باستخدام التصوير المؤقت الزائد، يمكن متابعة عملية التجدد الكاملة لكرويدات هيدرا . يصف هذا البروتوكول توليد كرويدات هيدرا ، ويناقش مجموعة متنوعة من استراتيجيات التثبيت، ويشرح كيفية إجراء التصوير الحي طويل الأمد باستخدام المجهر الكونفوكالي الدوار على الأقراص الدوار بالإضافة إلى المجهر الفلوري الصفائح الضوئية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
التحضير والتصوير الحي لكرويدات هيدرا المتجددة
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
تشتهر هيدرا بقدرتها الاستثنائية على التجديد. ومن اللافت أن شظايا صغيرة متجددة من نسيج هيدرا، تسمى كرويدات هيدرا، يمكن أن تؤسس منظما جديدا. بمجرد تأسيسه، يوجه هذا المنظم الأنسجة المحيطة للتمايز إلى الهياكل الفموية المناسبة. خلال أيام، يمكن أن يتطور الكروي إلى سلائل صغيرة لكنها ذات نمط كامل. يتيح الإطار الزمني القصير نسبيا لهذه العملية التصوير الزمني المستمر للعملية بأكملها، مما يوفر فرصة فريدة لدراسة ديناميكيات التجديد المكاني والزماني. هنا، نقدم سير عمل مفصل ونعرض نتائج تمثيلية لإنشاء مجموعات بيانات زمنية لإعادة توليد كرويدات هيدرا. يتضمن البروتوكول إجراء تفصيليا لتوليد الكرويدات وإرشادات لاختيار العينات المثلى للتصوير. نناقش استراتيجيات التثبيت المناسبة للتصوير طويل الأمد للعينات الحية ونعرض طرق التصوير باستخدام المجاهر الكونفوكال الدوارة والميكروسكوبات الضوئية على الأقراص الدوارة والصفائح الضوئية. المبادئ الموضحة هنا قابلة للتطبيق بشكل واسع على أنظمة النماذج الأخرى التي يمكن فيها دراسة العمليات الشكلية الديناميكية باستخدام التصوير طويل الأمد.
المقدمة
هيدرا هو بوليب صغير في المياه العذبة معروف بقدرته الاستثنائية على التجديد. تنطوي شظايا الأنسجة المستخرجة من منتصف الجسم إلى كروي مجوف يتكون من طبقتين ظهاريتين لهايدرا، الأديم الخارجي والانتباذ الداخلي. خلال التجدد، تؤسس هذه الكرويدات الهيدرا منظما جديدا 1. خلال حوالي 3 أيام، يطول محور الجسم، وتتمايز الخلايا في أطراف الرأس والقدم. وبسبب هذا الإطار الزمني القصير نسبيا، يمكن التقاط كامل عملية التجدد من خلال التصوير الحي. كانت مجموعات بيانات الفاصل الزمني حاسمة في كشف الدورات المميزة للتضخم والانكماش التي تمر بها كرويدات هيدرا خلال التجدد2. تساهم التمدد النسيجي الناتج عن هذه التذبذبات الميكانيكية الأسموزية في تحديد موقع المنظم3.
يتطلب التصوير الحي الناجح على المدى الطويل التقاط صور سريع لتجنب التشوهات الحركية، مع تقليل التعرض للضوء لمنع تلف العينة. المجهر الكونفوكلي الماسح أحادي النقطة الكلاسيكي لا يستوفي هذه المتطلبات. ومع ذلك، تم تطوير تقنيات متقدمة. في هذا البروتوكول، سنركز على نمطين شائعين على نطاق واسع: المجهر الكونفوكالي القرصي الدوار (SDCM) ومجهر الفلورة الصفائح الضوئية (LSFM). يستخدم SDCM قرصا يدور بسرعة مع مجموعة من الثقوب الدقيقة4. يتيح هذا التصميم الإثارة والكشف المتزامن لنقاط متعددة داخل العينة، مع الحفاظ على التناقض (كونفوكالية). هذا الاقتناء الموازي يسرع بشكل كبير من التصوير، مما يسمح بالتقاط عينات متحركة دون حركة. كميزة إضافية، يقلل التعريض القصير بشكل كبير من السمية الضوئية. ومع ذلك، وبسبب عمق التصوير المحدود، فإن التصوير الحي للهياكل الأكبر يمثل تحديا.
يستمد LSFM اسمه من الورقة الرقيقة من الضوء التي تستخدم لإثارة الفلوروفورات فقط داخل هذا المستوى5. على عكس الثقب الصغير، الذي يخلق دقة محورية عن طريق تقييد الضوء المنبعث الذي يتم اكتشافه، تحدد مجاهر صفائح الضوء الدقة المحورية عن طريق تقييد حجم المثارة بدلا من ذلك. يتم وضع هدف الكشف بشكل متعامد، حيث يجمع الفلورة بزاوية 90° مع صفيحة الضوء. يسمح ذلك للكاميرا بجمع إشارة الفلورة من كامل المستوى المضيء في تعريض واحد، مما يزيد من سرعة الاكتساب ويقلل من السمية الضوئية. الهندسات الشائعة لأجهزة LSFM التي تبني حول هدف أو هدفين للكشف أفقيا لها ميزة إضافية وهي إمكانية تصوير نفس العينة من زوايا متعددة. إذا كان المجهر مزودا بهدفين للكشف، يمكن تصوير العينات في نفس الوقت من جانبين6. بدلا من ذلك، يمكن تدوير عينة لالتقاط مشاهد من زوايا متعددة.
