يصف هذا البروتوكول طريقة استخلاص حمض-مذيب ثنائية الطور لعزل الأحماض الدهنية قصيرة السلسلة من عينات براز الفئران منخفضة الإدخال دون اشتقاق.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
استخراج الأحماض الدهنية قصيرة السلسلة من براز الفئران باستخدام طريقة الحمض-مذيب ثنائية الطور
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
تصف هذه المقالة بروتوكولا لاستخراج الأحماض الدهنية قصيرة السلسلة (SCFAs) من عينات براز فئران منخفضة الإدخال باستخدام استراتيجية استخلاص الحمض-مذيب ثنائية الطور. تم تصميم الطريقة لمدخلات البراز الفردية التي تتراوح قيمتها تقريبا بين 20–50 ملغ، وتستخدم حمض الهيدروكلوريك المخفف وأسيتات الإيثيل لتمكين فصل الطور دون اشتقاق. يتكون البروتوكول من توحيد البراز، والتحميض، وتقسيم المذيبات العضوية، والطرد المركزي منخفض الحرارة، ويمكن تنفيذه باستخدام معدات مختبرية قياسية متوفرة عادة في المختبرات البحثية. بعد الاستخراج، تعتبر SCFAs مناسبة للتحليل اللاحق بواسطة منصات تعتمد على كروماتوغرافيا الغاز الروتينية. يشير تنفيذ البروتوكول الناجح إلى اكتشاف قمم SCFA بوضوح عند أوقات احتفاظ مميزة فوق الضوضاء الخلفية، كما هو موضح في SCFAs الرئيسية في البراز بما في ذلك الأسيتات والبروبيونات والبيوتيرات من عينات الفئران الفردية. يعالج هذا البروتوكول تحديا إجرائييا شائعا في دراسات الحيوانات الصغيرة من خلال توفير سير عمل موحد لاستخراج SCFA البراز من مواد عينة محدودة مع الحفاظ على التوافق مع سير العمل التحليلي الروتيني.
المقدمة
تم تطوير هذا البروتوكول لتمكين استخراج الأحماض الدهنية قصيرة السلسلة (SCFAs) من عينات براز فئران منخفضة الإدخال بصيغة متوافقة مع التحليل القائم على الكروماتوغرافيا الغازية الروتينية (GC). SCFAs هي أحماض دهنية عضوية متطايرة تحتوي على أقل من ست ذرات كربون، تشمل أساسا حمض الخليك، حمض البروبيونيك، وحمض البيوتيريك، والتي تنتجها ميكروبيوتا الأمعاء من خلال تخمير الألياف الغذائية غير القابلة للهضم1. غالبا ما يكون قياس هذه المستقلبات من الفئران الفردية ضروريا في دراسات الحيوانات الصغيرة حيث تكون المادة البرازية محدودة، وترتبط العينات بالأنماط السلوكية أو الأيضية أو الفسيولوجية 2,3,4,5,6. لذلك فإن سير عمل استخراج عملي منخفض المدخلات ضروري لدعم التصاميم التجريبية التي تعتمد على قياسات SCFA لكل حيوان.
تقدم الأساليب الحالية لتحليل SCFA البرازي عدة قيود منهجية. يظل قياس SCFAs في عينات البراز تحديا تحليليا بسبب تقلبها، وقلة وفرةها، وتعقيد المصفوفات البيولوجية7. غالبا ما تتطلب سير العمل القياسية خطوات الاشتقاق، وأحجام عينات كبيرة، ومعدات متخصصة مثل التعامل الآلي مع السوائل، ومنصات التجانس المتخصصة، أو أعمدة الاستخراج بالطور الصلب 8,9,10,11. يمكن أن تحد هذه المتطلبات من إمكانية الوصول والتوسع، خاصة في دراسات الفئران حيث يكون إنتاج البراز لكل حيوان ضئيلا وأخذ عينات طولية أو جينية شائعة 12,13,14. ونتيجة لذلك، لا تزال هناك فجوة منهجية للبروتوكولات التي تسمح باستخراج SCFA من مدخلات براز صغيرة دون اشتقاق مع الحفاظ على التوافق مع سير عمل كروماتوغرافيا الغاز القياسي.
