تسجيلات الفوتومترية متعددة الألياف ثنائية اللون لشبكة السلوك الاجتماعي في الفئران

Eartha Mae Guthman; Jorge M. Iravedra-García; Polina Cherepanova; Sae Yokoyama; Sophie E. Lockwood; Stefan N. Oline; Annegret L. Falkner

doi:10.3791/70049

مقالة منهجية

تسجيلات الفوتومترية متعددة الألياف ثنائية اللون لشبكة السلوك الاجتماعي في الفئران

DOI:

10.3791/70049

⸱

مارس 17, 2026

Eartha Mae Guthman^*¹ , Jorge M. Iravedra-García^*¹ , Polina Cherepanova¹ , Sae Yokoyama¹ , Sophie E. Lockwood¹ , Stefan N. Oline¹ , Annegret L. Falkner¹

¹Princeton Neuroscience Institute, Princeton University

^* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الفوتومترية بالألياف هي واحدة من أكثر التقنيات شيوعا لتسجيل نشاط الكالسيوم من مجموعات الأعصاب العميقة في الدماغ. هنا، نصف بروتوكولا للتصوير متعدد المواقع ثنائي اللون القابل للتخصيص لنشاط الكالسيوم وإشارات فلورية ديناميكية أخرى من مجموعات عصبية عميقة الدماغ في الفئران.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الفوتومترية الليافية، وهي تسجيل الإشارات بشكل جماعي عبر كابل ألياف بصرية، هي طريقة مفيدة لتسجيل نشاط الكالسيوم من مجموعات الخلايا العصبية في القارض الحر الحر. على وجه الخصوص، تجعل هذه الطريقة استهداف مجموعات صغيرة من الخلايا العصبية المحددة وراثيا في مناطق أكثر بطنية وأقل وصولا من الدماغ مشكلة قابلة للحل، حيث لا يزال من الصعب تسجيلها بدقة خلوية. يمكن توسيع هذه التقنية لتسجيل من عدة مواقع في نفس الوقت باستخدام نهج متعدد الألياف المجمع، ويمكنها استهداف أنواع خلايا متعددة باستخدام استراتيجيات جينية في كل موقع مسجل. هنا، نقدم بروتوكولا لكيفية بناء وإدراج مصفوفات متعددة الألياف مخصصة لاستهداف شبكة السلوك الاجتماعي للفأرة (حتى 12 موقعا). يوضح هذا البروتوكول الإجراءات الجراحية اللازمة لاستهداف عدة مواقع بنجاح باستخدام مصفوفات الألياف المتعددة المخصصة لدينا والنهج الفيروسي لتوصيل مؤشرات فلورية مائلة إلى الأخضر والأحمر لنشاط الكالسيوم للتصوير المتزامن لمجموعتين عصبيين محددتين وراثيا في كل موقع. نعرض كيفية التسجيل من هذه المناطق باستخدام نظام كاميرا مكمل لأكسيد المعادن (CMOS) المتوفر تجاريا أثناء السلوك الاجتماعي. علاوة على ذلك، يوضح هذا البروتوكول طرق مراقبة الجودة ويفصل خط معالجة مسبقة لتصحيح الضوضاء وتوحيد القياس. وأخيرا، نناقش بعض التطبيقات المحتملة للأداة لاكتشاف نتائج جديدة حول شبكات الدماغ واسعة النطاق.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

برز الفوتومتري الليفي، وهو التسجيل الجماعي للإشارات الفلورية عبر كابلات الألياف البصرية، كتقنية قوية لقياس نشاط الأعصاب في مناطق أعماق الدماغ. غالبا ما لا تكون هذه المناطق سهلة الوصول إليها باستخدام المنظار المجهري أو الأساليب الكهربائية الفيزيولوجية التقليدية ^1,2,3. هدف رئيسي في علم الأعصاب النظامي المعاصر هو تحديد وفك الحسابات التي تستخدمها شبكات الدماغ واسعة النطاق الخاصة بنوع الخلية المشاركة في توليد السلوك. تتفوق مجسات النيروبكسل والحلقات متعددة الألياف التجارية المتاحة في تسجيل المجموعات العصبية الخطية 4,5,6,7، بينما يوفر التصوير القشري واسع النطاق تغطية ممتازة للديناميكيات القشرية السطحية ^8,9. ومع ذلك، ظل التسجيل في الوقت نفسه من مجموعات عصبية تحت قشرية متفرقة مكانيا لكنها متصلة وظيفيا تحديا تقنيا 5,10,11,12. علاوة على ذلك، بينما من الممكن استهداف عدة هياكل عميقة في الدماغ باستخدام عدة حلقات من ألياف واحدة للقياس الضوئي، فإن هذا النهج يقتصر على مجموعات عصبية بعيدة بما يكفي عن بعضها البعض لزرع عدة عقارات¹². تعالج مصفوفات الفوتومترية متعددة الألياف المخصصة هذه الفجوة من خلال تمكين تسجيلات متزامنة من العديد من المناطق تحت القشرية في الحيوانات التي تتصرف بحرية مع قيود قليلة، مما يوفر نافذة فريدة للتنسيق على مستوى الشبكة أثناء السلوكيات المعقدة.

تمثل شبكة السلوك الاجتماعي (SBN) نظاما مثاليا للتحقيق في ديناميكيات شبكات الدماغ واسعة النطاق. SBN هو مجموعة مترابطة بشكل كثيف ومحفوظة تطوريا من البنى تحت القشرية المشاركة في توليد السلوك الاجتماعي، وقد تم تحديدها عبر جميع فئات الفقاريات¹³^، ¹⁴^، ¹⁵. تشمل هذه البنى تقليديا، ولكن لا تقتصر على، الحاجز الجانبي، المنطقة قبل البصرية، نواة السرير للشريط النهائي، النوى الأمامية والبطنية تحت المهاد، اللوزة الدماغية الإنسية، النواة الأكمبنس، والرمادي حول القناة 13,14,15. داخل SBN، تلعب مجموعات عصبية محددة معرفة بواسطة علامات جزيئية أدوارا حاسمة في تنظيم السلوك الاجتماعي. تمثل الخلايا العصبية SBN ɣ-أمينوبوتيريك الأحماض الكهربائية (GABAergic) (المميزة بتعبير ناقل GABA الحويصلي، أو VGAT) والعصبونات الجلوتاماتية (التي تميز بتعبير ناقل الغلوتامات الحويصلي، أو VGlut) الأنواع الرئيسية للخلايا المثبطة والمثبطة داخل الشبكة، ومن المرجح أن تلعب أدوارا قابلة للتفكك في تنظيم الفعل الاجتماعي 16,17,18,19. بعيدا عن هذه الأنظمة الكلاسيكية للناقلات العصبية، تلعب إشارات هرمونات الجنس دورا حيويا في وظيفة الشبكة. على سبيل المثال، تتطلب العديد من السلوكيات الاجتماعية للذكور والإناث التعبير عن مستقبل الإستروجين ألفا، والنشاط في خلايا SBN التي تعبر عن هذه المستقبلات هو ما يدفع هذه السلوكيات سببيا¹⁶^،²⁰^،²¹^،²²^،²³^،²⁴^،²⁵^،²⁶. بالإضافة إلى ذلك، تثري مجموعات الأعصاب في SBN بالروابط والمستقبلات للعديد من الأنظمة العصبية المعدلة، بما في ذلك الدوبامين، الأرجينين فازوبريسين، الأوكسيتوسين، الأفيونات، التاكيكينين، النوريروببتيد Y، البرولاكتين، الأوركسين، الببتيد المرتبط بالأجوتي، الميلانوكورتينات، الكيسبتين، والهرمون الصادر عن التروبين 17,18,19,27,28,29,30,³¹، وتسمح التطورات الحديثة في أجهزة الاستشعار المشفرة وراثيا الآن بتتبع العديد من هذه الجزيئات المتنوعة للإشارة³²^، ^33، ³⁴^، ³⁵^، ³⁶^، ³⁷^، ³⁸. نظرا لأن مجموعات الأعصاب في SBN موزعة مكانيا عبر البنى تحت القشرية، فإن التحضيرات التجريبية التقليدية (مثل كهربية الفيزيولوجيا خارج الخلية، تصوير سطح القشر، والأساليب السابقة للفوتومترية متعددة الألياف) غير قادرة على التقاط ديناميكيات النشاط اللحظية عبر هذه الشبكة الدماغية واسعة النطاق. ومع ذلك، من خلال مراقبة ديناميكيات الكالسيوم في مجموعات عصبية معرفة وراثيا إلى جانب أنماط إطلاق المعدل العصبي، يمكن لمنصات الفوتومترية متعددة المواقع المخصصة أن تكشف عن أنواع الخلايا والجزيئات الإشارة المحددة التي تشفر خصائص معينة للسلوك الاجتماعي، مما يوفر رؤى ميكانيكية جديدة.

هنا، طورنا منصة قابلة للتخصيص لقياس الألياف متعدد المواقع ذو اللونين، تتيح التسجيل المتزامن من ما يصل إلى 12 منطقة دماغية في فئران حرة السلوك. باستخدام هذا النهج، أجرينا تسجيلات فوتومترية ثنائية اللون لنشاط الكالسيوم من 22 مجموعة عصبية محددة موزعة على 11 منطقة دماغية من SBN، إلى جانب قياسات تقلبات الدوبامين في النواة الأكومبنس باستخدام حساس DA القائم على تفعيل GPCR (GRAB-DA1m)³³ (الجدول 1). يوضح هذا البروتوكول (الشكل 1) بناء مصفوفات متعددة الألياف مخصصة، وإجراءات جراحية لاستهداف مواقع متعددة في أعماق الدماغ، واستراتيجيات توصيل الفيروسات للتعبير عن مؤشرات الكالسيوم المزدوجة (GCaMP³⁹ و RCaMP⁴⁰)، وجمع البيانات باستخدام نظام الفوتومترية الليفية المعتمد على كاميرا CMOS التجاري، وطرق مراقبة الجودة، وخط معالجة مسبقة لتصحيح الضوضاء وتوحيد الإشارة. والأهم من ذلك، أن خط معالجة ما قبل المعالجة لدينا يتضمن تسجيلات تحكم متساوية في الأطوال الموجية التي تتيح لنا إجراء تصحيح تشوهات الحركة. نتبع نهجا قائما على الانحدار⁴¹ لتصحيح التشوهات الحركية، مع ضمان دقة الإشارة أثناء السلوكيات الاجتماعية القوية مثل الصعود أو القتال. نظرا لأن طريقتنا المخصصة للقياس الضوئي متعدد الألياف يمكنها مراقبة النشاط المنتشر عبر البنى العميقة في الدماغ القريب والبعيد في الوقت نفسه، مع الحفاظ على خصوصية نوع الخلايا للتسجيلات من خلال الاستهداف الجيني ^42,43، فهي تقدم مزايا كبيرة مقارنة بالطرق البديلة لتسجيل ديناميكيات النشاط العصبي عبر شبكات الدماغ العميقة وواسعة النطاق.