تقنيات التصوير المستخدمة لدراسة الهيدرا الحية تطورت بشكل كبير في السنوات الأخيرة، مما أتاح ملاحظة التغيرات الشكلية المرتبطة بالتجدد حتى ديناميكيات النشاط العصبي 7,8,9,10. هنا، نوسع البروتوكولات 6,11 المنشورة سابقا، مع التركيز على إظهار الأساليب المتنوعة للتصوير الحي لكرويدات هيدرا المتجددة. نحن نصف طرق إنتاج كرويدات هيدرا من شظايا أنسجة صغيرة ونوفر إرشادات لتحديد العينات المطوية بشكل صحيح. تم توضيح تعليمات خطوة بخطوة لثلاث استراتيجيات تركيب شائعة في التصوير الحي. للتصوير على المجهر المقلوب، وهو هندسة شائعة في SDCM، عادة ما تركب الكرويدات في آبار الأغاروز. هذا يسمح لها بالتحرك والدوران بحرية مع البقاء ضمن مجال الرؤية. يستخدم الفلوروإيثيلين بروبيلين (FEP) عادة للتركيب لأن معامل انكلاسه (1.34) قريب من الماء (1.33). يمكن تشكيل رقائق FEP حراريا إلى غرف تصوير مخصصة، مصممة خصيصا لتلبية الاحتياجات التجريبية المحددة. وبالمثل، فإن تضمين الكرويدات في الأجاروز داخل الشعيرات الدموية الزجاجية هو نهج قياسي ل LSFM. على الرغم من أن هذه التقنية تحد من عدد العينات لكل شعيرات شعرية، إلا أنها تسهل الدوران المطلوب للكشف عبر الرؤية المتعددة. وأخيرا، نعرض كيفية إجراء التصوير الحي باستخدام كل من SDCM وLSFM، ونناقش الاعتبارات الرئيسية لاختيار التقنية المناسبة حسب الأهداف التجريبية. على الرغم من أن هذا البروتوكول محسن لهايدرا، إلا أن مبادئه الأساسية قابلة للتطبيق بشكل واسع على أنظمة النماذج الأخرى التي تعتمد على التصوير طويل الأمد لدراسة العمليات الشكلية الديناميكية.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تم تنفيذ جميع الإجراءات الموصوفة وفقا للإرشادات الأخلاقية للوائح الوطنية السويسرية لأبحاث الحيوانات. قبل بدء التجربة، يجب إطعام هيدرا بشكل طبيعي، ثلاث مرات في الأسبوع، لمدة لا تقل عن أسبوعين. يجب أن تكون الهيدرا المستخدمة في التجارب صحية12، بدون أعضاء جنسية وغير متبرعمة. يجب أيضا تجنب الهيدرا التي نشأت حديثا، والتي يمكن التعرف عليها بسبب طولها الأقصر مقارنة بالهيدرا الأخرى في المستعمرة.
1. تحضير كرويدات الهيدرا (الشكل 1)
- ابدأ بتحضير طبق يحتوي على وسط تفكك (DM؛ للوصفات راجع الجدول 1). يجب أن يكون مدير اللعبة في درجة حرارة الغرفة أثناء التجربة.
- جهز بقية مساحة العمل: ضع غطاء طبق زراعة الخلايا بحجم 10 سم تحت جهاز الستيريوسكوب واملأه بطبقة من وسط هيدرا (HM؛ للوصفات انظر الجدول 1). يمكن استخدام طبق زراعة الخلايا نفسه لجمع ما تبقى من أنسجة هيدرا . وأخيرا، اجمع هايدرا وضعها في طبق قريب من جهاز الستيريوسكوب.
- استخدم ماصة باستور زجاجية لنقل ماصة هايدرا إلى الغطاء تحت جهاز الستيريوسكوب. ينصح بتخفيف الطلاء على ماصات باستور. لتحقيق ذلك، ارفع طرفه بسرعة في اللهب.
- غالبا ما تكون هيدرا تطفو على سطح الوسط؛ ارفع الهيدرا حتى يغوص في أسفل الغطاء.
- اقسم الهيدرا إلى قسمين عن طريق إنشاء قطع مستقيم واحد بين منطقتي الجسم B2 و B3 (الشكل 1A,B). كن متسقا في الجزء الجسدي الذي تقطع منه الكرويات، لأن ذلك يؤثر بشكل كبير على سلوك الكرويدات.
