مقالة منهجية

التقييم اللوني لنشاط ديوديناز 1 في ميكروسومات الكبد البشرية باستخدام تفاعل ساندل-كولثوف

671 مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/70104

⸱

أبريل 10, 2026

 ,  ,  ,  , 
1Experimental Toxicology and Ecology, BASF SE, 2Pharmacy, Pharmacology and Toxicology, Free University of Berlin, 3German Federal Institute for Risk Assessment (BfR), German Centre for the Protection of Laboratory Animals (Bf3R)

في هذه المقالة

ملخص

يصف هذا البروتوكول طريقة لقياس اللون بشكل موثوق لتقييم تأثير المواد الكيميائية على نشاط ديوديناز 1 (DIO1) في ميكروسومات الكبد البشرية باستخدام تفاعل ساندل-كولثوف. يتضمن معايير قبول محددة مسبقا ومقاييس أداء إحصائية ويدعم الجهود المستمرة نحو إدراج إرشادات اختبار منظمة التعاون الاقتصادي والتنمية.

الملخص

تمكن هذه الطريقة من تحديد المواد المختبرة التي تثبط نشاط DIO1 وقد تتداخل مع توازن هرمون الغدة الدرقية. يصف البروتوكول المعروض طريقة غير مشعة ولونية لتقييم تأثيرات المواد المختبرة على النشاط الإنزيمي لديوديناز 1 (DIO1) في ميكروسومات الكبد البشرية. يعتمد الاختبار على تفاعل ساندل-كولثوف (SK)، الذي يقيس كمية اليوديد المنبعث خلال إزالة اليود من ثلاثي يودوثيرونين العكسي (rT3) إلى دييودوثيرونين (T2). يتم تقليل السيريوم الأصفر (IV) إلى سيريوم عديم اللون (III) في وجود اليوديد، مما يسمح بالكشف الضوئي عند 415 نانومتر. في هذا الإعداد الموحد، يتم ضبط تركيز السيريوم (IV) على 40 مللي مول لتحسين استقرار الإشارة ومتانته تحت الظروف الموصوفة. لضمان موثوقية الاختبار وقابليته للتكرار، يتم تضمين نظام تحكم شامل: 6-بروبيل-2-ثيوراسيل (عنصر مرجعي)، أوروثيوجلوكوز (تحكم إيجابي)، 1-ثيو-β-د-جلوكوز ملح الصوديوم (التحكم السلبي)، و1٪ ثنائي ميثيل كبريتد (التحكم بالمذيبات). يتضمن البروتوكول اختبار تحديد المدى لتحديد تركيزات الاختبار المناسبة، وتوحيد نشاط إطلاق اليوديد الخاص بدفعات الميكروسوم، واختبار التداخل الكيميائي الهيكلي في غياب الميكروسومات، مع تقييم متابعة اختياري بدون ديثيوثرايتول (DTT) لتحديد التشويشات المعتمدة على DTT. اختبار DIO1-SK مناسب للفحص متوسط إلى عالي الإنتاجية ودراسات السموم الميكانيكية. قوتها وقابليتها للتوسع، وقابليتها للتطبيق على ميكروسومات الإنسان تجعله أداة قيمة للتحقيق في اضطرابات الغدد الصماء. يدعم هذا البروتوكول جهود التحقق التنظيمي.

المقدمة

مسببات اضطراب الغدد الصماء (EDs) هي مواد كيميائية تتداخل مع تنظيم الهرمونات وبالتالي تسبب آثارا سلبية لدى البشر 1,2. ديودينازات (DIO) هي إنزيمات مرتبطة بالغشاء، حيث يعتبر السيلينوسيستين بقايا رئيسية في مواقعها النشطة. تتكون هذه العائلة من ثلاثة أشكال متمايلة مميزة (DIO1، DIO2، وDIO3)، والتي تنظم معا تركيزات هرمون الغدة الدرقية (TH) المتداول وتتحكم في توافرها الخاص بالأنسجة داخل الخلايا3. يلعب الثايروكسين (T4)، الذي يعمل كبروهرمون، وثلاثي يودوثيرونين (T3)، الشكل النشط، دورا حيويا في تنظيم استهلاك الطاقة، النمو، عمليات النمو، وتنظيم الحرارة في الجسم4. تختلف نظائر DIO في خصائص خصوصية موقع إزالة اليود والخصائص الحركية وتفضيلات الركيزة3. DIO1 هو الشكل الرئيسي لدييوديناز في الكبد البالغين ويظهر ألفة قوية مع الركيزة مع ثلاثي يودوثيرونين العكسي (rT3) واليودوثيرونينات المكبريتة، بينما يستخدم DIO2 بشكل مفضل T4 و rT3، ويعمل DIO3 بشكل أساسي على T4 وT3. استخدام ميكروسومات الكبد البشرية وrT3 كركيزة يسمح بالكشف الانتقائي عن نشاط DIO1، مما يقلل من التداخل من أشكال متشابهة أخرى. بينما لا تزال العواقب الدقيقة لتثبيط DIO1 الناتج عن المادة غير واضحة بالكامل، تظهر الأدلة من الطفرات الجينية البشرية التي تؤثر على DIO1 بوضوح أن DIO1 يمكن أن يعطلنظام هرمون الغدة الدرقية. نتيجة لذلك، هناك حاجة ملحة لطرق قوية وقابلة للتكرار للتحقيق في تثبيط DIO1.

هدف الطريقة المعروضة هو قياس نشاط DIO1 في المختبر باستخدام نهج غير مشع وقياس ألوان يعتمد على تفاعل ساندل-كولثوف (SK). يحفز DIO1 تحويل عكسي rT3 إلى T2، وهي عملية تؤدي إلى إطلاق أيونات اليوديد. يتيح تفاعل SK الكشف الحساس لليوديد المنبعث، مما يسمح بتحديد نشاط إطلاق اليوديد (IRA) كمقياس مباشر لنشاط DIO1. يتيح هذا الاختبار الكشف عن التأثيرات المثبطة للمواد المختبرة على DIO1، مما يدعم علم السموم الميكانيكي أو الفحص أو اتخاذ القرارات التنظيمية. ويعد ذلك ذا صلة خاصة لدراسة تثبيط DIO1 كحدث جزيئي يبدأ مسارات سلبية تؤدي إلى اضطراب الغدة الدرقية، كما هو موضح في جهود التحقق الدولية مثل تلك التي منسقها EURL ECVAM 6,7. تم تطوير هذه الطريقة في الأصل في عام 2012 8,9 وتم تحسينها أكثر استجابة للحاجة المتزايدة لاختبارات متينة وقابلة للتكرار وقابلة للتوسع في المختبر يمكن دمجها في بطاريات الاختبار لفحص الغدد الصماء، خاصة في سياق استقلاب هرمونات الغدة الدرقية. مؤخرا، نشر تطبيق إعدادات SK التناظرية للفحص المتوسط 10 إلى الفحص عالي الإنتاجية11، مما يوضح التطبيق الواسع للنهج القائم على SK.

على الرغم من أن اختبار DIO1-SK يقيس نشاط DIO1 بشكل غير مباشر عن طريق قياس كمية IRA بدلا من منتجات TH، إلا أنه يقدم عدة مزايا مقارنة بالتقنيات البديلة. على عكس الطرق التي تعتمد على الركائز الموسومةإشعاعيا 12 أو القياس القياسي المعتمد على الطيف الكتلي لهرمونات الغدة الدرقية المنضبطة أو المتكونة13، يوفر تفاعل SK قراءة بسيطة وقابلة للتوسع وفعالة من حيث التكلفة من خلال قياس إفراز اليود عند 415 نانومتر14. بينما توفر طرق LC-MS/MS مع استخراج الطور الصلب (SPE-LC-MS/MS) خصوصية وحساسية عالية لقياس rT3 وT2، إلا أنها تتطلب أجهزة مكلفة وأقل ملاءمة للفحص عالي الإنتاجية. على النقيض من ذلك، يمكن تنفيذ اختبار DIO1-SK في بيئات مختبرية قياسية وقد تم التحقق منه مسبقا للاستخدام مع ميكروسومات الكبد البشرية، مما أظهر قابلية تكرار عالية وتوقعا 6,7. في دراسة مقارنة، تمت مقارنة نتائج تفاعل SK، وتحديدا إفراز اليوديد، مباشرة مع قياس كميات مستقلبات هرمونات الغدة الدرقية (rT3 و T2) باستخدام SPE-LC-MS/MS 15. كشفت النتائج عن توافق قوي بين النهجين عبر مجموعة من المواد المختبرة وقدرات التثبيط المختلفة. بالنسبة لجميع المواد التي تم اختبارها، كانت التغيرات في نشاط إطلاق اليوديد (IRA) التي تقاس بتفاعل SK تعكس بشكل وثيق التغيرات في مستويات rT3 وT2 التي تحددها مطيافية الكتلة. وقد دعم ذلك صحة قراءة SK كبديل لنشاط DIO1. تؤكد هذه التحليلات المقارنة أن اختبار SK يوفر بديلا قويا وموثوقا للتقنيات التحليلية الأكثر تعقيدا، وأن إفراز اليوديد يمكن قياسه بثقة لتقييم تثبيط DIO1 في المختبر.

ومع ذلك، فإن طريقة SK لها بعض القيود التي يجب أخذها في الاعتبار: فهي عرضة للتداخل من مواد إما تحتوي على يوديد حر كشوائب أو تطلق اليود بشكل غير إنزيمي، أو تتفاعل مع مكونات الاختبار مثل الديثيوثرايتول (DTT). يتم تضمين DTT كعامل مختزل للحفاظ على كفاءة حفاز الدييوديناز من خلال دعم تجديد السيلينوسيستين في الموقع النشط في حالته المخفضة أثناء الدوران. نظرا لأن DTT هو مختزل قوي، فقد تخضع بعض المواد المختبرة (أو الشوائب) لتفاعلات أكسدة اختزاز تؤثر على قراءة الألوان اللونية، وفي بعض الحالات تؤدي إلى تشوهات اختبارية تعتمد على DTT غير مرتبطة بإطلاق اليوديد الإنزيمي. يمكن أن تؤدي هذه التداخلات إلى نتائج سلبية كاذبة لتثبيط DIO1، حيث قد لا ينشأ اليوديد المقاس من التحويل الإنزيمي ل rT3. لذا، بينما اختبار SK مناسب للفحص الروتيني ومعظم المواد المختبرة، يمكن استخدام اختبار LC-MS/MS للتأكيد عند الاشتباه في وجود تداخل في الاختبار أو للمواد ذات الخصائص الكيميائية المعقدة.

