيضا، اشتقاق كلوريد الألمنيوم (AlCl₃) يصبغ بشكل انتقائي مجموعة فرعية من الفلافونويدات. التطبيق المشترك لكلا الكاشفين يحسن توحيد الطريقة ويخفف من بعض القيود الجوهرية في أي منهما. ومن الجدير بالذكر أنه من غير المحتمل أن يظهر مركب غير فلافونويد كلا من اللون الأزرق المميز تحت FC والامتصاص الأصفر-الأحمر تحت AlCl₃. بالإضافة إلى ذلك، يمكن استبعاد الكروموفورات الموجودة مسبقا كتداخلات إذا كانت مرئية بنفس الشدة قبل الاشتقاق.

كما هو موضح في الشكل 5، أظهر مستخلص الجير نطاقين عند Rf 0.62 و0.46، لم يكونا قابلين للكشف على الصفيحة غير المتطورة لكنهما أصبحا مرئيين بوضوح بعد كل من اشتقاق فولين-تشوكالتيو (FC) وAlCl₃. يدعم هذا السلوك طبيعتها الفلافونويدية، والتي قد تتوافق مع النيويريوسيترين والهيسبيريدين23. لوحظت مكونات فينولية إضافية عند Rf 0.21 و0.37 في الجير، وعند Rf 0.36، 0.39، 0.42، 0.46، 0.54، و0.89 في اليوسفي. كانت هذه الأشرطة قابلة للكشف بعد اشتقاق FC ولكن ليس بعد معالجة AlCl₃، مما يشير إلى أنها قد تتوافق مع مركبات فينولية غير فلافونويدية. وفقا للأدبيات، تشمل الفينوليكيات غير الفلافونويدية الرئيسية المبلغ عنها في اليوسفي حمض الكلوروجينيك وحمض الفيروليكالعابر 24,25. في الجير، تشمل المركبات الأخرى التي وصفت سابقا حمض الكوماريك وحمض ديهيدروكسي فيروليك23. ومع ذلك، يتطلب تأكيد هذه الواجبات تحليلا بمعايير مرجعية إضافية.

مقارنة المراحل المتنقلة بين HPTLC
تم تطوير كلا المرحلتين المتنقلتين كتعديل للأنظمة السابقة 26,27,28. الطور الأكثر قطبية (MP1، الشكل 6A) وفر فصلا أفضل للمكونات الفينولية مقارنة ب MP2. على النقيض من ذلك، مكن الطور الأقل قطبا (MP2) (الشكل 6B) من الاحتفاظ المتزامن بكل من مكونات العينة والمعايير المرجعية ضمن نفس السلسلة الكروماتوغرافية. ومع ذلك، تحت ظروف MP2، كانت قيم Rf لمكونات العينة منخفضة نسبيا، مع بقاء بعض المركبات قريبة من الأصل، كما هو موضح في الشكل 6. لمعالجة هذا القيد، تم تنفيذ إجراء تطوير مزدوج باستخدام MP1 متبوعا بMP2. ضمنت هذه الاستراتيجية تحسين هجرة ودقة مكونات العينة مع السماح بالقياس القياسي مقابل معايير حمض الغاليك على نفس اللوح تحت ظروف كروماتوغرافية متطابقة. أظهر الكيرسيتين لونا أصفر باهتا قبل معالجة AlCl₃، والذي ازداد حدة بعد الاشتقاق. بالنسبة لكل من مستخلصات الجير واليوسفي، لوحظ وجود شريطين مميزين بالإضافة إلى شريط آخر في الأصل. علاوة على ذلك، أصبح شريط أصفر بقيمة Rf 0.14 مرئيا بوضوح بعد اشتقاق AlCl₃.