هذا البروتوكول مناسب بشكل مثالي للتجارب التي تتطلب تسجيلات متزامنة من مناطق دماغية تحت قشرية متفرقة مكانيا (≥4 مواقع) في الحيوانات الحرة، خاصة عند دراسة ديناميكيات الشبكة عبر أنواع الخلايا المحددة وراثيا أو تتبع إطلاق المعدل العصبي إلى جانب النشاط العصبي. يعد هذا النهج ذا قيمة خاصة لدراسة السلوكيات الطبيعية التي تتضمن حركة قوية (مثل التفاعلات الاجتماعية)، حيث يضمن خط تصحيح تشويش الحركة دقة الإشارة. ومع ذلك، قد يجد الباحثون الباحثون الباحثون عن دقة خلية واحدة، أو التمييز بين الإشارات الجسدية والمحورية، أو تسجيلات من مناطق قشرية سطحية أن الأساليب البديلة (مثل المجهر المصغر، أو البكسل العصبي، أو التصوير واسع المجال) أكثر ملاءمة. تشمل الاعتبارات العملية الرئيسية تعقيد الجراحة، والحاجة إلى تصنيع مصفوفة متعددة الألياف مخصصة، وإنشاء البنية التحتية اللازمة للمواد (قدرات الطباعة ثلاثية الأبعاد، وأدوات الألياف البصرية).

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ملاحظة: تم اختبار هذا البروتوكول والتحقق منه باستخدام فئران بالغة تتراوح أعمارها بين 8 و25 أسبوعا. تم وضع الفئران عند درجات حرارة تتراوح بين 21–26 درجة مئوية ورطوبة تتراوح بين 30٪-70٪ في دورة معكوسة من الظلام إلى الضوء (الإفصال: 10:00 صباحا؛ أونتار: 10:00 مساء). تجري التجارب حصريا خلال المرحلة النشطة الذاتية (الظلامية). تم توفير الطعام والماء بإرادة تامة. تمت الموافقة على جميع إجراءات الحيوانات من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوانات المؤسسية في جامعة برينستون، وكانت متوافقة مع معايير المعاهد الوطنية للصحة.

1. تصنيع مصفوفة الألياف المتعددة والحبل الرقع (الشكل 1A)

تصنيع حبل الرقعة (الشكل 2A).
1. احصل على حبل توصيل ألياف مكون من 12 وطبع موصل الحبل الرقعة المرفق وملحقات الحفر المجسمة (الملف الإضافي 1، الملف الإضافي 2، الملف الإضافي 3) باستخدام الراتنج (قوة الشد: 8.7 كيلوراوند/بوصة مربعة [ksi]، وحدة e: 377 ksi، انحراف الحرارة: 138 °F، الاستطالة: 8٪).
2. ابن قرص التلميع المرفق (الملف الإضافي 4) من قضيب من الفولاذ المقاوم للصدأ بقطر 2 إنش وأضف فتحة بحجم مصفوفة الألياف المتعددة في وسط القرص.
3. قم يدويا بإزالة الراتنج الزائد من ثقوب دبوس العصا في مصفوفة الألياف المتعددة باستخدام رأس حفر 1.22 مم × 11 مم. حتى مع الطباعة ثلاثية الأبعاد الدقيقة، تكون ثقوب دبابيس العصا صغيرة قليلا بحيث لا يمكن للعصا المرور من خلالها.
4. احفر ثقوب من الألياف الداخلية.
  1. أدخل دبابيس العصا المصنوعة من الفولاذ المصنوع من سبائك (1.19 مم × 12.7 مم) في جميع فتحات الدبابيس الأربعة في ملحق الحفر الستيريوتاكتيكي وضع موصل الحبل من الأسفل إلى الأعلى داخل ملحق الحفر الستيريوتاكتيكي مع مرور دبابيس الدبوس عبر فتحات دبوس الدبوس في مصفوفة الألياف المتعددة.
  2. شد براغي تثبيت M4 بحجم الفتحات في فتحات البراغي الملولبة لتثبيت موصل الحبل الرقعة في مكانه وتثبيت ملحق الحفر الستيريوتاكتيكي في إطار الستيريوتاكتيك.
  3. أدخل رأس مثقاب 0.25 مم × 5.5 مم في المثقاب المجسم وركب المثقاب على إطار المجسم. باستخدام رأس الحفر هذا، قم بتسوية الانحراف والميل واللفة في مصفوفة الألياف المتعددة بأقصى تحمل انحراف يبلغ ±0.03 مم.
    ملاحظة: الانحراف والميل المستويين في أقدم المواقع الأمامية والخلفية للطباعة ثلاثية الأبعاد، ولف مستوي عند الزوايا الأربع لمصفوفة الألياف المتعددة.
  4. قم بحفر مركزي فوق أحد الثقوب الليفية المطبوعة ثلاثية الأبعاد وضبط إحداثيات الإطار المجسم X/Y على إحداثيات ML (X) وAP (Y) لمنطقة الدماغ المرتبطة (الجدول 1). حرك المثقاب إلى الإحداثيات الجديدة (0، 0) على إطار الستيريوتاكتيك لمركز المثقاب فوق فتحة دبوس الدبوس الأمامي.
  5. استخدم رأس الحفر بحجم 0.25 مم × 5.5 مم لحفر كل ثقب من الألياف إلى عمق 5.5 مم عند الإحداثيات التعريفية بشكل ستيريوتيك (الجدول 1).
    ملاحظة: استخدم قطعة طويلة من الألياف الزائدة للتأكد من أن جميع الثقوب قد تم تنظيفها بالكامل قبل إزالة مصفوفة الألياف المتعددة من إطار الستيريوتاكتيك. هذا سيحد من عدد المرات التي يحتاج فيها مصفوفة الألياف المتعددة إلى تسوية وحفر لإزالة الثقوب العبورة.
5. ربط موصل الحبل الرقعة وكابل التوصيل المتفرع
  1. اعرض >10 سم من ألياف الحبل الرقعة. قم بتقليم الألياف باستخدام شريط ألياف لضمان أن تكون متساوية الطول. ثم ضع قطعة واحدة من أنابيب الانكماش الحراري بمقاس 3/16" و5/16" حول الألياف ال12 على الحبل الرقعة.
    ملاحظة: الأنبوب سيحمي أي ألياف مكشوفة بعد لصقها في الموصل.
  2. أدخل كل ألياف في أحد الفتحات في موصل الحبل بحيث يكون حوالي 0.3 مم من الألياف مكشوفة عند السطح السفلي. بعد إدخال جميع الألياف، استخدم رأس إبرة بوزن 21–27 جالون لوضع الغراء الفائق على السطح العلوي لموصل الحبل الرقعة لتثبيت الألياف في مكانها.
  3. ضع الإيبوكسي على السطح العلوي لموصل الحبل الرقع على شكل هرم بارتفاع 0.5–1 سم. تأكد من عدم تغطية أي منطقة من الإيبوكسي باستثناء السطح العلوي حيث تم إدخال الألياف. اترك الإيبوكسي يتجف في درجة حرارة الغرفة طوال الليل.
  4. استخدم مسدس حراري على أدنى إعداد لتصغير أنبوب التصغير الحراري فوق الإيبوكسي والألياف المكشوفة فوقه (<3–5 سم).
    ملاحظة: تجنب لمس أنبوب الانكماش الحراري أثناء ذلك لمنع الحروق.
  5. اقطع قطعة من أنبوب بلاستيك طري بقطر داخلي 3 مم بطول الألياف المكشوفة المتبقية، اقطع شقا على حافة الأنبوب، وأغلف الألياف المكشوفة المتبقية داخل الأنبوب.
  6. قم بلون الأنبوب الشفاف بقلم أسود معتم لضمان عدم ظهور الألياف، مما يقلل من الإضاءة الناتجة عن الألياف المكشوفة أثناء تجارب التصوير.
6. قم بتلميع الحبل المصنوع من الرقعة.
  1. ثبت موصل الحبل الرقع من السطح السفلي داخل قرص التلميع المخصص. قم بتلميع موصل الحبل الرقعة على صفائح تلميع الحبيبات بحجم 6 ميكرومتر، 3 ميكرومتر، 1 ميكرومتر، ثم 0.01 ميكرومتر مع 10–20 حركة على شكل رمز/ورقة اللانهائية. بالنسبة لصفائح الحبيبات بحجم 1 ميكرومتر و0.01 ميكرومتر، ضع 5 قطرات من الماء المقطر قبل التلميع.
  2. امسح سطح الموصل لإزالة أي ماء مقطر زائد. تحقق من وجود عيوب أو شقوق من الألياف على الجانب المصقول من موصل الحبل باستخدام مجهر برايتفيلد، وإذا وجدت، كرر التلميع.
7. تحقق من مخرج كابل الرقعة.
  1. توصيل طرف موصل النسخة الفرعية A (SMA) من الحبل الرقع بنظام تصوير فوتومتري الألياف المعتمد على كاميرا CMOS. باستخدام برامج الترميز البصري، اتبع دليل نظام التصوير الضوئي وركز كاميرا CMOS على طرف SMA من حبل الرقعة.
    ملاحظة: يتم تحديث الدليل بانتظام ليتماشى مع تحديثات البرمجيات. نظرا لأن الشيفرة البصرية لنظام الفوتومترية غالبا ما تتغير مع إصدارات البرمجيات الجديدة، يحتوي هذا الدليل على أحدث المعلومات عن إصدارات البرمجيات الحالية.
  2. قم بقياس مخرج كابل التوصيل 470 نانومتر عند 20٪ طاقة باستخدام عداد طاقة بصري. كرر الخطوة 1.1.7 إذا كان خرج كابل التوصيل < 2.5 مللي واط.
تصنيع مصفوفة الألياف المتعددة.
1. اطبع مصفوفة الألياف المتعددة المقدمة (الملف التكميلي 5، الملف التكميلي 6) باستخدام راتنج بالمواصفات التقنية الموضحة في الخطوة 1.1.1.
2. جهز مصفوفة الألياف المتعددة.
  1. أدخل صواميل M0.6 Brass Sixs في كل من الفتحات الأربعة في الزوايا الجانبية لمصفوفة الألياف المتعددة ومحاذاة فتحة الصامولة السداسية مع مركز الفتحة.
  2. ضع قطرة واحدة من الغراء الفائق من جانب كل فتحة صامولة سداسية مع رأس إبرة بوزن 21–27 جالون، مع إضافة قطرات إضافية للتعزيز إذا لزم الأمر. اترك الغراء ليجف في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق قبل الانتقال إلى الخطوة التالية.
  3. احلق أي غراء على جانبي مصفوفة الألياف المتعددة باستخدام شفرة حلاقة لضمان ملاءمته داخل قرص التلميع.
  4. إذا جف الغراء الفائق الزائد على الجانب السطحي من مصفوفة الألياف المتعددة، قم بتلميع سطح مصفوفة الألياف المتعددة باستخدام قرص التلميع المخصص وصفائح تلميع الحبيبات بطول 30 ميكرومتر حتى يزال الغراء ويصبح سطح مصفوفة الألياف المتعددة مستويا.
  5. قم يدويا بإزالة الراتنج الزائد من فتحات دبوس العصا في مصفوفة الألياف المتعددة باستخدام رأس مثقاب 1.22 مم.
3. احفر ثقوب تمر عبر الألياف (الشكل 2B-C).
  1. أدخل دبابيس العصا المصنوعة من الفولاذ المصنوع من السبائك (1.19 مم × 12.7 مم) في جميع الفتحات الأربعة في ملحق الحفر الستيريوتاكتيكي ووضع سطح مصفوفة الألياف المتعددة (الجانب المسطح) للأعلى داخل ملحق الحفر الستيريوتاكتيكي مع مرور دبابيس العصا عبر فتحات دبوس العصا في مصفوفة الألياف المتعددة.
  2. كرر الخطوة 1.4.2– الخطوة 1.4.5.
4. جهز الألياف لمصفوفة الألياف المتعددة.
  1. قم بإزالة الغلاف البلاستيكي عن جزء بحجم 200 ميكرومتر، ألياف بصرية بوزن 0.39 NA باستخدام مزيل الألياف. نظف الألياف بالإيثانول.
  2. اقسم الألياف إلى مقاطع طولها ~3–5 سم باستخدام ساطور ليفي. اقطع هذه الأقسام إلى نصفين باستخدام شريط ليفي. استخدم مجهر الحقل الساطع لضمان أن أحد طرفي الأقسام المشقوقة خال من الشقوق أو العيوب. استخدم فقط الألياف التي تحتوي على طرف واحد على الأقل بدون عيوب.
  3. ضع مسطرة دقيقة بطول لا يقل عن 15 مم تحت مجهر الحقل المضيء. ضع الجانب السليم من الألياف في موقع 0 مم على المسطرة (الشكل 2D). قطع الألياف إلى الطول المطلوب لكل منطقة مستهدفة (الجدول 1).
    ملاحظة: يتم حساب طول الألياف بإضافة 6 مم إلى إحداثي D/V المجسم لأعمق لياف، ثم تعديل هذه القيمة لجميع الألياف لتتناسب مع الفرق بين إحداثيات D/V الخاصة بها وأحدث إحداثيات D/V في أعمق لياف.
5. أدخل الألياف في مصفوفة الألياف المتعددة.
  1. ضع مصفوفة الألياف المتعددة داخل حامل التصنيع من السطح إلى الأسفل. قم بمحاذاة وتثبيت القطعة باستخدام دبابيس العصا.
  2. مطابقة طول الألياف مع الموقع (الجدول 1) وأدخلت الألياف المشقوقة في الفتحات المناسبة في مصفوفة الألياف المتعددة بحيث يكون الجانب السليم مواجها للأعلى. تأكد من دفع جميع الألياف بالكامل قبل الخطوة التالية.
  3. ضع الغراء السوبر برأس إبرة بوزن 21–27 جرام للصق جميع الألياف في مكانها. دع الغراء يعمل لمدة لا تقل عن 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة قبل الاستمرار.
6. قم بتلميع مصفوفة الألياف المتعددة بتكرار الخطوة 1.1.6 مع مصفوفة الألياف المتعددة على السطح للأسفل (الشكل 2E).
7. تحقق من كفاءة مصفوفة الألياف المتعددة.
  1. نظف السطح المصقول لمصفوفة الألياف المتعددة بالإيثانول ثم ضع جل مطابقة الفهرس عليها. أدخل 4 دبابيس عصا في موصل الحبل الرقعة وثبت مصفوفة الألياف المتعددة بها باستخدام براغي محرك G5 ومفك البراغي المرتبط بها (الشكل 2F).
  2. استخدم مقياس الطاقة لقياس انبعاث LED بمقدار 470 نانومتر و560 نانومتر من مصفوفة الألياف المتعددة. حساب الكفاءة باستخدام هذه القيم:
  3. إذا كانت الكفاءة <75٪، يرجى تكرار الخطوات 1.2.7.1–1.2.7.2.
    ملاحظة: إذا لم يحسن إعادة التلميع الكفاءة ولم تكن هناك عيوب على الألياف، فمن الممكن أن تكون الألياف على مصفوفة الألياف المتعددة غير متزاوية مع موصل الحبل الرقعة.
8. جهز مصفوفة الألياف المتعددة للاستخدام (الشكل 2G).
  1. أدخل 4 دبابيس عصا في الفتحات في مصفوفة الألياف المتعددة. تأكد من أن دبابيس العصا لا تبرز أكثر من 1 مم من جانب دماغ مصفوفة الألياف المتعددة.
  2. ضع الغراء الفائق على جانب الدماغ على دبابيس العصا. اترك الغراء ليجف لمدة لا تقل عن 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة قبل استخدام مصفوفة الألياف المتعددة.

