مقالة منهجية

التنميط الظاهري للأنماط السلوكية الشبيهة بباركنسون الناتجة عن العلاج المبكر في يرقات سمك الزرد بناء على تجربة سلوكية

DOI:

10.3791/70041

⸱

مايو 15, 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medicinal Chemistry, State Key Laboratory of Discovery and Utilization of Functional Components in Traditional Chinese Medicine, Key Laboratory of Chemical Biology (Ministry of Education), NMPA Key Laboratory for Technology Research and Evaluation of Drug Products, School of Pharmaceutical Sciences, Cheeloo College of Medicine, Shandong University, 2College of Information Engineering, Ningde Normal University, 3Digital Fujian Research Institute of Big Data for Elderly Rehabilitation and Nursing, 4Department of Neurology, Qilu Hospital Cheeloo College of Medicine, Shandong University, 5Key Laboratory of Bioactive Materials, Ministry of Education, Nankai University, 6Jinan Microecological Biomedicine Shandong Laboratory

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يؤسس هذا البروتوكول نموذجا لتصنيف السلوك في يرقات سمك الزرد المعالجة ب MPTP لتقييم العجز الحركي وغير الحركي الشبيه بمرض باركنسون.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تقدم هذه المقالة بروتوكول تصنيف ظاهري سلوكي فريد ومتعدد المعلمات لمرض باركنسون الناتج عن MPTP في يرقات سمك الزرد. يوفر الحث الكيميائي لأمراض شبيهة بمرض باركنسون في سمك الزرد نظاما عالي الإنتاجية وقابل للتعامل وراثيا، ومع ذلك ركزت معظم الدراسات بشكل ضيق على اختبارات الحركة الأساسية أو الانتقالات البسيطة بين الضوء والظلام. هذه الأساليب المحدودة لا تستطيع استيعاب الطيف الأوسع من اضطرابات الوظائف المرتبطة بمرض باركنسون، بدءا من بطء الحركة والعجز الحسي الحركي إلى السلوكيات الشبيهة بالقلق واضطرابات النوم. لمعالجة هذه الفجوة، طورت هذه الدراسة مجموعة متكاملة من 6 اختبارات تكميلية: اختبار الحركة لتقييم المحرك العام والدافع الاستكشافي؛ تقييم تقطير التاكسي لاكتشاف سلوكيات التفضيل الجانبي المرتبطة بالقلق؛ اختبار استجابة الدهشة لتسجيل بطء الحركة وضعف الاستجابة الحركية؛ تحدي الضوء والظلام لتقييم المخاطرة والاستجابة للتوتر؛ نماذج الاستجابة الحركية الضوئية (بما في ذلك تحفيز الضوء الوامض) لقياس الحركة الحسية والانعكاسية؛ ومراقبة تنظيم النوم واليقظة لقياس سلوك النوم والاستيقاظ. تتعرض يرقات سمك الزرد لتركيزات شبه قاتلة من MPTP من يوم واحد بعد الإخصاب (DPF) إلى 5 DPF، مع بدء تقييمات سلوكية من 4 إلى 6 DPF. التتبع الآلي عالي الدقة يولد عدة نقاط نهاية سلوكية في كل اختبار. يكشف هذا النهج عن تغييرات شبيهة بمرض باركنسون لم تكتشف سابقا، مثل بنية النوم غير المنظمة، وضعف تعلم التعود، والحركة الحسية الحركية والانعكاسية، مما يعكس أعراضا غير حركية مبكرة. من خلال دمج هذه الاختبارات، يحصل الباحثون على عرض سلوكي شامل يعكس بشكل أقرب تعقيد مرض باركنسون البشري. يوسع هذا البروتوكول نموذج دراسة مسببات مرض باركنسون، وفحص العلاجات المرشحة، واستكشاف المعدلات البيئية. يجسد هدف المجموعة في تقديم نماذج حيوانية مبتكرة تعزز الصلة الانتقالية من خلال النماذج الظاهرية القوية والمتعددة الأوجه.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

مرض باركنسون (PD) هو ثاني أكثر الاضطرابات التنكسية العصبية انتشارا بعد مرض الزهايمر1. لقد ازداد انتشاره وعدد الأشخاص المتأثرين بشكل مستمر في السنوات الأخيرة، مما يشكل تحديا كبيرا في الصحة العامة حول العالم2. معدل حدوث باركنسون يرتفع بشكل ملحوظ مع سن3 أو 4 سنوات. سريريا، يظهر اضطراب باركنسون من خلال الأعراض الحركية - مثل خلل الحركة، وبطء الحركة، والرعشة أثناء الراحة، وعدم استقرار الوضعية - ومجموعة متنوعة من الأعراض غير الحركية، بما في ذلك ضعف الإدراك، والقلق، واضطرابات النوم. حاليا، يعتمد تشخيص باركنسون بشكل أساسي على وجود الأعراض الحركية6؛ ومع ذلك، بحلول الوقت الذي تظهر فيه هذه الأعراض، يكون أكثر من 60٪ من خلايا الدوبامين في المادة السوداء قد فقدوا بالفعل7. على الرغم من أن الأعراض غير الحركية تظهر غالبا في وقت مبكر، فإن غياب معايير تقييم محددة وموضوعية يعقد التشخيص المبكر والتدخل8. حاليا، العلاج الأساسي لمرض باركنسون يتضمن إعطاء ليفودوبا9، الذي يتحول إلى دوبامين في الدماغ، مما يعيد تعويض مستويات الدوبامين في المخطط العظيم. بينما يمكن لهذا العلاج أن يخفف الأعراض مؤقتا، إلا أنه لا يوقفتقدم المرض. وبالتالي، فإن المزيد من البحث في مسببات مرض باركنسون وفحص الأدوية أمر ضروري.