يعالج البروتوكول الموضح هنا هذه الفجوة من خلال استخدام استراتيجية استخراج الحمض-مذيب ثنائية الطورين باستخدام حمض الهيدروكلوريك المخفف وأسيتات الإيثيل. يتكون سير العمل من توحيد البراز، والتحميض، وتقسيم المذيبات العضوية، والطرد المركزي منخفض الحرارة، وهو مصمم للعمل مع كتل صغيرة من البراز. على عكس سير العمل القائمة على الاشتقاق التي تتطلب خطوات تعديل كيميائي إضافية أو منصات تحضير عينات متخصصة، يتيح هذا البروتوكول الاستخلاص المباشر لمواد SCFA بصيغة متوافقة مع التحليل الروتيني القائم على GC باستخدام معدات المختبر القياسية2.
تهدف هذه الطريقة إلى الدراسات التي تتطلب استخراج SCFA من كميات محدودة من براز الفئران، خاصة عندما تكون هناك حاجة لقياسات فردية أو عندما يقيد توفر العينات تصميم التجربة. وهو مناسب للتحليل القائم على GC للكائنات الكيميائية الشائعة (C2–C6) في عينات البراز، لكنه غير مصمم للتطبيقات التي تتطلب اكتشافا يعتمد على الاشتقاق، أو القياس الفائق الأثر بعد حساسية GC، أو تقييم تركيزات SCFA النظامية.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
وافقت اللجنة الدائمة المعنية بالحيوانات في مستشفى ماس جنرال بريغهام (MGB)، بوسطن، ماساتشوستس، الولايات المتحدة الأمريكية، على بروتوكول الحيوانات السابق، الذي صمم لتقليل عدد الحيوانات المستخدمة. يلتزم هذا البروتوكول بإرشادات وأنظمة المعاهد الوطنية للصحة. تم إعداد هذه المخطوطة وفقا لإرشادات ARRIVE. يظهر مخطط البروتوكول في الشكل 1، والمواد المطلوبة مدرجة في جدول المواد.
الشكل 1: مخطط البروتوكول. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
1. جمع عينات البراز وتحضيرها
- اجمع عينات براز طازجة (~30 ملغ) في أنابيب منفصلة من الطرد المركزي الدقيق بحجم 1.5 مل. تسجيل الكتلة الدقيقة للبراز لكل عينة للسماح بتطبيع دقيق لتركيزات SCFA.
ملاحظة: تأكد من أن الاسترجاع يشمل قوارير نظيفة وقفازات وملاقط لكل عينة. يجب أن تكون جميع أدوات الزجاج والآلات الموسيقية مختصة قبل الاستخدام. تم التحقق من صحة هذا البروتوكول لكتل المدخلات البرازية التي تتراوح تقريبا بين 20–50 ملغ لكل عينة، مع استخدام ~30 ملغ كمدخل تمثيلي. يتم الحفاظ على حجم الاستخراج ثابتا ضمن هذا النطاق. - ضع وسم العدد اللازم من قوارير الطرد المركزي المقابلة للعينات.
- تحضير حمض الهيدروكلوريك المخفف (0.5 م؛ درجة الحموضة 1–2) بإضافة هيدروكلوريك مركز ببطء (12 م، درجة كاشف ACS) إلى الماء فائق النقي.
تحذير: HCl يسبب التآكل؛ يمكن أن يسبب حروقا شديدة في الجلد والعينين والجهاز التنفسي. خطير عند الاستنشاق. - إذابة العينات في درجة حرارة الغرفة لمدة 30–45 دقيقة، أو حتى تذوب تماما.
2. تجانس العينات والتحمض
- أضف 255 ميكرولتر من محلول 0.5 مليون هيكروليتر إلى كل قارورة طرد مركزي.
- خذ قارورة جديدة واملأها بإيثانول بنسبة 70٪ لاستخدامها في تنظيف الملقط. نظف الملقط بغمسه في الإيثانول ثم تجفيفه على منشفة ورقية نظيفة.
