مقالة منهجية

عزل وزراعة الخلايا المبكرة البيضاء والبنية من أجنة الفئران

245 مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/70101

⸱

أبريل 17, 2026

 ,  ,  , 
1Laboratory Lille Neuroendocrinology, Lille Neuroscience & Cognition, University of Lille, Inserm, CHU Lille

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

نقدم نهجا جديدا وقويا وقابلا للتكرار لعزل وزراعة الخلايا الدهنية البيضاء والبنية من أجنة الفئران، مما يؤسس استراتيجية قوية في المختبر لتحليل الآليات الخلوية والجزيئية التي تحكم التزام وتمايز سلالة الخلايا الدهنية، ونوفر إطارا للتحقيق في تأثير تطور الأنسجة الدهنية.

الملخص

يلعب نسيج الدهون دورا مركزيا في التوازن الأيضي، وتتشكل خصائصه أثناء تطور الجنين من خلال تمايز الخلايا الدهنية. لذلك، تمثل الخلايا الجنينية قبل الدهون نموذجا ذا صلة لدراسة الأحداث المبكرة في تكوين الأنسجة الدهنية وتحديد النسب. تصف هذه المقالة بروتوكولا قابلا للتكرار لعزل وتمايز الخلايا البيضاء والبنية قبل الدهون المعزولة من أجنة الفئران في اليوم الجنيني 15.5 (E15.5)، وهي مرحلة تطورية تبدأ فيها مستودعات الدهون في التكون. توفر الطريقة إرشادات مفصلة لاستئصال الأنسجة الدقيقة، والهضم الإنزيمي، والزراعة الأولية، وظروف التمايز الخاصة بالسلالة التي تدعم بقاء الخلايا ونضج الدهن. تشمل النتائج الممثلة تراكم قطرات الدهون والتعبير عن العلامات المرتبطة بالنسب، مما يؤكد نجاحا في التمايز تحت ظروف زراعة محددة. باستخدام هذا النهج، يمكن توجيه الخلايا الدهنية الجنينية نحو مصير الخلايا الدهنية البيضاء أو البنية، مما يمكن من إجراء تحليلات مقارنة لتوقيت التطور، وخصائص السلالة، وملفات التعبير الجيني. يقدم هذا البروتوكول أداة عملية وذات صلة تنمائية للتحقيق في تكوين الأنسجة الدهنية وآليات البرمجة حول الولادة في بيئة تجريبية مضبوطة.

المقدمة

يلعب نسيج الدهون دورا مركزيا في الحفاظ على التوازن الكامل للجسم من خلال تنظيم تخزين الطاقة، والإشارات الصماء، والتطور الحراري التكيفي، مع التفاعل الواسع مع الأعضاء المحلية والبعيدة1،2،3. يمكن التمييز بين نوعين رئيسيين من أنسجة الدهون الدهنية: النسيج الدهني الأبيض (WAT) والنسيج الدهني البني (BAT)، واللذان يختلقان بشكل ملحوظ في السلالة الخلوية، والوظيفة الفسيولوجية، والتوزيع التشريحي، والنشاط الأيضي4.

يشكل WAT الخزان الأساسي للطاقة للكائن الحي. الخلايا الدهنية البيضاء متخصصة جدا في تخزين الدهون وتتميز بوجود قطرة دهنية كبيرة واحدة (LD) تحتل معظم الفضاء السيتوبلازمي5. على النقيض من ذلك، يتخصص BAT في التكوين الحراري غير المرتجف. تحتوي الخلايا الدهنية البنية على عدة خلايا دهنية صغيرة وتظهر كثافة ميتوكوندرية عالية 3,6. تعتمد القدرة الحرارية ل BAT على بروتين الفصل 1 (UCP1)، وهو بروتين غشاء ميتوكوندريا داخلي يسهل تسرب البروتون عبر الغشاء. من خلال فصل الفسفرة التأكسدية الناتجة عن تخليق ATP، يقوم UCP1 بتبدد تدرج البروتون كحرارة، مما يساهم في الحفاظ على درجة حرارة الجسم8. نظرا لأدوارهما المتنوعة، جذب WAT وBAT اهتماما كبيرا ليس فقط كمنظمين رئيسيين وأهداف علاجية محتملة في الأمراض الأيضية، بل أيضا في علم الأحياء التطوري والتطوري، وعلم المناعة، والشيخوخة، بسبب تفاعلاتهما النظامية المعقدة والواسعة النطاق. تشير الأدلة المتراكمة أيضا إلى أن برمجة الأيض الجنينية مرتبطة ارتباطا وثيقا بتطور الأنسجة الدهنية، حيث يمكن أن تؤثر الاضطرابات في البيئة داخل الرحم على عدد الخلايا الدهنية وتوزيعها ووظيفتها، مما يعرض الأفراد للسمنة والأمراض الأيضية لاحقا في حياتهم11.