2. الجراحة (الشكل 1B)

جهز مساحة الجراحة والأدوات.
1. نظف إطار الستيريوتاكتيك لضمان وجود منطقة عمل معقمة.
2. احصل على غرزة معقمة قابلة للامتصاص.
3. استخدم معقما زوجا من الملقط الدقيق، والمقص الدقيق، ومشابك بولدوج.
4. تأكد من أن جهاز التبخير مملوء بالإيزوفلوران. تأكد من أن أنابيب الإيزوفلورانس، والفراغ، وخطوط الأكسجين متصلة بإحكام بجهاز التبخير وغرفة الحث وأنف الإطار المجسم.
احصل على الفيروسات المرتبطة بالأدينومي jRCaMP1b وGCaMP6f وGRAB-DA1m.
تحذير: ارتد دائما معدات الحماية الشخصية أثناء التعامل مع الفيروسات.
1. قم بتخفيف الفيروسات إلى تركيز عمل يتراوح بين 1x10¹³ و4x10¹³ جزء/مليلتر إذا لزم الأمر.
2. حضر مزيجا بنسبة 1:1 من الفيروسات المرتبطة بالأدينومي jRCaMP1b وGCaMP6f.
3. ضع قلة من خليط الفيروسي 1:1 jRCaMP1b:GcaMP6f وجزء من فيروس GRAB-DA1m على الجليد للحفاظ على درجة الحرارة عند 4 درجات مئوية.
تحفز التخدير.
1. ضع الفأر في غرفة الحث وأغلق باب الحجرة. ابدأ تدفق الأكسجين إلى جهاز التبخير بسرعة 1 لتر/دقيقة.
2. وجه تدفق الغاز إلى غرفة الحث وشغل خط التفريغ لإزالة الغاز الزائد من الحجرة. اضبط جهاز التبخير على تركيز إيزوفلوران بين 3٪ و5٪.
نقل الفأرة إلى الإطار المجسم.
1. بمجرد أن يتباطأ تنفس الفأر إلى نفس واحد في الثانية، انقل الفأرة إلى الإطار المجسم. اربط القواطع الأمامية للفأرة في الفتحة في قطعة فم مخروط الأنف وشد مخروط الأنف فوق أنف الفأرة.
2. حول تدفق الغاز إلى الإطار المجسم مع ضبط تركيز الإيزوفلوران على 1٪–2٪ للحفاظ على التخدير. قم بتبديل خط التفريغ لإزالة الغاز من مخروط الأنف.
  ملاحظة: راقب تنفس الفأر أثناء الجراحة وضبط تركيز الإيزوفلوران حسب الحاجة للحفاظ على التخدير العميق بمعدل تنفس واحد في الثانية. يجب تأكيد التخدير العميق بشكل دوري طوال فترة الجراحة من خلال التأكد من أن الفأر لا يستجيب لضغط إصبع القدم.
3. اضبط نظام التدفئة ليحافظ على درجة حرارة الجسم 35 درجة مئوية ووضع مرهم بصري على عيني الفأر لمنع جفافهما.
4. أدخل قضبان أذن ستيريوتاكتيك بحيث تدفع على جانبي الجمجمة، قليلا على الظهر وأمام قنوات الأذن. شد قضبان الأذن وتأكد من تثبيت جمجمة الفأر في مكانها عن طريق تطبيق ضغط لطيف على أعلى رأس الفأر.
جهز فروة الرأس للشق.
1. قم بقص أو حلق الشعر فوق رأس الفأر حتى يصبح قصيرا. ضع جل إزالة الشعر على قمة رأس الفأر واتركه لمدة دقيقة تقريبا. أزل ما تبقى من الجل بقطعة قطن نظيفة.
2. كرر الإصدار 2.5.1 حسب الحاجة حتى تزال كل الشعر في أعلى الرأس.
3. قم بتعقيم الجلد فوق الرأس باستخدام عشايات قطنية لوضع البيتادين (محلول بوفيدون-يود بنسبة 10٪) ثم محلول إيثانول بنسبة 70٪.
كشف الجمجمة.
1. اقطع شقا على طول خط منتصف الجمجمة، يمتد من الجزء الخلفي قليلا من لامبدا إلى الأمام قليلا من الوريد الأنفي الروسترالي.
  ملاحظة: الوريد الأنفي الروسترالي هو الوعاء الدموي الذي يقع على السطح الظهري للدماغ بين البصلة الشمية والقشرة الجبهية الأمامية.
2. اقطع وأزل الجلد المحلوق حول جانبي هذا الشق لتشكيل جرح على شكل قطرة دمعة يكشف عظام الجدارية، والطرف الأمامي للعظم داخل الجدارية، والجزء من عظام الأنف الذي يقع أمام الوريد الأنفي الأمامي (الشكل 2H).
3. نظف سطح الجمجمة بلطف بمحلول ملحي بنسبة 0.9٪ ومسحة قطنية نظيفة.
ارفع مستوى الجمجمة.
1. حدد مكان التقاء الوريد الأنفي الروسترالي بالخياطة السهمية. حدد هذه النقطة بشفرة مشرط معقمة.
2. أدخل رأس مثقاب #92 من نوع الكربيد في المثقاب الستيريوتاكتيكي وركب المثقاب على إطار الستيريوتاكتيك. استخدم جهاز التحكم المجسمي لوضع طرف المثقاب على سطح الجمجمة عند النقطة المحددة وصفر إحداثيات X وY وZ للمثقاب.
3. تسوية النغمة للجمجمة بقياس عمق Z عند النقطة المحددة و-8.25 مم خلفها. تسوية انحراف الجمجمة بقياس المسافة الجانبية بين النقطة المحددة والموضع -8.25 خلفي. التدوير المستوي بقياس عمق Z عند المواقع ±2.0–2.5 مم من خط المنتصف عند المواقع -2.0، -4.5، و-7.0 مم بالنسبة للنقطة المحددة.
قم بإجراء عمليات التجمجمة والدوراتومية.
1. استبدل رأس الحفر برأس مثقاب #76 أو #78. قم بتثبيت المثقاب في الموضع المحدد عند تقاطع خياطة السهمية، وريد الأنف الروسترالي، وسطح الجمجمة.
2. انقل المثقاب إلى إحداثيات A/P و M/L في كل منطقة دماغية (الجدول 1). في كل موقع، قم بحفر شق الجمجمة وإزالة الحصنة الجافة بعناية عند كل عملية فتح الجمجمة باستخدام رأس حقنة فارغ بحجم 27 جالون أو أصغر.
حقن الفيروس.
1. اسحب الميكروبايبت الزجاجية بحيث يكون طرفها ضيقا لا يقل عن 7 مم ويكون له فتحة رأس بين 10–30 ميكرومتر.
  ملاحظة: أعد تشغيل الخطوات 2.9.2–2.9.12 إذا احتوت الميكروبايبت على أي فقاعات هواء بعد أي من الخطوات التالية.
2. املأ رأس زجاجي فارغ من الميكروبايبت بزيت معدني. أدخل وثبت طرف المايكرو بايبت في حقن النانولتر. استخدم واجهة حقن النانولتر لطرد أكبر قدر ممكن من الزيت المعدني من المايكروبيت.
3. قم بتركيب حقن النانولتر على إطار الستيريوتاكتيك. اقطع قطعة صغيرة من ورقة شمع البرافين وضعها على رأس الفأر.
4. ميضية 1 ميكرولتر من خليط فيروس jRCaMP1b:GCaMP6f على شمع البارافين. خفض طرف حقنة النانولتر بحيث يكون طرف الميكروبايبت الزجاجي في خليط الفيروس، ثم قم بملء الميكروبايبت بالفيروس باستخدام واجهة الحاقن.
5. كرر الإصدار 2.9.4 حتى يتم نقل كل الفيروس المستخدم إلى حقن النانولتر (الجدول 1). قم بإزالة شمع البارافين وتخلصه في حاوية نفايات بيولوجية خطرة.
6. قم بتصفير طرف الميكروبايبت الحقنة في الموضع المحدد عند نقطة التقاء الدرز السهمي، وريد الأنف الخلفي، وسطح الجمجمة.
7. بدءا من موقع الحقن السفلي إلى الظهر (الجدول 1)، حرك طرف الماصي إلى كل موقع، وخفضه ليلامس سطح الدماغ، وصفر موضع Z على الإطار المجسم.
8. في كل موقع، اخفض طرف الماصي إلى الدماغ حتى يصبح 0.1 مم بطني بالنسبة لموقع الحقن. ثم ارفع رأس الماصة الدقيقة 0.1 مم إلى موقع الحقن النهائي. دع الأنسجة المحيطة تستقر حول طرف الماصي الدقيقة لمدة 30 ثانية.
9. باستخدام واجهة حقن النانوليتر، يتم حقن 300 نانولتر من خليط فيروس jRCaMP1b:GcaMP6f بنسبة 1:1 بمعدل 1–2 نانولتر/ثانية لتشتيت الخليط في موقع الحقن الحالي.
10. اترك طرف الماصلة الدقيقة يبقى في موقع الحقن لمدة لا تقل عن 5 دقائق بعد الانتهاء من الحقن. ارفع طرف الميكروبايبت ببطء خارج الدماغ لتقليل خطر انتشار الفيروس ظهريا على طول مسار الحقن.
11. بعد حقن خليط الفيروسات jRCaMP1b:GcaMP6f بنسبة 1:1 في كل موقع، استخدم واجهة حقن النانولتر لإعادة مكبس حقن النانولتر إلى وضعه الأصلي. قم بإزالة الماصة الدقيقة وتخلص منها في حاوية نفايات شاربز بيولوجية خطرة.
12. إذا لزم الأمر، كرر الخطوات 2.9.2–2.9.11 لكل منطقة دماغية مستهدفة لتعبير GRAB-DA1m. في كل موقع مستهدف، حقن 150 نانولتر بدلا من 300 نانولتر المستخدم في خليط الفيروس.
زرع مصفوفة متعددة الألياف.
1. ثبت مصفوفة الألياف المتعددة على الإطار المجسم باستخدام أي ملحق يمكنه تثبيت المصفوفة المتعددة بواسطة دبابيس العصا للحفاظ على استقرارها أثناء الزرع (الشكل 2I).
2. اضبط موقع مصفوفة الألياف المتعددة بحيث تصطف كل ألياف مع مركز فتحة الجمجمة الخاصة بها ومع أطول ألياف تستقر على سطح الدماغ. قم بتصفير جهاز التحكم الستيريوتكتيك في هذا الموقع وخفض مصفوفة الألياف المتعددة ببطء حتى تصل إلى 0.25 مم فوق موضع D/V لأعمق حقن للفيروس (الجدول 1، الشكل 2J).
3. ضع طبق خلط بارد على الثلج وأضف إليه ملعقة واحدة من مسحوق الأسمنت، وأربع قطرات من القاعدة السائلة، وقطرة واحدة من المحفز. مزج لمدة 20 ثانية.
  ملاحظة: كرر هذه الخطوة كلما تم استخدام الأسمنت السائل والحاجة إلى المزيد.
4. استخدم حقنة وإبرة 23–31 G لنقل الأسمنت السائل في الفراغ بين مصفوفة الألياف المتعددة والجمجمة.
5. ضع الأسمنت السائل باستخدام أداة تطبيق بلاستيكية رفيعة أو إبرة حقنة لتغطية الجوانب الأربعة للمصفوفة متعددة الألياف، مما يشكل شكل هرم من الجمجمة (الشكل 2K). اترك الأسمنت ليجف لمدة لا تقل عن 15 دقيقة.
6. قم بخياطة الجلد معا على طول الجرح لضمان عدم كشف الجمجمة.
دع الفأر يستعيد النشاط.
1. خفض تركيز الإيزوفلوران إلى 0.
2. انقل الفأرة من إطار الستيريوتيك إلى وسادة التدفئة وانتظر حتى يصبح الفأر يقظا ويتحرك قبل أن يعيدها إلى قفصها.
3. دع الفأر يتعافى لمدة لا تقل عن أسبوعين قبل بدء التجارب.