تحذير: الإيثانول قابل للاشتعال وقد يهيج الجلد والعينين؛ قد يسبب استنشاق الأبخرة الدوار. - قم بإعداد حمام إيثانول للمدقات عن طريق وضع المدقات في وعاء وملء الحاوية بنسبة 70٪ إيثانول حتى تغمر جميع المدقات بالكامل.
- استرجع العينة الصحيحة من صندوق العينة. انزع غطاء القارورة وأزل عينة واحدة (~30 ملغ) من البراز.
- ضع عينات البراز في قوارير الطرد المركزي المقابلة.
- بمجرد وضع جميع العينات في قوارير الطرد المركزي الصحيحة، قم بإزالة مدقة من حمام الإيثانول. جفف المدقة بمنشفة ورقية نظيفة.
ملاحظة: استخدم مدقة جديدة لكل عينة. - استخدم المدقات لسحق وإذابة عينات البراز بشكل صحيح، انظر الشكل 2. قم بطحن عينة البراز حتى يتم الحصول على تعليق متجانس بصريا، دون وجود شظايا صلبة مرئية.
الشكل 2: طحن عينات البراز باستخدام مدقة. تطحن البراز المجمع حديثا لتحقيق قوام موحد لتحليل SCFA. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
- ضع المدقات المستخدمة في صندوق فارغ لتغسله لاحقا.
- قم بتدوير العينات باستخدام خلاط دوامة نبضي بأقصى سرعة لمدة 10 ثوان، مع تغطية الأنابيب بإحكام.
ملاحظة: تأكد من تغطية قوارير الطرد المركزي بإحكام لمنع انسكاب الخليط.
3. استخراج SCFA وفصل الطور
- قم بعمل الطرد المركزي للعينات عند 16,000 × جرام لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية، لضمان توازن الطرد المركزي بشكل صحيح.
- بعد تشغيل جهاز الطرد المركزي، قم بتسمية القوارير الجديدة التي تتوافق مع العينات. قم بإزالة العينات من الطرد المركزي بمجرد اكتمال الطرد المركزي.
- اضبط الماصة بسعة 200 ميكرولتر على 120 ميكرولتر. اجمع بعناية 120 ميكرولتر من المادة المائية بعد الطرد المركزي، لتجنب إزعاج الحبيبة. انقل المادة الفائقة إلى قوارير الطرد المركزي الجديدة وتخلص من الحبيبة.
- أضف كمية متساوية (120 ميكرولتر) من أسيتات الإيثيل إلى القوارير الجديدة الموسومة مع السائل الفائق. كرر هذا لجميع العينات.
تحذير: أسيتات الإيثيل قابلة للاشتعال ويمكن أن تهيج الجلد والعينين والجهاز التنفسي. تجنب استنشاق الأبخرة والاتصال المطول. - أحضر العينات إلى جهاز الطرد المركزي مرة أخرى. تأكد من أن جهاز الطرد المركزي متوازن بشكل صحيح وأن غطاء الدوار مؤمن. ادور عند 2,374 × جرام لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
- بعد الطرد المركزي، اجمع بعناية 120 ميكرولتر من الطور العضوي العلوي دون الإخلال بالطور المائي السفلي. انقل المادة الفائقة المستخرجة التي تحتوي على SCFA إلى قوارير طرد مركزية جديدة تحمل علامات الطرد المركزي.
ملاحظة: قد يكون الحجم المجمع أقل من 120 ميكرولتر. إذا كان هناك مستحلب عند الواجهة، قم بتمديد الطرد المركزي أو تبريد العينات على الجليد حتى يتم تحقيق فصل واضح في الطور. قد تتضمن العينات الفارغة الإجرائية المعالجة بالتوازي دون مواد براز كخطوة اختيارية لمراقبة الجودة لتقييم مستويات الخلفية من SCFAs التي تم إدخالها بواسطة الكواشف أو المعالجة. - افحص القوارير السابقة للتأكد من أن الطبقة السفلية لم تسحب عن طريق الخطأ.