بناء نماذج حيوانية مناسبة أمر بالغ الأهمية للبحث حول مسببات مرض باركنسون وفحص أدوية مضاد له. الآن، هناك ثلاثة نماذج رئيسية لدراسات مرض باركنسون: نموذج الحث الكيميائي11، نموذج تحرير الجينات12، ونموذج زراعة الأعضاء الفضائية البشرية13. تشمل الحيوانات النموذجية الشائعة القوارض مثل الفئران14، والرئيسيات غير البشرية مثل القرود15. مؤخرا، حظي سمك الزرد (Danio rerio) باهتمام متزايد في دراسات مرض باركنسون لمزاياه، مثل صغر حجمه، والنمو السريع، والتشابه الجيني العالي مع البشر، والأجنة الشفافة16. استخدام MPTP للسموم العصبية (1-ميثيل-4-فينيل-1,2,3,6-تتراهيدروبيريدين) لتحفيز تلف الخلايا العصبية17,18، هو طريقة كلاسيكية لبناء نموذج اضطراب الشخصية الكهربائية. تظهر سمكة الزرد التي تعرضت لتركيزات MPTP شبه قاتلة أنماط سلوكية مشابهة لمرض باركنسون19.

ومع ذلك، تركز معظم دراسات باركنسون سمك الزرد اليوم بشكل رئيسي على السلوكيات الحركية الأساسية أو الانتقالات البسيطة بين الضوء والظلام16،20، وتحاليل السلوك أحادية البعد يصعب عكس الخصائص السلوكية المعقدة للباركنسون بشكل كامل، خاصة التغيرات السلوكية في الوظائف غير الحركية. نظرا لأن باركنسون مرض يشمل عدة أنظمة عصبية سلوكية خارج نطاق السيطرة الحركية21,22,23، فإن هناك حاجة ماسة لطريقة تقييم النمط السلوكي متعددة المعلمات لالتقاط الأنماط الظاهرية متعددة الأنظمة24.

وبناء عليه، تبني هذه الدراسة بروتوكول تحليل الأنماط الظاهرية السلوكية متعدد الأبعاد وسريع لوصف الأنماط السلوكية الشبيهة بمرض باركنسون في يرقات أسماك الزرد المعالجة ب MPTP بشكل أكثر شمولية. تم تطبيق جرعة شبه قاتلة من MPTP (50 ميكرومولار)25 على اليرقات من يوم إلى خمسة أيام بعد التخصيب (DPF)16،20،26. من 4 إلى 6 DPF 16,20,24، أجرينا 6 اختبارات سلوكية: مراقبة تنظيم النوم واليقظة، نماذج الاستجابة الضوئية، تقييم التاكسيس الثيغموتاكسي، تقييم الحركة، اختبار الاستجابة للذعر، واختبارات تحدي الضوء والظلام. تغطي هذه التقييمات السلوكية الجوانب الحركية وغير الحركية، مثل عجز الحركة، والحس الحركي، وتعلم التعود، والمخاطرة، والاستجابة للتوتر، وإيقاع النوم واليقظة.

باستخدام نظام تتبع الفيديو عالي الإنتاجية Zebrabox وطريقة التحليل الكمي، قمنا باستخراج وقياس معايير سلوكية مختلفة وقارنا الفروق السلوكية بين المجموعة المعالجة ب MPTP ومجموعة النوع البري (WT) من خلال الإحصائيات. مقارنة باختبارات التحليل الباركنسي الحالية لسمك الزرد، تلتقط هذه البطارية السلوكية متعددة المعايير الأنماط الحركية وغير الحركية ضمن إطار موحد. يضمن نظام التتبع الآلي جمعا موضوعيا للبيانات السلوكية وقابلية إعادة إنتاج عالية. بالإضافة إلى ذلك، يسمح حجم جسم اليرقات الصغير بوضع الحيوانات الفردية في صفائح متعددة الآبار، مما يتيح تقييما عالي الإنتاجية. الفوائد السابقة مفيدة لتحليل الآلية المرضية لمرض باركنسون بعمق، وفحص الأدوية أو المركبات المرشحة، واستكشاف تأثير العوامل البيئية على حدوث أو تطور مرض باركنسون.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أجريت هذه الدراسة التي شملت سمك الزرد وفقا للإرشادات المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوانات، وتمت الموافقة عليها من قبل اللجنة الأخلاقية لكلية علوم الصيدلة بجامعة شاندونغ (رقم YXDW2025-0056). المواد المستخدمة والمواد المستخدمة مدرجة في جدول المواد.

1. تحضير MPTP

  1. تحضير وسط 1× E3 عن طريق تخفيف محلول E3 بمقدار 100× 1:100 مع ماء فائق النقي (مثلا، خلط 5 مل من 100× E3 مع 495 مل من الماء فائق النقي للحصول على 500 مل من متوسط 1× E3).
    ملاحظة: حضر E3 متوسط طازج في يوم الاستخدام.
  2. جهز محلول مخزن بسعة 1 مللي مولار MPTP بإضافة 5.0 ملغ من مسحوق MPTP إلى أنبوب طرد مركزي بسعة 50 مل وإضافة وسط E3 إلى حجم نهائي يبلغ 25 مل (استخدم أنبوب الطرد المركزي كحاوية خلط، لكن لا حاجة للطرد المركزي). ضع علامة على المحلول كمحلول مخزوني بسعة 1 مللي مولار MPTP. خزن محلول المخزون في الظلام.
  3. تحضير محلول MPTP بسعة 50 ميكرومول: نقل 2.5 مل من محلول مخزن MPTP بسعة 1 مللي مولار إلى حاوية نظيفة وتخفيفه ب 47.5 مل من وسط E3 للحصول على حجم نهائي يبلغ 50 مل بتركيز نهائي 50 ميكرومولار MPTP. أما الجزء المتبقي من محلول المخزون فظل مخزنا في الظلام.
    تحذير: MPTP هو سم عصبي قوي ويجب التعامل معه بحذر شديد. ارتد دائما معدات الحماية الشخصية المناسبة (PPE)، بما في ذلك القفازات، ومعطف المختبر، ونظارات واقية. التخلص من نفايات MPTP وفقا لإرشادات السلامة البيولوجية المؤسسية.