لدراسة بيولوجيا نسيج الدهون، من الضروري توفر الخلايا الدهنية الناضجة. توفر أنظمة الزراعة المجهزة بيئة محكمة تسمح بتقييم العوامل المحددة التي تؤثر على تكون الدهون ووظيفة الخلايا الدهنية. تم إنشاء عدة بروتوكولات لعزل وتمييز الخلايا الدهنية عن الفئران البالغة أو الجراء الوليدة12،13،14،15. ومع ذلك، قد تختلف هذه الخلايا الدهنية عن مجموعات الخلايا الأصلية التي تولد الأنسجة الدهنية أثناء التطور. في الفئران، تكون مستودعات BAT هي الأولى التي تتطور أثناء تكوين الجنين، حيث توفر للأطفال الصغار قدرة حرارية غير مرتجفة وهي ضرورية للتكيف مع البرد بعد الولادة. يمكن اكتشاف مستودعات الخلايا الدهنية البنية في المنطقة بين الكتف في وقت مبكر من اليوم الجنيني 14.5 (E14.5)16. تبدأ LDs بالتكون عند E15.5، ويبدأ التعبير عن UCP1 حوالي E16.5. في جنين الفأر، توجد الخلايا ما قبل الدهون في WAT الإربية (iWAT) أيضا في هذه المرحلة16.

يركز البروتوكول الموضح هنا على الخلايا ما قبل الدهن المعزولة عند E15.5. تتوافق هذه المرحلة مع الفترة الجنينية التي تبدأ خلالها الخلايا السلفية التمايز في الجسم الحي16، مما يمثل الأسلاف الأولية التي تولد WAT وBAT. على النقيض من ذلك، قد تكون الأسلاف المنشأة بالأديبوجينات المعزولة في مرحلة البالغين أو حديثي الولادة قد تأثرت بالفعل بالعوامل البيئية ومن المرجح أن تظهر مرونة أكثر تقييدا. لذلك، فإن استخدام الخلايا الجنينية في E15.5 يعزز القدرة على إعادة تلخيص البرنامج الدهني في الجسم الحي ، حيث تحتفظ هذه الخلايا بدرجة عالية من المرونة التطورية وتميل أكثر لاتباع مسارات التمايز الفسيولوجي. هذا النهج يحظى باهتمام خاص لأسئلة علم الأحياء التنموي، لا سيما لدراسة تأثيرات العوامل البيئية على تمايز الخلايا الدهنية قبل الدهنية خلال فترة ما حول الولادة، مما يوفر نموذجا قيما لدراسة كيف يمكن أن تشكل التعرضات المبكرة في الحياة تطور أنسجة الدهون والنتائج الأيضية طويلة الأمد. ومع ذلك، يجب على المستخدمين توخي الحذر بشأن خصوصية المرحلة: فالطريقة محسنة للأجنة E15.5، وقد تؤثر الانحرافات في عمر الجنين أو دقة التشريح على إنتاج الخلية أو قابليتها للبقاء على الجهاز. بالإضافة إلى ذلك، تتطلب تقنية التشريح الدقيق ممارسة لتجنب التلوث بالأنسجة غير الدهنية، خاصة نظرا لصغر حجم المستودعات الجنينية. يلخص هذا البروتوكول جميع الخطوات والإجراءات لعزل وزراعة وتضخيم وتمايز الخلايا الدهنية الجنينية إلى خلايا دهنية بنية وبيضاء.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تم إجراء جميع إجراءات الحيوانات وفقا للوائح المحلية ووفقا للإرشادات المحددة في توجيه مجلس الاتحاد الأوروبي بتاريخ 22 سبتمبر 2010 (2010/63/EU) (APAFIS#2617-2015110517317420).