ملاحظة: إذا لم يكن هناك حاجة لقطع جزء معين من الجسم، استخدم الكرويدات من منتصف محور الجسم. بالنسبة للحيوانات ذات النمط الظاهري القوي (مثل الحيوانات التي لديها العديد من الرؤوس خارج الرحم)، ابحث عن مناطق في الجسم تشبه أكثر منتصف محور الجسم. - انتظر حتى تسترخي الهيدرا تماما بعد القطع. إذا لزم الأمر، استخدم أجزاء الجسم العائمة لجعلها تغرق مرة أخرى.
- بمجرد أن تسترخي النسيج المقطوع، سيبقى الطرف المقطوع من النسيج متورما. قم بعمل قطع ثان حيث ينتهي التورم لتكوين حلقة من النسيج (الشكل 1C). يمكن قطع حلقات نسيج من كل نصفي هيدرا .
- أزل ما تبقى من نهايات الرأس والقدم من الغطاء. يمكن ترك هذه الأجزاء المتبقية من الجسم لتتجدد. بمجرد أن تتجدد الهيدرا بشكل صحيح وتغذى لمدة لا تقل عن أسبوعين، يمكن إعادة استخدامها في تجارب أخرى.
- اقطع حلقات الأنسجة. اقطع الحلقات المفتوحة إلى عدة قطع نسيج (الشكل 1D). استهدف قطع نسيج مستطيلة بحجم ~100-150 ميكرومتر × ~300-500 ميكرومتر.
ملاحظة: عدد القطع التي يمكن قطعها لكل حلقة متغير. على سبيل المثال، عادة ما تكون هيدرا من سلالة 105 أرق بكثير من الهيدرا من سلالة AEP. إذا كانت حلقة النسيج صغيرة جدا بحيث لا يمكن إنتاج قطعتين مناسبتين، قم بقص الحلقة المفتوحة لتكوين قطعة نسيج بحجم مناسب وتخلص من القطعة الأخرى الأصغر. - انقل قطع الأنسجة إلى جهاز DM بدرجة حرارة الغرفة. قلل كمية النسيج العميق التي تتحرك مع قطع الأنسجة.
- اترك الكرويدات لتطوي في DM لمدة 3-4 ساعات. قيم ما إذا كانت الكرويدات قد طويت بشكل صحيح. يجب أن تكون الكريات المطوية بنجاح ذات شكل دائري ومغطاة بالكامل بالأديم الخارجي (الشكل 2A-D).
ملاحظة: إذا لم تقم أكثر من نصف الكرويدات بعد بالطي بنجاح، اترك الكرويدات في DM لمدة 30 دقيقة إضافية. - اختر الكرويدات المطوية بقطر 250-350 ميكرومتر (الشكل 2E-H). تجنب الكرويدات الملوثة بمواد خارجية مثل الألياف البلاستيكية. انقل الكرويدات المختارة إلى HM قبل التركيب.
ملاحظة: إذا أجريت التجربة في وسط مكمل (مثل العلاج بالأدوية)، انقل الكرويدات فورا إلى هذا الوسط بدلا من ذلك. ضع في اعتبارك أنه بمجرد نقل الكرويدات إلى HM، ستبدأ في التذبذب.
الشكل 1: تحضير الهيدرا الكروي. (أ) مخطط يوضح توليد الكرويدات الهيدرا . تكسر الكرويدات التماثل بإعادة إنشاء منظم Wnt3+ الذي يحرك تكوين المحاور وتمديدها وتمايزه. (ب) يتم القطع الأول في منتصف الجسم، عند الحدود بين المنطقتين B2 و B3، كما هو موضح في (A). (ج) يتم قطع كل نصف ناتج مرة أخرى أسفل المنطقة المتورمة مباشرة. (د) يتم بعد ذلك قطع حلقات الأنسجة المنتجة وتقسيمها إلى 2-4 قطع نسيج حسب حجم الحلقة. أشرطة المقياس: 250 ميكرومتر. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
| الوسيط | التكوين | درجة حرارة التخزين | ||
| وسيط الانفصال (DM) | 3.6 ملليمولار كيلوسيلترين، 6 ملليمولار ككلكلوريتاني، 1.2 ملليمولار ملغيوم SO4، 6 ملليمولار سترات الصوديوم، 6 ملليمول بيروفات الصوديوم، 4 ملليمول جلوكوز، و12.5 ملليمولار TES (رقم الهيدروجيني 6.9) | 4 درجة مئوية | ||
| هيدرا ميديوم (HM) | 1 مللي مولار CaCl2، 0.2 ملليمولار NaHCO3، 0.02 ملليمولار KCl، 0.02 ملليمولار MgCl2، و0.2 ملليمول ثلاثي HCl (الرقم الهيدروجيني 7.4) | درجة حرارة الغرفة | ||
الجدول 1: تركيبات الوسائط والتخزين.