figure-results-3
الشكل 6: صفائح HPTLC من الجير، اليوسفي، حمض الجاليك، والكويرسيتين المطورة بمرحلة متحركة 1 (A) و2 (B). لكل لوحة، تتوافق المسارات من اليسار إلى اليمين: العينات المطورة (غير المشتقة)، المشتقة من فولين–تشوكالتيو، والعينات المشتقة من AlCl₃. تم تنفيذ التصوير تحت إضاءة بيضاء. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعد جمع العينات وتخزينها خطوات حاسمة لضمان سلامة التحليلات الكيميائية النباتية. بعد الجمع، يجب نقل العينات في ظروف مبردة وتجفيفها بالتجميد في أقرب وقت ممكن لتقليل التحلل. بينما تكون المواد البيولوجية المجففة مستقرة عموما، فإن المستخلصات في المحلول تكون أكثر مرونة بكثير، حتى عند تخزينها في التبريد. لذلك، يفضل إجراء التحليلات على مستخلصات طازجة التحضير. التخزين المطول، حتى لبضعة أيام في ظروف باردة ومحمية من الضوء، أو لبضع ساعات في درجة حرارة الغرفة، يمكن أن يؤدي إلى تغييرات ملحوظة في الأشكال الكروماتوغرافية، بما في ذلك تغيرات في شدة الشريط وتكوين الرواسب. عادة ما ترتبط هذه التغيرات بالتحولات الكيميائية مثل الأكسدة، التحلل المائي، أو تفاعلات التعقيد. وبالتالي، يجب تخزين جميع المواد والمستخلصات والتعامل معها في ظروف باردة ومظلمة للحفاظ على استقرارها الكيميائي.

عند مقارنة التقنيتين (الجدول 3 والجدول 4)، تظهر اختلافات كمية منهجية. في كل من الجير واليوسفي، كانت قيم TPC التي تم الحصول عليها من اختبار الصفائح الدقيقة أعلى بحوالي ثلاثة أضعاف من تلك التي قدرها HPTLC. في الجير، كانت TPC 74.2 mmol/g بواسطة الصفيحة الصغيرة مقابل 22.0 mmol/g DM بواسطة HPTLC، بينما كانت قيم TFHC 15.5 mmol/g و 13.4 mmol/g على التوالي. في الماندرين، بلغ TPC 72.8 ممول/غ بواسطة الصفيحة الصغيرة مقارنة ب 20.8 ملليمول/غ بواسطة HPTLC. بالنسبة ل TFHC، أعطت طريقة الصفيحة الدقيقة 6.0 mmol/g، بينما لم يتم اكتشاف أي نطاقات مقابلة بواسطة HPTLC.

يمكن تفسير هذه التناقضات من خلال القيود الجوهرية وآليات الاستجابة لكل طريقة. من المعروف أن اختبار فولين-تشوكالتيو (FC) يتفاعل ليس فقط مع المركبات الفينولية، بل أيضا مع مواد مختزلة غير فينولية مختلفة، بما في ذلك حمض الأسكوربيك، التيروزين، حمض الفورميك، وحمض الخليك29، بالإضافة إلى مختزلات أخرى منخفضة الوزن الجزيئي. تساهم هذه المركبات في الإشارة الشاملة للتحليل الطيفي، مما قد يؤدي إلى تقدير مبالغ فيه ل TPC. بالإضافة إلى ذلك، قد تزيد المكونات الفينولية الثانوية بشكل جماعي من الامتصاص الكلي في اختبار الصفائح الدقيقة، حتى لو كانت تركيزاتها الفردية منخفضة جدا لإنتاج نطاقات مميزة وقابلة للقياس في HPTLC. قد تفشل بعض المستقلبات الصغيرة أو القطبية العالية أيضا في الاحتفاظ بها أو حلها أو رؤيتها تحت ظروف الكروماتوغرافية المستخدمة.

figure-discussion-1
الشكل 7: تمثيل تخطيطي لمركبات AlCl₃ المكونة من فلافونولات و5-هيدروكسي فلافونات. (أ) فلافونولات و(B) 5-هيدروكسي فلافونات. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

تساهم الاختلافات المنهجية في كيمياء الكشف بشكل أكبر في التغيرات الملحوظة. ينتج تفاعل FC زيادة كبيرة في الامتصاص بسبب تقليل المادة الكيميائية، مما يؤدي إلى حساسية تحليلية عالية. على النقيض من ذلك، فإن طريقة AlCl₃ غير محددة نسبيا وتعتمد على تكوين مركب مع بعض الفلافونويدات. عادة ما تظهر الفلافونولات أقصى امتصاص حوالي 410 نانومتر، بينما تمتص 5-هيدروكسي فلافونات بالقرب من 440نانومتر 18، وتظهر مركباتها مع Al3⁺ في الشكل 7. ومع ذلك، فإن زيادة الامتصاص بعد التعقيد تكون معتدلة نسبيا، مما يجعل اختبار AlCl₃ أكثر عرضة للتداخل من مكونات المصفوفة الملونة، بما في ذلك الفلافونويدات نفسها.