يتم حاليا تجهيز اختبار DIO1-SK للإدراج كدليل اختبار لمنظمة التعاون الاقتصادي والتنمية في مشروع PEPPER الدولي (المنصة العامة والخاصة للتحقق من طرق توصيف معطلات الغدد الصماء)، مما يبرز أهميته المتزايدة للتطبيقات التنظيمية والتوحيد الدولي لاستراتيجيات اختبار معطلات الغدد الصماء. يمكن دمج الاختبار في بطاريات اختبار مختبر شامل، مما يدعم كل من تقييم السلامة الكيميائية والتحقيقات الميكانيكية في اضطراب الغدد الصماء16. عند دمجها مع الفحوصات التي تعالج أحداثا رئيسية إضافية على مسار النتائج السلبية للغدة الدرقية، تساهم في فهم أكثر اكتمالا لآليات اضطراب هرمونات الغدة الدرقية.

بالإضافة إلى ذلك، فإن قابلية التوسع والتكرار العالي للبروتوكول تجعله مناسبا جدا للفحص متوسط إلى عالي الإنتاجية. وهذا أمر أساسي لتقييم أعداد كبيرة من المواد أثناء تطوير الأدوية وفي البيئات الأكاديمية، كما أظهرت مؤخرا11. سيستفيد الباحثون المهتمون بتثبيط DIO1، سواء للفحص أو السموم الميكانيكية أو اتخاذ القرار التنظيمي، من اختبار قوي وسهل الوصول ومتعدد الاستخدامات. سيجعل التحقق من صحة هذه الطريقة أداة قياسية للبحث حول اضطراب نظام هرمونات الغدة الدرقية ولتقييم السلامة الكيميائية.

البروتوكول

ملاحظة: قبل إجراء الاختبار الرئيسي، من الضروري إجراء سلسلة من الخطوات التحضيرية لضمان دقة وقابلية تكرار وصحة اختبار DIO1-SK. تشمل هذه الأنشطة التمهيدية صب صفائح المرشح المملوءة بالراتنج في تبادل الأيونات، وهي ضرورية للفصل الفعال وتقليل التداخل الخلفي في تفاعل SK. يتم توحيد تفاعل ساندل-كولثوف بانتظام باستخدام منحنيات اليوديد القياسية لمراقبة التغيرات المنهجية والحفاظ على جودة الاختبار. يتم قياس نشاط ميكروسومات الكبد البشرية لتحديد قدرة إطلاق اليوديد الخاصة بالدفعات، مما يضمن أداء إنزيميا متسقا عبر التجارب. معا، توفر هذه الخطوات أساسا قويا للعمل اللاحق في الاختبارات الرئيسية وتقييم البيانات، مما يدعم توليد نتائج قابلة للتكرار وقابلة للتفسير.

1. عمل الفحص التمهيدي

  1. تحضير المخازن والكواشف
    1. جهز جميع المخازن المؤقتة وحلول المخزون مسبقا كما هو موضح في الجدول 1. قم بتخزين الحصص كما هو موضح لضمان الاستقرار وقابلية التكرار.
    2. في يوم الفحص، حضر خليط الركيزة طازجا لكل طبق يحتوي على 96 بئر. لصالح صفيحة واحدة بسعة 96 بئر، اجمع بين 5.75 مل من مخزن HEPES/EDTA (50 ملليمول HEPES، 2.16 ملليمول EDTA، درجة حموضة 7.0)، 0.5 مل من 1 ملليتار DTT المذاب، و10 ميكرولتر من 6 ملليمول rT3 (مذاب في DMSO). اخلط بلطف واحتفظ بخليط الركيزة على الثلج حتى الاستخدام.
  2. إعداد المرجع
    1. جهز محلول مخزون بحجم 10-1 متر من وحدة تحكم مرجعية 6-PTU في مذيب مناسب (مثل DMSO) طازجا في يوم إجراء الاختبار.
    2. جهز تخفيفا بنسبة 1:10 لهذا المخزون بدرجة diH2O (RI-C8) لتحقيق تركيز DMSO بنسبة 10٪ وتحضير سلسلة من التخفيفات من هذا المخزون في 10٪ DMSO بدرجة diH2O كما هو موضح في الجدول 2.
  3. تحضير التحكم الإيجابي
    1. حضر محلول مخزوني بحجم 10-2 M من المادة المضادة الإيجابية Aurothioglucose في مذيب مناسب (مثل DMSO) وتخزينه لمدة تصل إلى 6 أشهر عند درجة حرارة 4 درجات مئوية.
    2. في يوم الفحص، قم بتخفيف المخزون إلى 10-3 مليون في diH2O لتحقيق تركيز DMSO بنسبة 10٪ DMSO.
  4. تحضير السيطرة السلبية
    1. حضر محلول مخزون بحجم 10-2 مليون من محلول الصوديوم 1-Thio-β-D-جلوكوز السالب في يوم إجراء الفحص.
    2. في يوم الفحص، قم بتخفيف المخزون إلى 10-3 مليون في diH2O لتحقيق تركيز DMSO بنسبة 10٪ DMSO.
      ملاحظة: استخدم دائما الاحتياطات الأمنية المناسبة، خاصة عند التعامل مع المواد الكيميائية الخطرة مثل الصوديوم أرسينيت وحمض الكبريتيك. يجب تجهيز جميع المواد بماء منزوع الأيونات وتخزينها وفقا لتوصيات الشركة المصنعة. خليط الركيزة، بعد التحضير، وتركيبة DTT المذابة مخصصة للاستخدام الواحد في يوم الفحص ولا ينبغي إعادة تجميده.
  5. صب راتنج تبادل الأيونات
    1. استخدم وعاء مستطيل شفاف مناسب للتحضير.
    2. أضف حوالي 250 جرام (أو الكمية المطلوبة) من راتنج تبادل الأيونات إلى وعاء كبير واغسل الراتنج. اغسل بإضافة 10٪ حمض الخليك؛ دع نظام التعليق الراتنجي يستريح لمدة 10 دقائق.
    3. بعد ترك نظام التعليق يستقر لمدة 10 دقائق، قم بإمالة واستنشاق السوبرناتانت قليلا. اغسل على الأقل 5 مرات أو حتى لا يتسرب اللون إلى المذيب.
    4. بعد آخر خطوة غسيل، أضف 10٪ حمض الأسيتيك بحيث يشكل حوالي 50٪ من الحجم الكلي.
    5. قم بإمالة الحاوية بحيث يتحرك الراتنج إلى جانب واحد وثبت الحاوية في وضعية مائلة. انتظر ~10 دقائق حتى تنفصل المراحل.
    6. ضع صفيحة فلتر بسعة 96 بئر فوق صفيحة بئر بعمق 96 وأضف 100 ميكرولتر من حمض الخليك 10٪ إلى كل بئر من صفيحة المرشح ذات 96 البئر.
    7. قص الأطراف المستخدمة في صب الراتنج على ارتفاع ~1 سم لتوسيع الفتحة في النهاية وصب 300 ميكرولتر من راتنج تبادل الأيونات في كل بئر من صفيحة المرشح ذات 96 بئر.
      ملاحظة: الأطراف المستخدمة في عملنا لها حجم أقصى يبلغ 1,200 ميكرولتر ويمكن توصيلها بماصات متعددة القنوات.
    8. يتم إخراج حمض الخليك عن طريق الطرد المركزي إلى صفيحة بئر بعمق 96 بسعة 100–200 × جرام في جهاز طرد مركزي مع دوار متحرك للخارج لألواح الميكروتيتر لمدة دقيقة واحدة. تحقق مما إذا كان الراتنج موزعا بشكل متساو عبر اللوحة.
    9. أغلق اللوحة بطبقة بلاستيكية غير منفذة واحتزنها عند 4 درجات مئوية لمدة أقصاها 6 أشهر.
      ملاحظة: من المعروف أن مكونات راتنج تبادل الأيونات تؤثر على تفاعل SK إذا لم يتم غسلها بشكل صحيح. يمكن استخدام المادة الفائقة المزولة مباشرة في تفاعل SK (استخدام 50 ميكرولتر من عينة الفائق، إضافة 50 ميكرولتر من السيريوم، وأخيرا 50 ميكرولتر من محلول الأرسينيت) ويمكن مقارنتها بعينة حمض الخليك 10٪ (التحكم الفارغ) لضمان غسل كامل للمكونات.
  6. توحيد تفاعل ساندل-كولثوف
    1. تحضير مخففات اليوديد من مصدر يوديد معين (مثل محلول يوديد قياسي) بتركيزات موصى بها 1,500، 1,000، 750، 500، 400، 300، 200، 100، 50، 25، 10، 5، و1 نانومول يوديد باستخدام معيار يوديد معين بمقدارdiH 2O.
    2. أضف 50 ميكرولتر من diH2O النقي كضابط و50 ميكرولتر من تخفيف اليوديد المحضر إلى صفيحة بحجم 96 بئر ثلاثية كما هو موضح في التخطيط في الشكل 1.
    3. أضف 50 ميكرولتر من محلول السيريوم بسعة 40 ملليمول إلى جميع الآبار وابدأ التفاعل بإضافة 50 ميكرولتر من محلول الزرنيخ 25 ملليمول إلى جميع الآبار.
    4. في أقرب وقت ممكن بعد إضافة محلول الأرنيخ، قس الامتصاص باستخدام قارئ ألواح عند 415 نانومتر (±2 نانومتر) عن طريق تسجيل الكثافة الضوئية (OD) كل دقيقة لمدة 21 دقيقة، بالإضافة إلى تسجيل الكثافة البصرية الأولية.
    5. قيم النتائج كما هو موضح في القسم 4.
      ملاحظة: عادة ما يحتاج خلفية ΔOD21 دقيقة > 0.3 في التحكم النقي diH2O إلى اهتمام وتحقيق إضافي في الأسباب الكامنة (مثل التلوث في دفعة A أو Ce، انخفاض جودة المياه).
  7. تقييم نشاط الميكروزومات
    1. تحضير أعلى تركيز (RI-C8) من العنصر المرجعي (6-PTU) كما هو موضح في الخطوة 1.2.
    2. جهز ستة تخفيفات ميكروسومية كما هو موضح في الجدول 3 وخليط الركيزة كما هو موضح في الجدول 1.
    3. أضف 10 ميكرولتر من تخفيف مذيب بنسبة 10٪ (v/v) بdiH2O (مثلا، 10٪ DMSO بdiH2O) و10 ميكرولتر من 10-2 M 6-PTU (RI-C8) إلى صفيحة ب 96 بئر ثلاثية كما هو موضح في تخطيط الصفيحة في الشكل 2.
    4. أضف 40 ميكرولتر من تخفيفات الميكروسوم بدرجة diH2O (مما ينتج عنه 20، 10، 5، 2.5، 1.25، 0.68، و0 ميكروغرام بروتين ميكروسوم لكل بئر) إلى صفيحة 96 بئر كما هو موضح في تخطيط الصفيحة.
      ملاحظة: عادة ما يوفر الموردون تركيز البروتين الدقيق المخزون. إذا لم يكن كذلك، فقد تستخدم طرق قياسية لقياس البروتين، رغم أننا لم نطبقها في هذه الدراسة.
    5. أضف 50 ميكرولتر من خليط الركيزة الطازج إلى كل بئر وأغلق اللوحة بورقة بلاستيكية غير منفذة.
    6. ضع لوحة ال 96 بئرا على هزاز في حاضنة (37 درجة مئوية عند 850 دورة في الدقيقة) وحضن لمدة ساعتين.
    7. بعد فترة الحضانة، ضع الطبق على الثلج لإيقاف التفاعل.
    8. قم بإجراء تبادل الأيونات بطريقة مماثلة للخطوة 2.2.
    9. نقل كميات مناسبة من العينة من البئر العميق الذي تم الحصول عليه في خطوة تبادل الأيونات إلى صفيحة جديدة ببئر 96 لقياس التخفيفات غير المخففة (50 ميكرولتر من العينة)، و1:2 (25 ميكرولتر من العينة + 25 ميكرولتر من حمض الخليك 10٪)، و1:4 (12.5 ميكرولتر من العينة + 37.5 ميكرولتر من 10٪ حمض الخليك)، مع الحفاظ على ترتيب اللوحة دون تغيير.
    10. تقييم النتائج كما هو موضح في القسم 4 وتحديد عامل التخفيف للعينات في حمض الأسيتيك 10٪ بالإضافة إلى تركيز البروتين الميكروسومي الذي لا يزال يؤدي إلى أعلى قيم ممكنةΔOD 21 دقيقة -BG في تفاعل ساندل-كولثوف دون الوصول إلى هضبة التشبع.
      ملاحظة: عادة ما يكون إطلاق اليوديد منΔOD 21 دقيقة > 0.5 سهل في تخفيف حمض الخليك بنسبة 1:4 أو 1:2 ل20 ميكروغرام من البروتين الميكروسومي لكل عينة بئر، وعادة ما يتراوح حول ΔOD21 دقيقة من 1. لا ينصح باستخدام تركيزات أعلى من البروتينات الميكروسومية، لأنها تزيد من الارتباط الخلفي وغير النوعي أثناء الاختبار. يوصى بتكرار قياس سلسلة تخفيف 6-PTU باستخدام تركيز وعامل تخفيف الميكروسوم المحدد لتأكيد النتيجة.
  8. تقييم ذوبانية عناصر الاختبار
    1. قم بإذابة عنصر الاختبار عند 100 ملليمول أو 200 ملغ/مل في مذيب مناسب (مثل DMSO) في درجة حرارة الغرفة. اخلط أو ابحث عن الدوامة وتحقق من الذوبان بصريا (المجهر).
    2. إذا لم يذب، قم بعمل سونيك لمدة تصل إلى 5 دقائق ثم تحقق مرة أخرى. إذا لم يذب، سخن على 37 درجة مئوية لمدة تصل إلى 60 دقيقة ثم أعد الفحص.
    3. إذا كان غير قابل للذوبان، قم بتخفيفه أكثر أو حضر مخزونا جديدا بتركيز أقل وكرر العملية. إذا لم يكن DMSO مناسبا، جرب الماء أو الإيثانول كبدائل للمذيبات.
    4. بعد الذوبان، جهز تخفيفا بنسبة 1:10 في diH2O (مذيب 10٪) وكرر التقييم (الخلط، الصوت، التسخين حسب الحاجة).
    5. لمحاكاة ظروف الاختبار، حضر تخفيفا لعنصر اختبار بنسبة 1٪ في مخزن الاختبار وكرر فحص الذوبانية.
  9. تحضير عنصر الاختبار وتحديد المدى
    1. جهز محلول مخزون عنصر الاختبار بأعلى تركيز قابل للذوبان في مذيب مناسب (ويفضل DMSO)، كما تم تحديده أثناء تقييم الذوبانية في الخطوة 1.8.
    2. لاختبار تحديد النطاق، حضر ثمانية تخفيف لعناصر اختبار بخطوات تخفيف متتالية بنسبة 1:10 (v/v) باستخدام محلول المخزون و10٪ DMSO بدرجة diH2O.
    3. إجراء اختبار تحديد المدى لتقدير ملف التثبيط لعنصر الاختبار من خلال تنفيذ الخطوات الموضحة في القسم 2. إذا أظهر عنصر الاختبار تثبيطا بنسبة ≥25٪ عند أي تركيز، قم بتعديل نطاق التركيز في عمليات الاختبار النهائية ليشمل على الأقل ثلاثة تركيزات في نطاق التثبيط الخطي وتركيزين أقل من 10٪ IRA، إذا كان ذلك مناسبا.
    4. إذا أظهر عنصر الاختبار تثبيطا بنسبة <25٪ في جميع التركيزات المختبرة، أعد استخدام نفس سلسلة التخفيف في عمليات الفحص النهائية. في هذه الحالة، قد يعتبر اختبار تحديد المدى واحدا من ثلاث عمليات اختبار مستقلة مطلوبة.
      ملاحظة: قم بإجراء تجربتين مستقلتين على الأقل، ويفضل ثلاث تجربات، لكل عنصر اختبار لضمان قابلية تكرار وموثوقية النتائج. إذا تم اختيار تخفيف آخر لتغطية نطاق النشاط بشكل أفضل، يسمح بالانحراف عن نسبة التخفيف 1:10. يميز الحد الأقصى البالغ 25٪ في هذه الاستراتيجية (انظر الخطوات 1.9.3 و1.9.4) بين تأثيرات عناصر الاختبار والضوابط السلبية، مع الأخذ في الاعتبار تباين النشاط الأساسي مع توفير هامش أمان إضافي. يضمن هذا العتبة تصنيفا موثوقا لملفات التثبيط الاعتقائية.