يجب التعامل مع جميع النفايات البيولوجية والحلول الإنزمية والتخلص منها وفقا لإرشادات ولوائح السلامة الحيوية المؤسسية للمواد البيولوجية الخطرة. تحديدا:
- النفايات البيولوجية: جمعها في حاويات بيولوجية معتمدة والتخلص منها عن طريق التعقيم أو حسب تعليمات مكتب السلامة البيولوجية في المؤسسة.
- المحاليل الإنزيمية: تعطل النشاط الإنزيمي المتبقي بإضافة 10٪ مبيض لمدة 30 دقيقة والتخلص منها كنفايات كيميائية وفقا للأنظمة المحلية.
- المواد الاستهلاكية الملوثة (رؤوس الماصات، الأنابيب، إلخ): توضع في أكياس الحماية البيولوجية والمعقم قبل التخلص منها.
- كواشف التثبيت: التخلص منها كنفايات كيميائية خطرة في حاويات مخصصة.

ارتد دائما معدات الحماية الشخصية المناسبة عند التعامل مع النفايات.

1. حصاد أجنة الفئران

  1. قتل الفئران الحوامل (C57Bl/6J) وفقا لإرشادات لجنة رعاية واستخدام الحيوانات المؤسسية.
  2. عقم منطقة بطن الفئران الحامل بنسبة 70٪ إيثانول وقم بعمل شق في منتصف المنتصف لكشف الرحم.
  3. قم بشق تجويف البطن لإزالة أكياس الصفار التي تحتوي على الأجنة عند E15.5 وضعها في صندوق أغاروز يحتوي على درجة حرارة باردة (4 درجة مئوية) 1x PBS.
  4. قم بإزالة الغشاء الخارجي لكل كيس صفار والمشيمة، واقطع الحبل السري للأجنة.
  5. ضع الأجنة في صندوق جديد من الأغاروز يحتوي على 1x PBS بارد.
    ملاحظة: على الرغم من أن هياكل الجهاز العصبي المركزي التي تقوم عليها الإدراك الواعي للألم لم تتطور بالكامل في هذه المرحلة الحملية، إلا أن مستقبلات الألم الطرفية تبدأ بالتشكل بين E13 و E15. وفقا لإرشادات رعاية الحيوانات المؤسسية، ولتقليل استجابات الألم المحتملة، نوصي مع ذلك بقتل الأجنة عن طريق قطع الرأس قبل أي تلاعب تجريبي.

2. تشريح الأنسجة الدهنية الجنينية (الشكل 1)

  1. تشريح BAT بين التناوب (الشكل 1A)
    1. اقطع مستطيلا من صفيحة أغاروز بنسبة 5٪ وضع الجنين بداخله لتثبيته. املأ الطبق ب PBS بارد 1x. ضع صندوق الأغاروز مع الجنين تحت المجهر الثنائي العينين.
    2. إزالة الجلد من الجزء الخلفي من الجنين.
    3. قم بتشريح ال BAT بين لوح الكتف باستخدام ملقط دقيق ومقص دقيق.
    4. افصل BAT بعناية عن الأنسجة المحيطة (الأنسجة الضامة والعضلات) باستخدام المقص المجهري للحصول على عينة BAT بقياس تقارب 4–6 مم × 2–3 مم.
    5. ضع BAT في أنبوب بحجم 2 مل يحتوي على 1 مل من خليط Dulbecco المعتدل/المغذي F-12 (DMEM/F-12) البارد (4 درجات مئوية) مع 100 U/mL بنسلين/ستريبتوميسين (P/S).
  2. تشريح iWAT (الشكل 1B)
    1. ضع الجنين على جانبه (على جانب ثم على الجانب الآخر) على طبق الأغاروز.
    2. قم بتشريح iWAT باستخدام ملقط دقيق ومقص دقيق.
    3. افصل iWAT عن الأنسجة المحيطة (الأنسجة الضامة والجلد) بعناية حتى يكون هناك مستودعين بقياس حوالي 2–4 مم × 0.5–0.8 مم.
    4. ضع عينتي WAT في أنبوب بسعة 2 مل يحتوي على 1 مل من غلوتامين DMEM/F-12 البارد مع 100 U/mL بنسلين/ستربتوميسين (P/S).
      ملاحظة: يجب إجراء جميع عمليات التشريح تحت المجهر الثنائي في أكثر بيئة معقمة ممكنة، باستخدام أدوات تم تعقيمها مسبقا.