ملاحظة: يجب تنفيذ خطوات تشمل إضافة الحمض والتعامل مع المذيبات العضوية بسرعة، مع إبقاء الأنابيب مغلقة كلما أمكن، لتقليل فقدان التبخور أو التبخر.
4. التعامل مع وتخزين المستخلصات
- حدد موقع صندوق الاستخلاص وضع عليه علامة صحيحة، ثم ضع العينات المستخرجة بداخله.
ملاحظة: يمكن إيقاف العينات بأمان بعد جمع الطور العضوي عن طريق تخزين المستخلصات عند −20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 24 ساعة في أنابيب مغلقة بإحكام، ثم نقلها إلى −80 درجة مئوية للتخزين لفترات طويلة. - ضع الصندوق في فريزر بدرجة حرارة -80 درجة مئوية لانتظار تحليل SCFA.
ملاحظة: نظرا لأن كل من أسيتات الإيثيل وSCFA متطايران للغاية، يجب تحليل العينات المستخرجة فورا بعد التخزين عند درجة حرارة −80 درجة مئوية. قد يؤثر التخزين طويل الأمد على سلامة العينة.
5. تحليل الكروماتوغرافيا الغازية
- تحليل SCFAs المستخرجة بواسطة GC باستخدام عمود شعيري من السيليكا المندمجة مع طور ثابت من الأحماض الدهنية الحرة عند معدلات تدفق 30، 300، و20 مل/دقيقة للهيدروجين والهواء والنيتروجين على التوالي. حقن 1 ميكرولتر من المستخلص العضوي للتحليل.
- للتطبيقات الكمية، يجب دمج المعايير الداخلية وإجراءات المعايرة (مثل حمض 2-إيثيلبوتيريك) كما هو موضح سابقا2.
ملاحظة: تم توفير إعدادات تفصيلية خاصة بالآلة في الطرقالمشار إليها 14.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
البروتوكول أعلاه قد أسفر عن اقتباسات SCFA مستخرجة بمقدار 120 ميكرولتر تتوافق مع عدد عينات البراز التي تم استخراجها منها. يشير التنفيذ الناجح لبروتوكول الاستخراج إلى وجود قمم SCFA واضحة عند أوقات احتفاظ مميزة مع شدة إشارة فوق الضوضاء الخلفية. عند تنفيذه كما هو موصوف، ينتج البروتوكول ملفات SCFA البرازية المناسبة للمقارنة الكمية في المراحل اللاحقة عبر العينات. قمنا بقياس ثمانية أنواع SCFAs: حمض الأسيتيك، حمض البروبيونيك، حمض البيوتيريك، حمض الإيزوبيوتيريك، حمض الفاليريك، حمض الإيزوفاليريك، ...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
يحتوي هذا البروتوكول على عدة خطوات حاسمة تضمن استخلاصا فعالا وقابلا لإعادة إنتاج SCFAs من عينات براز الفئران الصغيرة الحجم. يستخدم البروتوكول نظام استخلاص حمضي مذيب ثنائي الطورين باستخدام كميات محددة من حمض الهيدروكلوريك المخفف وأسيتات الإيثيل، وهو مصمم لتناسب الخصائص الفيزيائية الكيميائية لحمض الحمض النووي الكيميائي منخفض الوزن الجزيئي والأحماض العضوية الضعيفة. يؤدي التحمض إلى نقل SCFAs إلى شكلها البروتوني، مما يقلل التفاعلات الأيونية مع مصفوفة البراز ويسهل تقسيمها أثناء فصل الطور اللاح...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
المؤلفون لا يفرضون أي تضارب مصالح.