على الرغم من هذه القيود، فإن الاستخدام المشترك لاشتقاق FC وAlCl₃ في HPTLC يمثل استراتيجية تكميلية قوية للتحليل الفينولي. يربط هذا النهج الحساسية العالية لتفاعل FC بالتمييز البنيوي الذي توفره معقد AlCl₃ والفصل الكروماتوغرافي. علاوة على ذلك، من المعروف أن عدة فلافونولات تظهر أشرطة صفراء مميزة تحت إضاءة UV30، مما يدعم تصنيف المركبات وتأكيدها.

تعد طرق الميكروبليت مفيدة بشكل خاص للفحص عالي الإنتاجية. تتطلب تجهيز عينات قليل، واستهلاك منخفض للكاشف، وتتيح التحليل المتزامن لعشرات العينات. في الظروف المخبرية النموذجية، يمكن إجراء اختبار ميكروبلوح كامل في حوالي 4 ساعات باستخدام أجهزة متوفرة على نطاق واسع. تجعل هذه الخصائص اختبارات الميكروبليت مناسبة جدا للدراسات المقارنة السريعة، ومراقبة الجودة الروتينية، والتقييم الأولي لمجموعات العينات الكبيرة. على النقيض من ذلك، يتطلب HPTLC وقتا وعملا أكثر استهلاكا، حيث يتطلب سير عمل تحليلي كامل عادة من 7 إلى 8 ساعات. كما يعتمد على أجهزة متخصصة قد لا تكون متوفرة في جميع المختبرات، كما أن استخدام الألواح المخصصة وكواشف الاشتقاق يزيد من تكلفة كل تحليل. قيد آخر هو أن المستقلبات الموجودة بتركيزات منخفضة جدا قد تبقى غير قابلة للكشف تحت ظروف الرؤية القياسية. ومع ذلك، فإن هذه القيود العملية والمتعلقة بالحساسية تعوض بالميزة الرئيسية للفصل الكروماتوغرافي 30,31. تمكن HPTLC من حل المكونات الفردية في مصفوفات النباتات المعقدة، وتأكيد استجابات الاختبار الحقيقية، والكشف عن المركبات المتداخلة المحتملة. علاوة على ذلك، يسمح الاشتقاق الانتقائي بعد الكروماتوغرافي بتصنيف المركبات مباشرة إلى مجموعات وظيفية (مثل الفلافونولات و5-هيدروكسي فلافونات)، مما يعزز التفسير الكيميائي إلى ما يتجاوز تقدير المحتوى الكلي.

وبناء عليه، في الدراسات واسعة النطاق، قد يبدأ سير العمل التحليلي باختبارات الصفائح الدقيقة لتحديد العينات بسرعة مع مستويات مرتفعة من المركبات المستهدفة. يمكن بعد ذلك تخضع عينات مختارة لتحليل HPTLC لرؤية المكونات الفردية، وتقييم الانتقائية، وتقييم التداخلات المحتملة من خلال الاشتقاق المزدوج. تجمع هذه الاستراتيجية المتكاملة (الموضحة في الشكل 8) بين السرعة وسرعة النقل مع الخصوصية الكيميائية والبصيرة الهيكلية.

figure-discussion-2
الشكل 8: سير العمل المقترح لفحص وتحليل العينات. (أ) فحص الميكرولوح عالي الإنتاجية لدفعة كبيرة من العينات. (ب) تحليل HPTLC لعينات مختارة للقياس باستخدام طريقة فولين-تشوكالتيو ولتحديد الفلافونولات و5-هيدروكسي فلافونات من خلال اشتقاق AlCl₃. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

مقارنة ب HPTLC، يوفر HPLC مع مطيافية الكتلة عالية الدقة (HPLC–HRMS) — وهو البديل الأكثر شيوعا المبلغ عنه في الأدبيات — حساسية لا مثيل لها وتحديد هيكلي واضح للمركبات الفردية32. ومع ذلك، فإن تحليلات HPLC–HRMS بطبيعتها أبطأ، حيث يجب تنفيذ كل عملية كروماتوغرافية بشكل متسلسل، وتتطلب تكاليف أعلى بكثير مرتبطة بالأجهزة، ومتطلبات نقاء المذيب، واستهلاك المذيب. علاوة على ذلك، غالبا ما يتطلب الفحص الوظيفي معالجة بيانات معقدة وتفسيرا خاصا بالمركبات، بينما يتيح HPTLC التجميع البصري المباشر للمركبات بعد الاشتقاق. وبالتالي، يمثل HPTLC منصة وسيطة فعالة بين الفحص السريع للألواح الدقيقة وتحليل HPLC–MS الشامل، مع موازنة معدل الإنتاجية والتكلفة والانتقائية الكيميائية.