2. تحضير وتجميع أجنة سمك الزرد

  1. اختر ذكور وأنثى سمك الزرد البالغين الناضجين جنسيا وقم بتربية منظمة باستخدام أحواض تكاثر مزودة بفواصل قابلة للإزالة. في الساعة 8:00 مساء، ضع ذكر وأنثى سمك الزرد الوحشي بشكل منفصل في أحواض التكاثر بنسبة 2:3، وفصلهما بفواصل.
  2. في اليوم التالي، أزل الفواصل عند الساعة 8:00 صباحا للسماح بالتزاوج، وبالتالي بدء التكاثر. اجمع الأجنة بعد ساعة واحدة، واغسلها ثلاث مرات بماء نظيف في النظام.
  3. الأجنة المنزلية في أطباق بتري بحجم 100 مم مع متوسط E3 طازج، وتحتضنها عند 28 درجة مئوية تحت دورة إضاءة 14 ساعة / 10 ساعات مظلمة (الأنوار مضاءة من 08:00 صباحا حتى 10:00 مساء).
    ملاحظة: لا تتجاوز 50 جنينا في كل طبق مع وسط 20 مل لضمان النمو الطبيعي.
  4. عند 1 DPF، قم بإزالة الأجنة غير المخصبة والمشوهة وغير الطبيعية بعناية باستخدام Pasteur Pipette، واستبدلها المحلول الذي يحتوي على أجنة سمك الزرد. بالنسبة لمجموعة WT، استبدل الوسط الحالي بوسط جنين E3 الطازج. بالنسبة للمجموعة المعالجة ب MPTP، استبدل الوسط بمحلول MPTP بسعة 50 ميكرومولار (الشكل 1A)، ثم أعد كلا المجموعتين إلى الحاضنة.
  5. بالنسبة لكلا المجموعتين، استبدل المحلول وقم بإزالة أي أجنة ميتة أو غير صحية كل 24 ساعة. بالنسبة للمجموعة التي تم معالجتها ب MPTP، استبدل محلول MPTP يوميا من صباح 1 DPF حتى صباح 4 DPF (الشكل 1A). ثم نقل المجموعة المعالجة ب MPTP إلى متوسط E3 بدءا من صباح 5 DPF حتى نهاية التجربة.
    ملاحظة: استبدل المحلول بلطف باستخدام ماصحة باستور. استنشق الوسط ببطء من حافة طبق البتري وأضف محلول طازج على طول جدار صحن البتري لتقليل الاضطراب على الأجنة.

3. مراقبة تنظيم النوم واليقظة

  1. عند 4 DPF، اختر يرقات سمك الزرد من كل مجموعة عند الساعة 6:00 مساء، وانقلها إلى صفيحة تحتوي على 96 بئر باستخدام مقطعة Pasteur معدلة بسعة 3 مل مع قطع الطرف، يرقة واحدة لكل بئر (الشكل 1B). تمثل الصفوف الأربعة الأولى مجموعات WT، والصفوف الأربعة الأخيرة تمثل مجموعات MPTP (48 سمكة زرد في كل مجموعة).
    ملاحظة: لتجنب تحفيز أو إلحاق الضرر بسمك الزرد، عدل بيبت باستور عن طريق قطع الطرف (10 مم) لتوفير قطر عريض أكبر من حجم يرقات سمك الزرد 4 DPF (طول الجسم يتجاوز 3.7 مم27,28).
  2. راقب كل بئر باستخدام مجهر ستيريو لضمان صحة مظهر يرقة كل يرقة سمكة الزرد، وأن الزعانف مفتوحة وتتأرجح بانتظام، والجسم منتصب، ومثانة السباحة منتفخة29. بعد التأكد من أن سمك الزرد في كل بئر في حالة صحية، املأ كل بئر بمتوسط E3.
    ملاحظة: املأ كل بئر ببئر E3 متوسط إلى قريب من الانتفاخ، لضمان الحفاظ على التوتر السطحي. أضف السائل بحذر لمنع الفقاعات وتجاوز البئر العابر.
  3. بعد نقل السمك والسائل إلى صفيحة تحتوي على 96 بئر، ضعه في غرفة Zebrabox للتكيف لمدة 30 دقيقة قبل اختبار السلوك النوم-الاستيقاظ.
    ملاحظة: قبل وضع لوحة 96 بئر في غرفة زيبرابوكس، نظف أسفل اللوح بعناية لتجنب تأثير الأوساخ على نتائج تتبع الفيديو.
  4. افتح برنامج تتبع الفيديو Zebralab، اختر وضع الكم ، وتأكد من أن لوحة 96 بئر موضوعة في المركز السفلي لغرفة Zebrabox.
  5. اضبط ضبط الإضاءة ليطفئ الضوء في الساعة 10:00 مساء وتشغيل الضوء في الساعة 8:00 صباحا، وهو ما يتوافق مع ظروف الإضاءة عند تربية سمك الزرد. خلال النهار، يكون الضوء الأبيض عادة حوالي 1000 لوكس. اضبط معلمات البرنامج كما يلي: عتبة الكشف، 40؛ انفجار، 25 (عتبة للحركة المستمرة)؛ تجميد (عتبة للحركة)، 4؛ حجم الصندوق، 60 ثانية؛ إجمالي وقت المراقبة، 52 ساعة (من 8:00 مساء في اليوم الأول حتى 00:00 مساء في اليوم الثالث). ابدأ إجراء النوم والاستيقاظ في الساعة 8:00 مساء.
    ملاحظة: بمجرد بدء الإجراء، منع أي ضوضاء أو اهتزاز من الخارج طوال فترة التجربة، حتى لا تؤثر على إيقاع النوم والاستيقاظ الطبيعي لسمك الزرد. لمنع تبخر الماء أثناء المراقبة طويلة الأمد، غط لوحة 96 بئرا بغلاف بلاستيكي شفاف.
  6. بعد 52 ساعة، أوقف تجربة النوم والاستيقاظ، واحفظ ملف البيانات. أزل لوحة 96 بئر من ZebraBox.
    ملاحظة: باستخدام MATLAB وExcel، هناك معايير ضرورية مثل عدد نوبات النوم (تعرف فترة النوم بأنها فترات خمول تستمر دقيقة واحدة على الأقل)29، متوسط طول فترة النوم (متوسط مدة نوبات النوم)، إجمالي مدة النوم (جميع فترات النوم خلال فترة المراقبة)، زمن الاستجابة للنوم (الفترة من الانتقال الخفيف إلى بداية أول نوبة نوم)، تم استخراج وتحليل متوسط النشاط (يعرف بالنشاط الحركي خلال فترة المراقبة بأكملها)، ونشاط الاستيقاظ (المعروف بالنشاط الحركي خلال فترة اليقظة فقط، باستثناء نوبات النوم) من ملف البيانات.
    1. استخدم اختبار t للطالب لمقارنة الفروقات بين مجموعة WT والمجموعة التي تم معالجتها ب MPTP. بالإضافة إلى ذلك، رسم منحنى النوم، ومنحنى نشاط اليقظة، ومتوسط منحنى النشاط لسمك الزرد خلال 52 ساعة باستخدام برنامج MATLAB.