شكر وتقدير
نشكر بكل امتنان الدعم المالي لهذه الدراسة الذي قدمته المعاهد الوطنية للصحة من خلال R21AG065606 و R21AG08176 الممنوحة لييينغ تشانغ، بالإضافة إلى الدعم من مؤسسة عائلة بورتن وهبة عائلة تانغ لييينغ تشانغ.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| Centrifuge | ThermoFisher | 75003424 | "Sorvall Legend Micro 21R Microcentrifuge" |
| Centrifuge vials | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Microtube Rack | Millipore Sigma | HS29025F-5EA | |
| Ethyl acetate | ThermoFisher | 022912.K2 | HPLC Grade, ≥99.5% |
| Green pestles | Fisher Scientific | 50-189-9195 | |
| HCl | Fisher Scientific | SA49 | ACS Certified (10 N, stock solution); diluted to 0.5 M for use |
| 1000 μL pipette | USA Scientific | 7110-1000 | |
| 1000 μL pipette tips | USA Scientific | 1111-2821 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP82011 | Molecular Biology Grade, 70% solution |
| 200 μL pipette | USA Scientific | 7100-2200 | |
| 200 μL pipette tips | USA Scientific | 1110-1800 | |
| Tweezers | ThermoFisher | 046638.KT | |
| Vortex | Fisher scientific | 50-136-7909 | "Research Products International Corp VORNADO Miniature Vortex Mixer, Purple Cup" |
المراجع
- Koh, A., De Vadder, F., Kovatcheva-Datchary, P., Bäckhed, F. From dietary fiber to host physiology: short-chain fatty acids as key bacterial metabolites. Cell. 165 (6), 1332-1345 (2016).
- Zhang, Y., et al. Transmission of Alzheimer's disease-associated microbiota dysbiosis and its impact on cognitive function: evidence from mice and patients. Mol Psychiatry. 28 (10), 4421-4437 (2023).
- Sun, Y., et al. PYY-mediated appetite control and obesity alleviation through short-chain fatty acid-driven gut-brain axis modulation by Lacticaseibacillus rhamnosus HF01 isolated from Qula. J Dairy Sci. 108 (8), 7960-7978 (2025).
- He, J., et al. Short-chain fatty acids and their association with signalling pathways in inflammation, glucose and lipid metabolism. Int J Mol Sci. 21 (17), 6356(2020).
- Fock, E., Parnova, R. Mechanisms of blood-brain barrier protection by microbiota-derived short-chain fatty acids. Cells. 12 (4), 657(2023).
- Kachoueiyan, F., et al. Butyrate: a key mediator of gut-brain communication in Alzheimer's disease. Metab Brain Dis. 40 (5), 189(2025).
- Kim, K. S., Lee, Y., Chae, W., Cho, J. Y. An improved method to quantify short-chain fatty acids in biological samples using gas chromatography-mass spectrometry. Metabolites. 12 (6), 525(2022).
- Ueyama, J., et al. Freeze-drying enables homogeneous and stable sample preparation for determination of fecal short-chain fatty acids. Anal Biochem. 589, 113508(2020).
- Papanicolas, L. E., et al. Bacterial viability in faecal transplants: which bacteria survive. EBioMedicine. 41, 509-516 (2019).
- Yao, L., et al. Quantitative analysis of short-chain fatty acids in human plasma and serum by GC-MS. Anal Bioanal Chem. 414 (15), 4391-4399 (2022).
- Zhang, C., Liu, A., Zhang, T., Li, Y., Zhao, H. Gas chromatography detection protocol of short-chain fatty acids in mice feces. Bio Protoc. 10 (13), e3672(2020).
- Zha, X., et al. Microbiota-derived lysophosphatidylcholine alleviates Alzheimer's disease pathology via suppressing ferroptosis. Cell Metab. 37 (1), 169-186.e9 (2025).
- Li, L. J., et al. Neuronal double-stranded DNA accumulation induced by DNase II deficiency drives tau phosphorylation and neurodegeneration. Transl Neurodegener. 13 (1), 39(2024).
- Zhou, H., et al. Glia-to-neuron conversion by CRISPR-CasRx alleviates symptoms of neurological disease in mice. Cell. 181 (3), 590-603.e16 (2020).
- Zhao, G., Nyman, M., Jönsson, J. A. Rapid determination of short-chain fatty acids in colonic contents and faeces of humans and rats by acidified water-extraction and direct-injection gas chromatography. Biomed Chromatogr. 20 (8), 674-682 (2006).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