figure-protocol-1
الشكل 1: تخطيط الألواح لمنحنى اليوديد القياسي. يظهر هذا الشكل تصميم لوحة ال 96 بئر المستخدمة لتوليد منحنى معيار اليوديد. تحتوي الآبار على تخفيفات متسلسلة من اليوديد تتراوح من 1 نانوميل إلى 1500 نانومال، بالإضافة إلى ضوابط diH2O-فقط.  يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-protocol-2
الشكل 2: تخطيط الألواح لمعايرة البروتينات الدقيقة واختبار العناصر المرجعية. يعرض هذا الشكل تخطيط الصفيحة المكونة من 96 بئرا لمعايرة البروتينات الدقيقة واختبار مثبط المرجع (6-PTU). تحتوي الصفوف على كميات متزايدة من البروتين الميكروسومي في كل بئر، مع وبدون 6-PTU.  يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

2. إجراء اختبار DIO1–SK

  1. حضانة الميكروزومات مع عنصر الاختبار
    1. جهز العنصر المرجعي كما هو موضح في الخطوة 1.2، بالإضافة إلى التحكم الإيجابي والسلبي، كما هو موضح في الخطوات 1.3 و1.4. جهز عناصر الاختبار بتركيزات مناسبة وفقا للبروتوكول الموضح في الخطوتين 1.8 و1.9.
    2. جهز خليط الركيزة كما هو موضح في الجدول 1 وتحضير تعليق ميكروسوم بتركيز بروتين محدد مسبقا وفقا للخطوة 1.7 عن طريق تخفيف محلول ميكروسوم مذاب بعناية ومفصول في diH2O. حافظ على تعليق الميكروسوم على الثلج حتى الحاجة للحضانة.
    3. باتباع تخطيطات الألواح الموضحة في الشكل 3 والشكل 4 (إذا تم تقييم أكثر من عنصرين اختبار في نفس الوقت) أضف تركيزات 10 ميكرولتر من عناصر المرجع، والتحكم الإيجابي والسالب، والتحكم في المذيبات (10٪ (v/v) مذيب بdiH2O)، وتركيزات عناصر الاختبار إلى الآبار.
    4. أضف 40 ميكرولتر من نظام التعليق الميكروزومي إلى جميع الآبار. أضف 50 ميكرولتر من خليط الركيزة الطازجة إلى العينات.
    5. أغلق اللوحة بورقة بلاستيكية غير منفذة وضعها على هزاز في حاضنة (37 درجة مئوية عند 850 دورة في الدقيقة) لمدة ساعتين؛ ضع الصفيحة بعد الحضانة على الثلج لإيقاف التفاعل.
    6. ضع الطبق على الثلج بعد الحضانة لإيقاف التفاعل.
      ملاحظة: يمكن تخزين اللوح على الثلج حتى القياس للحفاظ على سلامة العينة. تحتوي لوح الاختبار الأول على ثمانية تركيزات من العنصر المرجعي، بينما تحتوي كل لوحة إضافية في نفس اليوم على أعلى تركيز فقط للعنصر المرجعي، مما يترك مساحة أكبر لعناصر اختبار إضافية إذا لزم الأمر.
  2. الفصل عبر صفائح مرشح 96 بئر مملوءة بالراتنج المملوء بتبادل الأيونات
    1. ضع صفيحة مرشح مجهزة براتنج مملوء بموزع 96 بئر مجهزة في التبادل الأيوني، كما تم تحضيرها في الخطوة 1.5، فوق صفيحة بئر بعمق 96 وأضف 150 ميكرولتر من حمض الأسيتيك 10٪ إلى كل بئر من صفيحة المرشح 96 بئر المملوءة بالراتنج في تبادل الأيونات لترطيب الراتنج في الأعمدة.
    2. يتم إخراج حمض الخليك عن طريق الطرد المركزي في صفيحة البئر المستخدمة بعمق 96 بسعة 100–200 × جرام في جهاز طرد مركزي مع دوار متحرك للخارج لألواح الميكروتيتر لمدة دقيقة واحدة.
    3. استبدل صفيحة البئر المستعملة بعمق 96 بصفيحة بئر جديدة بعمق 96.
    4. أضف 133 ميكرولتر من حمض الخليك 10٪ إلى كل بئر من صفيحة 96 بئر من الخطوة 2.1.6 ورك اللوح لفترة وجيزة لخلط المحاليل.
    5. نقل 175 ميكرولتر من العينات المحضرة في الخطوة السابقة إلى لوحة مرشح 96 بئر مملوءة بالراتنج في تبادل الأيونات، مع الحفاظ على ترتيب الصفيحة الأولية.
    6. مرر العينات عبر الراتنج إلى صفيحة البئر التي يبلغ عمقها 96 عن طريق الطرد المركزي (100–200 × جرام) في جهاز طرد مركزي مع دوار متحرك للخارج لصفائح الميكروتيتر لمدة دقيقة واحدة. قم بإزالة صفيحة المرشح المملوءة بالراتنج المملوء ب 96 بئر بتبادل الأيون.
      ملاحظة: يمكن إغلاق صفيحة البئر التي تحتوي على عينات بعمق 96 بورقة بلاستيكية غير منفذة وتخزينها عند 4 درجات مئوية لمدة لا تقل عن 3 أشهر. يتيح ذلك إجراء قياسات إضافية في حال حدوث أخطاء يدوية/تقنية أو تغييرات في عامل التخفيف في تفاعل أو قياس ساندل-كولثوف في الأيام التالية.
  3. رد فعل ساندل-كولثوف
    1. اعتمادا على عامل التخفيف المحدد للعينات في حمض الخليك 10٪ لدفعة الميكروسوم المستخدمة (انظر الخطوة 1.7)، أضف 50 ميكرولتر من العينة غير المخففة أو المخففة بشكل مناسب إلى صفيحة جديدة ذات 96 بئر.
    2. أضف 50 ميكرولتر من محلول السيريوم بوزن 40 ملليمول (المحضر كما هو موضح في الجدول 1) إلى جميع الآبار وابدأ التفاعل بإضافة 50 ميكرولتر من محلول الزرنيخ بوزن 25 ملليمول (المعد كما هو موضح في الجدول 1) إلى جميع الآبار.
    3. في أقرب وقت ممكن بعد إضافة محلول الأرنيخ، قس الامتصاص باستخدام قارئ الألواح عند 415 نانومتر (±2 نانومتر) عن طريق تسجيل الكثافة البصرية (OD) كل دقيقة لمدة 21 دقيقة، بالإضافة إلى تسجيل الكثافة البصرية الأولية.