3. هضم الأنسجة الدهنية

  1. قم بإزالة DMEM/F12 باستخدام ماصة وأضف في الأنابيب 200 ميكرولتر من غلوتامين DMEM/F12 مع 100 وحدة وحدة وحدة تحكم في الثانية، و0.2٪ ألبومين مصل البقري (BSA)، و0.5 كولاجناز D يو، و0.5 وحدة وحدة التوزيع II.
  2. اقطع الأنسجة بالمقص المجهري داخل الأنابيب لتقليل أجزاء النسيج قدر الإمكان وساعد عملية الهضم عن طريق التوصيل بالماصات لأعلى ولأسفل 10 مرات.
    ملاحظة: يجب أن تظهر العينات المهضومة بالكامل كتعليق ضئيب دون وجود كتل أنسجة مرئية.
  3. حضن عند حرارة 37 درجة مئوية (في حمام ماء) لمدة 15 دقيقة.
  4. أوقف التفاعل بإضافة 600 ميكرولتر من غلوتامين DMEM/F-12 البارد مع 100 وحدة U/ML p/s، و20٪ مصل أبقار جنيني (FBS). أعد تعليق المضخة بشكل متساو عن طريق التوصيل بأنبوب 10 مرات.

4. زراعة الخلايا الأولية

ملاحظة: من هذه الخطوة فصاعدا، يجب إجراء جميع الإجراءات تحت ظروف معقمة صارمة في خزانة السلامة البيولوجية (BSC) لمنع التلوث. ارتد قفازات معقمة، ومعطف مختبر، ونظارات أمان للحفاظ على التعقيم والحماية من المخاطر المحتملة. استخدم أدوات بلاستيكية معقمة قابلة للتخلص من مرة واحدة، وتقنية معقمة، وتأكد من أن جميع المواد والكواشف والوسائط معقمة. تجنب ملامسة الأسطح غير المعقمة لمنع التلوث.

  1. قم بتغليف الخلايا على شرائح البئر وحضنتها تحت ظروف قياسية (37 درجة مئوية، 5٪ ثاني أكسيد الكربون2) لمدة ساعة واحدة؛ بالنسبة لألواح 8 آبار، ضع 200 ميكرولتر/بئر. بعد الحضانة، تأكد من أن الخلايا التصقت بالحركة بلطف مع المراقبة تحت المجهر.
    ملاحظة: في هذه المرحلة، يمكن تجميع عينات BAT أو WAT المختلفة في أنبوب واحد للحصول على ثقافات متجانسة في الآبار المختلفة (مثل اختبار تأثير المعالجة على الثقافات المتشابهة).
  2. استبدل الوسط بغلوتامين dmem/f-12 مسخن مسبقا (37 درجة مئوية) ب 100 وحدة U/ML P/S، 10٪ FBS، وحضن الخلايا طوال الليل عند 37 درجة مئوية، 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
    ملاحظة: عن طريق تغيير الوسط، تزال الخلايا الميتة/غير المتصلة وأجزاء الأنسجة التي لم يكن بالإمكان تفكيكها، ويبقى فقط الخلايا المرتبطة.
  3. علاج التمايز (72 ساعة)
    1. لتمييز الخلايا الدهنية البنية، قم بتغيير الوسط باستخدام غلوتامين DMEM/F-12 مسخن مسبقا (37 درجة مئوية) مع 100 U/mL P/S، 10٪ FBS، 125 نانوميل إندوميثاسين، 0.5 mM 3-isobutyl-1-methylxantine (IBMX)، 1 نانومول ثلاثي يودوثيرونين (T3)، 1 ميكرومولار روزيغليتازون، 1 ميكرومولار ديكساميثازون، و850 نانومول إنسولين وحضن عند 37 °م، 5٪CO2 لمدة 72 ساعة.
    2. لتمييز الخلايا الدهنية البيضاء، قم بتغيير الوسط باستخدام غلوتامين DMEM/F-12 المسخن مسبقا مع 100 U/mL P/S، 10٪ FBS، 0.5 mM IBMX، 1 ميكرومولار ديكساميثازون، و850 نانومول أنسولين وحضانة عند 37 درجة مئوية، 5٪CO2 لمدة 72 ساعة.
  4. علاج صيانة (كل 48 ساعة)
    1. غير الوسط باستخدام غلوتامين DMEM/F-12 المسخن مسبقا (37 درجة مئوية) مع 100 وحدة U/mL P/S، 10٪ FBS، 1 نانومول T3، 1 ميكرومولار روزيغليتازون، و850 نانومالتر أنسولين. جدد الوسط كل 48 ساعة.
      ملاحظة: جميع التركيزات المدرجة تشير إلى التركيزات النهائية العاملة للكواشف. ضبط الأحجام النهائية لوسائط التميز والصيانة بناء على عدد الآبار التي سيتم معالجتها، باستخدام 200 ميكرولتر لكل بئر كحجم قياسي لألواح 8 آبار.