للتحليل الفلافونويد والفينولي تطبيقات واسعة النطاق في علوم الأغذية، والمنتجات الغذائية الغذائية، والأدوية، والزراعة، وأبحاث المواد. في علم الأغذية، يستخدم لتقييم قدرة مضادات الأكسدة، وأصالتها، ومدة صلاحيتها، ومراقبة جودة المنتجات مثل العصائر والنبيذ والشاي، بالإضافة إلى دعم الدراسات الزراعية، بما في ذلك تحديد وقت الحصاد الأمثل بناء على نضج الفينول33. في قطاع التغذية، يعد التحليل الفينولي ضروريا لتوحيد وضمان جودة المستخلصات النباتية والمنتجات التجارية مثل كبسولات مستخلص الشاي الأخضر، ومكملات بذور العنب، وأقراص الكيرسيتين، وتركيبات بيوفلونويد الحمضيات. في الأبحاث الصيدلانية والطبية الحيوية، تدعم هذه التحليلات فحص المركبات النشطة الحيوية التي تحتوي على مضادات أكسدة ومضادة للالتهابات ومضادات الميكروبات6. في الزراعة وفسيولوجيا النباتات، يساعد تحديد الفينول في تقييم استجابات إجهاد النبات وتوجيه استراتيجيات تحسين المحاصيل. بالإضافة إلى ذلك، في علم المواد — وخاصة في دراسات مثبطات التآكل المشتقة من النباتات34,35 - يساعد التوصيف الفينولي في ربط التركيب الكيميائي بسلوك الامتصاص وكفاءة الحماية.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المؤلفون لا يكشفون عن أي تضارب مصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر نائب رئيس الإرشاد على تقديمه دعما لتسجيل الفيديو، خاصة لنائبة المدير يولاندا بيريز-كاريلو، ومصورة الفيديو ناتاليا سيلفا-مافيو. نشكر بكل امتنان "صندوق دعم نشر المعرفة التي تولدها جامعة UNA" من نائب الرئيس للأبحاث لدعمه تكاليف النشر.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
أنابيب إيبندورف بسعة 1.5 ملإبندورف
قوارير حجمية بسعة 10 ملمختبرات إيسكوCH0451B10/19 سدادة بولي بروبيلين، زجاج بوروسيليكات، كهرماني - علامة تخرج بيضاء، تحمل وزيادة؛ 0.025 مل 
100 وميكرو؛ L و 1000 وميكرو؛ رؤوس ميكروبيبت Lعام
100– 1000 وميكرو؛ المايكربايبت الدقيقةإبندورفريسيرش بلس
10– 100 وميكرو؛ المايكربايبت الدقيقةإبندورفريسيرش بلس
أنابيب زجاجية مغطاة بسقف 15 ملعام
كؤوس 50 ملعام
ميكروبيبيت متعدد القنوات بثماني قنواتالعلم الحراري
ألواح دقيقة ذات 96 بئرغرينر655891بولي سيكلولين، قاع زجاجي، أسود
التوازن التحليلي  ± 0.0001 جرام
سامبلر TLC التلقائيكاماجATS4
الطرد المركزيالعلم الحراريسورفال ST8R≥ 850 & g
ورق فلتر واتمانبالنسبة لتشبع الحجرة
مجفف التجميدلاكونكوالطراز 10
خزانات الكواشف البلاستيكيةإبندورف
ملعقة ذات طرف مسطح ونهاية ملعقةشركة ميرك للكيماوياتHS15906
قارئ الصفائح الدقيقة متعدد الاكتشاف من Synergy HTبيوتيك إنسترومنتسسينرجي HT
ألواح سيليكيا جل TLC 60 F254 المدعومة بالألمنيوم (10 مرات 20 سم)ميرك
بخاخ TLCسيغما-ألدرتش20 مل
TLC Visualizerكاماج2
حمام/منظف بالموجات فوق الصوتيةالكريوركسZX-040مع تحكم في درجة الحرارة عند 40 & درجة؛ C
UV لامبUPVUVGL-58
برنامج VisionCATSكاماج
حقائب الزيبلوكعامربع جالون