figure-protocol-3
الشكل 3: تخطيط اللوحة للاختبار المتوازي لعنصرين اختباريين. تخطيط لوحة ببئر 96 لاختبار عنصرين اختبار ثلاثي التكرار عبر تركيزات متعددة، إلى جانب نسخ من عناصر التحكم السلبية والإيجابية والمذيبات والعنصر المرجعي. استخدمت كأول لوحة اختبار في اليوم. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-protocol-4
الشكل 4: تخطيط اللوحة للاختبار المتوازي لثلاثة عناصر اختبار. تصميم صفيحة بسعة 96 بئر لاختبار ثلاثة عناصر اختبار في ثلاث نسخ عبر تركيزات متعددة، مع نسخ من ضوابط سالبة وإيجابية ومذيبة. يتم تضمين العنصر المرجعي فقط عند أعلى تركيز له، حيث يتم اختباره بالكامل على اللوحة الأولى (انظر الشكل 3). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

3. اختبار التداخل (± ميكروسومات وDTT ±)

  1. جهز أعلى تركيز (RI C8) للعنصر المرجعي (6 وحدة وحدة الاختبار المرجعية) كما هو موضح في الخطوة 1.2 وتحضير محلول مخزون عنصر الاختبار والتخفيف (بما في ذلك أعلى تركيز لعنصر الاختبار).
  2. جهز تعليق الميكروسوم عند التركيز المحدد لكل بئر (انظر الخطوة 1.7) عن طريق تخفيف الميكروسومات المذابة بعناية والمجمعة بدرجة diH2O. احتفظ بتعليق الميكروسوم على الثلج حتى الاستخدام.
  3. حضر خليطين من الركيزة: خليط الركيزة القياسي مع DTT كما هو موضح في الجدول 1، وخليط ركيزة مطابق بدون DTT (باستثناء DTT فقط).
  4. يتم توزيع صفيحة بئر بحجم 96 في الآبار المخصصة وفقا للشكل 5: 10 ميكرولتر من RI C8، و10 ميكرولتر من 10٪ (v/v) DMSO في diH2O (التحكم في المذيبات)، و10 ميكرولتر من كل عنصر اختبار تخفيف.
  5. أضف 40 ميكرولتر من نظام التعليق الميكروزومي إلى الآبار المصنفة "مع ميكروسومات" و40 ميكرولتر من diH2O إلى الآبار المصنفة "بدون ميكروسومات"، وفقا للشكل 5.
  6. على الجليد، أضف 50 ميكرولتر من خليط الركيزة مع DTT إلى الآبار المصنفة "ب DTT" و50 ميكرولتر من خليط الركيزة بدون DTT إلى الآبار المصنفة "بدون DTT" (الشكل 5).
  7. أغلق الصفيحة بورقة بلاستيكية غير منفذة واحتضن على هزاز في حاضنة (37 درجة مئوية، 850 دورة في الدقيقة) لمدة ساعتين.
  8. بعد الحضانة، ضع الطبق على الثلج لإيقاف التفاعل.
  9. قم بفصل تبادل الأيونات وقياس كمية اليوديد عبر تفاعل SK كما هو موضح في الخطوات 2.2 و2.3، وتقييم النتائج كما هو موضح في القسم 4.
    ملاحظة: هذا الإعداد في اللوحة الواحدة (الشكل 5) يختبر أعلى تركيز لعنصر الاختبار بالتوازي مع الميكروسومات مقابل بدون ميكروسومات ومع عدم وجود DTT لتمييز نشاط الإنزيمات DIO1 عن التشكيلات التحليلية. تشير زيادة IRA ≥20٪ في الآبار التي لا تحتوي على ميكروسومات إلى تداخل SK (إطلاق/قراءة اليوديد بشكل مستقل عن DIO1)، وتصنف المادة على أنها "غير قابلة للتطبيق في اختبار DIO1 SK" ومستثناة من التحليل. تساعد الفروقات بين حالات DTT وبدونه في تحديد إطلاق اليوديد المعتمد على DTT كآلية تداخل إضافية.

figure-protocol-5
الشكل 5: تخطيط اللوحة لاختبار التداخل. يوضح هذا الشكل تصميم صفيحة ال 96 بئر لاختبار التداخل، حيث يتم اختبار عناصر الاختبار، والعنصر المرجعي، والتحكم في المذيبات مع وبدون ميكروسومات في وجود DTT وكذلك بدون ميكروسومات وبدون وجود DTT. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

4. تقييم البيانات

  1. تقييم نشاط DIO1
    1. حدد قيمΔOD لمدة 21 دقيقة عن طريق طرح قيم 21 دقيقة لجميع العينات من القيم القياسية الأولية (0 دقيقة):
      figure-protocol-6
    2. حدد قيم ΔOD-BG بطرح متوسط قيمΔOD 21 دقيقة للعناصر المنحطة 10 3 M 6-PTU (RI) من قيم ΔOD21 دقيقة لجميع العينات:
      figure-protocol-7
    3. تطبيع قيم عنصر الاختبار إلى قيم التحكم في المذيب المعنية عبر قسمة عناصر الاختبار (TI) ΔOD21min-BG TI بمتوسط قيم ΔOD21min -BG SC لوحدة التحكم في المذيب (SC)، مما يولد قيم نشاط إطلاق اليوديد (IRA) بالنسبة المئوية.
      figure-protocol-8
    4. رسم قيم IRA لتركيزات عناصر الاختبار المختلفة في حزمة برنامج الإحصاء، مع قيم IRA على المحور y (خطي) وتركيزات عناصر الاختبار على المحور x (لوغاريتمي).
    5. استخدم خوارزمية ملاءمة منحنى لتصور علاقة تركيز واستجابة (مثلا: "[المثبط] مقابل الاستجابة -- الميل المتغير (أربع معلمات)" في البرمجيات الإحصائية المختارة. "القمة" تمثل أقصى استجابة، و"القاع" تمثل أدنى استجابة، و"منحدر" تصف انحدار المنحنى:
      figure-protocol-9
    6. حدد IC50 للعنصر المرجعي، وإذا كان ذلك ينطبق، لعنصر الاختبار.
    7. احسب معامل التباين (CV) لتقدير لوغاريتميت IC50 للعنصر المرجعي بالنسبة المئوية:
      figure-protocol-10
    8. احسب حساب IRA للتحكم السالب المرتبط بالتحكم بالمذيب بالنسبة المئوية:
      figure-protocol-11
    9. احسب حساب IRA للتحكم الموجب المعدل إلى التحكم المذيب بالنسبة المئوية:
      figure-protocol-12
    10. احسب عامل z':
      figure-protocol-13
    11. للتحقق من صحة التجربة، قارن القيم المحسوبة بمعايير القبول في الجدول 4.
      ملاحظة: يجب تحقيق جميع المعايير للحصول على إجراء اختبار صالح.
    12. صنف عناصر الاختبار كمثبطات كاملة، أو مثبطات جزئية، أو غير مثبطات بناء على أقصى تثبيط وقيم IC50 ، كما هو موضح في الجدول 5.

النتائج

يوفر الشكل 6 نظرة عامة على سير عمل اختبار DIO1-SK والخطوات الرئيسية المطلوبة لتأسيس الطريقة بنجاح في المختبر. تلخص سير العمل (الشكل 6A) المراحل التتابعية للاختبار، بما في ذلك استخدام ميكروسومات الكبد البشرية، والحضانة مع عناصر الاختبار وأدوات التحكم، واستخراج اليوديد عبر فصل التبادل الأيوني، وقياس اليوديد اللوني باستخدام تفاعل ساندل-كولثوف (SK). يسلط الشكل 6B الضوء على استراتيجية التوحيد التي تدعم الأداء القوي والنتائج الصحيحة، بما في ذلك (1) توحيد تفاعل SK، (2) اختبار نشاط الميكروسوم الخاص بالدفعات، (3) تقييم الذوبانية واختبار التداخل، (4) اختبار تحديد النطاق، و(5) تعديل تركيزات عناصر الاختبار بناء على أول اختبار صالح.