5. التثبيت والتلطيم المناعي (الشكل 2أ)

  1. استنشق الوسط واغسل الخلايا ب 1x PBS بارد.
  2. ثبت الخلايا لمدة 10 دقائق مع الفورمالديهيد البارد بنسبة 4٪ في 1x PBS.
  3. اغسل الخلايا ب 1x PBS لمدة 3 × 5 دقائق.
  4. قم بنفخ الخلايا بنسبة 0.1٪ ترايتون في 1x PBS لمدة 10 دقائق.
  5. اغسل الخلايا ب 1x PBS لمدة 3 × 5 دقائق.
  6. قم بحجب المواقع غير المحددة باستخدام 5٪ مصل الحمار الطبيعي (NDS) في 1x PBS لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة (RT).
    ملاحظة: اختيار النوع لمصل الحاجب يعتمد على النوع الذي تنتج فيه الأجسام المضادة الثانوية.
  7. حضن الأجسام المضادة الأولية المخففة في 5٪ NDS في 1x PBS خلال الليل عند 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: لا تضف الأجسام المضادة الأولية إلى أحد الآبار — فهذا سيكون وسيلة تحكم سلبية.
  8. اغسل الخلايا ب 1x PBS لمدة 2 × 5 دقائق.
  9. اغسل الخلايا ب 5٪ NDS في 1x PBS لمدة 5 دقائق.
  10. حضن الأجسام المضادة الثانوية، DAPI، وبوديبي لمدة ساعة واحدة في RT، مغطى للحماية من الضوء.
  11. اغسل الآبار ب 1x PBS لمدة 3 × 5 دقائق.
  12. حافظ على الخلايا عند 4 درجات مئوية في الظلام حتى التقاط الصور.

6. حفظ الخلايا ما قبل الدهون بالتبريد

ملاحظة: من الممكن إيقاف الزراعة وتجميد الخلايا قبل أو بعد عملية التمايز لتخزينها وإعادة استخدامها في الزراعة الخلوية اللاحقة.