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kang, H. J., Chawla, S. P., Jo, C., Kwon, J. H., Byun, M. W. Studies on the development of functional powder from citrus peel. Bioresour Technol. 97 (4), 614-620 (2006).
  2. Furukawa, Y., et al. Isolation and characterization of neuroprotective components from citrus peel and their application as functional food. Chem Pharm Bull. 69 (1), 2-10 (2021).
  3. Kim, S. S., Lee, J. A., Kim, J. Y., Lee, N. H., Hyun, C. G. Citrus peel wastes as functional materials for cosmeceuticals. J Appl Biol Chem. 51 (1), 7-12 (2008).
  4. Shyu, Y. S., Lu, T. C., Lin, C. C. Functional analysis of unfermented and fermented citrus peels and physical properties of citrus peel-added doughs for bread making. J Food Sci Technol. 51 (12), 3803-3811 (2014).
  5. Hasnat, H., et al. Flavonoids: A treasure house of prospective pharmacological potentials. Heliyon. 10 (6), e27533(2024).
  6. Albuquerque, B. R., Heleno, S. A., Oliveira, M. B. P. P., Barros, L., Ferreira, I. C. F. R. Phenolic compounds: Current industrial applications, limitations and future challenges. Food Funct. 12 (1), 14-29 (2021).
  7. Khoddami, A., Wilkes, M., Roberts, T. Techniques for analysis of plant phenolic compounds. Molecules. 18 (2), 2328-2375 (2013).
  8. Kupina, S., Fields, C., Roman, M. C., Brunelle, S. L. Determination of total phenolic content using the Folin-C assay: Single-laboratory validation, first action 2017.13. J AOAC Int. 102 (1), 320-321 (2019).
  9. Matić, P., Sabljić, M., Jakobek, L. Validation of spectrophotometric methods for the determination of total polyphenol and total flavonoid content. J AOAC Int. 100 (6), 1795-1803 (2017).
  10. Folin, O., Ciocalteu, V. On tyrosine and tryptophane determinations in proteins. J Biol Chem. 73 (2), 627-650 (1927).
  11. Folin, O., Denis, W. On phosphotungstic-phosphomolybdic compounds as color reagents. J Biol Chem. 12 (2), 239-243 (1912).
  12. Lamuela-Raventós, R. M. Folin-Ciocalteu Method for the Measurement of Total Phenolic Content and Antioxidant Capacity. Measurement of Antioxidant Activity & Capacity. , John Wiley & Sons. (2017).
  13. Christ, B., Müller, K. H. Zur serienmäßigen bestimmung des gehaltes an flavonol-derivaten in drogen. Arch Pharm. 293 (12), 1033-1042 (1960).
  14. Carter, J. A., Barros, A. I., Nóbrega, J. A., Donati, G. L. Traditional calibration methods in atomic spectrometry and new calibration strategies for inductively coupled plasma mass spectrometry. Front Chem. 6, 504(2018).
  15. Appel, H. M., Govenor, H. L., D’Ascenzo, M., Siska, E., Schultz, J. C. Limitations of Folin assays of foliar phenolics in ecological studies. J Chem Ecol. 27 (4), 761-778 (2001).
  16. Cubero-Román, E., Carvajal-Miranda, Y., Rodríguez, G., Álvarez-Valverde, V., Jiménez-Bonilla, P. Antioxidant and antimicrobial activity of two Costa Rican cultivars of ber (Ziziphus mauritiana): An underexploited crop in the American tropic. Food Sci Nutr. 11 (6), 3320-3328 (2023).
  17. Shraim, A. M., Ahmed, T. A., Rahman, M. M., Hijji, Y. M. Determination of total flavonoid content by aluminum chloride assay: A critical evaluation. LWT. 150, 111932(2021).
  18. Mammen, D., Daniel, M. A critical evaluation on the reliability of two aluminum chloride chelation methods for quantification of flavonoids. Food Chem. 135 (3), 1365-1368 (2012).
  19. Salih, A. M., et al. Optimization method for phenolic compounds extraction from medicinal plant (Juniperus procera) and phytochemicals screening. Molecules. 26 (24), 7454(2021).