3. تصوير الكالسيوم متعدد المواقع ولونين (الشكل 1C)

تكوين جهاز اكتساب البيانات (DAQ).
1. وصل GND بمنفذ AGND فوق منفذ Ch7 باستخدام الأسلاك الكهربائية.
2. وصل DIO0 بمنفذ Ch0 باستخدام الأسلاك الكهربائية.
وصل نظام الفوتومترية بجهاز DAQ.
1. قم بتوصيل طرف موصل Baby Neill Constant (BNC) لكابل BNC مقسم (موصل BNC في أحد الطرفين، والأسلاك الكهربائية الحمراء والسوداء في الطرف الآخر) بمنفذ الإدخال في نظام الفوتومتري. قم بتوصيل طرف موصل BNC لكابل BNC مقسم آخر بمنفذ الإخراج في نظام الفوتومترية.
2. خذ كابل BNC المنقسم المتصل بمنفذ إدخال نظام الفوتومترية ووصل نهاية السلك الأحمر إلى منفذ DIO1 في DAQ. خذ كابل BNC المنقسم المتصل بمنفذ إخراج نظام الفوتومترية ووصل طرف السلك الأحمر إلى منفذ Ch1 في DAQ.
3. وصل الأسلاك السوداء الأرضية من كلا كابلي BNC المنقسمين إلى منفذ DAQ GND.
مزامنة السلوك وكاميرات الفوتومترية.
1. قم بربط عدة كاميرات سلوكية معا لتسجيل السلوك في نفس الوقت من زوايا متعددة.
  1. قم بتوصيل مخرج الكاميرا المعزولة بصريا (الدبوس 4، السلك الأبيض) لكاميرا السلوك الأساسي بالمدخل غير المعزول للكاميرا الثانوية (الدبوس 1، السلك الأخضر) باستخدام مقاومة 3.3 كيلو أوم. قم بتوصيل مخرج الكاميرا الرئيسي 3.3 فولت (الدبوس 3، السلك الأحمر) بنفس مقاومة 3.3 كيلو أوم وإلى القناة 2 في DAQ.
  2. قم بتوصيل مخرج كل كاميرا ثانوية معزولة بصريا إلى مخرجها 3.3 فولت باستخدام مقاومة 3.3 كيلو أوم.
  3. قم بتوصيل أرضية الكاميرا الأساسية (الدبوس 6، السلك البني) بأرضية كل كاميرا ثانوية. قم بتوصيل جميع أسلاك تأريض الكاميرا بمنفذ DAQ AGND فوق منفذ Ch2 وإلى أرضية إخراج نظام الفوتومتري.
قم بضبط إعدادات الكاميرا السلوكية باستخدام برنامج التصوير المرتبط بها.
1. اضبط "معدل الإطارات المكتسب" على 45 هرتز والكسب على 1.
2. اضبط وقت التعريض إلى 2998 ميكروثانية، والحد الأدنى للتعريض إلى 100 ميكروثانية، والحد الأعلى للتعريض إلى 150000 ميكروثانية.
  ملاحظة: قد لا يكون "معدل الإطارات المكتسبة" هو معدل الإطارات الفعلي الذي سيتم التقاطه. اعتمادا على زمن التعريض وعرض النطاق الترددي المطلوب للبيانات، قد يحتاج هذا القدر إلى ضبط أعلى من تردد التصوير النهائي. إذا لزم الأمر، قم بضبط "معدل الإطارات المكتسبة" بحيث يكون معدل الإطارات الناتجة المعروض 40 هرتز.
قم بتكوين برنامج DAQ (الملف التكميلي 7).
1. في برنامج DAQ، أضف DAQ ك 'جهاز' ثم انتقل إلى 'لوحة الإعدادات'.
2. في تبويب 'القنوات'، تحت 'الإدخال التناظري'، قم بتفعيل القنوات من 0 إلى 2. تحت 'رقمي'، فعل القناة 0.
  ملاحظة: ال Ch0 يتوافق مع إشارة منطق الترانزيتور-ترانزيتور (TTL)، والفصل 1 لنظام الفوتومترية، والفصل 2 مع الكاميرات المتسلسلة ذات الأقحوان.
3. تحت 'الإدخال التناظري'، تذكر القناة 0 "TTL"، والقناة 1 "Photometry_system"، والقناة 2 "Behavior_cameras" والتي تعني "منطق الترانزيتور". تحت 'رقمي'، اذكر القناة 0 "TTL_trigger".
4. في تبويب 'المشغلات'، اضبط الزناد على الوضع اليدوي. في تبويب 'معدلات العينة'، اضبط معدل العينة على 350 هرتز.
5. انتقل إلى 'لوحة العرض' وضع نوافذ 'الشريط' و'القياسي' و'الإخراج' في واجهة المستخدم الرسومية.
تكوين برنامج نظام الفوتومترية (الملف التكميلي 8).
1. تطوير سير عمل في برنامج الترميز البصري لقبول نبضة 5 فولت TTL لتحفيز التسجيلات وحفظ الطابع الزمني لكل إطار، وانبعاثات الفلورة للقنوات الحمراء والخضراء لكل لياف، والفيديو الخام، كما هو موضح في دليل نظام الفوتومترية.
2. باستخدام العقدة الخاصة بنظام الفوتومترية في سير العمل، تأكد من أن النظام مضبوط لتسجيل إطارات متناوبة من 560 و470 و415 نانومتر LED عند 120 هرتز لمعدل إطارات وظيفي يبلغ 40 هرتز.
  ملاحظة: يعالج هذا النهج التعدد بتقسيم الزمن (TDM) التداخل الطيفي بين GCaMP وRCaMP عن طريق فصل الإثارة الزمنية بينهما، مما يضمن أن كل مؤشر يثير بشكل مستقل عبر إطارات متتالية. يستخدم نظام التسجيل هنا مرشحات انبعاث باند ممر محسنة (القناة الخضراء: 500–530 نانومتر؛ القناة الحمراء: >580 نانومتر طول المرور) التي تقلل أكثر من التداخل الطيفي من خلال تقييد الفوتونات المكتشفة إلى الأطوال الموجية التي يصدرها كل مؤشر بشكل رئيسي. يثير طول الموجة المتساوي 415 نانومتر كل من GCaMP وRCaMP بالتساوي، لكنه ينتج تغيرات فلورية معتمدة على الكالسيوم طفيفة، مما يوفر إشارة تحكم في التشكيلة الحركية. معا، تضمن الإثارة وترشيح الطيف في TDM أن إطارات 470 نانومتر تلتقط بشكل رئيسي نشاط GCaMP (الشكل 3A)، وإطارات 560 نانومتر تلتقط بشكل رئيسي نشاط RCaMP (الشكل 3B)، وتوفر إطارات 415 نانومتر إشارات مرجعية مستقلة عن الكالسيوم لتصحيح الحركة.
أداء تسجيلات الفوتومترية في الجسم الحي .
1. احصل على فأر خضع لحقن فيروسية وزرع مصفوفة متعددة الألياف كما هو موضح في الخطوة 2.
2. نظف أسطح التوصيل في الحبل الرقع والمصفوفة متعددة الألياف المزروعة باستخدام الإيثانول وقطعة قطن. باستخدام العقدة الخاصة بنظام الفوتومترية في سير عمل الترميز البصري وجهاز قياس الضوئي، قم بضبط كل من مستويات طاقة 415 و470 و560 لإنتاج حوالي 1.2 ميلاواط من الإضاءة من كابل التوصيل.
3. ضع جل مطابقة الفهرس على سطح توصيل الحبل الرقعة. قم بمحاذاة الحبل مع مصفوفة الألياف المتعددة المزروعة في الفأرة باستخدام دبابيس العصا الخاصة بالمصفوفة، ثم انزلق الحبل الرقع للأسفل حتى يصبح مستويا لسطح مصفوفة الألياف المزروعة.
4. شد براغي الحبل الرقعة لتثبيت مصفوفة الألياف المتعددة في الحبل اليدوي. دع الفأر يعتاد قبل بدء التجارب (الشكل 2L–M).
5. حدد أسماء الملفات.
  1. لكل كاميرا سلوك، اضغط على زر الدائرة الحمراء 'تسجيل' لفتح نافذة التسجيل في برنامج تسجيل كاميرا السلوك وحدد اسم الملف.
  2. افتح برنامج DAQ، اضغط على زر الترس وانتقل إلى 'خيارات التسجيل'، وحدد اسم الملف.
  3. انقر على عقدة 'PhotometryWriter' في سير عمل الترميز البصري لنظام الفوتومتري لتحديد اسم الملف.
6. في برنامج تسجيل الكاميرا السلوكية في نوافذ، اضغط على 'بدء التسجيل' لكل كاميرا. بعد ذلك، اضغط زر التشغيل في سير عمل الترميز البصري لنظام الفوتومتري، ثم اضغط التسجيل في برنامج DAQ.
7. انقر على مفتاح TTL لبدء التسجيل بشكل متزامن عبر جميع الكاميرات.
8. نهاية التسجيل.
  1. انقر على مفتاح TTL لإنهاء تسجيلات الكاميرا المتزامنة
  2. اضغط زر التوقف في سير عمل الترميز البصري لنظام الفوتومتري، و"إيقاف التسجيل" في برنامج الكاميرا السلوكي لتسجيل النوافذ.
9. كرر الخطوات 3.7.5–3.7.8 حتى نهاية التجارب، ثم فصل الفأرة.
  ملاحظة: بعد التجارب، يمكن محاذاة تدفقات بيانات الفوتومترية وسلوك الكاميرات مع كود مخصص باستخدام مخرجات برنامج DAQ. تحديدا، (1) يشير التغير في جهد TTL إلى وقت بدء وانحراف TTL، (2) التغيرات في سلوك جهد الكاميرا تشير إلى متى يفتح ويغلق غالق الكاميرا لالتقاط كل إطار من فيديو السلوك، و(3) يمكن مقارنة التغير الأولي في جهد نظام الفوتومترية المسجل على DAQ بزمن بدء TTL وطوابع كاميرا الفوتومترية الزمنية الناتجة من برنامج الترميز البصري لتحديد طوابع كاميرا الفوتومترية.