  1. تحضير وسط تجميد: 50٪ FBS، 40٪ غلوتامين DMEM/F-12 مع 100 U/mL P/S، 10٪ ثنائي ميثيل كبريتسيد (DMSO).
    تحذير: DMSO مادة كيميائية خطيرة. إنه مهيج للجلد والعين، ويمكن أن يسهل امتصاص مواد سامة أخرى عبر الجلد، وقد يسبب ضررا إذا تم استنشاقه أو ابتلعه. دائما تعامل مع DMSO داخل BSC لتقليل التعرض والتلوث. ارتد معدات الحماية الشخصية المناسبة (PPE) (قفازات معقمة، معطف مختبر، ونظارات أمان لمنع التلامس). تجنب ملامسة الجلد. في حال التلامس، اغسله فورا مع الكثير من الماء. تخزين DMSO في حاوية محكمة الإغلاق داخل BSC عند عدم الاستخدام، وتأكد من التخلص السليم وفقا لبروتوكولات السلامة في المختبر.
  2. اغسل الخلايا بحرارة PBS مسخنة مسبقا (37 درجة مئوية) 1x.
  3. أضف تريبسين مسخن مسبقا (37 درجة مئوية) بنسبة 0.05٪ لفصل الخلايا كيميائيا وحضانة لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية، 5٪ ثاني أكسيد الكربون2. افحص بصريا وجود انفصال الخلايا تحت المجهر.
  4. أوقف التفاعل بإضافة 3 أضعاف حجم غلوتامين DMEM/F-12 المسخن مسبقا (37 درجة مئوية) مع 100 U/mL P/S، 10٪ FBS. أعد التعليق بشكل متساو.
  5. الطرد المركزي 7 دقائق عند RT، 300 × g وتخلص من السوبرناتانت.
  6. أعد تعليق الخلايا في وسط تجميد بحجم 10 مل. الطرد المركزي 7 دقائق عند RT، 300 × جرام وتخلص من السوبرناتانت، تاركا حوالي 3 مل.
    ملاحظة: قس الحجم الدقيق لحساب إجمالي عدد الخلايا بعد العد.
  7. قم بتخفيف حجم صغير بنسبة 1:2 باستخدام تريبان بلو وعد الخلايا الحية باستخدام غرفة نيوباور.
  8. اضبط الحجم باستخدام وسط تجميد لتحقيق 5 × 104 – 1 × 105 خلايا/قارورة (الحجم النهائي: 1 مل/قارورة).
  9. انقل القوارير إلى حاوية تجميد (معدل التبريد: -1 °م/دقيقة) وخزن على -80 درجة مئوية طوال الليل.
  10. انقله إلى النيتروجين السائل للتخزين طويل الأمد.
    ملاحظة: يسمح هذا البروتوكول بالبقاء على مدى نجاح يزيد عن 90٪ بعد الذوبان.
  11. قم بإذابة الخلايا عند الحاجة عن طريق إذابة القارورة بسرعة في حمام ماء بدرجة حرارة 37 درجة مئوية.
  12. انقل محتويات القارورة إلى 4 مل من غلوتامين DMEM/F-12 المسخن مسبقا (37 درجة مئوية) مع 100 يوروم/مل p/s، 10٪ FBS. أعد تعليقها بشكل متساو عن طريق الرش بلطف لأعلى وأسفل 10 مرات. حضن الليلة عند حرارة 37 درجة مئوية، 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
  13. استبدل الوسط بغلوتامين DMEM/F-12 جديد بجرعة 100 يوروم/لتر P/S، 10٪ FBS وجدد كل 48 ساعة.
    ملاحظة: من الضروري إجراء هذا التغيير في الوسط لإزالة بقايا DMSO، لأن التعرض المطول قد يؤثر سلبا على بقاء الخلية وتمايزها ووظيفتها. تأكد من استبدال الوسط بالكامل لتجنب التأثيرات السامة للخلايا.
  14. تابع التجارب أو خلايا المرور عندما تصل إلى نقطة التقاء 80٪.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

كما هو موضح في الشكل 1، يمكن عزل مستودعات BAT وiWAT السليمة بكفاءة من الأجنة عند E15.5. بينما يمكن اكتشاف BAT بسهولة في أجنة E15.5، قد يتطلب اكتشاف iWAT تدريبا. في كلتا الحالتين، من الضروري تشريح جميع الأنسجة المحيطة بعد التشريح الخشن لتجنب زراعة أنواع خلايا أخرى.

المراحل الأولية للهضم والزراعة للخلايا الدهنية البيضاء والبنية متطابقة (الشكل 2A,B)، بينما تختلف المراحل التالية من التماي...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

تم وصف زراعة الخلايا ما قبل الدهون بشكل موسع في سياقات تجريبية متنوعة. ومع ذلك، تعتمد البروتوكولات الحالية بشكل رئيسي على الأنسجة البالغة أو الأرومات الليفية الجنينية، ولا توجد طرق موحدة متاحة حاليا لعزل وزراعة الخلايا الدهنية الجنينية مباشرة من الأنسجة الدهنية النامية. دراسة هذه الخلايا مهمة بشكل خاص، لأنها تمثل مجموعات الخلايا ما قبل الدهنية الأصلية الموجودة في بيئتها الجنينية الدقيقة. تعد هذه التحليلات ضرورية لفهم تكوين الخلايا الدهنية البيضاء والبنية أثناء تكوين الجنين، بما في ذلك إش...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

المؤلفون لا يفرضون أي تضارب مصالح.