  20. Loescher, C. M., Morton, D. W., Razic, S., Agatonovic-Kustrin, S. High performance thin layer chromatography (HPTLC) and high performance liquid chromatography (HPLC) for the qualitative and quantitative analysis of Calendula officinalis–Advantages and limitations. J Pharm Biomed Anal. 98, 52-59 (2014).
  21. Attimarad, M., Mueen Ahmed, K. K., Aldhubaib, B. E., Harsha, S. High-performance thin layer chromatography: A powerful analytical technique in pharmaceutical drug discovery. Pharm Methods. 2 (2), 71-75 (2011).
  22. Dellapina, G., et al. Flavonoid-rich extracts from lemon and orange by-products: Microencapsulation and application in functional cookies. Foods. 14 (19), 3346(2025).
  23. Sanches, V. L., et al. Comprehensive analysis of phenolics compounds in citrus fruits peels by UPLC-PDA and UPLC-Q/TOF MS using a fused-core column. Food Chem X. 14, 100262(2022).
  24. Kaur, S., Singh, V., Chopra, H. K., Panesar, P. S. Extraction and characterization of phenolic compounds from mandarin peels using conventional and green techniques: A comparative study. Discover Food. 4 (1), 60(2024).
  25. Quispe-Fuentes, I., Uribe, E., López, J., Contreras, D., Poblete, J. A study of dried mandarin (Clementina orogrande) peel applying supercritical carbon dioxide using co-solvent: Influence on oil extraction, phenolic compounds, and antioxidant activity. J Food Process Preserv. 46 (1), e16116(2022).
  26. Tatkare, P. C., Jadhav, A. P. Development and validation of a novel high-performance thin-layer chromatography method for the quantitative estimation of neohesperidin from Citrus aurantium peel extract. JPC J Planar Chromatogr Mod TLC. 35 (6), 579-584 (2022).
  27. Wagner, H., Bladt, S. Plant Drug Analysis. , Springer Berlin Heidelberg. Berlin. (1996).
  28. Apraj, V., et al. Pharmacognostic and phytochemical evaluation of Citrus aurantifolia (Christm) Swingle peel. Pharmacogn J. 3 (26), 70-76 (2011).
  29. Bastola, K. P., Guragain, Y. N., Bhadriraju, V., Vadlani, P. V. Evaluation of standards and interfering compounds in the determination of phenolics by Folin-Ciocalteu assay method for effective bioprocessing of biomass. Am J Anal Chem. 8 (6), 416-431 (2017).
  30. Sultana, S., et al. Investigating flavonoids by HPTLC analysis using aluminium chloride as derivatization reagent. Molecules. 29 (21), 5161(2024).
  31. Pawar, K. N., Kadam, S. P., Redasani, V. K. A systematic review on high performance thin layer chromatography (HPTLC). Int J Pharm Res Appl. 10 (3), 402-416 (2025).
  32. Saftić Martinović, L., Barbarić, L., Gobin, I. Qualitative and quantitative mass spectrometry approaches for the analysis of phenolic compounds in complex natural matrices. Appl Sci. 15 (23), 12529(2025).
  33. de Araújo, F. F., de Paulo Farias, D., Neri-Numa, I. A., Pastore, G. M. Polyphenols and their applications: An approach in food chemistry and innovation potential. Food Chem. 338, 127535(2021).
  34. Castro-Castro, V., Jiménez-Bonilla, P., Álvarez-Valverde, V., Rodríguez-Yáñez, J. Pichichio extracts (Solanum mammosum) as a corrosion inhibitor of low carbon steel in an acidic environment. Pure Appl Chem. 98 (2), 283-300 (2026).
  35. Evaluation of natural products as corrosion inhibitors: Pinus caribaea and Pachira quinata bark extracts on steel. Villalobos-Ugalde, A., Piedra-Marín, G., Rodríguez-Yañez, J., Álvarez-Valverde, V., Jiménez-Bonilla, P., Soto-Fallas, R. M. 6th IEEE International Conference on BioInspired Processing (BIP 2024), , (1109).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Citrus Peel ExtractsTotal Phenolic ContentTotal FlavonolsMicroplate AssaysHPTLC AnalysisPhenolic ProfilingFlavonoid DeterminationFolin Ciocalteu AssayAluminum Chloride AssayPhytochemical Characterization
الفيديو قريباً

مقالات ذات صلة