4. معالجة البيانات (الشكل 1D، الملف التكميلي 9)

معالجة بيانات تصوير الكالسيوم مسبقا.
1. يتم فصل إطارات بيانات تصوير الكالسيوم لإنشاء تدفقات منفصلة من الإشارات المسجلة استجابة لمصابيح LED بتردد 415 نانومتر، 470 نانومتر، و560 نانومتر.
2. استخدم خوارزمية المربعات الصغرى المعاقبة المعاد وزنها بشكل تكراري التكيفية (airPLS)⁴⁴ لتصحيح انحراف الخط الأساسي.
3. احسب ΔF/F باستخدام:
  
  ملاحظة: يجب أن تكون فترة الأساس حقبة مستقرة قبل التلاعب التجريبي (مثلا قبل إدخال شريك اجتماعي). إذا كانت فترة الأساس قصيرة جدا (<2–3 دقائق) أو تظهر تقلبات كبيرة قد تكون ملوثة بتشوهات الحركة، فكر في التطبيع باستخدام متوسط التألق عبر الجلسة بأكملها بدلا من فترة أساسية محدودة.
صحيح للتشوهات الحركية (الشكل 4A).
1. استخدم نهجا قائما على الانحدار، رغم أن الطرق البديلة مناسبة (انظر الجدول 2)
2. إشارات ΔF/F ذات درجة Z تستخدم الوسيط لتطبيع مقدار الإشارة عبر المناطق:
3. طبق انحدار لاسو مع تنظيم اللغة الأولى. يقوم Lasso (عامل الانكماش والاختيار الأقل مطلقا) باختيار الميزات تلقائيا عن طريق تقليص معاملات المتنبئات غير المفيدة نحو الصفر.
  1. قم بإجراء بحث شبكي عبر معلمات التنظيم (α = 0.0001، 0.001، 0.01، 0.1، 1، 10، 10). يحدد البحث الشبكي التوازن الأمثل بين تعقيد النموذج وفرط التوافق. يمكن أتمتة هذه الخطوة بالكامل باستخدام روتينات التحقق المتقاطع المتوفرة في مكتبات تعلم الآلة القياسية (مثل scikit-learn بلغة بايثون).
  2. للفوتومترية ثنائية اللون (نهجنا الموصى بها)، استخدم جميع قنوات التحكم المتساوية المتاحة بطول 415 نانومتر عبر 12 منطقة تسجيل كمؤشرات (انظر الشكل 4B–C والنتائج للمنطق). بالنسبة للفوتومترية بلون واحد (GCaMP فقط أو RCaMP فقط)، قم بتقييد مصفوفة المتنبئ فقط بإشارة الإيزوسبيستيك من نفس الألياف التي يتم تصحيح إشارة الكالسيوم.
  3. اختر النموذج الذي يقلل متوسط التربيع بين الإشارة المتوقعة والإشارة المرصودة.
4. اطرح المكون المتوقع للحركة من الإشارة لتحقيق نشاط مصحح.
قم بتنعيم الإشارة باستخدام فلتر Savitzky-Golay مع نافذة 725 مللي ثانية.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لتسجيل ما يصل إلى 12 منطقة دماغية SBN في نفس الوقت، قمنا ببناء مصفوفة متعددة الألياف قابلة للتخصيص وفقا للبروتوكول أعلاه. بعد التعافي من الجراحة، تم تسجيل الفئران أثناء التفاعل الاجتماعي (الشكل 5). في جميع التجارب، سمح للذكور من فئران الموضوع في CD1 بالتفاعل مع ذكور فئران Balb/c في قفصهم المنزلي. استخدمنا فئران Vgat-Cre للتعبير عن jRCaMP1b⁴⁰ في الخلايا العصبية GABAergic بطريقة تعتمد على Cre عبر 11 منطقة دماغية SBN، وGCaMP6f³⁹ في الخلايا غير GABAergic بطريقة استبعاد Cre،^و45 عبر نفس مناطق الدماغ، وGRAB-DA1m³³ في النواة accumbens⁴² (الجدول 1). يمكن العثور على تأكيد نسيجي لاستهداف الألياف في منشوراتنا السابقة^42,43. هنا، سعينا لاختبار أداء طرق مختلفة لتصحيح تشوهات الحركة. على وجه التحديد، قارنا فعالية استخدام: (1) مرشح وسيط فقط؛ (2) انحدار الحبل مع تنظيم L1 باستخدام إشارات متساوية الألياف فقط (نهج المتنبئ الواحد) ¹¹ و(3) انحدار الحبل باستخدام إشارات إيزوسبيستية من جميع الألياف كمتنبئين (نهج متعدد المتنبئات) ^41,42 (الشكل 4A). والأهم من ذلك، أن الطرق المعتمدة على لاسو تصحح الإشارة الخام باستخدام إشارة فلورية مستقلة عن النشاط مولدة استجابة لمصباح LED متساوي التردد (415 نانومتر)، بينما لا يأخذ التنعيم الوسيط المرشح في الاعتبار الإشارة المستقلة عن النشاط.

قمنا بتقييم تصحيح الحركة باستخدام مقياسين مختلفين: الضوضاء عالية التردد المطلقة والاهتزاز. تم تعريف الضوضاء عالية التردد بأنها الانحراف المعياري للمشتقة الأولى للإشارة، والذي يعكس حجم التقلبات السريعة في الإشارة. تم تعريف التذبذب بأنه معامل تغير مشتقة الإشارة، والذي يعكس مقدار تباين الإشارة من إطار إلى آخر بالنسبة لمتوسط مشتقة الإشارة. وجدنا أن كلا النهجين المعتمدين على لاسو (المتنبئ الواحد والمتنبأ المتعدد) تفوقت بشكل كبير على مرشح الوسيط من حيث تقليل الضوضاء عالية التردد والتذبذب، مع تصحيح متعدد المتنبئين بأداء طفيف على تصحيح المتنبئ الفردي (الشكل 4C–D؛ ضوضاء عالية التردد، n=414 ل 23 إشارة عبر 18 جلسة تسجيل: اختبار كروسكال-واليس، H = 501.9420، p < 0.001؛ اختبارات مان-ويتني U بعد الحدث مع تصحيح بونفيروني: الانحدار الملمس مقابل الانحدار في الموقع الواحد ***p < 0.001، الانحدار المنعم مقابل متعدد المواقع < 0.001، الموقع الواحد مقابل الموقع المتعدد **p = 0.0073؛ التذبذب: اختبار كروسكال-واليس، H = 495.6685، الp < 0.001؛ اختبارات مان-ويتني U بعد الوقوع مع تصحيح بونفيروني: الانحدار المنعم مقابل الانحدار في الموقع الواحد ***p < 0.001، الانحدار المنعم مقابل متعدد المواقع < 0.001، الموقع الواحد مقابل الموقع المتعدد ***p = 0.0006). على وجه التحديد، أظهر نهج المتنبئين المتعدد (باستخدام جميع الألياف متساوية التساوي بيسكس) فوائد لإشارات القناة الحمراء (RCaMP): حيث أظهرت 5 من أصل 12 إشارة حمراء ضوضاء متبقية أقل بكثير مقارنة بتصحيح المتنبئ الفردي (n = 18 تسجيلا/منطقة). بالنسبة للتذبذب، أظهرت BNST (اختبار t، t = 5.42، ***p < 0.001)، POA (اختبار t، t = 2.68، *p = 0.011)، AH (اختبار t، t = 2.66، *p = 0.012)، وPAG (اختبار مان-ويتني U، U = 279، ***p < 0.001) تفوقا متعدد المتنبئات. بالنسبة للضوضاء عالية التردد، أظهرت BNST (اختبار مان-ويتني U، U = 285، ***p < 0.001)، POA (اختبار مان-ويتني U، U = 292، ***p < 0.001)، AH (اختبار t، t = 7.10، ***p < 0.001)، PAG (اختبار t، t = 13.72، ***p < 0.001)، وLHb (اختبار t، t = 5.47، ***p < 0.001) تفوقا متعدد المتنبئيات. أظهرت إشارات القناة الخضراء (GCaMP) عدم وجود اختلافات ذات دلالة إحصائية بين نهجي لاسو عبر جميع المناطق الاثني عشر سواء لمقاييس التذبذب أو الضوضاء عالية التردد (جميعها p>0.05، وللقائمة الكاملة للاختبارات الإحصائية انظر الجدول 3). يشير هذا إلى أنه في الفوتومترية ثنائية اللون، فإن دمج معلومات متساوية القنوات يحسن تصحيح الحركة للإشارات الحمراء، ويرجح أن الإيسوسبيتيكات الخضراء توفر معلومات حركة أنظف. تظهر هذه البيانات أن تصحيح تشويه الحركة باستخدام طرق الانحدار المعتمدة على الإيسوسبستيك يتفوق بشكل كبير على أساليب الترشيح البسيطة، حيث يوفر الانحدار متعدد القنوات مزايا محددة للتسجيلات ثنائية اللون.

