يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

تسلسل السائل الدماغي الشوكي من الجيل التالي في التحول الجيني للكشف عن مسببات الأمراض في الجهاز العصبي المركزي

292 مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/70075

⸱

أبريل 17, 2026

 ,  ,  , 
1University of California, San Francisco Weill Institute for Neurosciences, Department of Neurology, University of California, San Francisco

في هذه المقالة

ملخص

يوضح هذا البروتوكول البحثي سير عمل محسن لتسلسل الجيل التالي (mNGS) للسائل الدماغي الشوكي في الجينوم. من خلال معالجة التحديات الفريدة لعينات منخفضة الكتلة الحيوية، تمكن الطريقة من اكتشاف ممرض قوي عبر بيئات موارد متنوعة، مما يوفر أساسا متعدد الاستخدامات لتطبيقات أبحاث الأمراض العصبية المعدية.

الملخص

برز تسلسل الجيل التالي من الميتاجينوم (mNGS) كأداة قوية للكشف غير المتحيز عن مسببات الأمراض وتحليل ملفات النسخ للمضيف في البيئات السريرية والبحثية. بينما يزداد الاعتراف بفائدته في تشخيص عدوى الجهاز العصبي المركزي (CNS)، تشكل عينات السائل الدماغي الشوكي تحديات فريدة بسبب انخفاض وفرة الأحماض النووية وقابليتها للتدهور. تقدم هذه الدراسة بروتوكولا بحثيا محسنا لمنصات تسلسل Illumina، مصمم خصيصا لمعالجة العينات، واستخلاص الأحماض النووية، وتحضير المكتبة، والتتابع، والتحليل المعلوماتي الحيوي. كما تتوفر طرق مراقبة جودة قابلة للتكيف مع البيئات ذات الموارد العالية والمنخفضة، بما في ذلك بدائل للرحلان الكهربائي الشعري. تظهر هذه الدراسة متانة البروتوكول من خلال مجموعتين ممثلتين: سير عمل عالي العمق قائم على NovaSeq وسير عمل واعي من التكلفة يعتمد على NextSeq. عبر هذه الفئات، تم اكتشاف مسببات الأمراض في أكثر من 50٪ من الحالات، مما يؤكد الإمكانيات التشخيصية للطريقة حتى مع التكيفات المحدودة من حيث الموارد. يسهل هذا البروتوكول نظام الألياف الدماغية الدماغية القابلة للتكرار، مما يوفر أساسا لتطبيقات متنوعة في أبحاث وتشخيص الأمراض المعدية العصبية.

المقدمة

التسلسل من الجيل التالي في الميتاجينوم (mNGS) هو تقنية جزيئية تستخدم بشكل متزايد تسمح بالكشف عن طيف واسع من الأحماض النووية ضمن بيئة معينة أو عينة مضيفةمعينة. من خلال تضخيم وتسلسل الغالبية العظمى من المادة الوراثية داخل العينة، لا يتطلب mNGS فرضية مسبقة حول الكائنات الدقيقة المحددة التي قد تكون موجودة. أظهرت mNGS فائدة كأداة تشخيصية في مجموعة متنوعة من البيئات السريرية، مثل الكشف عن مسببات الأمراض غير الشائعة أو الظهور غير النمطي للأمراض المعدية 1,2,3. علاوة على ذلك، يتم أيضا التقاط ملف النسخ المضيف بواسطة بيانات تسلسل الحمض النووي الريبي التي تولدها اختبار mNGS، مما يسمح للباحثين بفهم استجابة المناعة للمضيف لحالات الأمراض المختلفةبشكل أفضل. أدى تطبيق mNGS على مجموعة واسعة من السياقات السريرية والبحثية، إلى جانب الانخفاض الكبير في تكلفة التسلسل الجنيس في العقود الأخيرة، إلى نمو هائل في استخدام هذه التقنية5.

على وجه الخصوص، أظهر mNGS وعدا في اكتشاف عدوى الجهاز العصبي المركزي (CNS)، والتي لا تزال صعبة التشخيص 2,6,7. قبل ظهور اختبارات mNGS السريرية، قام مشروع التهاب الدماغ في كاليفورنيا بدراسة أسباب التهاب الدماغ في جميع أنحاء الولاية ووجد أن أكثر من نصف الحالات بقيت غير مشخصة، رغم استخدام مجموعة موسعة من الاختبارات الجزيئية والتقييم السريري المفصل8. الآن، بعد أكثر من عقدين، كشف اختبار mNGS المعتمد سريريا لسائل دماغي شوكي (CSF) عن وجود كائنات ممرضة في السائل الشوكي لما يقرب من 15٪ من المرضى الذين يشك في إصابتهم بعدوى الجهاز العصبي المركزيخلال فترة سبع سنوات. علاوة على ذلك، بين المرضى الذين تم تشخيصهم معديا مؤكدا، تم تشخيص واحد من كل خمسة فقط بواسطة هذا الاختبار السريري للأشعة الدماغية الدماغية (CSF)، مما يؤكد فائدة هذا النهج الاختباري7. بالإضافة إلى ذلك، أظهرت الدراسات أيضا إمكانية التنبؤ باحتمالية حدوث عدوى مختلفة في الجهاز العصبي المركزي بناء على النسخ المضيف الناتج عن اختبار mNGS 9,10,11.