شكر وتقدير

نشكر كريستيان دوهم على نصائحه. نشكر الدعم من المعهد الوطني الفرنسي للصحة والبحوث الطبية (INSERM). كان M.C-M مدعوما من قبل ANR-23-CE13-0044. حظي الماجستير بدعم من المعهد الأوروبي للجينوم للسكري (EGID, ANR-10-LABX-0046)، والمركز الوطني للطب الدقيق في السكري (PreciDIAB, ANR-18-IBHU-0001)، والمجلس الإقليمي لأوت دو فرانس (22005973). تم إنشاء الشكل 2 في BioRender. مايوف-لوشار، أ. (2026) https://BioRender.com/3pbzif1. حظيت SB بدعم منحة ANR-24-CHBS-0002.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
3,5,3'-ثلاثي يودوثيرونينسيغما709719T3
3-إيزوبيوتيل-1-ميثيلزانثين سيغماI7018آي بي إم إكس
أغاروزسيغماA0169
الكحولVWR1.59010.0500
الأجسام المضادة المضادة لUCP1أبكامAB10983
المجهر الثنائيلايكا  MZ9.5
خزانة السلامة البيولوجيةثيرمو ساينتفيك51022482خزانة السلامة من نوع BSC، هيرا سيف، كانساس من الفئة الثانية
بوديبيإنفيتروجينD3922الإثارة/الانبعاث 493/504 نانومتر
مصل البقر الألبومينيوروميديكس04-100-812-CBSA
الطرد المركزيإبندورف5430 R
المشابكFST (ألمانيا ستانلس)
كولاجناز Dسيغما11088882001
أنابيب التبريدسارستيدت72.379
ألواح الزراعة (8 آبار)إيبيدي 80826
ألواح الزراعة (12 بئرا)كورنينغ كوستارCLS3513صفيحة بوليسترين، قاع مسطح، معقم
ديكساميثازونسيغماD2915
ديسباسي IIسيغما4942078001
DMEM/F12جيبكو31331الجلوتامين المضاف
DMSOسيغماD2438
الأجسام المضادة للأرنب من الحمارإنفيتروجينA32795أليكسا فلو بلس 647
إبندورفس 1.5 ملإبندورف15625367
FBSجيبكوA5256701
الفورمالديهايد 37٪ثيرمو ساينتفيك119690010
حاوية التجميدثيرمو ساينتفيك  5100-0001
هوشست إنفيتروجينH3570
الحاضنةثيرمو ساينتفيك50116048حاضنة هيراسيل 150i ثاني أكسيد الكربون
إندوميثاسينسيغماI7378
الأنسولينسيغماI9278
  مجهر مقلوب مزود بمقياس 10&00 مرات الإضاءة الموضوعية والهالوجينكارل زايس أكسيو فيرت.A1
فئران C57BL/6Jنهر تشارلز
المقص الدقيقFST (ألمانيا ستانلس)
NDSسيغماD9663
غرفة نويباورثيرمو ساينتفيك10195580
PBS 10xجيبكو14200
PBS 1xجيبكو14190
البنيسيلين/الستربتوميكينجيبكو15140-122
أطباق بترىسارستيدت83.3902
لوحات qPCRثيرمو ساينتفيكAB-0600
مسبار qPCR ل Fabp4ثيرمو ساينتفيك4331182اختبارات تقمان، Mm00445878_m1
مسبار qPCR ل Ppargثيرمو ساينتفيك4331182اختبار تقمان، Mm00440940_m1
مسبار qPCR ل Ucp-1ثيرمو ساينتفيك4331182اختبار تقمان، Mm01244861_m1
مجموعة النسخ العكسي  ثيرمو ساينتفيك4368813مجموعة cDNA عالية السعة
مجموعة استخراج الحمض النووي الريبيأوميغا بايو-تيكR6934-02مجموعة E.Z.N.A. مجموعة RNA كاملة II
روزيغليتازونسيغماR2408
ترايتون X-100ثيرمو ساينتفيكA16046
تريبان بلوسيغماT8154
تريبسين-إيدتاجيبكو25300054
حمام مائيغرانتSAP12 سعة 12 لتر