الشكل 2: نظرة عامة على الكرويدات غير المطوية والمطوية. (A-D) الكرويدات غير المطوية مرتبة من الأقل طي إلى شبه كامل. تعرف الكريات غير المطوية بمنطقة لا يغطي فيها الأديم الخارجي الأديم (كما يشار إليه برؤوس سهام زرقاء). (ه) مثال على كروي صغير جدا. (F-G) كرويدات مطوية بحجم مثالي (250-350 ميكرومتر). (ح) مثال على كروي كبير جدا. تم التقاط الصور في لوحة تصوير زجاجية ذات 4 آبار باستخدام مجهر Revolve الهجين من Echo (RVL2-K)، باستخدام الوضع المقلوب مع هدف 4.0x وكاميرا ضوء النقل (ملونة). أشرطة المقياس: 250 ميكرومتر. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
2. استراتيجيات التركيب
ملاحظة: يجمع بين تخطيط المجهر وتصميم التجارب هو تحديد أفضل استراتيجية تركيب للتجربة. هنا، نصف مجموعة متنوعة من تقنيات التركيب التي يمكن استخدامها لتطبيقات متنوعة.
- التركيب في آبار الأجوروز (الشكل 3A)
- حضر 1٪ أغاروز في HM عن طريق غلي الخليط حتى يذوب الأغاروز تماما.
ملاحظة: يمكن تحضير مخزون من 1٪ من الأغاروز مسبقا وتخزينه في زجاجة مغلقة بإحكام لمدة شهر. ننصح بعدم إعادة تسخين الأجاروز أكثر من 5 مرات. ومع ذلك، يجب تجهيز آبار الأغاروز في يوم التجربة. - بينما الأغاروز لا يزال سائلا، غط طبقة سمكة 2 مم على قاع زجاجي من قاع زجاجي بأربعة آبار بشكل كامل.
ملاحظة: قد تكون ألواح التصوير الأخرى مناسبة أيضا حسب إعداد التصوير وعدد الحالات التي يجب اختبارها. عند التجارب باستخدام علاج، تأكد من تعويض الأغاروز. يمكن خلط المواد الكيميائية المستقرة حراريا مباشرة في الأغاروز. حضر محلول أغاروز بنسبة 2٪، وبعد الغليان، اخلطه مع محلول 2x من المادة الكيميائية المطلوبة. غط الأجاروز بمحلول 1x كالمعتاد. إذا لم تكن المادة الكيميائية مستقرة حراريا، قم بضبط تركيز المادة الكيميائية مع الأخذ في الاعتبار حجم الأغاروز في لوحة التصوير، واستخدم هذا المحلول لتغطية الأغاروز. - اترك الأغاروز ليجف تماما. ثم، اصنع آبارا في الأغاروز. اترك ما لا يقل عن 10 ملم من الأجاروز بين كل بئر لضمان سلامة هيكلها.
- أثناء تثبيت المكبس، ادفع طرف ماصة P1000 إلى داخل الأغاروز حتى تلمس أسفل لوحة التصوير.
ملاحظة: يمكن تعديل حجم آبار الأغاروز، على سبيل المثال، باستخدام رأس بحجم مختلف أو باستخدام طابع. من المهم أن يكون لدى العينات مساحة كافية للتحرك. - امسك الماصة بشكل مستقيم للأعلى واستطاع أسفل لوحة التصوير. ثم حرك ولف طرف الماصة لقطع الأغاروز.
- حرر مكبس الماصة وقم في نفس الوقت بإزالة طرف الماصة ببطء من الأغاروز عن طريق تحريك الماصة للأعلى مباشرة.
- أثناء تثبيت المكبس، ادفع طرف ماصة P1000 إلى داخل الأغاروز حتى تلمس أسفل لوحة التصوير.
- كرر عملية صناعة الآبار حتى يتم إنشاء عدد كاف من الآبار. إذا تمت إزالة الماصة بسرعة كبيرة أو لم يتم قطع الأغاروز بالكامل قبل إزالتها، سيبقى بعض الأغاروز في قاع البئر. تجنب استخدام هذه الآبار لأنها ستؤثر على جودة التصوير.
- غط الأغاروز بطبقة رقيقة من HM. لمنع تبخر الوسط، استخدم لوحة تصوير مع غطاء.
- أطلق أي فقاعات هواء قد تكون تكونت في آبار الأغاروز عن طريق لمس فقاعات الهواء بطرف ماصة P20.
- حرك كرويدات هيدرا واحدة تلو الأخرى إلى لوحة التصوير. إذا لم يسقط الكروي فورا في البئر، وجه الكروي نحو اتجاه البئر بدفع الكروي بلطف باستخدام الماصة.
ملاحظة: قد ينتهي الأمر بكرويدين في نفس البئر. قم بإزالة كلا الكرويدين عن طريق الشفط وحاول تركيبهما مرة أخرى. كن على علم أن إعادة شفط الكرويدات قد يؤدي إلى تلف الكرويدات و/أو بئر الأغاروز. إذا حدث ذلك، استمر في استخدام أنواع مختلفة من الطيران والكرويدات الجديدة. - صور العينات على مجهر مقلوب (الشكل 4A).
- حضر 1٪ أغاروز في HM عن طريق غلي الخليط حتى يذوب الأغاروز تماما.
- التركيب في آبار FEP (الشكل 3B)
- جهز ماصات زجاجية مخصصة ستستخدم لإزالة فقاعات الهواء من آبار FEP (الشكل الإضافي 1).