عنصر أساسي في هذه الاستراتيجية هو اختبار النشاط الصغري الخاص بالدفعات، لأن دفعات ميكروسوم الكبد البشرية يمكن أن تختلف بشكل كبير في نشاط إزالة اليود ل rT3، مما يتطلب تحديد تركيز إنزيم مناسب لكل دفعة جديدة قبل الاختبار الروتيني للمواد.

تعد استراتيجية الاختبار المرحلي هذه ضرورية للتنفيذ: فقط بعد التحقق من الأداء الأساسي للاختبار (الضوابط، سلوك تفاعل SK، ونشاط الميكروسوم) وتوحيد شروط الاختبار، يمكن توقع أن ينتج اختبار المواد ملفات تثبيط صحيحة وقابلة للتفسير.

figure-results-1
الشكل 6: سير عمل اختبار DIO1 SK وخطوات التوحيد القياسي. (أ) يوضح سير العمل استخدام ميكروسومات الكبد البشرية، وإعداد صفيحة 96 بئرا، والحضانة مع عناصر الاختبار وأدوات التحكم، واستخراج اليوديد، والقياس اللوني عبر تفاعل SK. يتم تصوير كل خطوة بشكل متسلسل لتسليط الضوء على المراحل الرئيسية للاختبار. (ب) تشمل خطوات التوحيد القياسي لتفاعل ساندل-كولثوف، واختبار نشاط الميكروسومات الخاصة بالدفعات، وتقييم الذوبانية واختبار التداخل، واختبار تحديد النطاق، وضبط تركيزات عناصر الاختبار بناء على أول اختبار صالح. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

استنادا إلى سير العمل وإطار التوحيد الموضح في الشكل 6، يوضح الشكل 7 كيف تحدد المختبرات تركيز البروتين الميكروسومي المناسب (وتخفيف ما بعد تبادل الأيونات) لتحقيق نطاق ديناميكي كاف مع الحفاظ على استجابة تثبيط سيجمويدي للمثبط المرجعي. في الشكل 7A، يزداد ΔOD21min-BG مع زيادة البروتين الميكروسومي ويعتمد على التخفيف بعد تبادل الأيونات (غير مخفف، 1:2، 1:4). يتم اختيار التخفيف الذي ينتج أعلى ΔOD21min-BG مع الحفاظ على استجابة سيجموية للتجارب اللاحقة (المثال الموضح هو تخفيف بنسبة 1:2). في الشكل 7B، تتم مقارنة منحنيات تثبيط 6-PTU عبر كميات البروتين الميكروسومي لتحديد أدنى تركيز بروتين لا يزال يعطي منحنى سيجمويدي (المثال الموضح: 5 ميكروغرام من البروتين/البئر)، وبالتالي موازنة الحساسية مع الخلفية.

من المهم أن كل مختبر يجب أن يقوم بهذه الخطوة عند تنفيذ الطريقة، لأن تركيز البروتين المطلوب يعتمد على نشاط دفعة الميكروسوم المستخدمة، مما يستلزم توحيد تركيز الإنزيمات حسب دفعات معينة.

figure-results-2
الشكل 7: النشاط الميكروسومي والتثبيط بواسطة 6-PTU. (A) يظهر الرسم البياني زيادة النشاط مع إشارة ساندل-كولثوف المصححة بالخلفية (BG) (ΔOD21 دقيقة n- BG) مع زيادة كميات البروتين الميكروسومي لكل بئر (log10[ميكروغرام بروتين/بئر])، التي تم اختبارها في تخفيفات غير مخففة، 1:2، و1:4. سيتم استخدام أعلى تخفيف مع أعلى قيمة ΔOD21 دقيقة في BG، وكذلك مع شكل سيغمويد، في التجارب المستقبلية. في هذه الحالة، هو التخفيف بنسبة 1:2. (ب) منحنى التركيز-الاستجابة للمثبط المرجعي 6-بروبيل-2-ثيوراسيل (6-PTU) الذي يظهر نشاط إطلاق اليود (IRA في ٪) مرسوم مقابل log10[تركيز (M)] عند أحمال بروتينات ميكروسومية مختلفة (5، 7.5، و10 ميكروغرام بروتين/بئر). يتم تطبيع قيم IRA إلى التحكم في المذيب. تمثل نقاط البيانات في كلا الرسمين البيانيين متوسط SD ± ثلاثة نسخ تقنية (آبار) لكل حالة من اختبار نشاط ميكروسوم ممثل. تم تكييف المنحنيات بواسطة الانحدار غير الخطي باستخدام نموذج لوجستي مكون من أربعة معاملات ("ميل متغير") (مثبط مقابل استجابة). سيتم استخدام أصغر تركيز بروتين ذو منحنى سيجمويدي في التجارب المستقبلية؛ في هذه الحالة، 5 ميكروغرام/بئر. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

بمجرد الانتهاء من سير العمل وخطوات التوحيد القياسي (الشكل 6) وتحديد تركيز مناسب للبروتين الميكروسومي لدفعة الميكروسوم المختارة (الشكل 7)، تكون معايير الاختبار الأساسية جاهزة للمضي قدما في اختبارات المواد الروتينية. في هذه المرحلة، يمكن تقييم عناصر الاختبار جنبا إلى جنب مع مجموعة التحكم في الصفيحة (العنصر المرجعي، التحكم بالمذيب، والتحكم الإيجابي/السلبي) بصيغة الصفيحة الموحدة، مما يتيح تطبيعا قويا وتفسيرا متسقا لملفات التثبيط.

يوضح الشكل 8 التمييز بين الاختبارات بناء على سلوك التركيز والاستجابة في نشاط إفراز اليوديد (IRA). يظهر مثبط المرجع 6-PTU (الشكل 8A) انخفاضا يعتمد على التركيز في IRA، مما يوفر ملف التثبيط السيني المتوقع، كما هو متوقع للتحقق من أداء الاختبار. حمض التانيك (الشكل 8B) يظهر ملف مثبط يقارن بالمثبط المرجعي (أقصى تثبيط > 90٪) تحت الظروف المعروضة. أظهرت أعلى ثلاثة تركيزات من المادة المختبرة قيم IRA سلبية. قيم IRA <0٪ لا تعكس 'إطلاق اليوديد السلبي' ذي معنى بيولوجيا، بل تنشأ من عملية الحساب (طرح الخلفية والتطبيع إلى التحكم بالمذيب)، والتي يمكن أن تنقل تقلبات صغيرة في التحكم بالمذيب إلى قيم سالبة مطبعة. وبناء عليه، تعتبر قيم IRA أقل من 0٪ مكافئة ل 0٪ (خط الأساس) لتفسير النتائج. ديبيوتيل فثالات (الشكل 8C) لا يظهر أي تثبيط (أقصى تثبيط أقل من 25٪) عبر نطاق التركيز المختبر، مما يمثل ملف غير مثبط. توضح هذه الملفات معا أن الاختبار يمكنه التمييز بين السلوك المثبط وغير المثبط في الظروف الموحدة. يمكن لنظام الاختبار أيضا تحديد المثبطات الجزئية، التي تظهر مستويات تثبيط قصوى تتراوح بين 25٪ و90٪ (البيانات غير موضحة). يمكن العثور على مزيد من التفاصيل حول كيفية تصنيفها في الجدول 5.

figure-results-3
الشكل 8: سلوك استجابة الجرعة في اختبار DIO1–SK يميز المثبطات عن غير المثبطات. تظهر منحنيات الجرعة-الاستجابة نشاط إطلاق اليود (IRA بالنسبة المئوية) مخططا مقابل تركيز log10 (M) ل (A) المثبط المرجعي 6-PTU، (B) مثبط تمثيلي (حمض التانيك)، و(C) مثبط غير مثبط ممثل (ثنائي بيوتيل فثالات). تم حساب قيم IRA بعد طرح الخلفية وتم تطبيعها إلى التحكم في المذيب. تمثل الرموز متوسط ± SD (n = 3) من تجربة مستقلة واحدة، كل تجربة تجرى بثلاث نسخ تقنية (آبار) لكل تركيز. تم تكييف المنحنيات بواسطة الانحدار غير الخطي باستخدام نموذج لوجستي مكون من أربعة معاملات ("ميل متغير") (مثبط مقابل استجابة). تعتبر قيم IRA أقل من 0٪ مكافئة ل 0٪ (خط الأساس) لتفسير النتائج. تظهر هذه البيانات أن الاختبار يعطي ملف تثبيط سيجمي للمثبط المرجعي ويمكن أن يؤكد ما إذا كان منحنى تركيز الاستجابة مثبطا أم غير مثبط في الظروف الموحدة. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

في إجراء اختبار صالح، تظهر ضوابط المذيب (SC) فصلا واضحا للإشارة لمدة21 دقيقة ΔOD عن الحالة المرجعية المقيدة بالكامل (6-PTU، RI-C8). في مجموعة بيانات نموذجية (10 عمليات مستقلة)، تضمنت كل لوحة n = 9 نسخ تقنية مكررة ل SC والمرجع المثبط بالكامل (6-PTU عند 10−3 M). عبر الألواح، تراوحت قيم متوسط SC ΔODللصفيحة لمدة 21 دقيقة من 1.383 إلى 1.819 (متوسط ± SD: 1.565 ± 0.114)، بينما تراوحت قيم متوسط الصفيحةΔOD 21 دقيقة لحالة 6-PTU المثبطة من 0.258 إلى 0.771 (متوسط ± SD: 0.473 ± 0.087). يعتمد حساب ΔOD في هذا الاختبار على الفرق بين OD0min و OD21min، وعادة ما يدعم صحة الاختبار عتبة عامل z′ >0.5.

عبر 10 عمليات اختبار مستقلة، أنتج 6-PTU منحنى تركيز واستجابة سيغمويدية بقيم IC50 تتراوح بين 1.20E-06 M إلى 5.02E-06 M (متوسط SD ± 2.74E-06 M ± 1.13E-06 M). معايير قبول قيم IC50 في النطاق المرجعي من 1.00E-06 إلى 1.00E-05 تعتمد على بيانات من دراسات التحقق السابقة. ومع ذلك، تتأثر قيم IC50 بشكل كبير بدفعة الميكروسوم المحددة المستخدمة وقد تظهر تباينا كبيرا. ومع ذلك، من المتوقع أن تبقى هذه التغيرات ضمن نفس الرتبة المئوية.