ومع ذلك، فإن سهولة الوصول لهذه التقنية الواعدة محدودة بالتحديات الفريدة في معالجة ومعالجة عينات CSF. على وجه الخصوص، غالبا ما تكون كمية الحمض النووي والحمض النووي الشوكي الشوكي الشوكي أقل من الحد الأدنى للكمية المحددة في مجموعات تحضير المكتبة12,13. يمكن أن تكون جودة الأحماض النووية أيضا دون المستوى الأمثل، نظرا لأن عينات السائل النخاعي المجمعة لأغراض سريرية غالبا ما تخزن في درجات حرارة يمكن أن تبقى فيها الحمض النووي النووي والحمض النووي الريبي نشطة14. تصف هذه الورقة بروتوكول mNGS قائم على الأبحاث لأنظمة تسلسل Illumina، وقد تم تحسينه لتعظيم احتمال توليد بيانات قابلة للاستخدام لاكتشاف مسببات الأمراض (الشكل 1).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تم تطوير هذا البروتوكول واختباره باستخدام عينات جمعت كجزء من دراسات معتمدة من قبل مجلس مراجعة المؤسسات في UCSF.

figure-protocol-1
الشكل 1: معالجة العينات من الجيل التالي (mNGS) في تسلسل العينات الميتاجينومي (mNGS) وسير العمل التحليلي لاكتشاف الممرضات. يوضح هذا المخطط الخطوات الأساسية في مختبر التقنية الرطبة والمسارات الحيوية للعلوم الدماغية (CSF). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

1. اعتبارات التعامل مع عينات CSF

ملاحظة: تكون نتائج mNGS مثالية إذا تم تحضير مكتبة السائل الدماغي الشوكي وقت الجمع، أو إذا تم الحفاظ على عينات السائل الدماغي عبر التجميد الفوري في النيتروجين السائل، تليها التخزين طويل الأمد عند -80 درجة مئوية15. بدلا من ذلك، يمكن أن يسمح استخدام المحاليل الحافظة مثل درع DNA/RNA وقت جمع العينات بالتخزين في درجة حرارة الغرفة لفترات أطول16,17. قد يكون هذا مفضلا في الحالات التي تكون فيها مخاوف بشأن موثوقية سلسلة التبريد. بالإضافة إلى ذلك، يمكن لتجنب دورات التجمد والذوبان غير الضرورية أن يساعد أيضا في الحفاظ على سلامة الأحماض النووية، وقد يكون من الحكمة أخذ العينات مسبقا عند الجمع إذا كان من المتوقع تعدد سير العمل التحليلي لعينات CSF18,19.

2. استخراج حمض السائل النخاعي النووي

تحذير: قم بالعمل في خزانة مناسبة لمستوى السلامة البيولوجية مع قفازات ومعطف مختبر لتقليل خطر انتقال الكائنات المعدية. المواد الكيميائية ضارة إذا ابتلعتها أو استنشقت أو لامست الجلد. التخلص من المواد المستخدمة كنفايات كيميائية خطرة وفقا للأنظمة المحلية.

  1. عادة ما تعمل مجموعة Quick-DNA/RNA جيدة للعينات التي تحتوي على وفرة منخفضة من الأحماض النووية.
  2. قم بإذابة عينات السائل النخاعي على الثلج، ثم نقل 100 ميكرولتر إلى 1 مل من كل عينة إلى أنبوب بسعة 1.5 مل وجهاز طرد مركزي عند 16,000 × جرام عند 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق.
  3. قم بإزالة الماصة بعناية من السوبرناتانت، تاركا خلفك الحبيبة (التي غالبا ما تكون غير مرئية بالعين المجردة) و100 ميكرولتر من السوبرناتانت.
  4. أضف 100 ميكرولتر من درع DNA/RNA إلى ال 100 ميكرولتر المتبقية من المادة الفائقة والحبيبات، وامزج الماصة جيدا.
  5. ثم أضف 600 ميكرولتر من محلول تحلل DNA/RNA وخلط الماصة حتى يصبح المحلول متجانسا.
  6. اتبع بقية بروتوكول استخراج DNA/RNA كما وصفه المصنع في الملحق التكميلي A، مع التعديلات المهمة التالية الخاصة بالسائل الدماغي الشوكي:
    1. قم بجميع خطوات الطرد المركزي لمدة دقيقة واحدة بأقصى سرعة (~21,000 × g) باستثناء الخطوة النهائية لغسل DNA/RNA، والتي يجب أن تستمر لمدة 3 دقائق بأقصى سرعة.
    2. يتم شرب العينة بإضافة 22 ميكرولتر (بدلا من 25 ميكرولتر) من الماء الخالي من النوكلياز مباشرة إلى مصفوفة الأعمدة، ثم يحتضن العينة لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة. الحجم الأعلى يؤدي عادة إلى كمية أكبر من الحمض النووي المنبعثة من العمود.
    3. بعد التطهير، قم بعمل الماصة على مصفوفة العمود ثم قم بعمل الماصة على مصفوفة العمود والطرد المركزي مرة أخرى لمدة دقيقة واحدة بأقصى سرعة. انقل العينة إلى أنبوب تخزين جديد بسعة 1.5 مل، ثم إما المضي قدما فورا في التحضير للمكتبة أو تخزينه عند -80 درجة مئوية.