- سخن ماصة باستور زجاجية في نار في مكان يسمح بتثبيت طرف الطرف. استمر في تدوير الماصة لتسخين متساو.
- عندما يبدأ الزجاج في التلين، قم بتمديد طرف الماصة بسرعة أثناء إخراج الماصة من اللهب.
- اكسر المنطقة المخففة لإنشاء رأس ماصة جديد بحجم حوالي 0.4-0.5 مم. لمس بسرعة طرف الماصة في اللهب لتخميده؛ تأكد من أن هذا لا يغلق الماصة.
- سخن ماصة باستور الزجاجية في المكان الذي تتسع فيه الماصة. لا تدير الماصة، بل حركها خارج اللهب عندما يبدأ طرف الماصة بالترهل. أمسك الماصة أفقيا حتى تتصلب على شكل حرف L.
- إنشاء غرف FEP عن طريق التشكيل الحراري الورقي FEP فوق قوالب ألمنيوم مخصصة6. يمكن تعديل أبعاد القوالب لتناسب أحجام عينات مختلفة أو غرف المجاهر. بالنسبة للكرويدات الهيدرا ، الآبار التي يبلغ قطرها 0.5 مم هي الأنسب.
- اقطع ورق FEP إلى صفائح بحجم 15 × 15 سم. ثبت ورق FEP داخل آلة التشكيل الحراري وسخنها لمدة 8 دقائق.
- ضع قوالب الألمنيوم تحت الرقاق. تحت الفراغ، شكل الورق حول القوالب لمدة 30 ثانية.
- قم بقص الغرف يدويا من رقائق FEP المشكل حراريا.
- اجعل غرفة FEP خالية من الغبار باستخدام الهواء المعلب. املأ غرفة FEP ب HM.
ملاحظة: عادة لا تحتوي غرف FEP على غطاء. هذا يعني أن بعض الوسط سيتبخر أثناء التصوير. إذا كان تبخر الوسط سيسبب مشاكل، صمم غرفة يمكن إغلاقها - أطلق فقاعات الهواء من الآبار باستخدام الماصات الزجاجية المعدة مسبقا. استخدم حركة السحب لدفع فقاعة الهواء خارج البئر بطرف الماصة.
- بمجرد أن تخلت جميع الآبار من الفقاعات، انقل كرات الهيدرا واحدة تلو الأخرى إلى غرفة FEP. إذا لم تسقط الكرة في البئر، ادفعها بمصدر.
ملاحظة: إذا سقط كرويدان في نفس البئر، قم بإزالة كلاهما عن طريق شفط الماصة وإعادة تركيبهما. تصميم آبار FEP سيحدد نوع المجهر الذي يجب استخدامه للتصوير. بشكل عام، المجاهر التي تحتوي على هدف كشف أفقي واحد أو أكثر مناسبة (الشكل 4B).
- جهز ماصات زجاجية مخصصة ستستخدم لإزالة فقاعات الهواء من آبار FEP (الشكل الإضافي 1).
- تركيب مدمج في الأجاروز في الشعيرات الدموية الزجاجية (الشكل 3C)
- حضر 1٪ أجاروز منخفض نقطة الانصهار في HM عن طريق غلي الخليط حتى يذوب الأغاروز منخفض نقطة الانصهار تماما. انقل 1 مل من الأغاروز السائل إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق.
ملاحظة: يمكن تحضير مخزون من أغاروز منخفض نقطة الانصهار بنسبة 1٪ مسبقا وتخزينه في زجاجة مغلقة بإحكام لمدة شهر. إذا لزم الأمر، يمكن الحفاظ على الأجاروز في حالة سائلة من خلال إبقائه عند 37 درجة مئوية. ومع ذلك، لا تسخن الأغاروز بنشاط بمجرد إضافة العينات. فكر في إضافة علاج للأجاروز (انظر خطوة البروتوكول 2.1.2) أو خرز فلوري في هذه الخطوة. يمكن استخدام الخرزات لإعادة بناء الرؤية المتعددة. - حرك 2-4 كرويدات إلى الأغاروز. إدخال قضيب المكبس بالكامل في شعيرة زجاجية؛ يجب أن يتناسب قضيب المكبس بإحكام.
- أدخل نهاية الشعيرة الدموية في الأغاروز، وبسحب قضيب المكبس ببطء، اسحب الأغاروز إلى الأعلى إلى الشعيرة الدموية. ابدأ باستنشاق بعض الأجاروز بدون كرويدات، ثم بدون توقف، حمل الكرويدات المدمجة في الأجاروز إلى الشعيرات الدموية.
ملاحظة: للحصول على أفضل نتائج التصوير، يجب أن تكون الكرويدات الفردية منفصلة جيدا وتقع في أسفل عمود الأغاروز (الشكل 3C).
- حضر 1٪ أجاروز منخفض نقطة الانصهار في HM عن طريق غلي الخليط حتى يذوب الأغاروز منخفض نقطة الانصهار تماما. انقل 1 مل من الأغاروز السائل إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق.