يمكن تلخيص جودة الاختبار باستخدام عامل z′، الذي يعكس كل من نافذة الإشارة وتقلب أدوات التحكم. في مجموعة البيانات الموصوفة، ارتبطت ستة منحنيات مرجعية بعوامل z′ تتراوح بين 0.544 و0.774 (متوسط ± SD: 0.658 ± 0.062)، مما يتوافق مع هدف القبول المستخدم عادة وهو z′ > 0.5.

في الواقع، يمكن تحديد التجارب غير المثالية من خلال الانحرافات في خلفية الاختبار و/أو عدم تحقيق معايير القبول المحددة مسبقا. على سبيل المثال، يشار إلى خلفية عالية في تفاعل ساندل-كولثوف عندما يظهر فراغ diH₂O النقي ΔOD > 0.3، مما يستدعي التحقيق (مثل التلوث الكيميائي أو مشاكل جودة المياه). يمكن أن تقلل هذه الزيادات في الخلفية من النطاق الديناميكي للاختبار وترفع من تباين التحكم، مما يساهم في فشل معايير القبول، بما في ذلك عامل z′ أقل من 0.5. الآبار التي تظهر عيوبا تقنية واضحة (مثل الهطول أو تغير اللون غير الطبيعي) تستبعد كحالات شاذة من التقييم. كما يتم استبعاد القيم الشاذة التي تم تحديدها عبر اختبار الصندوق المخطط (boxplot). إذا لم تستوف معايير القبول بعد إزالة المؤشرات الشاذة، يعتبر اختبار الاختبار غير صالح ويجب تكراره.

الكاشف/المخزن المؤقتمعلومات عن التحضير
محلول السيريوم الحمضي للأمونيوم (40 ملمولار (NH4)4Ce(SO4)4*2H2O، 0.5 M H2SO4) (250 ملم)أضف 6.32 جرام من (NH4)4Ce(SO4)4*2H2O و125 مل من diH2O إلى قارورة حجمية بحجم 250 مل. أضف 125 مل 1 متر H2SO4 للوصول إلى حجم نهائي يبلغ 250 مل. خزن في درجة حرارة الغرفة حتى 6 أشهر.
DTT (أليكوتات 1 M)أليكوت هو محلول DTT بسعة 1 متر في H2O جاهز أو مورد في أنابيب طرد مركزي دقيق بحجم 1.5 مل ويخزن عند -20°C لمدة تصل إلى 6 أشهر.
هيبس (50 ملم م) / إيدتا (2.16 ميليمتر) (الرقم الهيدروجيني 7.0)باستخدام قارورة حجمية بسعة 250 مل، أضف 12.5 مل محلول HEPES بسعة 1 مل، و201 ملغ من حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA) واملأ حتى 250 مل بمحلول ثاني H2O. تخزين عند 4°C لمدة تصل إلى 3 أشهر.
محلول rT3 ("أنابيب خلط الركيزة")قم بإذابة rT3 في DMSO إلى تركيز نهائي يبلغ 6 مللي مول، ثم تقسيمها في أجزاء 10 ميكرولتر في أنابيب طرد مركزي بسعة 15 مل، وتخزنها عند -20°م لمدة تصل إلى 6 أشهر.
محلول الصوديوم أرسنيت (25 ملليموتر NaAsO2، 0.8 ملليمول NaCl، 0.5 ملويكيمونيوم H2SO4) (250 مل)أضف 0.81 جرام من NaAsO2، و11.7 جرام من NaCl، و125 مل من diH2O إلى قارورة حجمية بحجم 250 مل. أضف 125 مل 1 متر H2SO4 للوصول إلى حجم نهائي يبلغ 250 مل. خزن في درجة حرارة الغرفة حتى 6 أشهر.

الجدول 1: تحضير المخازن والكواشف. يوضح هذا الجدول خطوات التحضير وتعليمات التخزين لجميع المخازن والمحاليل المستخدمة في اختبار DIO1 SK، بما في ذلك مخزن HEPES/EDTA، وDTT، ومحلول rT3، ومحلول سيريوم الأمونيوم الحمضي، ومحلول أرسنيت الصوديوم.

اسم عنصر التخفيف المرجعيتركيز عنصر المرجع لتخفيف العنصر [M]10٪ DMSO [μL]عنصر مرجعيالتركيز النهائي لعنصر المرجع في الاختبار [M]
RI-C81.00E-0245050 ميكرولتر من محلول العنصر المرجعي 10-1 متر1.00E-03
RI-C71.00E-0345050 ميكرولتر من RI-C81.00E-04
RI-C61.00E-0445050 ميكرولتر من RI-C71.00E-05
RI-C53.16E-05342158 ميكرولتر من RI-C63.16E-06
RI-C41.00E-0545050 ميكرولتر من RI-C61.00E-06
RI-C33.16E-0645050 ميكرولتر من RI-C53.16E-07
RI-C21.00E-0645050 ميكرولتر من RI-C41.00E-07
RI-C11.00E-0745050 ميكرولتر من RI-C21.00E-08

الجدول 2: تحضير تخفيف العناصر المرجعية. يلخص هذا الجدول تحضير التخفيفات التسلسلية للعنصر المرجعي (6-PTU)، بما في ذلك التركيزات، وأحجام DMSO، والتكثفات النهائية المستخدمة في الاختبار.

ميكروزوم لكل بئر [ميكروغرام]diH2O [μL]تخفيف الميكروزومات [μL]التركيز النهائي للإنزيم في الاختبار [ميكروغرام/مل]
2078020 ميكرولتر من محلول ميكروسوم بسعة 20 ملغ/مل200
10400400 ميكرولتر من 20 ميكروجرام ميكروسوم لكل تخفيف بئر100
5400400 ميكرولتر من 10 ميكروغرام ميكروسوم لكل تخفيف بئر50
2.5400400 ميكرولتر من 5 ميكروجرام ميكروسوم لكل تخفيف بئر25
1.25400400 ميكرولتر من 2.5 ميكروجرام ميكروسوم لكل تخفيف بئر12.5
0.68400400 ميكرولتر من ميكروسوم 1.25 ميكروغرام لكل تخفيف بئر6.8

الجدول 3: تحضير تخفيفات الميكروسوم. يوفر هذا الجدول نظام التخفيف للبروتين الميكروسومي لكل بئر، بما في ذلك الأحجام المطلوبة من محلول diH₂O ومخزون الميكروسوم لتحقيق التركيزات النهائية للبروتينات الميكروسومية للاختبار.

معايير القبولالقيمة القطعية المقترحة
رقمي
IC50 من البند المرجعي [M]1*10-05 - 1*10-06
السيرة الذاتية لتقدير لوغاريتمية IC50 للبند المرجعي [٪]< 3
السيطرة السلبية على حساب IRA [٪]80 - 120
التحكم الإيجابي في IRA [٪]< 20
عامل z'-Factor> 0.5
ثنائي
شكل عنصر مرجعي (سيغمويدال؟)نعم
يتكون منحنى التركيز والاستجابة النهائي للعنصر المرجعي من ست تركيزات على الأقل من ثلاث نسخ مكررةنعم
يتكون منحنى التركيز والاستجابة النهائي لعنصر الاختبار من ست تركيزات على الأقل من ثلاث نسخ مكررةنعم

الجدول 4: معايير القبول لاختبار DIO1 SK. يسرد هذا الجدول معايير القبول لصلاحية الاختبار مثل نطاق IC₅₀، ومعامل التغير، وقيم IRA للضوابط، وعامل z'، ومتطلبات منحنيات التركيز-الاستجابة. تم اشتقاق نوافذ القبول من دراسات التحقق من DIO1-SK المبلغ عنهاسابقا 6، بما في ذلك تقييم قابلية التكرار بناء على خمس عمليات مستقلة أثرت نافذة IC₅₀ المرجعية. في مجموعة بيانات نموذجية من 10 جولات مستقلة، تراوح أداء عامل z′ من 0.544 إلى 0.774 (متوسط SD ±: 0.658 ± 0.062)، مما يدعم عتبة قبول z′ المستخدمة هنا.

الفئة (حسب الفعالية)الفئة الفرعية (حسب القوة)نشاط التثبيطالعتبة
الفئة 1: مثبط كاملج: مثبط كامل قوييثبط نشاط DIO1 بالكامل بتركيز مماثل للعنصر المرجعي 6-PTUأقصى تثبيط أعلى بنسبة 90٪ وIC50 عند أو أقل من النطاق الأعلى IC50 من 6-PTU
ب: مثبط ضعيف بالكامليثبط نشاط DIO1 بالكامل عند تركيزات أعلى من العنصر المرجعي 6-PTUأقصى تثبيط أعلى بنسبة 90٪ وIC50 فوق النطاق الأعلى IC50 من 6-PTU
الفئة 2: مثبط جزئي-لا يوجد تثبيط كامل، لكنه أكبر من السلبية والتحكم في المذيباتأقصى تثبيط بين 25٪ و90٪
الفئة 3: ليس مثبطا-لا يثبط DIO1 (نفس التحكم السلبي والمذيب)أقصى تثبيط أقل من 25٪

الجدول 5: تصنيف عناصر الاختبار بناء على فعالية تثبيط DIO1 وفعاليته. تصنف عناصر الاختبار إلى ثلاث مجموعات فعالية (كاملة، جزئية، أو غير مثبطة) بناء على أقصى تثبيط لنشاط DIO1. يتم تصنيف المثبطات الكاملة بشكل فرعي حسب الفعالية، اعتمادا على IC₅₀ بالنسبة للعنصر المرجعي 6-PTU.

المناقشة

يوفر اختبار DIO1-SK بديلا غير مشيع، فعال من حيث التكلفة، وقابلا للتوسع للطرق التقليدية لتقييم نشاط DIO1، مثل الاختبارات الموسومة بالإشعاع أو مطيافية الكتلة. تأكيد التحقق المسبق لميكروسومات الكبد البشرية وتوافقه القوي مع قياسات SPE-LC-MS/MS لمستويات هرمونات الغدة الدرقية يؤكد موثوقيته وأهميته التنظيمية، كما يتضح من إدراجه في خطة عمل إرشادات اختبار منظمة التعاون الاقتصادي والتنمية. بساطة تفاعل ساندل-كولثوف (SK) تجعل الاختبار متاحا للمختبرات التي لا تحتوي على أجهزة متقدمة.