3. تحضير مكتبة الحمض النووي الريبي السائل الدماغي

تحذير: قم بالأداء في خزانة السلامة البيولوجية المناسبة، وارتداء قفازات ومعطف مختبر. المواد الكيميائية ضارة إذا ابتلعتها أو استنشقت أو لامست الجلد. التخلص من المواد المستخدمة كنفايات كيميائية خطرة وفقا للأنظمة المحلية.

ملاحظة: اعتبارات مهمة قبل البدء: يفضل استنزاف rRNA على إثراء البولي أدينيليشن لعزل mRNA، نظرا لأن استنزاف rRNA لا يتطلب خطوات إضافية نظيفة (مما قد يقلل من إنتاج mRNA القابل للاستخدام)، وبعض نسخ فيروسات RNA الغازية العصبية تفتقر إلى البولي أدينيل. يمكن إضافة سبايك-إن من ERCC (اتحاد التحكم الخارجي للRNA) كمقياس لمراقبة الجودة، رغم أنه ليس ضروريا تماما. إذا تم تخزين الحمض النووي الريبي عند -80 درجة مئوية بعد الاستخراج، فإذابة الجليد على الجليد قبل البدء.

  1. تجزئة وتحضير الحمض النووي الريبي: خلط البيبت التالي في أنبوب تفاعل متسلسل بوليميراز (PCR): عينة RNA بسعة 3.5 ميكرولتر، 0.5 ميكرولتر 1:2500 سبايك ERCC مخفف، 4 ميكرولتر لمخزن تفاعل الخيط الأول (5x)، 1 ميكرولتر برايمر عشوائي، و1 ميكرولتر مخفف 1:100 rRNA (جدول المواد). في جهاز التدوير الحراري، اضبط الغطاء المسخن على 105 درجة مئوية وحضن العينات على 75 درجة مئوية لمدة دقيقتين، 70 درجة مئوية لمدة دقيقتين، 65 درجة مئوية لمدة دقيقتين، 60 درجة مئوية لمدة دقيقتين، 55 درجة مئوية لمدة دقيقتين، 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، و25 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
  2. تخليق cDNA للسلسلة الأولى: تقوم البيبيت بخلط الحمض النووي الريبي المجزأ والممهد (10 ميكرولتر) مع 8 ميكرولتر ماء خال من النوكلياز و2 ميكرولتر من خليط إنزيم تخليق الخيط الأول. في جهاز التدوير الحراري، اضبط الغطاء المسخن على 105 درجة مئوية وحضن العينات على 25 درجة مئوية لمدة 10 دقائق، و42 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة، و70 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
  3. تخليق cDNA للسلسلة الثانية: يخلط البيبيت الحمض النووي المركب في السلسلة الأولى (20 ميكرولتر) مع 8 ميكرولتر لمخزن تفاعل تخليق السلسلة الثانية، و4 ميكرولتر لمزيج إنزيمات تخليق الخيط الثاني، و48 ميكرولتر ماء خال من النوكلياز. في جهاز التدوير الحراري، يتم حضن العينات لمدة ساعة واحدة عند درجة حرارة 16 درجة مئوية، مع إغلاق الغطاء الساخن.
  4. إجراء تنقية للخرزات المغناطيسية (الملاحق الإضافية B) باستخدام نسبة 1.8x من خرزات SPRI المغناطيسية (144 ميكرولتر). يتم إدخاله إلى مياه خالية من النوكلياز بسعة 53 ميكرولتر ونقل 50 ميكرولتر من المادة الفائقة النهائية (التي تحتوي على cDNA مزدوج السلسلة المنقى) إلى أنبوب PCR نظيف خال من النوكلياز. في هذه المرحلة، يمكن تجميد العينات بأمان عند -20 درجة مئوية طوال الليل إذا لزم الأمر.
  5. تحضير نهاية مكتبة cDNA: إذا تم تخزين العينة عند -20 درجة مئوية خلال الليل، قم بإذابة الجليد قبل إعادة التشغيل. تخلط بيبت الحمض النووي ds-cDNA المنقى (50 ميكرولتر) مع 7 ميكرولتر من محلول تفاعل التحضير النهائي و3 ميكرولتر من خليط إنزيم التحضير النهائي.
  6. في جهاز التدوير الحراري، حضن العينات عند 20 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، و65 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، مع إغلاق الغطاء المسخن.