- أخرج الشعيرة الدموية من الأغاروز ونظف الخارج بورق مناديل. أمسك الشعيرات الدموية أفقيا وقم بتدويرها حتى يتصلب الأغاروز؛ هذا سيساعد في إبقاء الكرويدات في منتصف عمود الأجاروز.
- ضع الشعيرات الدموية المملوءة بالأجاروز في HM للحفاظ على رطوبة العينات. يجب تصوير العينات المثبتة في الشعيرات الدموية الزجاجية باستخدام مجهر يحتوي على هدف كشف واحد أو أكثر موضوعا أفقيا (الشكل 4C).
الشكل 3: تركيب كرويدات هيدرا للتصوير الحي. (أ) آبار الأغاروز ذات (حجرتين وسطيتين) وبدون (حجرات خارجية) كرويدات. (ب) الكرويدات المثبتة في آبار FEP. (ج) الكرويدات المدمجة في الأغاروز ومثبتة في شعيرات زجاجية. للتصوير، يدفع عمود الأغاروز قليلا خارج الشعيرات الدموية الزجاجية. لذلك، يجب وضع الكرويدات بالقرب من أسفل عمود الأغاروز (رؤوس سهام خضراء)، مع البقاء متباعدة جيدا. لا يمكن تصوير الكرويدات التي تقع بعيدا جدا عن الأسفل (رأس السهم الأحمر) بشكل فعال. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 4: مخططات تخطيطية لإعدادات التصوير المناسبة لاستراتيجيات التثبيت الموصوفة. (أ) كرويدات مثبتة في آبار الأغاروز ومصورة على مجهر كونفوكال قرصي دوار مقلوب. (ب) كرويدات مثبتة في غرفة FEP وتم تصويرها باستخدام مجهر فلوري من صفائح الضوء مناسبة للتصوير متعدد الآبار6. للتوضيح، لا يتم عرض هدف الكشف الثاني، الموضوع المقابل لهدف الكشف 1. (ج) كروي مدمج في الأجاروز ومثبت في شعيرات زجاجية لاستخدام مجهر فلوري من صفائح الضوء باستخدام مجهر بتكوين بديل مقارنة ب (B). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
3. المجهر الكونفوكال للقرص الدوار
- صور العينات على مجهر مقلوب مزود بوحدة أقراص دوارة. اضبط درجة حرارة غرفة المجهر على 18-21 درجة مئوية. إذا لم يكن بالإمكان تبريد المجهر، قم بتبريد الغرفة بدلا من ذلك.
- اختر هدفا بمجال رؤية يغطي العينة الكاملة. بالنسبة للعينات المثبتة في آبار الأغاروز، يجب أن يغطي مجال الرؤية البئر بالكامل.
ملاحظة: يفضل استخدام الهدف الجاف، خاصة لمجموعات البيانات التي تحتوي على عدة عينات بتقنية التايم لابس. - ضع حامل العينة في مرحلة المجهر. شغل الضوء المرسلة واضبط وقت التعريض.
- اختر طول موجة الليزر، وقوة الليزر، ووقت التعريض للفلوروفورات الموجودة في العينة. اختر مزيجا من قوة الليزر ووقت التعريض يكون منخفضا قدر الإمكان لتقليل خطر السمية الضوئية، لكنه مرتفع بما يكفي للحصول على نسبة إشارة إلى ضوضاء جيدة.
ملاحظة: قد تتحرك العينات الحية بشكل كبير أثناء التصوير. كلما أمكن، قم بالحصول على الفلورة والضوء المنقول في نفس الوقت، أو الفلورة المزدوجة باستخدام كاميرتين. إذا تم تصوير أكثر من قناتين، أعط الأولوية لالتقاط القنوات المتزامنة حيث يكون التداخل الدقيق هو الأهم. - ابحث عن جميع العينات وضبطها كمواقع تصوير متعددة. لكل عينة، أنشئ مكدس z يبدأ من المستوى الأقرب إلى الهدف وينتهي عند أول مستوى خارج التركيز. بالنسبة لكرويدات هيدرا ، ينصح بحجم خطوة 2 ميكرومتر.
ملاحظة: إنشاء مكدس z ليس ضروريا دائما. على سبيل المثال، عند فحص السلوك التذبذبي لكرويدات هيدرا المتجددة، يكون مستوى واحد يركز على مستوى خط الاستواء للعينات كافيا. عندما تغوص عينات هيدرا بشكل صحيح في قاع بئر الأغاروز، ويتم اختيار هدف مناسب، يجب أن تكون هذه الطائرة ضمن مسافة العمل من الهدف. - اضبط معلمات التايم لابس. مدة 60-70 ساعة مع تصوير كل 10 دقائق مناسبة لتصوير التجدد الكامل لكرويدات هيدرا . ابدأ بالتصوير.
4. مجهر الفلورة الصفائح الضوئية
- صور العينات على مجهر من صفائح الضوء مع هدف كشف أفقي موضوع.
- قبل البدء، قم بمحاذاة ورقة الضوء التي تنشأ بواسطة أهداف الإضاءة. اضبط درجة حرارة غرفة المجهر على 18-21 درجة مئوية. إذا لم يكن بالإمكان تبريد المجهر، قم بتبريد الغرفة بدلا من ذلك.