4. نماذج الاستجابة الحركية الضوئية

ملاحظة: نماذج الاستجابة الحركية الضوئية (بما في ذلك ضوء الوميض) هي اختبارات سلوكية عالية الإنتاجية في يرقات 5 DPF لقياس التغيرات الحسية الحركية والانعكاسية استجابة لانتقال مفاجئ للضوء. تم إجراء هذا الاختبار باستخدام صفيحة بسعة 96 بئرا، شملت نموذجين: (1) انتقال خفيف من دقيقة ظلام إلى دقيقة واحدة من الضوء الثابت (1000 عرض للتردد)، و(2) استجابة ضوء وميض تتضمن الانتقال من دقيقة ظلام إلى دقيقة واحدة من الضوء المتلألئ عند 10 هرتز.

  1. ضع يرقات 5 DPF في صفيحة بها 96 بئر (يرقة واحدة لكل بئر) (الشكل 1B)، واملأ كل بئر بمتوسط E3. قسم ما مجموعه 96 يرقة إلى مجموعة WT ومجموعة MPTP في المتوسط.
  2. نموذج الضوء الثابت والظلام:
    1. ضع صفيحة ال 96 بئر مع يرقات 5 dpf في صندوق الزيبرا ودع اليرقات تتأقلم لمدة 5 دقائق في الظلام قبل الاختبار.
    2. افتح وضع التحليل عبر الإنترنت للتتبع.
    3. اضبط برنامج انتقال الضوء كما يلي: 0-60 ثانية: داكن، 60-120 ثانية: ضوء ثابت (1000 lx).
    4. ابدأ البروتوكول، واجمع معلمات الحركة ذات الصلة كل 6 ثوان خلال الاختبار الذي يستغرق 120 ثانية.
    5. أوقف البروتوكول عند 120ثانية ، ثم أصدر ملف البيانات. ضع اليرقات في ظلام كامل لمدة 5 دقائق للتكيف مع البيئة، مستعدا لاختبار الضوء الوامض الداكن التالي.
  3. نموذج الضوء الوامض الداكن:
    1. اضبط برنامج انتقال الضوء كما يلي: 0-60 ثانية: داكن، 60-120 ثانية: ضوء وميض (1000 عرض أمام) عند 10 هرتز.
      ملاحظة: وميض 10 هرتز يعادل 10 نبضات ضوئية في الثانية. في ZebraLab، نفذ ذلك بالتناوب بين شدة الضوء من 0 إلى 1000 lx كل 100 مللي ثانية.
    2. بعد الانتهاء من تعديل الإضاءة المظلمة لمدة 5 دقائق، ابدأ اختبار الضوء من الظلام إلى الوميض. اجمع معايير الحركة كل 6 ثوان خلال اختبار 120 ثانية.
  4. تحليل البيانات: بمجرد انتهاء الاختبار، قم بتصدير ملف البيانات. استخدم برنامج MATLAB لاستخراج مسافة السباحة كل 6 ثوان. رسم المسافة الكلية (متوسط القيمة لكل 6 ثوان) التي تم سباحيها خلال فترة دقيقتين لكلا الاختبارين. احسب مؤشر التجمد بطرح إجمالي المسافة المقطوعة في دقيقة واحدة في الظلام من إجمالي المسافة المقطوعة في الضوء30.
    ملاحظة: مؤشر التجمد < 0 يشير إلى سلوك التجميد؛ مؤشر التجمد > 0 يشير إلى الهروب؛ مؤشر التجمد = 0 يعني عدم وجود تفاعل. استخدم اختبار t للطالب وتحليل النوفاع ثنائي الاتجاه لمقارنة الفروقات بين مجموعة WT والمجموعة المعالجة ب MPTP. تم استخدام ما مجموعه 48 يرقة من سمكة الزرد (n = 48) لكل مجموعة.

5. تقييم التاكسي

  1. اختر لوحين ب 6 آبار، واملأ كل بئر ب 4 مل من E3 متوسط.
  2. عند 5 DPF، تم جمع يرقات سمك الزرد من مجموعة WT ومجموعة معالجة MPTP ووضعها في لوحين من 6 آبار (واحدة هي مجموعة WT، والأخرى المجموعة المعالجة ب MPTP، يرقة واحدة لكل بئر) (الشكل 1C).
    ملاحظة: تأكد من أن الموقع الأولي لليرقات يكون في مركز الآبار.
  3. قبل تقييم الثيغموتاكسيس، يجب وضع ألواح البئر في الموقع المناسب لزيبرا بوكس قبل 15 دقيقة لاستيعاب ذلك.
  4. جمع البيانات وتحليلها: باستخدام دالة مساحة السحب ، ارسم دائرتين متحدتين المركز في منطقة المراقبة لكل بئر (نصف قطر الدائرة المركزية يمثل نصف نصف قطر الثقب) (الشكل 1C)، ويتم تعيين المعلمات المتبقية لتكون مماثلة لتقييم الحركة. ابدأ البروتوكول لتقييم ثيغموتاكسيس لمدة 5 دقائق، وقم بتجربة موازية.
    ملاحظة: بعد انتهاء البرنامج، سيقوم برنامج Zebralab بتوليد مسار يرقات سمك الزيبرا خلال 5 دقائق ومعلمات حركة مختلفة ذات صلة. في ملف البيانات، تمثل an1 المساحة الكاملة لكل بئر، وتمثل an2 المنطقة الداخلية لكل بئر. لذا، تشير المجموع dis(an1) وإجمالي dur(an1) إلى إجمالي مسافة السباحة والوقت الإجمالي الذي قضى في البئر بأكمله، بينما يمثل إجمالي dis(an2) وإجمالي dur(an2) المسافة والوقت القضائي في المنطقة الداخلية على التوالي.
    1. احسب ثيغموتاكسيس باستخدام الصيغ التالية:
      احسب نسبة المسافة التي تم سباحيها في المنطقة الخارجية:
      figure-protocol-1
      احسب نسبة الوقت الذي يقضيه في المنطقة الخارجية:
      figure-protocol-2
    2. استخدم اختبار t للطالب لمقارنة فروقات التاكسي بين مجموعة WT والمجموعة المعالجة ب MPTP. تم استخدام ما مجموعه 24 يرقة من سمك الزرد (n = 24) لكل مجموعة.