figure-results-1
الشكل 1. التسجيل من شبكة السلوك الاجتماعي باستخدام الفوتومترية الليفية متعددة المواقع ذات اللونين. (أ) تمثيل تخطيطي لكيفية بناء مصفوفة متعددة الألياف. (ب) تمثيل تخطيطي لسير عمل الجراحة. (ج) تمثيل تخطيطي لتجارب تصوير الكالسيوم بلونين. (د) مثال على استخدام إشارة إيزوسبيستية لحساب إشارة مصححة للحركة. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-2
الشكل 2. صور لإجراءات رئيسية للتصنيع والجراحة. (أ) حبل رقعة مصنع جاهز للاستخدام في التسجيل. (ب) مصفوفة متعددة الألياف موضوعة في حامل استيريوتاكتيكي مخصص مع رأس الحفر 0.25 مم × 5.5 مم فوق ثقب ليفي. (ج) مصفوفة متعددة الألياف مع إزالة جميع ثقوب الألياف ولصق الصواميل السداسية. (د) قطع الألياف باستخدام خط ليفي. (ه) مصفوفة متعددة الألياف مع جميع الألياف مغطاة بالغراء الفائق وموضوعة على قرص تلميع مخصص. (و) رؤية مكبرة لكيفية محاذاة وتثبيت موصل الحبل الرقع إلى مصفوفة الألياف المتعددة. (G) مصفوفة متعددة الألياف كاملة البناء مع دبابيس العصا الملتصقة في مكانها. (ح) فأر مثبت على إطار الستيريوتاكتيك مع شق في فروة الرأس يكشف الجمجمة. (1) مصفوفة متعددة الألياف المصنعة متصلة بجهاز التحكم المجسم للمناورة أثناء الجراحة. (J) رؤية مكبرة لمصفوفة الألياف المتعددة وهي تنزل إلى الدماغ. (ك) مصفوفة الألياف المتعددة مخفضة بالكامل ومثبتة على الجمجمة بأسمنت سني. (L) مصفوفة متعددة الألياف على حيوان متصل بإحكام بحبل التوصيل قبل التسجيل. (م) عرض مبسط للحيوان في القفص مع توصيل الحبل قبل و/أو أثناء التسجيل. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-3
الشكل 3. الفصل الطيفي. أمثلة على آثار تظهر تقاطعا طيفيا بسيطا بين مؤشرات الكالسيوم. تظهر إشارات GCaMP6f (الأزرق) تفعيلا قويا أثناء الإثارة 470 نانومتر لكنها استجابة ضئيلة لإثارة 560 نانومتر. تظهر إشارات jRCaMP1b (الحمراء) نمطا عكسيا مع تنشيط قوي من 560 نانومتر ولكن استجابة ضئيلة لإضاءة 470 نانومتر. (أ) إشارات GCaMP6f و jRCaMP1b مسجلة في نفس الوقت مع إضاءة 470 نانومتر فقط. (ب) نفس (أ)، لكن بإضاءة 560 نانومتر فقط. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-4
الشكل 4. مقارنة الطرق المختلفة لمعالجة الإشارات متعددة الألياف. (أ) مخطط يصور تصحيح إشارة الفوتومترية القائم على الانحدار متعدد المواقع. يتضمن هذا النهج خطوات معالجة متتابعة حيث يتم تعيين جميع الإشارات الإيسوسبستية المتاحة بحجم 415 نانومتر بشكل خطي لكل إشارة تعتمد على الكالسيوم. يتم طرح مكونات الحركة المتوقعة من هذه الإشارة لإنتاج القراءة النهائية للنشاط. إشارات ΔF/F مصنفة على درجة z من إشارتين تحتويان على وجود قوي لتشويشات الحركة. (ب) من الأعلى إلى الأسفل: إشارة متساوية من نفس قناة الألياف/التصوير التي تظهر تشوهات الحركة، إشارة RCaMP الملساء فقط (يسار) أو GCaMP (يمين) (مرشحة وسطية، خضراء)، نفس الإشارة المصححة بانحدار القناة البصرية (سماوي)، إشارة تصحيح الانحدار متعدد الألياف (أزرق). (ج) اليسار: متوسط درجة الضوضاء عالية التردد لكل إشارة مسجلة (n = 21 جلسة). يتم حساب الضوضاء عالية التردد كانحراف معياري للمشتقة الأولى لكل إشارة. تظهر درجات الضوضاء ل 1) إشارة مصححة للخط الأساسي ولكن غير مصححة (رمادي)، 2) إشارة مصححة للخط الأساسي ومرشحة للوسيط (وردي)، 3) إشارة مصححة بانحدار الأساس والألياف الواحدة مع تنعيم سافيتسكي-غولاي (سماوي)، و4) إشارة مصححة بانحدار الأساس ومتعدد الألياف مع تنعيم سافيتسكي-غولاي (أزرق). الوسط: متوسط نسبة الضوضاء التي تم إزالتها باستخدام الانحدار السريع فقط، أو الانحدار بألياف واحدة أو متعددة الألياف، مجمعة عبر جميع الإشارات ال 23. يتم حساب نسبة الضوضاء المزولة كنسبة الضوضاء عالية التردد الناتجة عن التصحيح بالنسبة للمستوى الكلي للضوضاء في الإشارة الخام المصححة بخط الأساس. يتم الإبلاغ عن البيانات كمتوسط ± SEM (اختبار كروسكال-واليس، H = 501.9420، p < 0.001؛ اختبارات مان-ويتني U بعد الوقوع مع تصحيح بونفيروني: الانحدار الملمس مقابل الموقع الواحد ***p < 0.001، الانحدار المنعم مقابل متعدد المواقع***p < 0.001، الموقع الواحد مقابل متعدد المواقع **p = 0.0073). اليمين: نسبة الإشارات التي يكون فيها الضوضاء عالية التردد مختلفة إحصائيا بعد تصحيح الانحدار المعتمد على الألياف الفردية مقابل متعددة الألياف، مفصولة حسب نوع الإشارة. لكل من الإشارات ال 23، تمت مقارنة مستويات الضوضاء بعد تصحيح الموقع الواحد بمستويات الضوضاء بعد تصحيح المواقع المتعددة باستخدام اختبارات t مستقلة (إذا كانت موزعة عادة) أو اختبارات Mann-Whitney U (بديل غير معلمي). تشير المقاطع الزرقاء إلى إشارات حيث أدى التصحيح متعدد المواقع إلى ضوضاء أقل بكثير من التصحيح في الموقع الواحد (p < 0.05). تشير المقاطع الرمادية إلى إشارات لا يوجد بها فرق كبير بين طرق التصحيح. تشير المقاطع السماوية إلى إشارات يؤدي فيها التصحيح في الموقع الواحد إلى انخفاض ملحوظ في الضوضاء. E: Vgat- GCaMP6f. DA: امسك-دا. I: Vgat+ jRCaMP1b. (D) نفس (C) لكن يصور التباين من إطار إلى آخر (تذبذب)، محسوب كمشتقة معامل تباين كل إشارة (اختبار كروسكال-واليس، H = 495.6685، p < 0.001؛ اختبارات مان-ويتني U بعد الوقوع مع تصحيح بونفيروني: الانحدار المنعم مقابل الموقع الواحد ***p < 0.001، الانحدار المنعم مقابل متعدد المواقع***p < 0.001، الموقع الواحد مقابل الموقع المتعدد ***p = 0.0006). للاطلاع على القائمة الكاملة للاختبارات الإحصائية والنتائج، راجع الجدول 3. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-5
الشكل 5. عرض متعدد المواقع لقياس الألياف ثنائي اللون. إشارات تمثيلية من أنواع مؤشرات متعددة تم تسجيلها في نفس الوقت أثناء السلوك الاجتماعي (اختبار المقيم-المتسلل، فترة دخول المتسلل). تظهر الآثار خلايا عصبية سلبية Cre غير طبيعية ومطروحة في الأساس ولكن غير مصححة بالحركة من حيث التشويش الطبيعي، وjRCaMP1b (خلايا GABAergic Vgat-Cre+)، وGRAB-DA1m (مستشعر الدوبامين في النواة الأكوبنس) عبر مواقع شبكات السلوك الاجتماعي في نفس الحيوان. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الجدول 1. إحداثيات الفيروس وأطوال الألياف لكل منطقة دماغية مستهدفة من شبكة السلوك الاجتماعي. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.

الجدول 2. مقارنة طرق تصحيح الآثار الحركية لتصوير الألياف متعددة المواقع. المبادئ الأساسية، حالات الاستخدام المثلى، المزايا والقيود لطرق تصحيح تشويلات الحركة التالية: الانحدار الخطي البسيط، الانحدار الحبل مع تنظيم اللغة الأولى (باستخدام نهج المتنبئين المتعدد)، النمذجة التوليدية البايزية، التحجيم القائم على التردد، والمربعات الصغرى المعاد وزنها بشكل تكراري. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.

الجدول 3. تفاصيل ونتائج الاختبارات الإحصائية المستخدمة في الشكل 4. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.

الملف التكميلي 1. ملف طباعة ثلاثي الأبعاد لموصل الحبل الرقعة.يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

ملف تكميلي 2. 3D ملف طباعة لموصل كابل التوصيل بدون فتحات عبور.يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

ملف تكميلي 3. 3D ملف طباعة لملحق الحفر المجسم.يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الملف التكميلي 4. مخطط تلميع القرص المخصص.يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

ملف تكميلي 5. 3D ملف طباعة لمصفوفة الفوتومترية متعددة المواقع تستهدف 12 موقعا من مواقع SBN.يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

ملف تكميلي 6. 3D ملف طباعة لمصفوفة الفوتومترية متعددة المواقع بدون ثقوب تستهدف المواقع.يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الملف التكميلي 7. ملف تكوين DAQ لبرنامج DAQ.يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الملف الإضافي 8. ملف ترميز بصري لنظام الفوتومتري.يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الملف التكميلي 9. كود بايثون المستخدم في بروتوكول الخطوة 4 وللمقارنات المصححة للتشويش الحركية. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الفوتومترية بالألياف هي تقنية مفيدة وفعالة من حيث التكلفة لتسجيل نشاط الكالسيوم من أعماق الدماغ أو أنواع الخلايا المحددة في الحيوان الحر³. التسجيل من عدة مناطق دماغية في نفس الوقت يسمح للمستخدم بمقارنة الديناميكيات عبر المناطق أو الإسقاطات أثناء السلوك الطبيعي أو التحضيرات المثبتة للرأس⁵^،⁷^،¹². هنا، نشرح طرقا للتسجيل بلونين من ما يصل إلى 12 منطقة دماغية عبر شبكة السلوك الاجتماعي تحت القشرية للدماغ باستخدام مصفوفة ألياف مصممة خصيصا ونظام كاميرا متوفر تجاريا. فيما يلي، نناقش الخطوات الحاسمة في تنفيذ هذه الطريقة، والتعديلات المحتملة واستراتيجيات استكشاف المشكلات، وأهميتها بالإضافة إلى القيود المتعلقة بالأساليب الحالية.

يتضمن البروتوكول ثلاث مراحل رئيسية. أولا، يتطلب تصنيع مصفوفة الألياف المتعددة والحبل الرقعة حفر أجزاء مطبوعة ثلاثية الأبعاد مخصصة عند إحداثيات الستيريوتاكتيك، تليها إدخال الألياف، والتلميع، ومراقبة الجودة لضمان ≥75٪ من كفاءة نقل الضوء. محاذاة الحفر الدقيقة (±تحمل 0.03 مم) والتلميع الشامل أمران حاسمان. تشمل الأعطال الشائعة كفاءة نقل الضوء المنخفضة (<75٪) وانسداد فتحات الألياف المرورية. عادة ما تكون الكفاءة المنخفضة نتيجة تشويش الألياف أثناء الشقوق أو التلميع غير الصحيح. تشمل الحلول التحقق من أن كل طرف من الألياف غير مشوه تحت مجهر الحقل السلاع قبل الإدخال (الخطوة 1.1.6.2)، وإعادة التلميع باستخدام تتابع الحصى الكامل (6 ميكرومتر → 0.01 ميكرومتر، الخطوة 1.1.6.1)، والتأكد من حادة شفرة الساطور الأليافية. لتحسين معدل الإنتاجية، يمكن للمختبرات تنفيذ تعديلات سير العمل مثل قوالب قطع الألياف المخصصة باستخدام مراحل الترجمة الدقيقة أو أنظمة القطع المعتمدة على الليزر (الخطوة 1.2.4). يمكن لمصنعي الطباعة ثلاثية الأبعاد التجارية الذين يمتلكون أنظمة عالية الدقة تقليل احتياجات الحفر اليدوي (الخطوات 1.1.3–1.1.4، الخطوة 1.2.3)، رغم أن دقة الأبعاد قد تختلف بين الدفعات.