المراجع

  1. Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. Adipocytes as regulators of energy balance and glucose homeostasis. Nature. 444 (7121), 847-853 (2006).
  2. Kershaw, E. E., Flier, J. S. Adipose tissue as an endocrine organ. J Clin Endocrinol Metab. 89 (6), 2548-2556 (2004).
  3. Luo, L., Liu, M. Adipose tissue in control of metabolism. J Endocrinol. 231 (3), R77-R99 (2016).
  4. Bouchekioua, A., Pourquié, O., Mayeuf-Louchart, A. In vitro differentiation of beige/brown adipocytes for the treatment of metabolic diseases. Adipose Tissue Homeostasis in Health and Disease. IntechOpen. , (2024).
  5. Fischer-Posovszky, P., Newell, F. S., Wabitsch, M., Tornqvist, H. E. Human SGBS cells - a unique tool for studies of human fat cell biology. Obes Facts. 1 (4), 184-189 (2008).
  6. Mayeuf-Louchart, A., Duez, H. From glycogen to lipid droplet: an intimate connection in the brown adipocyte. Med Sci (Paris). 36 (6-7), 577-579 (2020).
  7. Fedorenko, A., Lishko, P. V., Kirichok, Y. Mechanism of fatty-acid-dependent UCP1 uncoupling in brown fat mitochondria. Cell. 151 (2), 400-413 (2012).
  8. Wang, W., Seale, P. Control of brown and beige fat development. Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (11), 691-702 (2016).
  9. Ghaben, A. L., Scherer, P. E. Adipogenesis and metabolic health. Nat Rev Mol Cell Biol. 20 (4), 242-258 (2019).
  10. Cypess, A. M., et al. Identification and importance of brown adipose tissue in adult humans. N Engl J Med. 360 (15), 1509-1517 (2009).
  11. Merkestein, M., et al. Programming of adipose tissue function: an evolutionary perspective. Mamm Genome. 25 (9-10), 413-423 (2014).
  12. Peics, J., et al. Isolation of adipogenic and fibro-inflammatory stromal cell subpopulations from murine intra-abdominal adipose depots. J Vis Exp. (162), e61610(2020).
  13. Curtin, M. C., Jackson, A. E., Hilgendorf, K. I. Isolation and culturing of primary murine adipocytes from lean and obese mice. J Vis Exp. (215), e67846(2025).
  14. Rocha, A. L., Guerra, B. A., Boucher, J., Mori, M. A. A method to induce brown/beige adipocyte differentiation from murine preadipocytes. Bio Protoc. 11 (24), e4265(2021).
  15. Galmozzi, A., Kok, B. P., Saez, E. Isolation and differentiation of primary white and brown preadipocytes from newborn mice. J Vis Exp. (167), e62005(2021).
  16. Mayeuf-Louchart, A., et al. Glycogen dynamics drives lipid droplet biogenesis during brown adipocyte differentiation. Cell Rep. 29 (6), 1410-1418.e6 (2019).
  17. Herbers, E., et al. Preventing white adipocyte browning during differentiation in vitro: the effect of differentiation protocols on metabolic and mitochondrial phenotypes. Stem Cells Int. 2022, 3308194(2022).
  18. Yau, W. W., et al. Thyroid hormone (T3) stimulates brown adipose tissue activation via mitochondrial biogenesis and MTOR-mediated mitophagy. Autophagy. 15 (1), 131-150 (2019).
  19. Zekri, Y., et al. Brown adipocytes local response to thyroid hormone is required for adaptive thermogenesis in adult male mice. eLife. 11, e81996(2022).
  20. Smolińska, K., et al. Targeting fatty acid-binding protein 4: a therapeutic intersection of obesity and cancer via lipid metabolism. Prog Lipid Res. 100, 101353(2025).
  21. Cero, C., et al. Standardized in vitro models of human adipose tissue reveal metabolic flexibility in brown adipocyte thermogenesis. Endocrinology. 164 (12), bqad161(2023).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

الفيديو قريباً

مقالات ذات صلة