في البروتوكول الحالي، تم تحديد عدة جوانب عملية بتفصيل أكبر مقارنة بإجراءات DIO1-SK المنشورة سابقا لدعم المتانة وقابلية التكرار في صيغة 96 بئر روتينية. تركز هذه التوضيحات على مبررات مفهوم التحكم (المذيب، السلبية والإيجابية)، وقرار استخدام ألواح راتنج تبادل الأيونات المحضرة حديثا بدلا من إعادة استخدام الصفائح المصبوبة سابقا، وظروف تفاعل SK التي تحسن متانة التعامل في قياسات الصفائح متعددة الآبار، مع الحفاظ على التفسير البيولوجي متسقا مع أعمال التوحيد السابقة6،7.

على الرغم من نقاط قوته، يجب اتخاذ عدة خطوات حاسمة لقياس اليوديد المنبعث بدقة خلال التحويل الوسيط DIO1 من rT3 إلى T2. يتم تحقيق ذلك عبر تفاعل ساندل-كولثوف، الذي يتطلب توقيتا دقيقا ومعالجة متسقة مع الكواشف لضمان قابلية التكرار. تفاعل SK هو عملية تحفيزية سريعة يسرع فيها اليوديد تحويل السيريوم الأصفر (IV) إلى السيريوم عديم اللون (III) بواسطة الأرنيخ؛ معدل تغير اللون يتناسب طرديا مع تركيز اليوديد. نظرا لأن التفاعل يتقدم بسرعة بمجرد إضافة محلول الزرنيخ، فمن الضروري أن يبدأ القياس دون تأخير. في صيغة الصفائح ذات 96 البئر، يمكن أن يؤدي الإضافة البطيئة أو غير المتسقة لمحلول الزرنيخ إلى حدوث تفاوت كبير بين الآبار. لذلك، ينصح بشدة باستخدام ماصة متعددة القنوات أو موزع آلي لضمان إضافة كواشف منتظمة وسريعة عبر جميع الآبار.

لتعظيم قابلية المقارنة عبر الآبار وبين الصفائح، يجب الحفاظ على ترتيب إضافة الكواشف في تفاعل SK متسقا مع سير العمل المذكور: السيريوم موجود كركيز كروموجينية، ويبدأ التفاعل بإضافة الأرسينيت، مما يحدد وقت البدء وبالتالي يتطلب توزعا سريعا ومتزامنة. لم يتم تقييم أوامر إضافة الكواشف البديلة في هذا الإعداد؛ لذا، لا ينصح بتغيير الترتيب عند إعادة إنتاج البروتوكول. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن يؤثر تركيز السيريوم على خصائص الأداء العملية لقراءة SK (مثل نافذة الإشارة والمتانة). بينما تم تعريف سيريوم 25 ملليمولار كحالة معيارية معتمدة خلال توحيد الاختبارات السابقة، أظهرت التركيزات الأعلى مثل 40 ملمولار أنها تزيد من نافذة الإشارة وعامل z′ دون التأثير على قيم IC50 أو التفسير البيولوجي، كما هو موضح بالفعل في العملالسابق 6. في هذا البروتوكول، يستخدم سيريوم 40 ملليمولار لضمان تعقيد اليوديد الكامل والسريع تحت ظروف الاختبار ولتحسين المتانة واستقرار الإشارة في القياسات الروتينية القائمة على الصفائح. معايير القبول (مثل عامل z′، قيم IC50 للمثبط المرجعي) تعتمد على الأداء التاريخي الذي لوحظ في دراسات التحقق السابقة ويهدف منها كاختبار أداء روتيني.

استخدام ميكروسومات الكبد البشرية يدخل التغيرات البيولوجية، مما يجعل توحيد نشاط إطلاق اليوديد الخاص بدفعات الميكروسوم أمرا ضروريا. يعد التحضير الدقيق لألواح المرشح المملوءة بالراتنج المملوء بتبادل الأيونات ضروريا لتجنب توزيع الراتنج غير المتساو عبر لوحة الترشيح وضمان فصل اليود تماما عن المواد التي قد تكون متداخلة. فيما يتعلق بسير عمل الراتنج، تم اختيار ألواح مرشح مملوءة براتنج تبادل الأيونات الصب حديثا لتقليل خطر التباين الإضافي الناتج عن تشبع الراتنج، ونقل اليود أو البروتين، وفقدان كفاءة الارتباط عند إعادة الاستخدام. إعادة استخدام صفائح الراتنج والترشيح ممكنة تقنيا، لكنها قد تحمل بعض المخاطر التي لم يتم تقييمها بشكل منهجي في هذه الدراسة. قد يؤدي ذلك إلى انحراف الدفعة إلى الدفعة إذا انخفضت قدرة الربط بالراتنج أو إذا بقيت مكونات المصفوفة المتبقية في طبقة الراتنج بعد التشغيل السابق. بالنسبة للمختبرات التي تفكر في إعادة التدوير، التوصية العملية هي التحقق من أداء الراتنج بعد إعادة الاستخدام (مثل مراقبة سلوك الخلفية والمنحنى القياسي وضمان التقاط اليود بشكل متسق) وإيقاف إعادة الاستخدام إذا لوحظ زيادة الخلفية أو تقليل النطاق الديناميكي أو الفصل غير المتسق. يوصى باستخدام صفائح مرشح مملوءة بالراتنج للاستخدام الواحد، حيث تم تطوير هذا البروتوكول خصيصا بناء على هذه المنهجية.

بالإضافة إلى ذلك، يجب تحديد ذوبانية كل عنصر اختبار في مركبة مناسبة، حيث أن التركيز الأقصى الذي يتم اختباره محدود بالذوبانية (عادة حتى 1 مللي مولار مع 1٪ DMSO). نظرا لأن جميع المركبات التجريبية تطبق في DMSO كمذيب، فإن التحكم في المذيب يحدد نشاط DIO1 الأساسي تحت ظروف مناسبة للاختبار ويعمل كأفضل حالة مرجعية للتطبيع والمقارنة. على النقيض من ذلك، تم تضمين ملح الصوديوم 1-ثيو-β-د كعامل تحكم سلبي لأنه مشابه هيكليا للجلوكوز المثبت (ATG) لكنه خامل كيميائيا فيما يتعلق بدييودين اليودوثيرونين ولا يتداخل مع أنظمة الأكسدة الدقيقة أو النشاط التحفيزي DIO1. يساعد إدراجه في التمييز بين التأثيرات الحقيقية الخاصة ب DIO1 والتأثيرات غير النوعية المتعلقة بإضافة المركبات أو التعامل أو تفاعلات مصفوفة الاختبار. لم يستخدم نظام التحكم بدون معالجة/عدم وجود مركبة كحالة مرجعية أساسية لأنه لا يعكس بيئة الفحص الفعلية التي يوجد فيها DMSO في جميع الآبار المعالجة بالمركبات؛ لذلك، فإن التحكم في المذيب هو الأساس المناسب لتفسير الاختبارات.

يركز استكشاف الأخطاء على تحديد التداخلات في تفاعل SK. قد تؤثر المواد التي تحتوي على اليود أو تخلبها أو مؤكسدة بشدة بشكل مصطنع على قراءة الألوان14، 17، 18. لمعالجة ذلك، يتضمن البروتوكول اختبار التداخل بدون ميكروسومات. علاوة على ذلك، يمكن أن يؤدي استخدام الديثيوثرايتول (DTT) كعامل مساعد إلى إفراز يوديد غير إنزيمي من بعض المواد المختبرة. في مثل هذه الحالات، يوصى بطرق متعامدة مثل SPE-LC-MS/MS لتأكيد تثبيط DIO1. يمكن أن يؤدي التداخل غير النوع عن طريق تأثيرات التغيير العام (مثل المواد السطحية السطحية) إلى نتائج إيجابية كاذبة، لذا فإن استراتيجية عامة لتحديد الضربين المتكررين، باستخدام أدوات في السيليكو أو أساليب اختبار متكاملة، يمكن أن تكون ذات قيمة.

للاختبار عدة قيود. هو عرضة للتداخل من مواد الاختبار التي تتفاعل مع مكونات الاختبار أو تفرز اليوديد بشكل مستقل عن نشاط DIO1. لا يميز الاختبار بين التثبيط النوعي ل DIO1 والتداخل غير النوعي في وظيفة الإنزيمات أو سلامة البنيوية. لتحسين النوعية، يمكن تحليل تثبيط إنزيمات ميكروسومية إضافية بالتوازي، ومقارنة القدرات المثبطة عبر اختبارات الإنزيمات المختلفة قد توفر أدلة إضافية.

استراتيجية إضافية لتحديد العيوب المحتملة هي تضمين اختبارات السلامة أو الجدوى، كما تجرى عادة في اختبارات الخلايا في المختبر ، لتحديد أقصى تركيز للاختبار. بينما لا يوجد اختبار سلامة مباشر في اختبار DIO1-SK، فإن استخدامه ضمن بطارية اختبار في المختبر يسمح بدمج بيانات السمية الخلوية من اختبارات خلاية أخرى لتوجيه اختيار التركيز. إذا لم تكن هذه المعلومات متاحة من التحليل المتبادل، فإن التركيز الأعلى في اختبار DIO1-SK يكون محدودا بالذوبانية، والتي قد لا تعكس التعرضات الحية ذات الصلة. ومع ذلك، يمكن استخدام الأساليب السمية لتعريف وتفسير تركيزات الاختبار المختبري بشكل أفضل.

اختبار DIO1-SK ذو قيمة خاصة في الفحص السممي والدراسات الميكانيكية لاضطراب الغدد الصماء. يعالج حدثا رئيسيا في توازن هرمون الغدة الدرقية ويمكن دمجه في بطاريات الاختبار الصناعي. تجعلها متانتها وقابليتها للتكرار وقابليتها للتكيف مع بيئات المختبرات المختلفة واحتياجات الإنتاجية منها أداة قيمة لتقييم السلامة الكيميائية والتحقق التنظيمي. يوفر الاختبار قياسا قويا في المختبر لتثبيط DIO1 تحت ظروف موحدة ويدعم تصنيف المواد المختبرة مقارنة بمثبط مرجعي محدد جيدا (6-PTU). ومع ذلك، فإن البيانات في الجسم الحي حول تثبيط DIO1 نادرة، وبالتالي فإن الارتباط المباشر بين نتائج تثبيط DIO1 في المختبر مع التأثيرات في الجسم الحي، لا ينطبق حاليا على تقدير التنبؤ في الجسم الحي. وبناء عليه، يجب تفسير نتائج الاختبارات كدليل ميكانيكي على التدخل في حدث رئيسي واحد في استقلاب هرمونات الغدة الدرقية، وأن تدمج مع خطوط أدلة إضافية (مثل اختبارات MoA الأخرى للغدة الدرقية وقياسات متعامدة عند الحاجة). ومن المهم أن اختبار DIO1–SK قد تم تقييمه في عدة دراسات موجهة للتحقق (التحسين/التوحيد القياسي، تقييم التنبؤ، وتحليل المتانة/الدقة)6,7,15، ومع تقدم الطريقة نحو تنفيذ منظمة التعاون الاقتصادي والتنمية، توفر هذه المقالة مستوى من التفاصيل الإجرائية خطوة بخطوة تهدف إلى تسهيل النقل والتنفيذ المتسق عبر مختبرات إضافية.