6. تقييم الحركة

  1. عند 5 dpf، يتم اختيار يرقات سمك الزرد من مجموعة WT ومجموعة معالجة MPTP، ويتم نقلها على التوالي إلى صفيحتين من 12 بئر (واحدة هي مجموعة WT، والأخرى المجموعة المعالجة ب MPTP، يرقة واحدة لكل بئر، مع 2 مل من وسط E3) (الشكل 1D).
    ملاحظة: تأكد من أن أحجام يرقات سمك الزرد متشابهة، ويجب أن تكون اليرقات المختارة ذات زعانف مفتوحة، ووضعية منتصبة، وتمدد جيد لمثانة السباحة، وحركة منتظمة.
  2. قبل تقييم الحركة، ضع صفيحة البئر في وضع اختبار زيبرابوكس قبل 15 دقيقة للتكيف.
    ملاحظة: تأكد من أن ظروف الإضاءة أثناء التكيف تتوافق مع ظروف الإضاءة أثناء الاختبار.
  3. بعد فترة تأقلم مدتها 15 دقيقة، اختر وضع التتبع - تحليل عبر الإنترنت، وسجل نشاط الحركة لكل يرقة لمدة 5 دقائق باستخدام نظام تتبع فيديو محوسب آلي. باستخدام برنامج Zebralab لجمع مسارات الحركة ومجموعة متنوعة من معلمات الحركة ذات الصلة كل 60 ثانية، وتصدير ملف البيانات الكامل، واستخدام MATLAB لتحليل المسافة الكلية ومتوسط السرعة لكل يرقة خلال 5 دقائق.
    1. استخدم اختبار t للطالب وتحليل النوفاع ثنائي الاتجاه لمقارنة الفروقات بين مجموعة WT والمجموعة المعالجة ب MPTP. تم استخدام ما مجموعه 24 يرقة من سمك الزرد (n = 24) لكل مجموعة.

7. اختبار استجابة الدهشة

ملاحظة: يقيس هذا الاختبار استجابة الذعر البصري (VSR)، المعروفة أيضا باسم الذعر الناتج عن وميض الظلام، والتي تنشأ من الانتقالات المفاجئة إلى الظلام. يقيم هذا الاختبار استجابة الذعر صدمة بصرية مستثارة بفعل الفوتوك ناتجة عن ومضات مظلمة مفاجئة على مقياس مثلثي ثانية. على عكس نموذج الضوء الوميض المظلم، الذي يتضمن تكرار نبضات الضوء لتقييم الاستجابات السلوكية المستمرة، يركز هذا الاختبار على ردود فعل سريعة وانعكاسية للمنبه البصري الحاد.

  1. التحضيرات: عند 5 DPF، يتم اختيار يرقات سمك الزرد من مجموعة WT والمجموعة المعالجة ب MPTP، ونقلها على التوالي إلى صفيحتين من 12 بئر (واحدة هي مجموعة WT، والأخرى مجموعة معالجة MPTP، يرقة واحدة لكل بئر، مع وسط E3 بسعة 2 مل) (الشكل 1D).
  2. قبل اختبار الاستجابة للدهشة، ضع صفيحة البئر في وضع اختبار زيبرا بوكس قبل 5 دقائق للتكيف.
  3. حدد معلمات التحفيز: افتح برنامج Zebralab ، شغل وضع التحليل Tracking-online ، افتح واجهة تشغيل الضوء ، اختر استخدام إحدى طرق التفعيل الثلاث أدناه، تفعيل المحفزات المحسنة، واضبطه عند بدء الجلسة؛ في جدول الانتقال، يعرف إيقاع الفلاش المظلم كما يلي (يبدأ البرنامج في التفعيل بعد 21 ثانية): الانتقال 1: 5 مللي ثانية، شدة الضوء 100٪؛ الانتقال 2: 2890 مللي ثانية، شدة الضوء 100٪؛ الانتقال 3: 5 مللي ثانية، 0٪ شدة الضوء؛ الانتقال 4: 100 مللي ثانية، 0٪ شدة الضوء؛ ضع علامة على قائمة الانتقالات لضمان الوميض الدوري.
  4. بروتوكول البدء: تأكد من تفعيل وظيفة تسجيل الفيديو في Numeriscope، حيث سيولد التتبع الآلي عالي الإنتاجية مجموعة بيانات متعددة الأبعاد تشمل 30 نقطة نهاية سلوكية في هذا الاختبار الذي يستغرق 90 ثانية.
  5. تحليل البيانات: بعد الانتهاء من اختبار استجابة الذعر، يتم تصدير ملفات البيانات الخام واستيرادها إلى برنامج MATLAB للتحليل. احسب مسافة السباحة لكل يرقة على فواصل 3 ثانية، مع متوسط سرعة السباحة.
    1. حدد مسافة الحركة القصوى، السرعة القصوى، أو زمن الاستجابة بعد المحفز الوميضي لكل مجموعة. استخدم اختبار t للطالب وتحليل النوفاع ثنائي الاتجاه لمقارنة الفروقات بين مجموعة WT والمجموعة المعالجة ب MPTP. تم استخدام ما مجموعه 24 يرقة من سمك الزرد (n = 24) لكل مجموعة.