  7. ربط المحول (قم بهذه الخطوة على الجليد): أنشئ تخفيفا بنسبة 1:100 للمحول في مياه خالية من النوكليز. يتم دمج خليط تفاعل التحضير النهائي (60 ميكرولتر) إلى أنبوب يحتوي على خليط رئيسي للربط 30 ميكرولتر، ومعزز ربط 1 ميكرولتر، ومحول مخفف بسعة 2.5 ميكرولتر 1:100. تأكد من إضافة المحول بشكل منفصل (مثلا، ليس ممزوجا مسبقا مع خليط الربط الرئيسي أو معزز الربط) لتجنب تكوين دايمر في المعدل.
  8. في جهاز التدوير الحراري، يتم حضن العينات على حرارة 20 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة، مع إغلاق الغطاء الساخن.
  9. انتقل فورا إلى تنقية الخرزات المغناطيسية (الملحق التكميلي 2) باستخدام نسبة 0.9x من خرز SPRI المغناطيسي (87 ميكرولتر).
  10. يسحب إلى ماء خال من النوكلياز بسعة 17 ميكرولتر، وينقل 15 ميكرولتر من المادة الفائقة النهائية إلى أنبوب PCR نظيف خال من النوكلياز
  11. PCR المرمز: يتم توصيل cDNA المنقى المرتبط بالمحول (15 ميكرولتر) إلى أنبوب يحتوي على إنزيم USER بسعة 3 ميكرولتر، و25 ميكرولتر Q5 Master Mix، و10 ميكرولتر برايمرات باركود فريدة. في جهاز الدراجة الحرارية، اضبط الغطاء المسخن على 105 درجات مئوية، واحتضن العينات على 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة، ثم 98 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، ثم قم بأداء 19 دورة من 98 درجة مئوية لمدة 10 ثوان و65 درجة مئوية لمدة 75 ثانية. أكمل اختبار PCR بالحضانة عند 65 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
  12. قم بإجراء تنقية نهائية للخرزات المغناطيسية باستخدام نسبة 0.8x من الخرزات المغناطيسية (43 ميكرولتر). يتم السحب في مياه خالية من النوكلياز سعة 23 ميكرولتر، وبعد الخطوة النهائية لفصل الخرز، يتم نقل 20 ميكرولتر إلى أنبوب PCR نظيف خال من النوكلياز. في هذه المرحلة، يمكن تجميد العينات بأمان عند -20 درجة مئوية طوال الليل إذا لزم الأمر.

4. تحضير مكتبة الحمض النووي للسائل الشوكي

تحذير: قم بالأداء في خزانة مناسبة للسلامة البيولوجية مع قفازات ومعطف مختبر. المواد الكيميائية ضارة إذا ابتلعتها أو استنشقت أو لامست الجلد. التخلص من المواد المستخدمة كنفايات كيميائية خطرة وفقا للأنظمة المحلية.

  1. إذا تم تخزين الحمض النووي المستخرج عند -20 درجة مئوية خلال الليل، فإذابته على الجليد قبل إعادة التشغيل.
  2. تجزئة الحمض النووي والتحضير النهائي: اخلط محلول تفاعل الخيط الأول جيدا عن طريق الدوامة والمزج بالماصة لإعادة تعليق أي ترسب. خليط البيبت يحتوي على 3.5 ميكرولتر من الحمض النووي المستخرج، 22.5 ميكرولتر ماء خال من النوكليز، 7 ميكرولتر من محلول تفاعل الخيط الأول، و2 ميكرولتر من خليط الإنزيم من الخيط الأول.
  3. في جهاز التدوير الحراري، اضبط الغطاء المسخن على 105 درجة مئوية وحضن العينات على 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، ثم 65 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  4. عملية ربط المحول والترميز الشريطي في PCR متطابقة لمكتبات الحمض النووي والحمض النووي الريبي. كرر الأقسام 7–10 من "تحضير مكتبة الحمض النووي الشوكي الشوكي" مع الحمض النووي المجزأ والمعد في النهاية لإكمال تحضير مكتبة الحمض النووي.