- اختر هدف كشف يمكنه أن يناسب العينة الكاملة في مجال رؤيتها. عندما يكون لدى العينات مساحة للتحرك، اختر هدف كشف يتناسب مع ذلك.
- ضع حامل العينة في المجهر. إذا كانت العينات مثبتة في شعيرات زجاجية، ادفع المكبس للأسفل حتى تخرج العينات من الزجاج ليتم التصوير فقط عبر الأغاروز (الشكل 3C).
- قم بإعداد إعدادات المجهر للضوء المنقول، والفلورة، والمواضع المتعددة، والزمن الزمني كما هو موضح في القسم 3 (المجهر الكونفوكالي للقرص الدوار).
- إذا لم يكن المجهر مزودا بأهداف كشف متعددة، قم بإعداد كشف متعدد الرؤى لاكتشاف العينة من زوايا متعددة. عندما يمكن اكتشاف أكثر من نصف العينة داخل مكدس z واحد، يكفين عرضين مفصولين بزاوية 180°. بدلا من ذلك، استخدم من ثلاث إلى خمس رؤى.
- إعداد أكوام z بحجم خطوة مناسب، وبالنسبة لكروات هيدرا ينصح بحجم خطوة 2 ميكرومتر. يجب أن تغطي مجموعة Z-stack العينة بالكامل. عند تصوير العينات التي تتحرك بحرية في آبار FEP، أنشئ مكدس Z يغطي البئر بالكامل. ابدأ بالتصوير.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
نجحنا في توليد مجموعات بيانات طويلة الأمد لإعادة توليد كرويدات هيدرا باستخدام كل من المجهر الكونفوكالي للقرص الدوار (SDCM) ومجهر الفلورة الصفائح الضوئية (LSFM). حدث التجدد بشكل طبيعي في كلا النظامين التصويريين: كسرت الكرويدات التماثل، واستطالت، وطورت مجسات وقدم خلال 3 أيام (الشكل 5A، الشكل 6A، الفيديو التكميلي 1، والفيديو التكميلي 2). بعد تصوير مطول، أصبحت الحيوانات المتجددة متحركة جدا وبدأت تتحرك خارج ...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
كل من SDCM وLSFM مناسبان جدا لتوليد مجموعات بيانات زمنية طويلة الأمد لكرويدات هيدرا المتجددة. المبادئ البصرية التي تستند إليها كل تقنية مميزة، وبالتالي تقدم مزايا وحدود فريدة (الجدول 2). يفضل SDCM عندما لا تكون هناك حاجة لرؤية كاملة وعالية الدقة للعينة. يمكن تصوير عدة عينات في تجربة واحدة، مما يجعلها مفيدة بشكل خاص لاختبار حالات مختلفة مثل العلاجات الدوائية. بالإضافة إلى ذلك، فإن مجموعات بيانات SDCM سهلة المعالجة والتحليل، مما يجعلها التقنية الأسرع والأكثر سهولة...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
يعلن المؤلفون أنهم لا يملكون تضارب مصالح.
شكر وتقدير
نود أن نشكر لور بلانتارد من منشأة التصوير المتقدم والمجهر في FMI على مساهمتها القيمة. وقد دعمت مؤسسة نوفارتيس للأبحاث.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 20×/0.8 Plan-Apochromat objective | Zeiss | 440640-9903-000 | للمجهري المجسم بقرصي الدوران |
| 20x/1.0 W Plan-Apochromat water dipping objective | Zeiss | 421452-9700-000 | يستخدم كعدسة كشف في Zeiss Lightsheet 7 |
| حامل مطبوع ثلاثي الأبعاد لتثبيت غرفة FEP | مصنوع حسب الطلب | ||
| لوح تصوير زجاجي سفلي بأربعة آبار (#1.5H) | Ibidi | 80427 | |
| أجاروز | Carl Roth | 3810.4 | |
| قالب ألومنيوم لغرفة FEP | مصنوع حسب الطلب | ||
| كلوريد الكالسيوم | Sigma-Aldrich | C4901 | |
| هواء معبأ | Durable | POWERCLEAN STANDARD 400 | |
| لوح زراعة الخلايا (6 سم) | Thermo Fisher Scientific | 150288 | |
| D-(+)-glucose | Sigma-Aldrich | G8769 | |
| رقائق FEP (سمك 127 µm) | Adtech Polymer Engineering | ||
| FluoSpheres carboxylate-modified (0.2 µm, dark red) | Thermo Fisher Scientific | F8807 | |
| قنينة زجاجية | Brand | 701904 | |
| ماص زجاجي باستور (150 ملم) | VWR | 612-1701 | |
| Hydra vulgaris | |||
| برنامج التصوير | Visitron | VisiView | للمجهري المجسم بقرصي الدوران |
| مجهر ضوء مقلوب | Zeiss | Axio observer 7 | للمجهري المجسم بقرصي الدوران |
| مجهر ورقة الضوء | Leica | Viventis Deep LS2 | |
| مجهر ورقة الضوء | Zeiss | Lightsheet 7 | |
| أجاروز ذو نقطة انصهار منخفضة | Thermo Fisher Scientific | R0801 | |
| كلوريد المغنيسيوم | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| كبريتات المغنيسيوم | Sigma-Aldrich | M2643 | |
| ميكروسكالبل | pfm medical | 200300745 | |
| كيس ماصة | |||
| مكبس ماصة نقل | Brand | 701932 | |
| كلوريد البوتاسيوم | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| برنمج بنسن أمان | INTEGRA Biosciences | FIREBOY plus | |