8. اختبار تحدي الضوء والظلام

  1. عند 5 DPF، انقل يرقات سمك الزرد بشكل فردي إلى لوحين من 24 بئر (الشكل 1E)، مع يرقة واحدة لكل بئر و1 مل من متوسط E3 في كل بئر. احتوت كل صفيحة على 24 يرقة، وتم تقسيم اللوحتين المكونتين من 24 بئر بشكل متساو إلى مجموعة WT ومجموعة معالجة MPTP (n = 24 لكل مجموعة).
  2. قبل الاختبار، ضع لوحة ال 24 بئر في منطقة الاختبار المخصصة داخل زيبرا بوكس لفترة تأقلم ضوئي مدتها 5 دقائق لتكييف بيئة الاختبار. فعل وضع التحليل عبر الإنترنت للتتبع. قم بتكوين برنامج الضوء كما يلي: 6 دقائق من الضوء المستمر تليها 4 دقائق من الظلام التام (الشكل 1E). إجمالي وقت الاختبار هو 10 دقائق، ووقت جمع البيانات هو 60 ثانية.
    ملاحظة: ال 6 دقائق من الضوء العالمية مخصصة للتكيف والتعود، لضمان استقرار خط الحركة الأساسي واستجابات خاصة بين الضوء والظلام31,32.
  3. فيالدقيقة العاشرة، أوقف التسجيل السلوكي واحفظ البيانات. أزل الطبق بحذر من صندوق الزبرا.
  4. لكل يرقة، استخرج مسافة السباحة عند كل فترة 60 ثانية. احسب المسافة المقطوعة خلال المرحلة المضيئة (0 إلى 6 دقائق)، والمرحلة المظلمة (7 إلى 10دقائق)، وإجمالي فترة العشر دقائق. قم بقياس سلوك ثيغموتاكسيس وأداء التعلم التعويدي في المرحلة المظلمة.
    ملاحظة: يعرف تعلم التعود بأنه تقليل الاستجابة السلوكية عندما يتعرض الحيوان لمنبه/بيئة مستمرة33،34، وتم تقييمه إحصائيا من خلال مقارنة متوسط المسافة الكلية التي تم تحريكها (مم) خلال الدقيقة الأولىوالدقيقة الرابعة بعد الانتقال من الضوء إلى الظلام. استخدم اختبار t للطالب وتحليل النوفاع ثنائي الاتجاه لمقارنة الفروقات بين مجموعة WT والمجموعة المعالجة ب MPTP. تم استخدام ما مجموعه 24 يرقة من سمك الزرد (n = 24) لكل مجموعة.

9. التخلص من نفايات MPTP

ملاحظة: بعد كل تجربة سلوكية، رش وامسح الأسطح التي تلامست مع MPTP (مثل طاولات المختبر وجهاز ZebraBox) باستخدام هيبوكلوريت الصوديوم الجاهز حديثا (مبيض؛ ≥10٪ v/v).

  1. اجمع النفايات السائلة (بما في ذلك محاليل التعرض المتبقية ووسائط الشطف) والنفايات الصلبة (مثل ماصات باستور، القفازات، أطباق بتري، وألواح متعددة الآبار) من MPTP. من الواضح أن تصنفها على أنها نفايات عصبية سامة خطيرة.
  2. عالج النفايات السائلة الملوثة والمواد الصلبة بهيبوكلوريت الصوديوم المحضر حديثا (مبيض؛ ≥10٪ v/v) لمدة لا تقل عن 24 ساعة لضمان إزالة التلوث، ثم التخلص منه وفقا للوائح المؤسسات.
  3. قم بقتل يرقات سمك الزرد المعالجة ب MPTP بالغمر في محلول هيبوكلوريت الصوديوم المخفف (مثل نسبة 1:5 من 6٪ مبيض: ماء) لمدة 5 دقائقو35 دقيقة. تم تأكيد الوفاة بسبب قلة الحركة أو نبض القلب. عامل اليرقات والوسائط المنكوبة كنفايات بيولوجية خطرة للتخلص منها في المؤسسات (وفقا للبروتوكولات المعتمدة مؤسسيا).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

مراقبة تنظيم النوم واليقظة
بدأت مراقبة تنظيم النوم-الاستيقاظ لمدة 52 ساعة عند 4 DPF وأجريت باستخدام لوحة بسعة 96 بئر. أظهر سمك الزرد المعالج ب MPTP اضطرابات كبيرة في بنية النوم مقارنة بمجموعة WT. تظهر منحنيات النوم التمثيلية، ومخططات نشاط الاستيقاظ، ومتوسط آثار النشاط في الشكل 2. تعرض معايير تحليل تنظيم النوم واليقظة في يرقات سمك الزرد في الشكل 3. زاد إجمالي وقت النوم بشكل ملحوظ في مجموعة MPTP مقارنة ب WTs (p...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