5. مراقبة جودة المكتبة وتجميعها

  1. قم بقياس تركيز مكتبات العينات عبر مجموعة قياس الحمض النووي وجهاز الفلورومتر المقابل. يجب أن تحتوي ضوابط المياه على تركيزات أقل بكثير (أو غير قابلة للقياس) مقارنة ببقية العينات.
  2. تقييم حجم مكتبات العينات عن طريق تشغيل العينات على جهاز الرحلان الكهربائي الشعري الآلي.
  3. بدلا من ذلك، إذا لم تتوفر آلة الرحلان الكهربائي الشعرية الآلية، قم بتضخيم 1-2 ميكرولتر من العينة بإجراء تفاعل PCR باستخدام بادئات Illumina العالمية، ثم قم بالرحلان الكهربائي بمقدار 10 ميكرولتر من المنتج النهائي على جل أغاروز بنسبة 2٪. التخلص من المواد المستخدمة كنفايات كيميائية خطرة وفقا للأنظمة المحلية.
    ملاحظة: الطول الأمثل للمكتبة هو حوالي 400–500 زوج قاعدة، لذا يجب تعديل حضانات التجزئة المستقبلية وفقا لذلك إذا كانت أحجام المكتبات أكبر أو أقصر من المرغوب فيه. بالإضافة إلى ذلك، من الضروري تقييم وجود الديمرات المكيلة، التي يبلغ طولها حوالي 150 زوج قاعدة، وتحدث عندما يرتبط جزيئان من المحول معا دون وجود تسلسل إدخال. حتى لو كانت موجودة بكميات منخفضة، تميل دايمرات المحولات إلى التجمع والتسلسل بكفاءة على خلية التدفق، مما يقلل من نسبة القراءات القابلة للاستخدام أثناء تشغيل التسلسل. وبالتالي، إذا كانت هناك ديمرات محولات، قم بتنقية إضافية للخرز المغناطيسي بنسبة 0.8x من خرز SPRI المغناطيسي. (ومن الجدير بالذكر، إذا كان >10٪ من العينة من ديمر المحول، فقد يستغرق الأمر 2-3 جولات من تنقية الخرزات المغناطيسية لإزالة معظم الديمرات المحولة).
  4. لضمان عمق مماثل من التسلسل عبر العينات ضمن نفس سلسلة التسلسل، من الضروري تجميع كميات متساوية الشكل لكل عينة. إذا كانت أحجام المكتبات قابلة للمقارنة عبر جميع العينات، ببساطة قم بتجميع الكتل المتكافئة لكل مكتبة RNA وتكرار ذلك بشكل منفصل لكل مكتبة DNA.

6. اعتبارات التسلسل

  1. العينات المجمعة جاهزة الآن للتسلسل على أجهزة التسلسل من Illumina. إذا كنت تقوم بالتسلسل داخليا (بدلا من منشأة متخصصة في التسلسل الأساسي)، قم بتفكيك وتخفيف المكتبات المجمعة بعناية وفقا لتعليمات جهاز التسلسل قبل تحميل المجموعة على خرطوشة الكواشف (التركيز النموذجي هو 4 نانوميل لمعظم منصات تسلسل Illumina).
  2. احسب عمق التسلسل المقدر عن طريق قسمة عائد البيانات المتوقع لخلية تدفق إلومينا على عدد العينات المتبادلة في التشغيل.
    ملاحظة: تحديد عمق التسلسل المطلوب يعتمد على عدة عوامل، منها التكلفة، وجهاز التسلسل المستخدم، وأهداف التجربة. يتم عرض مثالين على أعماق تسلسل مختلفة أدناه في قسم النتائج التمثيلية.