| كاميرات sCMOS | Photometrics | Prime 95B | للمجهري المجسم بقرصي الدوران |
| بيكربونات الصوديوم | Fluka Analytical, Sigma-Aldrich | 71630 | |
| ديهايدرات سترات الصوديوم | Sigma-Aldrich | W302600 | |
| بيروفات الصوديوم | Sigma-Aldrich | P2256 | |
| وحدة المسح المجسم بقرصي الدوران (فتحات 50 µm) | Yokogawa | CSU-W1 | للمجهري المجسم بقرصي الدوران |
| مجهر ستيريوسكوبي | Leica | M80 | |
| TES | Sigma-Aldrich | T1375 | |
| أداة تشكيل حراري | Yuyao Jintai Machine Factory | Jintai JT-18 | |
| طبق زراعة الأنسجة (10 سم) | VWR | 734-2321 | |
| محلول Tris-HCl العازل | Roche Diagnostics | 10812846001 |
المراجع
- Bode, P. M., Bode, H. R. Formation of pattern in regenerating tissue pieces of hydra attenuata: I. Head-body proportion regulation. Dev Biol. 78 (2), 484-496 (1980).
- Fütterer, C., Colombo, C., Jülicher, F., Ott, A. Morphogenetic oscillations during symmetry breaking of regenerating hydra vulgaris cells. Europhys Lett. 64 (1), 137(2003).
- Weevers, S. L., et al. Mechanochemical patterning localizes the organizer of a luminal epithelium. Sci Adv. 11 (26), eadu2286(2025).
- Oreopoulos, J., Berman, R., Browne, M. Chapter 9 - Spinning-disk confocal microscopy: present technology and future trends. Meth Cell Biol. 123, 153-175 (2014).
- Stelzer, E. H. K., et al. Light sheet fluorescence microscopy. Nat Rev Meth Primers. 1 (1), 73(2021).
- Moos, F., et al. Open-top multisample dual-view light-sheet microscope for live imaging of large multicellular systems. Nat Meth. 21 (5), 798-803 (2024).
- Soriano, J., Colombo, C., Ott, A. Hydra molecular network reaches criticality at the symmetry-breaking axis-defining moment. Phys Rev Lett. 97 (25), 258102(2006).
- Livshits, A., Shani-Zerbib, L., Maroudas-Sacks, Y., Braun, E., Keren, K. Structural inheritance of the actin cytoskeletal organization determines the body axis in regenerating hydra. Cell Rep. 18 (6), 1410-1421 (2017).
- Hanson, A., et al. Automatic monitoring of neural activity with single-cell resolution in behaving hydra. Sc Rep. 14 (1), 5083(2024).
- Escobar, A., et al. Terminal differentiation precedes functional circuit integration in the peduncle neurons in regenerating hydra vulgaris. Neural Dev. 19 (1), 18(2024).
- Ferenc, J., Tsiairis, C. D. Studying Mechanical Oscillations During Whole-Body Regeneration in Hydra. Whole-Body Regenerat. 2450, 619-633 (2022).
- Bossert, P., Galliot, B. How to use hydra as a model system to teach biology in the classroom. Int J Dev Biol. 56 (6-8), 637-652 (2012).
- Jemielita, M., Taormina, M. J., Delaurier, A., Kimmel, C. B., Parthasarathy, R. Comparing phototoxicity during the development of a zebrafish craniofacial bone using confocal and light sheet fluorescence microscopy techniques. J Biophotonics. 6 (11-12), 920-928 (2013).
- Icha, J., Weber, M., Waters, J. C., Norden, C. Phototoxicity in live fluorescence microscopy, and how to avoid it. Bioessays. 39 (8), 1700003(2017).
- Ravichandran, Y., Vogg, M., Kruse, K., Pearce, D. J. G., Roux, A. Topology changes of hydra define actin orientation defects as organizers of morphogenesis. Sci Adv. 11 (3), eadr9855(2025).
- Maroudas-Sacks, Y., Garion, L., Suganthan, S., Popović, M., Keren, K. Confinement modulates axial patterning in regenerating hydra. PRX Life. 2 (4), 043007(2024).
- Bailles, A., et al. Anisotropic stretch biases the self-organization of actin fibers in multicellular hydra aggregates. Proc Natl Acad Sci. 122 (32), e2423437122(2025).
- Luu, P., Fraser, S. E., Schneider, F. More than double the fun with two-photon excitation microscopy. Comm Biol. 7 (1), 364(2024).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