طورت هذه الدراسة وتحققت من بروتوكول شامل لتقييم وتحليل النمط السلوكي المشابه لمرض باركنسون الناتج عن MPTP. دمج هذا البروتوكول 6 اختبارات مختلفة: تقييم الحركة، اختبار التاكسي الصغري، اختبار الاستجابة للذعر، نماذج الاستجابة الحركية الضوئية (بما في ذلك تحفيز الضوء الوامض)، اختبار تحدي الضوء والظلام، ومراقبة تنظيم النوم والاستيقاظ، لتقييم وتصوير العيوب الحركية وغير الحركية في باركنسون. أشارت النتائج إلى أنه مقارنة بمجموعة الزرد، أظهرت يرقات سمك الزرد المعالجة ب MPTP تغيرات سلوكية حركية وغير ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون عدم وجود تضارب مصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد تم دعم هذا العمل بمنح من المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (رقم 21906095)، ورعاية برنامج العلماء الشباب في جامعة شاندونغ، ومؤسسة شاندونغ للعلوم الطبيعية (رقم ZR2019BB018)، وصناديق البحث الأساسية لجامعة شاندونغ (رقم 2017GN0030)، ومؤسسة علوم ما بعد الدكتوراه الصينية (رقم 2018M640640). كما يحظى بدعم من صندوق البحث المفتوح لعام 2025 من معهد فوجيان الرقمي للبيانات الضخمة لإعادة تأهيل كبار السن والتمريض (منحة رقمية) BDRI202502) وصندوق البحث المفتوح لعام 2025 من المختبر الرئيسي للمواد الحيوية النشطة، وزارة التعليم، جامعة نانكاي (منحة رقم: SWHX-202503). مشروع بحثي لمختبر جينان للطب الحيوي الميكروبيئي في شاندونغ (منحة رقم JNL-2023002KF). يرغب المؤلفون في شكر مركز الحيوانات المختبرية، مستشفى تشيلو بجامعة شاندونغ، والدكتورة سون تشنغشي من قسم المختبر السريري في مستشفى تشيلو بجامعة شاندونغ، على مساعدتهم خلال التجربة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
100&00 مرة؛ محلول E3شنغهاي في فيشي للتكنولوجيا الحيويةلا يوجدتحتوي على 34.8 جرام NaCl، 1.6 جرام KCl، 5.8 جرام CaCl2· 2H2O، و9.78 جرام MgCl2· 6H2O لكل لتر
صفيحة زراعة الخلايا ذات 12 بئرتقنية NEST الحيوية712011غير معالج، غير بيروجيني، معقم، بوليسترين. يستخدم في اختبارات سلوك يرقات سمك الزرد
لوحة زراعة الخلايا ذات 24 بئرتقنية NEST الحيوية702011غير معالج، غير بيروجيني، معقم، بوليسترين. يستخدم في اختبارات سلوك يرقات سمك الزرد
3 ملل باستور بيبيتبيولوجيكس30-0238A1
لوحة زراعة الخلايا ذات ال6 آبارتقنية NEST الحيوية703011غير معالج، غير بيروجيني، معقم، بوليسترين. يستخدم في اختبارات سلوك يرقات سمك الزرد
صفيحة زراعة الخلية ذات 96 بئرتقنية NEST الحيوية701011غير معالج، غير بيروجيني، معقم، بوليسترين. يستخدم في اختبارات سلوك يرقات سمك الزرد
ماتلاب R2020aMathWorks، الولايات المتحدة الأمريكية لا يوجدMATLAB R2020a، ترخيص شامل للحرم الجامعي تم الحصول عليه من بوابة البرمجيات بجامعة شاندونغ (softms.sdu.edu.cn). يستخدم للتحليل الإحصائي لبيانات سلوك يرقات سمك الزرد.
مايكروسوفت إكسلمايكروسوفتلا يوجدمايكروسوفت إكسل (جزء من مايكروسوفت أوفيس)، نسخة تم تثبيتها عبر بوابة البرمجيات المرخصة لجامعة شاندونغ (softms.sdu.edu.cn).
MPTP(1-ميثيل-4-فينيل-1,2,3,6-تتراهيدروبيريدين) بيوتايم411252815 ملغ
بيتري ديشتقنية NEST الحيوية704202100 مم، معقم، مقبض سهل التماسك، معالج ب TC
محلول هيبوكلوريت الصوديومماكلينS817439محلول مبيض منزلي مخزن (أساس الكلور النشط 6-14٪)، مخفف إلى &GE؛ 10٪ فولت/فولت لإزالة التلوث السطحي والمخلفات؛ كما تم تخفيفه بنسبة 1:5 (6٪ مبيض: ماء) لقتل الرحيم ليرقات سمك الزرد المعالجة ب MPTP.
المجهر الستيريوأوليمبوسسلسلة SZX2
نظام تتبع الفيديو عالي الدقة زيبرابوكس فيوبوينت، فرنسا لا يوجد
Zebralab Software  فيوبوينت، فرنسا لا يوجدالنسخة (3,52,3,87)