7. تحليل البيانات لاكتشاف الممرضات

  1. استخدم منصة الويب مفتوحة المصدر Chan Zuckerberg ID (CZID, https://www.czid.org, Illumina mNGS Pipeline v8.3) لإجراء التحليل الميتاجينومي لاكتشاف مسببات الأمراض. يتضمن CZID أيضا خيارات لرفع العينات عبر واجهة سطر الأوامر والنقل المباشر من حساب Illumina BaseSpace إلى CZID. يتوفر نظرة عامة مفصلة على تحليل بيانات CZID mNGS على https://chanzuckerberg.zendesk.com/hc/en-us/articles/13770737266196-Guide-to-mNGS-Data-Analysis
  2. سجل الدخول إلى CZID، اضغط على "رفع"، اختر "الميتاجينومكس" لنوع التحليل، واختر ملفات الإدخال السريعة من عملية التسلسل. إدخال المعلومات اللازمة لكل عينة، بما في ذلك اسم العينة، ونوع العينة (CSF)، والنيوكليوتيدات (RNA أو DNA).
    ملاحظة: تخضع الملفات المرفوعة لمعالجة تلقائية عبر خط أنابيب CZID، الذي يتضمن عدة أدوات حسابية مثل STAR وBowtie2 وTrimmomatic وPriceSeq وGSNAP، من بين أخرى، لإزالة القراءات منخفضة الجودة وتسلسلات القراءة البشرية. ثم يقوم خط الأنابيب بمحاذاة وتجميع التسلسلات المصفاة باستخدام قواعد بيانات النيوكليوتيدات (NT) والبروتينات (NR) التابعة للمركز الوطني لمعلومات التكنولوجيا الحيوية (NCBI) عبر برامج Minimap2 وDIAMOND على التوالي. يتضمن الناتج النهائي من CZID أعداد تصنيفات NT/NR وأعداد الكونتيج (الأجزاء المتجاورة المتداخلة التي تولد أثناء التجميع) لكل عينة.
  3. بعد المعالجة، انقر على مجلد المشروع الذي يحتوي على العينات وانتقل إلى لوحة التلخيص.
  4. قم بالتمرير للأسفل لفحص عدد القراءات لكل عينة (وقارن مع العدد المتوقع للقراءات بناء على خلية تدفق Illumina المستخدمة وعدد العينات التي تم تعددها في عملية التسلسل)، ونسبة القراءات التي اجتازت ترشيح مراقبة الجودة، ونسبة الضغط المكررة لتقييم مدى تحيز التضخيم المفرط ل PCR.
  5. وجود التلوث بواسطة شظايا الأحماض النووية البيئية - سواء التي يتم الحصول عليها أثناء عملية جمع عينات السائل الشوكي الشوكي، أو أثناء الاستخراج/التحضير في المكتبة - هو أمر شائع20. لتحديد ما إذا كانت القراءات البكتيرية والفطرية والطفيلية إيجابية حقيقية، يمكن النظر في طرق محتملة تستخدم أعداد القراءة الموحدة (القراءات في المليون، أو rpm):
    1. إنشاء نموذج خلفية (مثلا، باستخدام عينات مياه تم استخراجها وتحضيرها وتسلسلها) مباشرة داخل CZID لتصفية أي تصنيفات تحتوي على rPMs مشابهة أو أقل في الوفرة مقارنة بالنموذج الخلفي (وبالتالي من المحتمل أن تمثل التلوث). داخل مجلد المشروع، تحقق من كل عينة من عينات التحكم في المياه ثم اضغط على "نموذج خلفية" للإنشاء. أثناء تحليل كل عينة، اختر نموذج الخلفية وانقر على "مرشحات العتبة" لتطبيق "درجة NTZ" > 1 (أو أعلى) لتصفية الملوثات المحتملة.
    2. استخدم عتبات rpm المحددة مسبقا، مثلعينة RPM > 10* (متوسط تحكم rPM)، أو log10 (عينة rPM) تزيد على الأقل 1 log عن log 10 (متوسطعدد الدفعات كاملة). أولا، قم بتنزيل rpm الخاص بالتصنيف لكل عينة عن طريق التحقق من كل عينة في صفحة المشروع، والنقر على تنزيل، واختيار "نتائج التصنيف المركبة للعينات". يمكن تحليل ملف .csv الناتج باستخدام برامج إحصائية مثل R أو Stata حسب الرغبة.
      ملاحظة: نظرا للوفرة النسبية الأقل للممرضات الفيروسية، يجب اعتبار أي فيروس لديه إمكانات تدخلية عصبية معروفة وقراءة واحدة على الأقل تتوافق مع الجينوم الفيروسي نتيجة إيجابية (ويفضل أن يتم تأكيده عبر تكرار mNGS أو اختبارات سريرية خاصة بمسببات الأمراض). بالإضافة إلى ذلك، يتطلب خط أنابيب التحليل أن تكون كل قراءة في ملف fastq محاذاة حسابيا مع الجينوم المرجعي الأكثر احتمالا في قاعدة بيانات NCBI. وبالتالي، قد تكون بعض القراءات غير محددة نسبيا لممرض معين، ومن الناحية النظرية قد تكون متوافقة مع مجموعة واسعة من الكائنات الحية بدلا من التصنيف المحدد في CZID. نظرا لهذا الخطر، يجب إجراء تأكيد يدوي للمكالمات الإيجابية عن طريق تأكيد المحاذاة عبر أداة NCBI BLAST المعتمدة على الويب (يمكن إرسال القراءات المحددة لتصنيف معين مباشرة من CZID إلى NCBI BLAST بالنقر على أيقونة الانفجار بجانب التصنيف المعني).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