الإفصاحات

المؤلفون K.S.، N.H، D.F.-W.، وR.L. هم موظفون في شركة BASF SE، وهي شركة كيميائية، قد تستخدم اختبار DIO1 لتطوير وتسجيل المنتجات التجارية في المستقبل.

شكر وتقدير

يريد المؤلفون شكر الدكتور أندرياس ويبر على عمله خلال تأسيس اختبار DIO1-SK.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
1-ثيو-بيتا؛-د-جلوكوز ملح الصوديومسيغما-ألدرتشT6375-1GCAS 10593-29-0
3,3',5'-تراييودوثيرونين (rT3) سانتا كروز للتكنولوجيا الحيويةSC-209692CAS 5817-39-0
6-بروبيل-2-ثيوراسيل (6PTU)سوبيلكوP3755-10GCAS 51-52-5
حمض الخليكثيرمو فيشر9526-33CAS 64-19-7
التوازن التحليليNANAقادر على وزن بدقة يصل إلى 30 جرام مع وضوح قراءة 0.1 ملغ
أكسيد الصوديوم الزرنيخ (NaAsO2)ثيرمو فيشر041533.APCAS 7784-46-5
ألواح الفحص (صيغة 96 بئر)ميركZ707902-108EAمثل ألواح زراعة الأنسجة، صفيحة 96 بئر، قاع مسطح، بوليستيرين، 0.34 سم2، معقمة، 108/cs، TPP
أوروثيوجلوكوز (ATG)سيغما-ألدرتشA0606-5MGCAS 12192-57-3
أنابيب الطرد المركزي 15 و50  mLميركZ707724-800EA، Z707716-320EAمثل أنابيب الطرد المركزي TPP، حجمها 15 و50 مل، بولي بروبيلين،  
جهاز طرد مركزي مع دوار قابل للخروج لألواح الميكروتيترNANAيجب أن يكون مرتفعا بما يكفي لوضع صفيحة بئر بعمق 96 مع صفيحة فلتر بسعة 96 بئر في الأعلى (على الأقل حوالي 6 سم ارتفاعا)
السيريوم (IV) كبريتات الأمونيوم (Ce(NH4)4(SO4)4)سيغما-ألدرتش22269-100G-FCAS 10378-47-9
حاضنة ثاني أكسيد الكربونNANAقادر على الحفاظ على درجات حرارة 37&°C; C، 5٪ ثاني أكسيد الكربون و > رطوبة 90٪
ألواح البئر العميقة (صيغة 96 بئرا)سوبيلكو575653-Uعلى سبيل المثال، SPE 96-صفيحة جمع بئر مربع عميق، حجم البئر 2 مل، بولي بروبيلين
كبريتات ثنائي ميثيل (DMSO)AppliChemA3672,0250CAS 67-68-5
ديثيوثرايتول (DTT)سيغما-ألدرتشD9779-1GCAS 3483-12-3
حمض الإيثيلين ديامين رباعي أسيتيك (EDTA) سيغما-ألدرتشAPO456787707-500GCAS 6381-92-6
ألواح الترشيح (صيغة 96 بئر)ميركWHA77002810مثل الألواح الدقيقة، 96-بئر، البوليسترين الشفاف، 800 وميكرو؛ L، ربط DNA، وات مان
الألواح المقاومة للغازثيرمو فيشر232698مثلا: شريط ختم، بوليستر، معقم، شريط ختم، بوليستر، معقم، Nunc
هيبسبان بيوتكP05-01100CAS 7365-45-9
ميكروسومات الكبد البشريةBiovitX008070على سبيل المثال، ميكروسومات كبد كبد الإنسان المجمعة من INVITROCYP 150
اليوديد (معيار IC)سوبيلكو41271-100MLمثل معيار اليوديد للدوائر المتكاملة، 1000 ملغ/لتر في الماء، سيغما-ألدريتش
راتنج تبادل الأيونات مثل Dowex 50WX2روث334.4CAS 12612-37-2؛ الشبكة 100-200
أنابيب الطرد المركزي الدقيق 1.5  mLميركEP0030120086-1PAKمثلا: Eppendorf® أنابيب الطرد المركزي الدقيقة ذات قفل آمن، حجم 1.5 مل، طبيعية
موزع متعدد القنوات قادر على توصيل 50 إلى 300 بوصة فقط؛ > L لكل خطوةNANANA
ماصة متعددة القنوات قادرة على توصيل 10 إلى 100 وبوصة إضافية؛ > L لكل خطوةNANANA
مقياس الرقم الهيدروجيني مع أقطاب كهربائية ومخازن معايرةNANAقادر على قراءة وحدات pH بمعدل +/- 0.1
مقياس الفوتومتر لقياس الامتصاصشركة تيكان تريدينغ إيه جيNAمثلا: قارئ امتصاص شروق الشمس، INSTSUN-3
بيبيتس قادرة على توصيل 1 إلى 10  > LNANANA
بيبيتس قادرة على توصيل 10 إلى 100 و... > LNANANA
أنابيب قادرة على توصيل 100 إلى 1000 و... > L NANANA
الأنابيب للأحجام الأعلىNANAالماصات المصلية، مثل 10، 25، 50 مل
هز الصفائحثيرمو فيشرNAمثل لوحة الميكروتيتر Thermo Scientific H+P MONOSHAKE VORTEXER، التي يتم التحكم بها مباشرة
ماصة المكررNANANA
كلوريد الصوديوم (NaCl)سيغما-ألدرتشS9888-25GCAS: 7647-14-5، مثل كلوريد الصوديوم، كاشف ACS، وما إلى ذلك؛ 99.0 %
برامج الإحصاءNANAقادر على إجراء تحليل الانحدار الذي يعكس خصائص الاختبار وقادر على حساب تركيزات مثبطة مثل GraphPad Prims 8، GraphPad
حمض الكبريتيك (H2SO4) سوبيلكو1007311000CAS 7664-93-9
قارورة حجميةNANAمعتمد بحجم محدد

المراجع

  1. Kabir, E. R., Rahman, M. S., Rahman, I. A review on endocrine disruptors and their possible impacts on human health. Environ Toxicol Pharmacol. 40 (1), 241-258 (2015).
  2. Yue, B., et al. Human exposure to a mixture of endocrine disruptors and serum levels of thyroid hormones: a cross-sectional study. J Environ Sci. 125, 641-649 (2023).
  3. Köhrle, J. The deiodinase family: selenoenzymes regulating thyroid hormone availability and action. Cell Mol Life Sci. 57 (13), 1853-1863 (2000).
  4. Zhang, J., Lazar, M. A. The mechanism of action of thyroid hormones. Annu Rev Physiol. 62 (1), 439-466 (2000).
  5. França, M. M., et al. Human type 1 iodothyronine deiodinase (DIO1) mutations cause abnormal thyroid hormone metabolism. Thyroid. 31 (2), 202-207 (2020).
  6. Weber, A. G., et al. Assessment of the predictivity of the DIO1-SK assay to investigate DIO1 inhibition in human liver microsomes. Appl Vitro Toxicol. 9 (2), 44-59 (2023).
  7. Weber, A. G., et al. A new approach method to study thyroid hormone disruption: optimization and standardization of an assay to assess the inhibition of DIO1 enzyme in human liver microsomes. Appl Vitro Toxicol. 8 (3), 67-82 (2022).
  8. Renko, K., Hoefig, C. S., Hiller, F., Schomburg, L., Köhrle, J. Identification of iopanoic acid as substrate of type 1 deiodinase by a novel nonradioactive iodide-release assay. Endocrinology. 153 (5), 2506-2513 (2012).
  9. Renko, K., et al. An improved nonradioactive screening method identifies genistein and xanthohumol as potent inhibitors of iodothyronine deiodinases. Thyroid. 25 (8), 962-968 (2015).
  10. Olker, J. H., et al. Screening the ToxCast phase 1, phase 2, and e1k chemical libraries for inhibitors of iodothyronine deiodinases. Toxicol Sci. 168 (2), 430-442 (2019).
  11. Sane, R., et al. Identification and characterization of highly potent and isoenzyme-selective inhibitors of deiodinase type I via a nonradioactive high-throughput screening method. Thyroid. 35 (5), 576-589 (2025).
  12. Visser, T. J., Van Overmeeren, E. Binding of radioiodinated propylthiouracil to rat liver microsomal fractions: stimulation by substrates for iodothyronine 5′-deiodinase. Biochem J. 183 (1), 167-169 (1979).
  13. Hindrichs, C., et al. A novel and fast online SPE-LC-MS/MS method to quantify thyroid hormone metabolites in rat plasma. Chem Res Toxicol. 37 (1), 33-41 (2024).
  14. Kolthoff, I. M., Sandell, E. B., Lingane, J. J. A modified persulfate-arsenite method for manganese. Anal Chem. 8 (1), 73-73 (1936).
  15. Stefanidis, K., et al. Assessment of the robustness and accuracy of the deiodinase 1 Sandell–Kolthoff assay: a comparative analysis. Appl Vitro Toxicol. 10 (4), 80-90 (2024).
  16. Satya, S., et al. Guidance document on standardised test guidelines for evaluating chemicals for endocrine disruption. OECD Environ Health Saf Publ. 150, (2012).
  17. Joseph, O., Eberle, M., Lieberman, M. Metabolites in urine that interfere with the Sandell–Kolthoff assay for urinary iodine. Biol Trace Elem Res. 202 (2), 466-472 (2024).
  18. May, W., Wu, D., Eastman, C., Bourdoux, P., Maberly, G. Evaluation of automated urinary iodine methods: problems of interfering substances identified. Clin Chem. 36 (6), 865-869 (1990).

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

التقييم اللوني لنشاط ديوديناز 1 في ميكروسومات الكبد البشرية باستخدام تفاعل ساندل-كولثوف
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.