ثانيا، يتضمن الزرع الجراحي تسوية الجمجمة (تحمل ±0.03 مم)، وحقن الفيروسات في 11–12 موقعا، وزرع مصفوفة متعددة الألياف يتبعه تثبيت الأسمنت. تتأثر دقة الاستهداف عندما يتجاوز مستوى الجمجمة التحمل. يمكن التخفيف من ذلك بقياس النغمة عند عدة نقاط أمامية-خلفية تفصل بينها 8.25 مم وقياس الدوران عند ±2.0–2.5 مم في وضعيات جانبية، مع ضمان تثبيت قضبان الأذن للجمجمة بالكامل. تمنع فقاعات الهواء في الميكروبايبت الدقيقة لحقن الفيروسات التوصيل الدقيق وتستلزم إعادة بدء تحضير الماصات الدقيقة (الخطوة 2.9). أثناء زرع مصفوفة الألياف، تجنب ملامسة الأسمنت مع أطراف الألياف عن طريق بناء هرمات أسمنتية من سطح الجمجمة إلى أعلى (الخطوات 2.10.3–2.10.5) وترك وقت جفاف كاف (≥15 دقيقة).

ثالثا، يتضمن التسجيل ومعالجة البيانات مزامنة الكاميرا عبر نظام DAQ، معايرة طاقة LED (مخرج 0.1 ميلاواط/ألياف، 1.2 ميلي واط/12 ليفا مخرجا)، ومعالجة الإشارة المبدئية مع ضوابط متساوية الإيسوسبيست. يستخدم خط أنابيب تصحيح الحركة الذي تم تقديمه هنا انحدار لاسو، وهو مناسب جدا لتكوينات المتنبئات متعددة القنوات لأنه يقلل تلقائيا من المتنبؤات غير المفيدة نحو الصفر، مع الاحتفاظ فقط بتلك التي تساهم بشكل فعال في تصحيح التشوهات. تجعله هذه الخاصية ميزة خاصة للفوتومترية ثنائية اللون: فمن خلال تضمين إشارات متساوية اللونين من القناتين الحمراء والخضراء كمؤشرات تنبؤية، يستفيد لاسو بشكل انتقائي من القنوات التي تحمل معلومات الحركة الحقيقية، مما ينتج تقليل أفضل بكثير في الضوضاء في إشارات القناة الحمراء (RCaMP) مقارنة بتصحيح نفس الألياف وحده (الشكل 4C–D). نظرا لأن لاسو يحدد أكثر المتنبئات معلوماتية تلقائيا، ينصح بشدة باستخدام جميع القنوات المتساوية المتاحة كمدخل. ومع ذلك، فإن الانحدار باللاسو هو أحد عدة طرق تصحيح صحيحة؛ تشمل البدائل النمذجة التوليدية البايزية⁴⁶، والمقياس القائم على التردد⁴⁷، والمربعات الصغرى المعاد وزنها بشكل تكراري (IRLS)⁴⁸، وكلها من المرجح أن تؤدي إلى تقليل مشابه، مع توجيهات التنفيذ المقدمة في الجدول 2. جودة الإشارة الضعيفة المستمرة رغم المعالجة المسبقة المحسنة تشير على الأرجح إلى مشاكل في الأجهزة أو الجراحة، ويجب إعادة النظر في الخطوات 1–2

بعيدا عن هذه الاعتبارات الإجرائية، تقدم الفوتومترية ثنائية اللون تحديات تقنية إضافية تتعلق بالفصل الطيفي. اعتبار حاسم في الفوتومترية ثنائية اللون هو إدارة التداخل الطيفي بين مؤشرات الكالسيوم الأخضر والأحمر. بينما يعد الإزالة الكاملة للتداخل الطيفي تحديا بسبب تداخل أطياف الانبعاث بين GCaMP وRCaMP، فإن نهجنا في التعدد الزمني مع إثارة LED متداخلة (470 نانومتر ل GCaMP، 560 نانومتر ل RCaMP، 415 نانومتر إيسوسبستيك) ومرشحات انبعاث النطاق المحسنة تخفف بشكل كبير من هذه المشكلة. في الواقع، نلاحظ تداخلا بسيطا: تحفيز 470 نانومتر يثير نشاطا ضئيلا في القناة الحمراء، والعكس صحيح لتحفيز 560 نانومتر في القناة الخضراء (الشكل 3). يمكن للباحثين القلقين بشأن التداخل الطيفي المتبقي تحسين أنظمتهم بشكل أكبر من خلال اختيار مرشحات انبعاث ضيقة النطاق مع أقصى فصل طيفي بناء على تركيبات المؤشرات الخاصة بها.

مقارنة بالطرق الأخرى للتسجيلات العصبية واسعة النطاق، يوفر الفوتومترية الألياف متعددة المواقع ثنائية اللون متعددة اللونين العديد من المزايا الكبيرة. أولا، بينما تقتصر الفوتومترية الليفية ^{المفردة} ^1,2,3، والتسجيلات الخارجية الخلوية المعاصرة ^4,6، أو طرق تصوير السطح ^القشري ^8,9 على منطقة دماغية واحدة أو مجموعة مقيدة مكانيا (مثل سطح القشرة)، فإن تصميم الطباعة ثلاثية الأبعاد القابل للتخصيص الذي نشاركه هنا يسمح باستهداف ما يصل إلى 12 منطقة دماغية في أي مكان في الدماغ باستخدام ألياف بصرية بحجم 200 ميكرومتر. بالمقارنة، تدعم حلقات^{الألياف المتعددة} ^5,7 المتوفرة تجاريا فقط ألياف بصرية بحجم 100 ميكرومتر، وهي مقيدة أيضا بمجموعة محدودة من مناطق الدماغ مباشرة في البطن مع المصفوفة الخطية للفيرول. فيما يتعلق بالاستهداف والتسجيل من مناطق دماغية محددة، فإن المقايضة الأساسية تكون بين قطر الألياف ومجال رؤية نظام الفوتومترية. تسجل المصفوفات متعددة الألياف المطبوعة ثلاثية الأبعاد والمزودة بألياف بقطر 200 ميكرومتر من مساحة أكبر في كل موقع مقارنة بالحلقات متعددة الألياف المتوفرة تجاريا. في البروتوكول الحالي، يحد مجال رؤية كاميرا نظام الفوتومترية من التسجيل إلى 12 ليفا بصريا عند 200 ميكرومتر. يمكن التغلب على هذا القيد بتقليل قطر الألياف إلى 100 ميكرومتر لما يصل إلى 60 ليفا أو ببناء نظام فوتومترية مخصص بهدف كاميرا أكبر.

وأخيرا، تم استخدام هذه المنصة القابلة للتخصيص متعددة المواقع متعددة المواقع للقياس الضوئي للألياف لتتبع ديناميكيات النشاط العصبي لمجموعتين عصبيين متميزتين جينيا عبر 11-12 منطقة دماغية طوليا. باستخدام استراتيجية Cre-in/Cre-exception-purpose تعبر عن RCaMP المعتمد على Cre وGCaMP مستبعدة Cre عبر مجموعات SBN في فأر Vgat-cre، أظهرت التجربة العدوانية والملاحظة تعزيز أنماط مشتركة من ديناميكيات النشاط على مستوى SBN خلال التفاعلات الاجتماعية الدفاعية المستقبلية⁴². باستخدام نفس الاستراتيجية الفيروسية في فأر Esr1-cre لتسجيل الخلايا العصبية التي تعبر أو لا تعبر عن مستقبلات الإستروجين ألفا، ارتبطت أنماط السلوك الاجتماعي الخاصة بالمنطقة بإعادة تكبير سريع وحساس للهرمونات لرمز الفعل الاجتماعي على مستوى SBN، مما عزز النشاط المرتبط بالسلوك في المنطقة الأصلية⁴³. تتطلب هذه الاختلافات الخاصة بالمنطقة في السلوك وترميز الشبكات وجود هرمون تستوستيرون في الفئران الذكور. بينما استخدمت هذه الدراسات نهج فيروسي وخط Cre واحد، يمكن للدراسات المستقبلية توسيع هذه الطرق من خلال طرق فيروسية تقاطعية، أو مؤشرات الكالسيوم المعبر عنها وراثيا، أو مبلغين فلوريين لإشارات المعدل العصبي والعصبي الببتيد.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم التمويل من NIH K99MH135212 (إلى E.M.G.)، وNIH F32MH126562 (إلى E.M.G.)، و DP2MH126375 (إلى A.L.F.)، NIH R01MH126035 (إلى A.L.F.)، NYSCF (إلى A.L.F.)، مؤسسة سيمونز (SCGB) (إلى A.L.F.)، مؤسسة كلينغنشتاين (إلى A.L.F.)، وزمالة ألفريد بي. سلون (إلى A.L.F.)، مؤسسة ماكنايت (A.L.F). معهد ألين (A.L.F). A.L.F. هو باحث روبرتسون في مؤسسة نيويورك للخلايا الجذعية.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
رأس الحفر #76	مدينة لقمة الحفر	#76
رأس مثقاب #78	مدينة لقمة الحفر	#78
رأس مثقاب #92	مدينة لقمة الحفر	#92
0.01 μ صفائح تلميع الحصى	ثورلابز	LFCF2
رؤوس الحفر 0.25 مم × 5.5 مم	مدينة لقمة الحفر	منتج مخصص	رأس حفر 0.25 × 5.5 مم، تم التواصل مع الشركة لبناء
1 & mu; صفائح تلميع الحصى	ثورلابز	LF1D
12 رقعة متفرعة من الألياف	عدسة دوريك	CustomBBP(12)_200/220/3000-0.37 _5m_SMA-12xCL_LAF
200 μ الألياف البصرية	ثورلابز	FT200UMT
3 μ صفائح تلميع الحصى	ثورلابز	LF3D
30 & mu; صفائح تلميع الحصى	ثورلابز	LF30D
6 & mu; صفائح تلميع الحصى	ثورلابز	LF6D
خياطة قابلة للامتصاص	إثيكون	J421H
توثيق المربعات الصغرى المعاقبة بشكل تكيفي معاد وزنه بشكل تكراري	جوجل	لا يوجد	https://code.google.com/archive/p/airpls/
دبابيس العصا المصنوعة من الفولاذ الألمنيوم	ماكماستر-كار	98381a983
كاميرات السلوك	تيليداين فلير	بلاكفلاي إس
بونساي	مؤسسة بونساي للبرمجيات	الإصدار 2.9.0
مجهر برايتفيلد	لايكا	ES2
مشابك بولدوج	أدوات العلوم الدقيقة	18038-45
DAQ	الحوسبة القياسية	سلسلة MC USB-200 DAQ
برمجيات DAQ	الحوسبة القياسية	DAQami
الحفر	كوبف إنسترومنتس	نموذج 1911 المثقاب الستيريوتاكسي
ساطور الألياف	ثورلابز	XL411/CLVB
نظام الفوتومترية الليفية	القياس العصبي الضوئي	FP3002
دليل نظام الفوتومترية الليفية	القياس العصبي الضوئي	لا يوجد	دليل جهاز استضافة صفحات الويب: https://neurophotometrics.com/documentation
شريط الألياف	ثورلابز	S90C
مقطف الألياف	ثورلابز	T10S13
الملقط الدقيق	أدوات العلوم الدقيقة	11252-00
مقص دقيق	أدوات العلوم الدقيقة	14084-08
براغي محرك G5	موقع إنتاج إيفيس المفتوح	OEPS-7105
مفك G5	موقع إنتاج إيفيس المفتوح	OEPS-7121
GCaMP6f	مختبر الهندسة العصبية الفيروسية PNI	EF1a-Cre out-GCaMP6f-WPRE-hGHpA
إمساك	أدجين	hSyn-GRAB_DA1m-WPRE-hGHpA
وسادة التدفئة	أدرويت ميديكال سبويزنز	HTP-1500
نظام التدفئة	كنت ساينتفيك	RT-0515
إيزوفلوران	كوفيتروس	29405
jRCaMP1b	أدجين	pAAV.Syn.Flex.NES-jRCaMP1b.WPRE.SV40
صواميل سداسية النحاسية M0.6	MetricScrews.us	21614
كواشف وأدوات الأسمنت الميتابوندية	باركل	S380
مطبوعات راتنج ثلاثية الأبعاد شبيهة ب MicroFine ABS	البروتولابز	منتج مخصص	انظر ملفات الكود التكميلية 1-3، 5، 6
محقن النانولتر	شركة دروموند العلمية	نانوجيكت II	محقن النانولتر
أوراق شمع البارافين	أمكور	فيلم بارافيلم إم متعدد الأغراض لفيلم مختبر
مابيتر	ثيرموفيشر ساينتيفيك	4641310N
تلميع القرص	ورشة الآلات في قسم الفيزياء بجامعة برينستون	منتج مخصص	انظر ملف الكود التكميلي 4
باورميتر	ثورلابز	PM100D
مرهم بصري بورالوب	ديشرا	P1490-1
بايثون	مؤسسة بايثون للبرمجيات	لا يوجد
أنابيب بلاستيكية ناعمة لحبل الرقعة	ماكماستر-كار	3774N4
سبينفيو	تيليداين فلير	الإصدار 1.25.0.52	برنامج تصوير يتحكم في كاميرات السلوك
الإطار المجسم	كوبف إنسترومنتس	موديل 1900
توثيق TMAC	لا يوجد	لا يوجد	رمز TMAC: https://github.com/Nondairy-Creamer/tmac
أنابيب الإطار المجسم	سان غوبان	E-3603
جهاز التبخير	كنت ساينتفيك	جهاز تبخير فيتفلو