مراقبة جودة المكتبة
بعد استخراج DNA/RNA، يكون التركيز المقاس للحمض النووي المستخرج عادة بين 1–10 نانوغرام/ميكرولتر. ومع ذلك، فإن تركيز الحمض النووي الريبي المستخرج غالبا ما يكون في حدود pg/μL، وبالتالي غالبا ما يكون غير قابل للكشف بواسطة مقياس الطيف الضوئي. بعد تحضير المكتبة، تكون مكتبات cDNA والحمض النووي المنقاة والمضخمة عادة عند تركيز 0.5–10 ng/μL و10–30 ng/μL على التوالي. تظهر بيانات الرحلان الكهربائي الشعري وتخطيط الكهروبية في الشكل 2A

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

هناك اعتبارات مهمة قد تتطلب تعديلات على هذا البروتوكول، وذلك حسب عمق التسلسل المطلوب، ومنصة التسلسل المستخدمة، وتوفر المعدات لمراقبة الجودة. ومع ذلك، فإن المجموعتين الممثلتين المعروضتين هنا تظهران أن الكشف القوي عن مسببات الأمراض ممكن عبر مجموعة واسعة من الظروف التجريبية. على وجه التحديد، أظهرت المجموعة ب أنه، رغم عدة تدابير لتوفير التكاليف – مثل التسلسل الضحل، واستبعاد عناصر التحكم في ERCC، وتصغير البروتوكول، واستخدام الرحلان الكهربائي الهلام التقليدي لمراقبة الجودة (بدلا من المحلل الحي...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يحصل M.R.W. على تمويل بحثي غير مرتبط من Roche/Genentech ونوفارتس وكيفرنا ثيرابيوتكس، وهو مؤسس وعضو مجلس إدارة شركة Delve Bio Inc. قدم خدمات استشارية لشركات فايزر، فيرتكس فارماسيوتيكالز، أورو ميديسينز، وإندابتا ثيرابيوتكس.

شكر وتقدير

وقد دعمت هذه الدراسة تمويل من مركز فوغارتي الدولي للمعاهد الوطنية للصحة بموجب الجائزة رقم D43TW009343. نود أن نشكر العديد من الباحثين في مختبر ويلسون، وجامعة كاليفورنيا في سان فرانسيسكو، وCZI الذين ساهموا في تطوير وتحسين بروتوكولات mNGS لتطبيقات بحثية متنوعة خلال السنوات القليلة الماضية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
شريط أنبوب PCR بسعة 0.2 ململإبندورف30124359
أنابيب الربط النووي 1.5 ملإبندورف30108051
أنابيب قفل آمن بسعة 1.5 ملإبندورف30120191
مزيج ERCC RNA Spike-Inثيرمو فيشر4456740
كواشف D1000 عالية الحساسيةأجيلينت5067-5585
مزيج رئيسي لتضخيم مكتبة إنفيتروجن كوليبريثيرمو فيشرA38539050
ماسترسايكلر x50ثيرمو فيشر6311000010
NEBNext Multiplex Oligos لفيلم Illuminaمختبرات نيو إنجلاند البيولوجية7335S/L
مجموعة تحضير مكتبة الحمض النووي NEBNext Ultra IIمختبرات نيو إنجلاند البيولوجيةE7645
مجموعة تحضير مكتبة الحمض النووي الريبي لجهاز NEBNext Ultra II ل Illuminaمختبرات نيو إنجلاند البيولوجيةE7770
NextSeq 500/550 مجموعة الإخراج العالي v2.5 (150 دورة)إلومينا20024907
NextSeq 550إلومينالا يوجد
مجموعة QIAseq FastSelect -rRNA HMRكياغين334386
كيوبت 1X dsDNA لاختبار عالي الحساسيةالكيوبتQ33230
فلوروميتر الكيوبت 4ثيرمو فيشرلا يوجد
مجموعة Quick-DNA/RNA Microprep PlusزيموD7005
تيب ستيشن 4150أجيلينتG2992AA