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Elbaz, A., Carcaillon, L., Kab, S., Moisan, F. Epidemiology of Parkinson's disease. Rev. Neurol. (Paris). 172 (1), 14-26 (2016).
  2. Elgueta, D., et al. Analyzing the Parkinson's disease mouse model induced by adeno-associated viral vectors encoding human alpha-synuclein. J Vis Exp. (185), e63313(2022).
  3. Peng, S. Y., Liu, P., Wang, X. W., Li, K. Y. Global, regional and national burden of Parkinson's disease in people over 55 years of age: a systematic analysis of the global burden of disease study, 1991-2021. BMC Neurol. 25, 178(2025).
  4. Zhu, J. Q., et al. Temporal trends in the prevalence of Parkinson's disease from 1980 to 2023: a systematic review and meta-analysis. Lancet Healthy Longev. 5 (7), 464-479 (2024).
  5. Goldman, J. G. Non-motor symptoms and treatments in Parkinson's disease. Neurol Clin. 43 (2), 291-317 (2025).
  6. Kobylecki, C. Update on the diagnosis and management of Parkinson's disease. Clin Med. (Lond). 20 (4), 393-398 (2020).
  7. Zhou, J., Li, J., Papaneri, A. B., Kobzar, N. P., Cui, G. Dopamine neuron challenge test for early detection of Parkinson's disease. NPJ Parkinsons Dis. 7, 116(2021).
  8. Tolosa, E., Garrido, A., Scholz, S. W., Poewe, W. Challenges in the diagnosis of Parkinson's disease. Lancet Neurol. 20 (5), 385-397 (2021).
  9. Salat, D., Tolosa, E. Levodopa in the treatment of Parkinson's disease: Current status and new developments. J. Parkinsons Dis. 3 (3), 255-269 (2013).
  10. Kalia, L. V., et al. Disease-modifying therapies for Parkinson's disease: Lessons from multiple sclerosis. Nat Rev Neurol. 20 (12), 724-737 (2024).
  11. Thirugnanam, T., Santhakumar, K. Chemically induced models of Parkinson's disease. Comp. Biochem. Physiol C Toxicol Pharmacol. 252, 109213(2022).
  12. Crabtree, D. M., Zhang, J. H. Genetically engineered mouse models of Parkinson's disease. Brain Res. Bull. 88 (1), 13-32 (2012).
  13. Hallett, P. J., et al. Successful function of autologous iPSC-derived dopamine neurons following transplantation in a non-human primate model of Parkinson's disease. Cell Stem Cell. 16 (3), 269-274 (2015).
  14. Dovonou, A., et al. Animal models of Parkinson's disease: bridging the gap between disease hallmarks and research questions. Transl. Neurodegener. 12, 36(2023).
  15. Potts, L. F., et al. Modeling Parkinson's disease in monkeys for translational studies: A critical analysis. Exp. Neurol. 256, 133-143 (2014).
  16. Doyle, J. M., Croll, R. P. A critical review of zebrafish models of Parkinson's disease. Front. Pharmacol. 13, 835827(2022).
  17. Bagwell, E., Larsen, J. A. A review of MPTP-induced Parkinsonism in adult zebrafish to explore pharmacological interventions for human Parkinson's disease. Front. Neurosci. 18, 1451845(2024).
  18. Feng, X. -Z., et al. Behavioral assessments of spontaneous locomotion in a murine MPTP-induced Parkinson's disease model. J Vis Exp. 143, e58653(2019).
  19. Razali, K., Kumar, J., Mohamed, W. M. Y. Characterizing the adult zebrafish model of Parkinson's disease: a systematic review of dynamic changes in behavior and physiology post-MPTP administration. Front. Neurosci. 18, 1432102(2024).
  20. Brinez-Gallego, P., et al. Experimental models of chemically induced Parkinson's disease in zebrafish at the embryonic larval stage: A systematic review. J Toxicol Environ Health B Crit Rev. 26 (4), 201-237 (2023).
  21. Xu, Z. H., et al. Deep clinical phenotyping of Parkinson's disease: Towards a new era of research and clinical care. Phenomics. 2 (5), 349-361 (2022).
  22. Tinaz, S. Functional connectome in Parkinson's disease and Parkinsonism. Curr Neurol Neurosci Rep. 21, 24(2021).
  23. Costa, H. N., et al. Parkinson's disease: A multisystem disorder. Neurosci Bull. 39 (1), 113-124 (2023).
  24. Christensen, C., Thorsteinsson, H., Maier, V. H., Karlsson, K. Æ Multi-parameter behavioral phenotyping of the MPP⁺ model of Parkinson's disease in zebrafish. Front Behav Neurosci. 14, 623924(2020).
  25. Zhang, S., et al. Anti-Parkinson's disease activity of phenolic acids from Eucommia ulmoides Oliver leaf extracts and their autophagy activation mechanism. Food Funct. 11 (2), 1425-1440 (2020).
  26. Maleski, A. L. A., et al. Integrated behavioral and proteomic characterization of MPP⁺-induced early neurodegeneration and Parkinsonism in zebrafish larvae. Int J Mol Sci. 26 (14), 6762(2025).
  27. Vauti, F., et al. All-age whole mount in situ hybridization to reveal larval and juvenile expression patterns in zebrafish. PLoS One. 15 (8), e0237167(2020).
  28. Parichy, D. M., et al. Normal table of postembryonic zebrafish development: staging by externally visible anatomy of the living fish. Dev Dyn. 238 (12), 2975-3015 (2009).
  29. Lee, D. A., Oikonomou, G., Prober, D. A. Large-scale analysis of sleep in zebrafish. Bio Protoc. 12 (3), e4313(2022).
  30. Shen, Q., et al. Rapid well-plate assays for motor and social behaviors in larval zebrafish. Behav Brain Res. 391, 112625(2020).
  31. Rock, S., et al. Detailed analysis of zebrafish larval behaviour in the light-dark challenge assay shows that diel hatching time determines individual variation. Front Physiol. 13, 827282(2022).
  32. Hillman, C., Kearn, J., Parker, M. O. A unified approach to investigating 4 dpf zebrafish larval behaviour through a standardised light/dark assay. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry. 134, 111084(2024).
  33. Best, J. D., et al. Non-associative learning in larval zebrafish. Neuropsychopharmacol. 33 (5), 1206-1215 (2008).
  34. Gomez-Laplaza, L. M., Gerlai, R. Latent learning in zebrafish (Danio rerio). Behav Brain Res. 208 (2), 509-515 (2010).
  35. Winn, A. A., Prestia, K. A., Peneyra, S. M. Testing alternative surface disinfection agents for zebrafish (Danio rerio) embryos. J Am Assoc Lab Anim Sci. 60 (5), 510-518 (2021).
  36. Wagle, M., Nguyen, J., Lee, S., Zaitlen, N., Guo, S. Heritable natural variation of an anxiety-like behavior in larval zebrafish. J Neurogenet. 31 (3), 138-148 (2017).
  37. Maximino, C., et al. Measuring anxiety in zebrafish: a critical review. Behav Brain Res. 214 (2), 157-171 (2010).
  38. Schnorr, S. J., Steenbergen, P. J., Richardson, M. K., Champagne, D. L. Measuring thigmotaxis in larval zebrafish. Behav Brain Res. 228 (2), 367-374 (2012).
  39. Dekens, M. P. S., Fontinha, B. M., Gallach, M., Pflugler, S., Tessmar-Raible, K. Melanopsin elevates locomotor activity during the wake state of the diurnal zebrafish. EMBO Rep. 23 (5), e51528(2022).
  40. Lee, H. B., et al. Key HPI axis receptors facilitate light adaptive behavior in larval zebrafish. Sci Rep. 14 (1), 7759(2024).
  41. Cavanagh, J. F., Kumar, P., Mueller, A. A., Richardson, S. P., Mueen, A. Diminished EEG habituation to novel events effectively classifies Parkinson's patients. Clin Neurophysiol. 129 (2), 409-418 (2018).
  42. Bedrossiantz, J., Prats, E., Raldua, D. Neurotoxicity assessment in adult Danio rerio using a battery of behavioral tests in a single tank. J Vis Exp. 201, e65869(2023).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

MPTP

مقالات ذات صلة