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cui, G., et al. Concurrent activation of striatal direct and indirect pathways during action initiation. Nature. 494 (7436), 238-242 (2013).
Adelsberger, H., Zainos, A., Alvarez, M., Romo, R., Konnerth, A. Local domains of motor cortical activity revealed by fiber-optic calcium recordings in behaving nonhuman primates. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (1), 463-468 (2014).
Gunaydin, L. A., et al. Natural Neural Projection Dynamics Underlying Social Behavior. Cell. 157 (7), 1535-1551 (2014).
Jun, J. J., et al. Fully integrated silicon probes for high-density recording of neural activity. Nature. 551 (7679), 232-236 (2017).
Sych, Y., Chernysheva, M., Sumanovski, L. T., Helmchen, F. High-density multi-fiber photometry for studying large-scale brain circuit dynamics. Nature Methods. 16 (6), 553-560 (2019).
Steinmetz, N. A., et al. Neuropixels 2.0: A miniaturized high-density probe for stable, long-term brain recordings. Science. 372 (6539), (2021).
Guo, Z., et al. Neural dynamics in the limbic system during male social behaviors. Neuron. 111 (20), 3288-3306.e4 (2023).
Ma, Y., et al. Wide-field optical mapping of neural activity and brain haemodynamics: considerations and novel approaches. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 371 (1705), 20150360(2016).
Musall, S., Kaufman, M. T., Juavinett, A. L., Gluf, S., Churchland, A. K. Single-trial neural dynamics are dominated by richly varied movements. Nature Neuroscience. 22 (10), 1677-1686 (2019).
Zhou, Z. C., et al. Deep-brain optical recording of neural dynamics during behavior. Neuron. 111 (23), 3716-3738 (2023).
Martianova, E., Aronson, S., Proulx, C. D. Multi-Fiber Photometry to Record Neural Activity in Freely-Moving Animals. JoVE. (152), e60278(2019).
Kim, C. K., et al. Simultaneous fast measurement of circuit dynamics at multiple sites across the mammalian brain. Nature Methods. 13 (4), 325-328 (2016).
Newman, S. W. The Medial Extended Amygdala in Male Reproductive Behavior A Node in the Mammalian Social Behavior Network. Annals of the New York Academy of Sciences. 877, 242-257 (1999).
Goodson, J. L. The vertebrate social behavior network: Evolutionary themes and variations. Hormones and Behavior. 48 (1), 11-22 (2005).
O’Connell, L. A., Hofmann, H. A. Evolution of a Vertebrate Social Decision-Making Network. Science. 336 (6085), 1154-1157 (2012).
Wu, M. V., Tollkuhn, J. Estrogen receptor alpha is required in GABAergic, but not glutamatergic, neurons to masculinize behavior. Hormones and Behavior. 95, 3-12 (2017).
Moffitt, J. R., et al. spatial, and functional single-cell profiling of the hypothalamic preoptic region. Science. 362 (6416), eaau5324(2018).
Gegenhuber, B., Wu, M. V., Bronstein, R., Tollkuhn, J. Gene regulation by gonadal hormone receptors underlies brain sex differences. Nature. 606 (7912), 153-159 (2022).
Knoedler, J. R., et al. A functional cellular framework for sex and estrous cycle-dependent gene expression and behavior. Cell. 185 (4), 654-671.e22 (2022).
Musatov, S., Chen, W., Pfaff, D. W., Kaplitt, M. G., Ogawa, S. RNAi-mediated silencing of estrogen receptor in the ventromedial nucleus of hypothalamus abolishes female sexual behaviors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (27), 10456-10460 (2006).
Lee, H., et al. Scalable control of mounting and attack by Esr1+ neurons in the ventromedial hypothalamus. Nature. 509 (7502), 627-632 (2014).
Hashikawa, K., et al. Esr1+ cells in the ventromedial hypothalamus control female aggression. Nature Neuroscience. 20 (11), 1580-1590 (2017).
Fang, Y. -Y., Yamaguchi, T., Song, S. C., Tritsch, N. X., Lin, D. A Hypothalamic Midbrain Pathway Essential for Driving Maternal Behaviors. Neuron. 98 (1), 192-207.e10 (2018).
Wei, Y. -C., et al. Medial preoptic area in mice is capable of mediating sexually dimorphic behaviors regardless of gender. Nature Communications. 9 (1), 279(2018).
Yamaguchi, T., Wei, D., Song, S. C., Lim, B., Tritsch, N. X., Lin, D. Posterior amygdala regulates sexual and aggressive behaviors in male mice. Nature Neuroscience. 23 (9), 1111-1124 (2020).
Yang, B., Karigo, T., Anderson, D. J. Transformations of neural representations in a social behaviour network. Nature. , (2022).
Jacobowitz, D. M., O’Donohue, T. L. alpha-Melanocyte stimulating hormone: immunohistochemical identification and mapping in neurons of rat brain. Proceedings of the National Academy of Sciences. 75 (12), 6300-6304 (1978).
Flanigan, M. E., et al. Orexin signaling in GABAergic lateral habenula neurons modulates aggressive behavior in male mice. Nature Neuroscience. 23 (5), 638-650 (2020).
Bayless, D. W., et al. A neural circuit for male sexual behavior and reward. Cell. 186 (18), 3862-3881.e28 (2023).
Dawson, M., et al. Hypocretin/orexin neurons encode social discrimination and exhibit a sex-dependent necessity for social interaction. Cell Reports. 42 (7), 112815(2023).
Iyilikci, O., et al. Age-specific regulation of sociability by hypothalamic Agrp neurons. bioRxiv. , (2025).
Patriarchi, T., et al. Ultrafast neuronal imaging of dopamine dynamics with designed genetically encoded sensors. Science. 360 (6396), eaat4422(2018).
Sun, F., et al. A Genetically Encoded Fluorescent Sensor Enables Rapid and Specific Detection of Dopamine in Flies, Fish, and Mice. Cell. 174 (2), 481-496.e19 (2018).
Sun, F., et al. Next-generation GRAB sensors for monitoring dopaminergic activity in vivo. Nature Methods. 17 (11), 1156-1166 (2020).
Duffet, L., et al. A genetically encoded sensor for in vivo imaging of orexin neuropeptides. Nature Methods. 19 (2), 231-241 (2022).
Ino, D., Tanaka, Y., Hibino, H., Nishiyama, M. A fluorescent sensor for real-time measurement of extracellular oxytocin dynamics in the brain. Nature Methods. 19 (10), 1286-1294 (2022).
Wang, H., et al. A tool kit of highly selective and sensitive genetically encoded neuropeptide sensors. Science. 382 (6672), eabq8173(2023).
Dong, C., et al. Unlocking opioid neuropeptide dynamics with genetically encoded biosensors. Nature Neuroscience. 27 (9), 1844-1857 (2024).
Chen, T. -W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
Dana, H., et al. Sensitive red protein calcium indicators for imaging neural activity. eLife. 5, e12727(2016).
Zhang, Z. -M., Chen, S., Liang, Y. -Z. Baseline correction using adaptive iteratively reweighted penalized least squares. The Analyst. 135 (5), 1138(2010).
Iravedra-Garcia, J. M., Guthman, E. M., Cuturela, L., Ocasio-Arce, E. J., Pillow, J. W., Falkner, A. L. Aggression experience and observation promote shared behavioral and neural changes. bioRxiv. , (2024).
Guthman, E. M., Iravedra-Garcia, J. M., Sirrs, L., Le, A., Falkner, A. L. Context rescales a social action code in a hormone-sensitive network. bioRxiv. , (2025).
Zhang, Z. -M., Chen, S., Liang, Y. -Z. Baseline correction using adaptive iteratively reweighted penalized least squares. The Analyst. 135 (5), 1138(2010).
Saunders, A., Johnson, C. A., Sabatini, B. L. Novel recombinant adeno-associated viruses for Cre activated and inactivated transgene expression in neurons. Frontiers in Neural Circuits. 6, (2012).
Creamer, M. S., Chen, K. S., Leifer, A. M., Pillow, J. W. Correcting motion induced fluorescence artifacts in two-channel neural imaging. PLOS Computational Biology. 18 (9), e1010421(2022).
Donka, R. M., Loh, M. K., Konanur, V. R., Roitman, M. F., Roitman, J. D. PASTa: An Open-Source Analysis and Signal Processing Toolbox for Fiber Photometry Data. Current Protocols. 5 (7), e70161(2025).
Keevers, L. J., Jean-Richard-dit-Bressel, P. Obtaining artifact-corrected signals in fiber photometry via isosbestic signals, robust regression, and dF/F calculations. Neurophotonics. 12 (02), (2025).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

CMOS

تسجيلات الفوتومترية متعددة الألياف ثنائية اللون لشبكة السلوك الاجتماعي في الفئران

في هذه المقالة

ملخص

الملخص

المقدمة

البروتوكول

النتائج

المناقشة

شكر وتقدير

المواد

المراجع

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

مقالات ذات صلة