المراجع

  1. Chiu, C. Y., Miller, S. A. Clinical metagenomics. Nat Rev Genet. 20 (6), 341-355 (2019).
  2. Wilson, M. R., et al. Clinical metagenomic sequencing for diagnosis of meningitis and encephalitis. N Engl J Med. 380 (24), 2327-2340 (2019).
  3. Forbes, J. D., Knox, N. C., Ronholm, J., Pagotto, F., Reimer, A. Metagenomics: the next culture-independent game changer. Front. Microbiol. 8, (2017).
  4. Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat Rev Genet. 10 (1), 57-63 (2009).
  5. DNA Sequencing Costs: Data. , National Human Genome Research Institute (US). https://www.genome.gov/about-genomics/fact-sheets/DNA-Sequencing-Costs-Data (2026).
  6. Wilson, M. R., et al. Chronic meningitis investigated via metagenomic next-generation sequencing. JAMA Neurology. 75 (8), 947-955 (2018).
  7. Benoit, P., et al. Seven-year performance of a clinical metagenomic next-generation sequencing test for diagnosis of central nervous system infections. Nat Med. 30 (12), 3522-3533 (2024).
  8. Glaser, C. A., et al. In search of encephalitis etiologies: diagnostic challenges in the California encephalitis project, 1998-2000. Clinical Infectious Diseases. 36 (6), 731-742 (2003).
  9. Ramachandran, P. S., et al. Integrating central nervous system metagenomics and host response for diagnosis of tuberculosis meningitis and its mimics. Nat Commun. 13, 1675(2022).
  10. Xing, Z., et al. Integrating DNA/RNA microbe detection and host response for accurate diagnosis, treatment, and prognosis of childhood infectious meningitis and encephalitis. J Transl Med. 22, 583(2024).
  11. Omura, C., et al. 298. Host response profiling from clinical metagenomic sequencing data for diagnosis of central nervous system infections. Open Forum Infect Dis. 12 (1), (2025).
  12. Andriuk, L. V., Skochiĭ, P. G. Nucleic acids of the cerebrospinal fluid in acute disorders of cerebral circulation. Zh Nevropatol Psikhiatr Im S S Korsakova. 88 (7), 32-34 (1988).
  13. Olausson, J., et al. Optimization of cerebrospinal fluid microbial DNA metagenomic sequencing diagnostics. Sci Rep. 12 (1), 3378(2022).
  14. Becskei, A., Rahaman, S. The life and death of RNA across temperatures. Comput Struct Biotechnol J. 20, 4325-4336 (2022).
  15. Wang, C., Liu, H. Factors influencing degradation kinetics of mRNAs and half-lives of microRNAs, circRNAs, lncRNAs in blood in vitro using quantitative PCR. Sci Rep. 12 (1), 7259(2022).
  16. Cb, T., et al. DNA/RNA preservation in glacial snow and ice samples. Frontiers in microbiology. 13, (2022).
  17. Kazantseva, J., et al. Optimisation of sample storage and DNA extraction for human gut microbiota studies. BMC microbiology. 21 (1), (2021).
  18. Xiaoli, J., et al. The impact of repeated freeze-thaw cycles on the quality of biomolecules in four different tissues. Biopreservation and biobanking. 15 (5), (2017).
  19. Kellman, B. P., et al. Multiple freeze-thaw cycles lead to a loss of consistency in poly(A)-enriched RNA sequencing. BMC genomics. 22 (1), (2021).
  20. Zinter, M. S., Mayday, M. Y., Ryckman, K. K., Jelliffe-Pawlowski, L. L., DeRisi, J. L. Towards precision quantification of contamination in metagenomic sequencing experiments. Microbiome. 7 (1), 62(2019).
  21. Mayday, M. Y., Khan, L. M., Chow, E. D., Zinter, M. S., DeRisi, J. L. Miniaturization and optimization of 384-well compatible RNA sequencing library preparation. PLoS One. 14 (1), e0206194(2019).
  22. Sakiyama, Y., et al. Brain biopsy and metagenomic sequencing enhance aetiological diagnosis of encephalitis. Brain Commun. 7 (3), fcaf1650(2025).
  23. Sakiyama, Y., Yuan, J., Yoshimura, A., Takei, J., Ando, M., Takashima, H. Etiological insights of encephalitis and encephalitis-like central nervous system diseases: brain tissue metagenomic next-generation sequencing. Neurology. 102 (7-1), 3782(2024).
  24. Sun, J., et al. Correcting PCR amplification errors in unique molecular identifiers to generate accurate numbers of sequencing molecules. Nat Methods. 21 (3), 401-405 (2024).
  25. Tan, J. K., et al. Laboratory validation of a clinical metagenomic next-generation sequencing assay for respiratory virus detection and discovery. Nat Commun. 15 (1), 9016(2024).
  26. Prasanna, A. kshatha Clin-mNGS: Automated pipeline for pathogen detection from clinical metagenomic data. , https://github.com/AkshathaPrasanna/Clin-mNGS (2025).
  27. Marra, P. S., et al. Metagenomic next-generation sequencing in patients with infectious meningoencephalitis: a comprehensive systematic literature review and meta-analysis. Open Forum Infect Dis. 12 (5), ofaf274(2025).
  28. Ramachandran, P. S., Wilson, M. R. Metagenomics for neurological infections - expanding our imagination. Nat Rev Neurol. 16 (10), 547-556 (2020).
  29. Salter, S. J., et al. Reagent and laboratory contamination can critically impact sequence-based microbiome analyses. BMC Biol. 12, 87(2014).
  30. Simner, P. J., Miller, S., Carroll, K. C. Understanding the promises and hurdles of metagenomic next-generation sequencing as a diagnostic tool for infectious diseases. Clin Infect Dis. 66 (5), 778-788 (2018).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

تسلسل السائل الدماغي الشوكي من الجيل التالي في التحول الجيني للكشف عن مسببات الأمراض في الجهاز العصبي المركزي
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.